RO109863B1 - Gena care codifica cel putin un factor de restrictie complementar, animal transgenic si metode de transplantare a tesuturilor sau organelor animale - Google Patents

Gena care codifica cel putin un factor de restrictie complementar, animal transgenic si metode de transplantare a tesuturilor sau organelor animale Download PDF

Info

Publication number
RO109863B1
RO109863B1 RO92-200502A RO92200502A RO109863B1 RO 109863 B1 RO109863 B1 RO 109863B1 RO 92200502 A RO92200502 A RO 92200502A RO 109863 B1 RO109863 B1 RO 109863B1
Authority
RO
Romania
Prior art keywords
hcrf
cells
complement
species
human
Prior art date
Application number
RO92-200502A
Other languages
English (en)
Inventor
David James Graham White
Alan Frederick Williams
Original Assignee
Imutran Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26296038&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RO109863(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from GB898922987A external-priority patent/GB8922987D0/en
Priority claimed from GB909017198A external-priority patent/GB9017198D0/en
Application filed by Imutran Ltd filed Critical Imutran Ltd
Publication of RO109863B1 publication Critical patent/RO109863B1/ro

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/108—Swine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
    • A01K2267/025—Animal producing cells or organs for transplantation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Description

Prezenta invenție se referă la o genă care codifică cel puțin un factor de restricție complementar, animal transgenic și metoda de transplantare a țesuturilor sau organelor animale.
înlocuirea țesuturilor, inclusiv a organelor animale (în special, umane) nereușite sau defectuoase, în ultimele patru decenii a devenit o terapie obișnuită în medicina clinica. Aceste terapii de înlocuire sunt cuprinse, de exemplu, de la utilizarea tereftalatului de polietilenă, comercializat sub numele de DACRON produs comercial al firmei Du Pont, la repararea vaselor sanguine defectuoase, la utilizarea venei safene cu autografe la arterele blocate by-pass și la transplantarea inimii de la un om la celălalt
Transplantarea de organe a trecut printr-o dezvoltare semnificativă, cu imunosupresați moderni ce au dus la rate de succes ridicate care au fost obținute la costuri relativ modeste. Cererea transplantării de organe a crescut rapid. în prezent exista mai mult de 20000 de transplante de organe anual efectuate în lumea întreagă. Aceasta reprezintă totuși numai aproximativ 15 procente din necesarul evaluat prin criterii curente. Raportul dintre furnizare și solicitare a organelor donoare de toate tipurile nu poate fi găsit de la sursele existente. Acesta este probabil cel mai bine ilustrat cu solicitarea pentru transplantul de inima. Primul transplant de inimă realizat de Bamard în 1967 a generat considerabile reportaje în presă. în timp de un an, au fost efectuate 101 transplante de inimă în 22 de țări, de către 64 echipe diferite de chirurgi A urmat o perioadă de deziluzii cu rezultate slabe obținute în așa fel, încât în câțiva ani din perioada anilor 1970, au fost efectuate în lumea întreagă, mai puțin de 30 transplante în fiecare an. Introducerea totuși a ciclosporinelor imunosuprasoare, a revoluționat apoi transplantul de inimă astfel că majoritatea centrelor pot anticipa durata succeselor pentru transplantul de inimă cu mai mult de 80 de procente pe an de grefe (cu pacienți în viața). Pe măsura câștigării unei experiențe, rata de supraviețuire poate fi așteptată în mod rezonabil sa crească în continuare. Succesul acestui procedeu, desigur stimulează cererea, astfel că medicii și publicul, în general, sunt în continuare mai conștienți că transplantul de inimă oferă o reală alternativă față de moarte, așa că din ce în ce mai mulți pacienți se îndreaptă către acest procedeu. în mod curent, peste 2000 de transplante de inimă sunt realizate în fiecare an.
Astăzi cel mai mare risc fața de moarte în cazul transplantelor de inimă este cel de așteptare pentru un organ donor care să devină disponibil. în timp ce inima artificială oferă un dispozitiv suport pe termen scurt pentru acești pacienți, cererile pe termen lung sunt pentru mai multe centre de transplant de inimă și un număr mai mare de furnizori donori. Numărul potențial al indivizilor care ar putea beneficia de transplantul cardiac, n-a fost niciodată stabilit științific, dar din publicații se estimează nevoia de transplant de inimă care a crescut de ordinul a 50 și 250 persoane per milion per an dependent de criteriile de selecție, vârsta primitorului, boala și altele. Oricare ar fi dintre figurile actuale, este foarte clar deja că opțiunile de donori curenți sunt incapabile de a întâlni cererea. Comentarii asemănătoare ar putea fi făcute pentru transplantul de rinichi și pentru cel de ficat și se pare la fel că, pentru pancreas.
Există, în continuare, dezavantaje ale terapiei curente cu transplante. Aceasta este prin lipsa mijloacelor, în care caz nu întotdeauna organele donoare sunt potrivite pentru utilizare în transplante, pentru ca mulți donori de organe sunt victimele unor accidente (de exemplu un accident de circulație) care poate cauza moartea prin distrugerea unor organe altele decât cele care trebuiesc transplantate; totuși pot exista unele distrugeri adiționale sau care pot fi asociate dificultăților cu organul care trebuie trans109863 plantat în continuare, deoarece există biodisponibilitatea organelor de la donori, chirurgia de transplante, adesea, nu poate fi programată ca la o operație de rutină cuprinzând timpul dramatic care este înregistrat cu puțin timp înainte.
în cazul transplantelor de inimă, ficat și plămâni, dacă rejecția este înregistrată, atunci în mod obișnuit nu va fi posibil să se efectueze un retransplant, în acest interval scurt de timp.
în afara dificultăților medicale menționate mai sus, practica de transplant curentă poate include uneori dificultăți sociale. Pe primul loc pot fi situate obiecțiunile religioase privind îndepărtarea organelor de la donorii potențiali, în special la cultele care cred în reîncarnare. Există desigur și alte dificultăți etice și sociale, cum ar fi cele întâlnite la îndepărtarea organelor de la oamenii morți, în special, atunci când consimțământul este necesar în unele țări. în sfârșit, apariția unei concurențe comerciale la donorii de rinichi vii este cauza îngrijorării, în special în țările lumii a treia și ar fi de dorit de a suprima sau reduce acest comerț.
Chirurgia convențională de transplantar, așa cum s-a menționat mai sus cu dezavantajele ei, cuprinde transplantarea de la un animal de o anumită specie (în general omul) la un alt animal de aceeași specie. Astfel de transplantări sunt denumite alogrefe. Datorită dificultăților cu aproxivizionarea acestor alogrefe convenționale, așa cum s-a menționat mai sus, atenția a fost îndreptată către posibilitatea utilizării xenogrefelor în transplantare. Xenogrefarea este un termen generic comun utilizat pentru implantarea țesuturilor, incluzând celule și organe, peste barierele speciilor.
Au fost prezentate deja diferite exemple ale utilizării cu succes a xenogrefelor în programele de înlocuire terapeutice.
De exemplu, anii recenți au fost mărturia utilizării țesuturilor de porc pentru înlocuirea valuri aortice, pielea de porc pentru acoperirea pacienților cu diferite arsuri și vena ombilicală de vite pentru înlocuirea venei grefate. Toate aceste xenogrefe au totuși un punct comun și anume acestea prevăd numai o înlocuire mecanică. Țesutul utilizat este biologic ne-funcțional. Motivul pentru aceasta este că procesele imune existând la om imediat (în minute sau ore), duc la distrugerea integrității celulare a țesuturilor din majoritatea speciilor. Astfel de xenogrefe sunt cunoscute de xenogrefe discordante. Ferocitatea acestei distracții este asociată filogenetic. Astfel, țesutul de la cimpanzei care sunt primate apropiate de om, poate supraviețui în organismul uman cel mult în același fel ca în cazul alogrefelor; astfel de xenogrefe sunt cunoscute ca xenogrefe concordante. în timp ce s-a crezut că xenogrefele concordante ar putea răspunde la dificultățile privind alogrefele, în practică aceasta este considerată un caz. Cimpanzeii sunt mult mai mici decât omul și organele nu sunt în general destul de mari pentru a se putea lucra la oameni. în cazul rinichilor, această dificultate este învinsă prin transplantarea a doi rinichi de cimpanzei care înlocuiesc rinichii defectuoși la om, dar pentru ficat și pentru inimă aceasta în mod dar, nu constituie o posibilitate. Mai departe, rasa de cimpanzei este slabă în natură și puțină în captivitate și solicitarea cimpanzeilor ca animale de experiență în special în era curentă a cercetărilor în cadrai AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome) înseamnă din nou că reprezintă o cerință depășită, în plus, există unele dificultăți sociale pentru acceptarea de către public a utilizării altor primate ca donori de xenogrefe. Atenția a fost astfel îndreptată către xenogrefele discordante. în mod obișnuit s-a crezut că motivul nereușitei atât de rapide a xenogrefelor discordante constă în existenta în speciile primitoare a anticorpilor care se produc natural față de antigenii încă nedefiniți ai speciilor donoare, așa cum se menționează în Shone și colaboratori, Eu109863 rop.Surg.Res., 5,26-36 (1973). Anticorpii sunt găsiți că există la indivizii care nu au avut transmiteri imunologice de la speciile donoare.
Rejecția rapidă cunoscută ca rejecție hiperacută mediată de anticorp a organului grefat este bine documentată. în ultimii ani începând din 1960, când (alogrefele) transplantarea de rinichi devine un tratament de rutină, s-a observat că rinichii transplantați sunt ocazional rejectați de către primitor în timp ce operația este încă în program.
în timpul operației de transplant, rinichiul, de regulă, va deveni roșu și de consistență fermă curând după ce vasele primitorului și donorului sunt suturate împreună. Astfel de transplanțe adesea produc urină aproape imediat în forma rejecției în care grefa este distrusă în timp ce pacientul este încă pe masă (rejecție hiperacută) procesul distructiv începe în primele câteva minute sau după transplantare. Când aceasta se produce, rinichiul devine albăstrui și neuniform și apoi congestionat Consistența organului este așadar alterată. De regulă, grefa devine edematoasă, nu are loc nici o producere de urină și rinichiul nou transplantat este imediat transferat A devenit clar că există un răspuns imunologic umoral imediat între anticorpii de la primitor și antigenii din rinichiul donor. Singura cale de evitare a producerii acestora în alogrefe este verificarea înainte de transplantare ca să nu existe nici un anticorp la primitor față de celulele donoare. Prin cunoașterea crescută a testării pentru astfel de anticorpi (cunoscuți ca perechi încrucișate) a devenit clar că această generalizare că anticorpul de la primitor reacționează față de antigenii de la donor, nu este adevărată și că destrucția grefei hiperacute, când aceasta include transplante între indivizii aceleiași specii, este restricționată la existența unor sortimente specifice de anticorpi cunoscuți ca perechi încrucișate T-warm pozitiv și aproape sigur, acești anticorpi aparțin subclasei Zgff.
în continuare, prezența acestor anticorpi întotdeauna este rezultatul procedeului pre-existent de imunizare fie ca rezultat al transfuziilor de sânge precedente, fie ca rezultat al pregnanței, sau mult mai comun, ca rezultat al transplantului mai înainte nereușit
Mecanismul pentru rejecția xenogrefei hiperacute a fost crezut pe scară largă a fi mult timp același cu mecanismul pentru rejecția hiperacută alogrefă, așa cum s-a menționat mai sus. Literatura privind mecanismul de rejecție a xenogrefei este extensivă, întinzându-se înapoi pe o perioadă de circa 83 de ani în acest timp, numai trei publicații apar ca sugerând mecanismul pentru rejecția xenogrefei care nu cuprinde anticorpi. Sugestia a fost că baza alternativă a activării complementare este implicată în rejecția xenogrefei (altfel nu este necesar să se utilizeze astfel de terminologie). Prima sugestie apare în 1976, din partea lui Schillin, conform datelor din Schilling și colab. Surgery, Gynaecology and Obstretics 142, 29-32 (1976). Sugestia a fost făcută mai târziu de către Miyagawa, conform datelor din Miyagawa și colab. Transplantation 45 (6) 825-830 (1988) și Transplantation Proceedings 21 (1) 520-521 (1989). Totuși, rezultatele nu sunt concluzive deoarece, ambele aceste experimente suferă substanțial de aceeași defecțiune. Modelul ales este revendicat de prezenții autori ca un model de xenogrefă în care anticorpii de la specii încrucișate nu există. Totuși, se pare că analizele utilizate pentru detectarea anticorpilor din specii încrucișate sunt inadecvați și că, concluziile trase din aceste referate sunt bazate pe date inadecvate.
Majoritatea măsurilor luate în mod curent, experimental, pentru evitarea sau reducerea rejecției în xenogrefe includ interferări chimioterapeutice cu sistemul imunitaral primitorului, mai larg, pe bază nespecifică, de exemplu, cu ciclosporina A și alți imunosupresori, prin plasmoforeze, prin tratamentul cu factorul venin de cobră, proteina stafilococului care absoarbe anticorpul și altele asemănătoare. Aceasta pare în mod natural că este urmată de chimioterapie, care este suportul alogrefelor.
Invenția se referă la o genă care codifică cel puțin un factor de restricție complementar și care cuprinde o secvență care codifică cel puțin un factor de restricție complementar omolog al unei specii și una sau mai multe secvențe care permit exprimarea acestei gene întro celulă animală transgenică a unei specii discordante.Pomind de la această genă prin procedee în sine cunoscute, se obține un animal transgenic cu un țesut transplantabil care nu duce la rejecția xenogrefă la transplantare sau expunerea la sistemul imunitar a unei specii discordante. Țesutul de grefare și care aparține unei specii discordante față de primitor, se asociază cu unul sau mai mulți factori de restricție, omologi activi (HCRF).
Această invenție, adoptă o apropiere de radicali diferiți în locul interferențelor nespecifice cu sistemul imunitar al primitorului, invenția fiind capabilă de coadministrarea materialului care are efectul donorului de grefe care se referii la el însuși prin anumite componente ale sistemului imunitar al primitorului. Conform unor întruchipări speciale, țesutul donor el însuși este modificat pentru a apare imunologic ca primitorul.
S-a descoperit, de asemenea, că rejecția xenogrefei hiperacute nu este necesară a fi mediată de anticorp. Aceasta provine de la două observații: prima, în absența anticorpului dar în prezența complementului, când rejecția hiperacută este observata; a doua, în prezența anticorpului, dar în absența complementului, când nu se observă rejecția hiperacută.
Invenția este bazată pe descoperirea că activarea complementului este preeminentă în destrucția hiperacută a xenogrefei dacă sau nu această activare este ajutată prin legarea unor molecule de anticorpi corespunzătoare. Activarea unei baze alternative a complementului poate fi indusă printr-o varietate de produse celulare. Aceste produse nu au restricție la celulele străine invadatoare, cum ar fi, de exemplu, bacteriile sau xenogrefele, dar acestea există pe multe celule. Astfel, în principiu, multe celule ale unui individ ar putea activa baza alternativă a complementului, cauzând masive destrucții auto-imunitare. Când aceasta nu se întâmplă, se datorește existenței unui număr de proteine complementare care rezultă în mod natural pentru reglarea inferioară, prezente în aer și la suprafața celulelor. Aceste molecule (factori de restricție homologj complementari) sunt pentru prevenirea completei activări a însuși complementului, fie prin baze clasice sau alternative prin produsele cu aceste celule, fiind astfel prevenită distrugerea autoimună a acestor celule. Funcționarea acestor celule este elegant ilustrată în hemoglobinuria nocturnă poroxismală. în această maladie, membrana ancher a cel puțin unei molecule este absenta (factorul de accelerare a descompunerii). Astfel, proteina nu este reținută în membranele celulare eritrocitare și se detașează de celulele care activează ca bază alternativă a complementului și care apoi sunt lizate și astfel este cauzată hemoglobinuria.
Conform unui prim aspect al prezentei invenții, se face referire la metoda de transplantare a țesuturilor animale la primitor, în care țesutul este derivat de la un donor de specii diferite în raport cu primitorul, speciile de donor fiind specii discordante față de primitor. Metoda menționata cuprinde grefarea țesuturilor la primitor și se prevede asocierea cu țesutul de grefare a unuia sau mai multor factori de restricție complementari, omologi activi, la speciile de primitori, pentru prevenirea activării complete a complementului.
Termenul de țesut este utilizat în această specificație, însemnând orice material biologic care este capabil să fie transplantat și include organe, în special, organele interme vitale cum ar fi, de exemplu: inima, plămânul, ficatul și rinichiul, pancreasul și tiroida, corneea, pielea, vasele de sânge și alte țesuturi conective, celulele incluzând celule sanguine și celule hematopoietice, insulele lui Langerhans, celulele nervoase și celulele din glandele endocrine și din alte organe și fluide din organism (cum ar fi PPF), dintre care toate pot fi candidate pentru transplantarea de la o specie la alta.
O specie discordantă este o specie (în general vascularizată) de xenogrefă de la care, la primitor în mod normal apare rejecția hiperacuta, adică o rejecție în timp de minute sau ore și nu zile, așa cum se menționează în Câine Transplant Proc. 2; 550, 1970. Astfel de rejecții hiperacute sunt cunoscute la fel ca cele din referatele de specialitate, a fi sub 6 h sau chiar sub o oră după transplantare.
Complementul și activarea acestuia se cunosc bine și sunt descrise în Rotit, Essentiallmmunologyed.V 1984, Blackwell Scientific Publica ti ons, Oxford. Activarea descrisă pentru complement C’ depinde de acțiunea a nouă componente de proteine (CI până la C9) acționând în secvență din care prima constă din trei subfracțiuni majore denumite Clq, Cir și Cls. Complementul poate fi activat prin metoda de baza clasică, sau alternativă, ambele metode fiind descrise pe scurt în continuare. Astfel, în metoda de bază clasică, anticorpii se leagă la CI, ale cărui subunități Cls formează activarea esterazei și leagă aproximativ activitatea și transferul la părțile de pe membrană sau la complexul imun, mai întâi la C4 și apoi la C2. Acest complex are o activitate C3-convertază” și desface C3 în soluție pentru a produce un fragment îngust de peptide C3a și o moleculă reziduală C3b, care au funcții foarte distincte. C3a are o activitate de anafilatoxină și nu mai face parte din cascada de amplificate a complementului C3b este membrana legata și poate produce aderența imună a complexului
C5b-anticorp antigen, facilitând astfel fagocitoza ulterioară.
în metoda de baza alternativă, activitatea convertazei C3 este efectuată de C3bB a cărui activitate poate fi declanșată de agenți extrinseci, în special, polizaharide, ca de exemplu, endotoxine acționând independent de anticorpi Convertaza este formată prin acțiunea factorului D asupra complexului C3b și factorului B. Acesta formează un ciclu de reacții pozitive în care produsul C3 descompus (C3b) ajută la formarea enzimei de clivaj. în ambele metode clasice și alternative prezentate mai sus, nivelul de C3b este menținut prin acțiunea «activatorului C3b (Factorul 7). C3b se combină în mod real cu factorul H pentru a forma un complex care este descompus de factorul I, pierzând astfel proprietățile hemolitice și de imunoaderență.
Cele două metode de bază clasică și alternativă sunt comune după stadiul C3. C5 este rupt pentru a da C6a și C5b sub formă de fragmente. C5a are o activitate anafîlatoxinică și duc la creșterea chemotaxiei polimerilor. C5 se leagă ca, complex cu C6 și C7 pentru a forma porțiuni tennostabile pe membrana care completează componentele finale C8 și C9 pentru a genera MAC complexul de atac al membranei. Aceasta este o structură anulara înserată pe membrană și de la care este proiectată și care formează un canal transmembranal complet permeabil la electioliți și apă. Datorită presiunii osmotice coloidale interne ridicate, există un influx net al ionilor de sodiu și apoi, care duce la liza celulelor.
Factorii de restricție complementari omologi (HCRFs) utilizați în prezenta invenție, pot în generat să interfereze cu orice parte a cascadei de activare complementară. Un factor de restricție complementar omolog interferează numai cu acea parte care este constituită după metoda clasică de bază sau numai cu partea care este constituită după metoda alternativă de bază, sau mult mai uzual poate interfera cu partea care este comună la ambele metode de baza clasică și alternativă. Se preferă ca factorul de restricție complementar omolog de reglare, să interfereze cu partea comună a acestei baze. Factorul de restricție complementar omolog poate fi identic cu factorul de restricție complementar omolog natural sau simplu poate avea o funcție apropiată. Factorii de restricție complementari omologi sintetici și semisintetici incluzând pe cei preparați prin tehnologia acidului dezoxiribonucleic DNA recombinam și variantele preparate pe de altă parte, sunt incluși în termenul de HCRF factori de restricție complementari omologi
Așa cum s-a menționat mai sus, factorii de restricție complementari omologi sunt substanțe care reglează acțiunea cascadei complementare, astfel ca să se reducă sau să se prevină activitatea lor lirică; aceștia sunt utilizați de corpul animal pentru marcarea țesuturilor individuale pentru a evita reacția autoimună. în această invenție, este posibil în principiu pentru factorul de restricție complementar omolog HCRF să fie cu legătura la membrană sau liber în aer, așadar în practică este preferat a avea factorul HCRF legat de membrană pe celulele țesutului xenogrefel în acest fel, este mai ușor pentru acest factor HCRF sa fie în asociere cu țesutul grefat De preferință, acești factori HCRF includ factorii de membrană a celulelor putarive incluzând receptorul C3b/C4B (CRI), receptorul C3.dg (CR2), factorul de accelerare a descompunerii (DAF), inactivatorul C3b și proteina cofactor de membrană (MCP). Acești factori HCRF putativi din aer includ factorul H, factorul de accelerare a descompunerii (DAF) și proteina de legătură C4 (C4bp). Acești factori HCRF au toți activitate de reglare inferioară a activității complementului prin interferența în stadiul C3. Factorul de restricție omolog (HRF), care se blochează la C8, este așadar un factor de membrană probabil. Multe, dar nu toate genele pentru acești factori HCRF con venabili, sunt localizate la locul RCA de reglare a activării complementului este prevăzut pentru legarea q 32 la cromozomul 1, așa cum este descris în ReyCampus și colab. J.Exp.Med. 167, 644669 (1988).
S-au făcut așadar, unele confuzii cu nomenclatura și localizarea factorilor HCRF, iar factorii C4BP, CRI, DAF și factorul 77sunt identificați de către ReyCampus și prin alte studii recente Rey-Campus și colab. (loc.cit.) și J.Exp.Med. 166,246-252(1987). Proteina cofactor de membrană (MCP) este tratata de către unii specialiști ca fiind sinonime cu proteina de legătură C4 (C4bp) și acești doi factori sunt, fie înrudiți, fie identici, așa cum este menționat în Rether și ΊΠ11 The Complement System, Springer-Verleg, Berlin 1988 în care sunt descriși factorii de reglare ai C3 convertazei în secțiile 7,2,3 și 2; acești factori egalează legătura C4 a proteinei (C4bp) cu factorul de accelerare a descompunerii și factorul H cu proteina B1H și acceleratorul inactivator C3b. Nu este nici o îndoiala în ceea ce privește nomenclatura, localizarea și caracterizarea factorilor HCRF, care continuă să se dezvolte, dar este de înțeles că prezenta invenție contemplează utilizarea tuturor factorilor HCRF ca fiind convenabili și dictați de preferința.
Alte preferințe privind factorii HCRF sunt următoarele: factorul Icunoscut mai înainte ca factor inactivator C3b sauKAF, conform datelor din Tamara & Nelson J.Immunol. 99, 572-589 (1967) și factorul H Pangbum și colab. J.Exp.Med. 146,257-270 (1977); proteina de legătură C4 Fujita și colab. J.Exp.Med.148,10441051 (1978) DAF cunoscută așadar ca CD55 Nichelson-Waller și colab. J.Immunol.129,184 (1982) Proteina cofactor de membrană MCP, așa cum este cunoscută ca CD46 și descrisă mai întâi ca gp 45 și apoi cunoscută ca gp 66/56 Seya și colab. J.Exp.Med.163, 837-855 (1986); CRI cunoscut așadar ca CD35 Medof și colab. J.Exp.Med.156, 1739109863
1745 (1982) și Ress și colab. J.Immunol.129,2051-2060 (1982)”; CR2 cunoscut așadar ca CD21, receptorul 3d/EBV și pl 40 Iida și colab. J.Exp.Med.158,10211033 (1983) și Weis și colab. PNAS 81, 881-885 (1984). Distribuția tisulară a unor proteine RCA este după cum urmează:
CRlz Membrana (limitată); eritrocite; monocite; majoritatea celulelor B și unde din celulele T; leucocitele polimorfonucleare; celulele dendritice-foliculare; podocitele glomerulare;
CR2: Membrana (limitată); majoritatea celulelor B; celulele dendritice foliculare; unele celule epiteliale și câteva linii celulare T;
MCP: Membrana (largă); toate celulele sanguine periferice (dar eritrocite); liniile celulare de fibroblaști și celule endoteliale; trofoblaștî și sperma;
DAFz Membrana (largă); toate celulele sanguine periferice; liniile celulare de fibroblaști și celule endoteliale; trofoblaștî și sperma;
C4bp: Plasma; sinteza ficatului și H; plasma; sinteza ficatului; liniile celulare de monocite și fibroblaști.
După cum proteinele sunt cuprinse în factorii de restricție homologi la nivelul complexului membranei de atac, utilizarea acestora este așadar contemplată prin mijloacele prezentei invenții, existând, în general, o relație sub formă de secvență de proteină (dar nu este încă nici o dovadă) care confonn proteinelor 65KDa (sau altor proteine asemănătoare) sunt identice; în literatura de specialitate Schănermark și colab. J.ImmunoL136, 1772 (1986), este descrisă legătură C8 a proteinelor; factorul omolog de restricție HRF Zalman și colab. Immunology 83, 6975 (1986) și proteina de inhibiție MAC (MIP) Watts și colab. 1988 sunt, de asemenea, descriși.
Proteina C8bp/HRF/MIP este atașată la suprafața celulelor cu ajutorul anchorului glicolipidic, cum ar fi CD59 și DAF-, aceste proteine sunt cunoscute a fi funcțional absente în hemoglobinuria nocturnă paroxismala; o proteină 18-20 kDa, este așadar implicată la nivelul MAC. Următoarele se cred a fi identice (dar pot fi și accidentice); așa cum este menționat în: P-18 Sugita și colab. J.Biochem. 104, 633 (1988); HRF-20 Okada și colab. Intl.Immunol. 1 (1989); CO59 Davies și colab. J.Exp.Med.sepL 1989; și inhibitorul de membrană a lizei reactive (MIRL) Hologuin și colab. J.Clin.Invest 84, 7 (1989).
Evidența pentru identitatea probabilă a acestor proteine este că proteina și/sau secvențele de cDNA pentru CD59 și HRF-20 arată a fi identice; probabil că sunt aceleași cu P-18/MIRL. Ar fi de notat că exista o oarecare omologie a secvenței CDS9ÎHRF-20 cu cea a antigenului murinic LY- 6, care este implicat în activarea τ-celulelor, așa cum se arată în Greny și colab. J.Immunol.142, 3013 (1989). SP-40, 40 este așadar implicat în reglarea MACy așa cum, de asemenea, este menționat în Kivazbaum și colab. EMBO 8, 711 (1989).
Se preferă ca HCRF să interfereze cu activarea complementară la stadiul C3. Ambii compuși MCP și DAF blochează reacția pozitivă în metoda de bază alternativă a activării C3 și acestea constituie factorii HCRF preferați. Factorul HCRF este prevăzut a fi în asociere cu țesutul grefat Aceasta înseamnă că HCRF este administrat astfel ca țesutul grefat să fie marcat ca atare, dar alte materiale străine cum ar fi, de exemplu, bacteriile de invazie, nu sunt atât de semnificativ marcate. Este posibil să se simplifice administrarea parenterală, cu cea locală la țesutul grefat cu unul sau mai mulți factori apropiați J/CRF. Totuși în practică aceasta nu se preferă deoarece există dificultatea de a se cauza localizarea adecvata a HCRF la țesutul grefat și datorită altor dificultăți ca factorul HCRF să poată fi administrat repetat la primitor după grefarea care a avut loc; totuși, aceasta poate fi depășită prin utilizarea sistemelor de eliberare a specialiștilor farmaceutici.
în general, este mult mai convenabil să se prevadă factorul HCRF în așa fel, ca acesta să fie integrat cu membrana celulară a țesutului donor. Așadar, pot exista unele infecții benigne ale țesuturilor transplantate care ar putea cauza exprimarea, prin caile cele mai preferate pentru a se realiza aceasta la sfârșit, pentru țesutul donor care trebuie să fie transgenic, astfel ca să conțină și acidul nucleic exprimat codificat pentru unul sau mai mulți factori activi HCRF la speciile primitoare când aceștia sunt grefați la primitor. Astfel de țesuturi transgenice pot să continue exprimarea ca HCRF indefinit Factorul HCRF poate fi genetic derivat de la speciile primitoare sau mai puțin preferabil de la speciile primitoare înrudite pentru care xenogrefele concordante pot fi posibile. Așadar, în principiu țesutul donor transgenic poate fi provenit din culturile celulare, de preferință pentru țesutul donor care provine de la animalul transgenic. La animalul transgenic factorul HCRF ar putea fi exprimat (sau ar putea fi capabil de exprimare) cel puțin în țesutul care trebuie transplantat de preferință. Totuși, chiar dacă aceasta nu este esențial, așa cum ar putea fi posibil, factorul HCRF se poate lega la membranele celulare ale țesutului donor prin orice agent de legătură sa receptor (așa ca de exemplu anticorpul monoclonal hibrid) conform Milstein & Culele Nature 305, 537 (1983)”. Speciile primitoare vor fi în primul rând umane, dar nu în exclusivitate. Alte primate pot fi receptori convenabili, ca și multe alte specii când din punct de vedere economic și etic este permis. Speciile donoare pot fi orice specii convenabile care sunt diferite de speciile primitoare și care, având în vedere fiziologia speciilor primitoare sunt capabile să furnizeze țesuturi corespunzătoare pentru transplantare. Pentru primitorii umani, se are în vedere că donorii de tipul porcilor sunt convenabili, dar și orice altă specie poate fi convenabila.
Conform unui al doilea aspect al prezentei invenții, se face referire la celulele animale grefabile sau la țesuturile animale grefabile ale speciilor donoare, celulele sau țesutul fiind asociat cu unul sau mai mulți factori de restricție complementari omologi activi la speciile intenționate ca primitoare, pentru prevenirea activării complete a complementului, speciile donoare fiind specii discordante cu referire la speciile primitoare.
Conform cu cel de-al treilea aspect al prezentei invenții, se face referire la animalul transgenic având țesut transplantabil, care nu duce la creșterea rejecției xenogrefei în transplantarea sau expunerea la sistemul imunitar a cel puțin o specie discordantă. O specie discordantă este una care în mod normal ar determina rejecția hiperacută a xenogrefei de la animal. Invenția mai cuprinde astfel utilizarea țesutului animal derivat de la speciile donoare și unul sau mai mulți factori de restricție complementari omologi activi de la speciile primitoare, în care speciile donoare sunt specii discordante față de speciile primitoare, la prepararea țesutului grefabil la speciile primitoare.
Conform unui al patrulea aspect al prezentei invenții, se face referire la animalul transgenic având celule capabile de exprimare a factorilor de restricție complementari omologi la alte specii. Factorul de restricție complementar omolog va fi în general activ la speciile care sunt discordante față de speciile de animale transgenice. Celulele pot fi de un țesut special, cu preferință descris în raport cu primul aspect al prezentei invenții sau mai mult de un țesut sau toate țesuturile. Astfel de animal transgenic poate fi privit ca o colecție de celule netransformate (în sensul neproliferativ).
Conform celui de-al cincilea aspect al prezentei invenții, se face referire la celulele animale netransformate capabile de exprimarea unui sau mai multor factori de restricție complementari omologi activi în speciile care sunt discordante cu referire la celulele animale.
Conform celui de-al șaselea aspect al prezentei invenții, se face referire la acidul dezoxiribonucleic recombinant, DNA, cuprinzând DNA codificat pentru cel puțin un factor de restricție complementar omolog și una sau mai multe secvențe care permit codificarea acidului dezoxiribonucleic DNA care trebuie exprimat printr-o celulă netransformată. Celula animală poate fii o celulă a animalului transgenic care încorporează genetic construcția. Ca o alternativă, celulele pot fi o cultură de oigane sau alte țesuturi cum ar fi, de exemplu, insulele Langerhans.
Conform celui de-al șaptelea aspect al prezentei invenții, se face referire la construcția genetică convenabilă pentru încorporarea în materialul genetic al unui animal, pentru a produce un animal transgenic, construcția cuprinzând acidul dezoxiribonucleic, DNA, codificat pentru cel puțin un factor de restricție complementar omolog și una sau mai multe secvențe care permit codificarea acidului dezoxiribonucleic DNA să fie exprimat în cel puțin unele celule ale animalului transgenic care încorporează construcția. Astfel de construcții genetice pot fi sub forma unui mini-cromozom cunoscut ca YAC. Așa cum s-a menționat mai sus, factorul de restricție complementar omolog va fi în general activ în speciile care sunt discordante cu referire la speciile de animal transgenic.
Conform celui de-al optulea aspect al prezentei invenții, se face referire la o metodă de obținere a animalului transgenic» metoda cuprinzând încorporarea în materialul genetic animal a cel puțin unui factor de restricție complementara omolog și a uneia sau a mai multor secvențe care permit codificarea acidului dezoxiribonucleic DNA care trebuie exprimat tn cel puțin câteva celule ale animalului transgenic.
Metodele de producere a animalului transgenicau devenit în general răspândite și fazele detaliate care trebuiesc realizate sunt utilizate în prezent în mod convențional în domeniul de specialitate. De exemplu, WO-A-8800239 descrie fazele necesare în principal pentru construcția animalului transgenic. Metoda actuala de încorporare a construcției în celulele animalului transgenic poate fi realizată prin micro-injectare, prin încorporarea spermei mediate sau orice altă metodă convenabilă. Manipularea genetică preliminară poate fi efectuată așa cum se preferă în general, într-o celulă procariota. Acidul dezoxiribonucleic codificat DNA pentu factorii HCRF este corespunzător în formă de cDNA sau poate fi dedus utilizându-se tehnici de donare convenționale. Addul dezoxiribonucleic DAM codificat pentru factorul de accelerare a descompunerii (DAF) este probabil cel mai bine caracterizat și a fost descris în referatele de specialitate Medof și colab. PNAS 84, 20072011 (1987). De asemenea, referatele de specialitate Rey-Campos și colab. (1988) (loc.ciL), EP-A-0244267 conțin o hartă fizică a clusterului genei RCA. NaâaBteăeDAF și prepararea lor prin tehnologia acidului dezoxiribonucleic recombinant DNA sunt, de asemenea, descrise în Rey-Campos și colab. (1988) (locxit), EP-A-0244267’ acești varianți fiind utilizați în prezenta invenție.
Datorită unei caracterizări mai bune a produselor genetice ale DAF și a secvențelor cunoscute de cDNA codificat DAF, DAF constituie un factor de restricție complementar omolog preferat Alte caracteristici preferate ale aspectelor doi până la șapte ale prezentei invenții sunt la fel ca pentru primul aspect, mutatis mutandis.
în continuare, prezenta invenție, este ilustrată prin următoarele exemple, în care se fac referiri la fig.l...l8, care reprezintă:
- fig. IA... IE, arată succesiv semnele ECC pentru inima grefată de iepure la porci neonați, conform exemplului 1;
- fîg2» arata rezultatul rodioimunoanalizei indicând, câ porcii utilizați în exemplul 1, nu au cantități semnificative de anticorpi de antispecii;
- fig.3, arată anumite etape ale electroforezei proteinei, așa cum s-a utilizat în exemplul 4;
- fig.4, arată anumite faze ale electroforezei bidimensională încrucișată, așa cum s-a utilizat în exemplul 4;
- fig.5, arată 2D-Recketa care rezultă din exemplul 4;
- fig.6, arată rezultatul analizei de liză celulară cu eliberare de cromiu, așa cum s-a menționat în exemplul 5;
- fig7, ilustrează titrurile anticorpilor litici anti-hamster de la primitorul șobolan al grefei de inimă de hamster, cu pre-transplante (o zi) și post-transplante în zilele 5, 7 și 9, așa cum s-a descris în exemplul 6;
- fig-8, arată reprezentarea grafică a fracțiunilor de G200; histograma ilustrează titrele în fiecare fracțiune de anticorpi litici anti-hamsteri de la șobolanul primitor al inimii de hamster, așa cum s-a descris în exemplul 6;
- fig-9, arată pata sudică a acidului dezoxiribonucleic DNA extras din T5, blO și DB3 ca linii celulare, așa cum s-a descris în exemplul 7;
- fig. 10, arată figurile 51 Or ca indicative ale liniei celulare umane T5, așa cum s-a descris în exemplul 7, aceste celule fiind lizate de complementul de iepure și nu de complementul uman în prezența anticorpilor anti-umani la porc;
- fig. 11, arată figurile declanșate, indicative pentru anticorpii umani nereușiți pentru liza liniei celulare umane T5, fie cu complement uman, fie de iepure, așa cum s-a descris în exemplul 7;
- fig. 12, arată figurile 51 Cr care se desprind și care demonstrează că anticorpii umani pot liza hibridoma șoareceșoarece (DB3) în prezența ambilor complemenți uman și de iepure, așa cum s-a descris tu exemplul 7;
-fig 13, arată 51 Creare este desprins, ilustrând că linia celulară de hibrid umanșoarece B 10 este lizată de anticorpii umani în prezența complementului de iepure, dar care nu este lizată de anticorpii umani în prezența complementului uman, așa cum s-a descris în exemplul 7;
- fig 14, arată absorbția adeninei 3H (calculat pe minut) de către celulele CHO, arătând că aceste celule sunt distruse de aerul imun de șobolan în prezența complementului uman sau a complementului de iepure, așa cum s-a descris în exemplul 8;
- fig. 15, arată absorbția 3H adeninei calculat pe minut, de către celulele CHO transfectate cu MCP uman, arătând că aceste celule sunt distruse de aerul imun de șobolan în prezența complementului de iepure, dar nu sunt distruse de acest aer imun de șobolan în prezența complementului uman, așa cum s-a descris în exemplul 8;
- figl6, arată 2D rockets care arata că în circumstanțele descrise în legătură cu fig 15, componentul C3 al complementului uman nu este clivat de la C3b, așa cum este descris în exemplul 8;
- figl7, arată figurile 51 Cr ca indicative pentru fibrobjaștii de șoarece 3T3 fiind lizați prin anticorpii produși natural în prezența complementului umanși a efectului de protecție al expresiei MCP umane prin celulele de șoarece;
- fig. 18, arată analiza unei urme de pată a acidului dezoxiribonucleic DNA la șoarecele transgenic de generația a doua, utilizându-se ca probă MCP cDNA (superior) marcat sauDAFcDNA marcat
Exemplul 1. Rejecfia xenogrefei are loc în absența vreunui anticorp de antispecie în general, animalele nu pot supraviețui fără circulația imunoglobulinelor. Acestea sunt produse de către limfocite în răspunsul la stimulii antigenict în viața neonatală, totuși imunoglobulinele materne transferate pasiv, acționează ca substituire temporară pentru anticorpul/ acesta auto-produs. Aceste imunoglobuline transferate pasiv, conferă protecție la tineret deoarece prima experiență imună este dobândită. La mamifere, acest transfer pasiv al imunoglobulinelor materne se produce de obicei, atât transplancental, cât și prin colostrum. La câteva specii totuși, structura placentei este, astfel ca nici un anticorp matern să poată fi transferat pe această cale. Porcul este una dintre aceste specii. Toți anticorpii materni se obțin din colostrum. Astfel, purceii presugari, nou născuți sunt în principiu liberi de imunoglobulină. Porcii albi mari, sunt luați la naștere și plasați în cuști de lemn încălzite cu vase de apă caldă fără să fie lăsați să sugă. Doi purcei de la fiecare serie de purcei născuți odată, sunt luați pentru fiecare experiment Aceste animale cântăresc aproximativ 1 kilogram la naștere.
Iepurii albi Baby New Zeeland cântăresc aproximativ 300 g, sunt utilizați ca donori. Acești donori sunt anesteziați cu hipnel și diazepan, apoi cușca este deschisă și vena cavă este canulată cu ajutorul acelor de măsura 19. La temperatura de plus 4°C la rece, cardioplegia este infuzată până ce inima se oprește să bată și a devenit perfuzată. Se aplică extern răcirea cu cardioplegie rece direct din seringă* Inima iepurelui este apoi îndepărtată utilizându-se tehnici chirurgicale standard și apoi sunt păstrate într-o soluție de cardioplegie, la temperatura de plus 4°C, cât este necesar. S-a descoperit ca este necesar să se ia aceste precauții, deoarece inima iepurelui este probată a fi foarte susceptibilă la tulburări ischemice. Porcii primitori sunt anesteziați inițial prin inhalare de Halotan/02. Un ac de tip fluture intravenos de măsura 23 este apoi înserat în vena mamară, anestezia fiind menținută prin administrare de ketaamina intravenos. Porcul este menținut simultan hidratat cu o soluție salină administrată intravenos. Serul și probele de acid etilen-diaminotetraacetic EDTA cu sânge sunt scoase pentru pretransplantare. Inima de iepure este grefată la gâtul porcului după metoda Heron, așa cum este menționat în Heron, Acta Pathol.Microbiol.Scand.79, 366-372 (1971). Aorta este anastomozată de la capăt la părțile (6-0 prolene) spre artera carotidă și artera pulmonară este anastomozată spre vena jugulară. Toate vasele cardiace care au rămas sunt ligate. Inimile încep să bată în câteva minute de la îndepărtarea clemelor. Ritmul cardiac este monitorizat cu ajutorul unui sistem diascop/monitor ECG. Gâtul porcului nu este închis în timpul experimentelor, iar inimile sunt menținute umede prin acoperire cu un film adeziv. Rezultatele ECG sunt prezentate în fig. IA... IE. Linia trasată în fig. IA, arată o bătaie normală a inimii imediat după transplantare. Insuficiența începe după circa 20 min mai tâiziu (fig.lB) și în timp de o oră nu există nici o bătaie detectabilă a inimii evidențiată prin rejecție hiperacută. Acest exemplu demonstrează astfel, că rejecția hiperacută a xenogrefelor discordante are loc chiar în absența anticorpilor.
Exemplul 2. Porcii neonatali utiliza fi în exemplul 1 nu au anticorpi antispecii
Ig£r de iepure anti-porc este radicidurat prin metode cunoscute Greenwood și colab. Biochemical Journal 89, 114123 (1963), modificat de Devies și Hcward - nepublicat. Următoarele substanțe sunt adăugate în tubul de polistiren (LP2 6x1 cm) într-o succesiune rapidă:
25-50 μΐ de proteină (la 1 mg/ml concentrație 3-4 μΐ de Na125 I (100 mCi/ml).
μΐ cloramină T (+ 4 mg/5 ml; 0,5M) + înseamnă că trebuie să fie proaspăt preparat înainte de utilizare.
Aceste componente sunt lăsate să fie amestecate timp de 30 s cu agitare continuă. Se adaugă apoi rapid următoarele: 50 μ\ DL-tirozină (soluție saturată în 0,5 ml de fosfat de sodiu soluție tamponată la pH=7,5); 300 μΐ 2% BSA/PBS/azidă. Proteina marcată este apoi separată din soluția de iod nereacționată prin utilizarea unei coloane mici de 80 cm x 1,0 cm de Sephadex G-25, gradul mediului fiind preparat în amestec de PBS și azidă.
Amestecul de reacție iodurat este transferat cantitativ pentru prepararea coloanei G-25 și eluat cu amestec de
PBS și azidă. Fracțiunile (șase) sub forma de picături sunt colectate în tuburile de polistiren (LP2). Coloana este apoi eluatii până ce ambele proteine și iodura ( 25 I) ca maxime, au fost eluate și apoi este măsurată radioactivitatea în toate fracțiunile. Radioactivitatea încorporată în proteină poate fi calculată astfel:
- calculul de radioactivitate în proteină = cantitatea totală originală cantitate radioactivă din maximele de iod.
IgQ radiomarcat (se referă la izotop) este apoi utilizat într-o analiză pentru anticorpii de porc, la porcii neonatali, astfel:
Materiale: PBS 4- 0,01% azidă - oxoid; PBS/BSA 1% BSA - Sigma; izotopul de iepure anti-porc IgG molecula întreagă cu 12-18 x IO3 impulsuri pe minut; era încălzită inactivată (56°C, timp de 30 min); probe de sânge anticoagulant
Metoda: o suspensie de 1% celule roșii sanguine de iepure în PBS se prepară în PBS/BSA de la porcul adult (control pozitiv), porcul neonatal (probă de testare) sau iepure (control negativ); 0,025 ml cantități se adaugă la pastilele cu celule roșii în duplicat Tuburile sunt incubate la temperatura de 4°C, timp de 4 h.
După incubare, tuburile sunt spălate de trei ori în amestec de PBS și BSA. Se adaugi apoi 0,05 ml de izotopi la fiecare tub și se incubează peste noapte la temperatura de 4°C.
Tuburile sunt apoi respălate de trei ori timp de un minut Se face calculul realizat cu ajutorul unui gamma-counter.
Rezultatele sunt calculate ca numărul de impulsuri pe minut în raport cu titrul.
Rezultatele obținute sunt prezentate în fig.2. Serul de iepure este utilizat ca, control negativ și serul de porc adult (sau de la sugari) ca, control pozitiv. Este de observat că nivelul anticorpului la porcii pre-sugari 2, este comparabil cu cel de la controlul negativ.
Exemplul 3. Demonstrarea relevantei complemâauhâ C3 la destrucțiaxenogrefei
Complementul deficient de la cobai, derivat de la diferite specii, așa cum este menționat în Burger și colab. Eur.J. Im mu noi. 16,7-11 (1986), este grefat pe inimi, utilizând în esență aceeași tehnică ca cea descrisa pentru xenogrefele de la iepure la porc din exemplul 1. Șobolanii sunt anesteziați prin inhalarea de eter și inimile sunt răcite cu cardioplegia și excizate așa cum s-a descris mai înainte. Donorii cobai sunt anesteziați prin administrarea intravenoasă de valium și intramusculară de hipnol. Inimile sunt implantate în gâtul animalului așa cum s-a descris mai înainte. Pentru controlul cobailor, de exemplu, se consideră cei cu nivele complementare normale, rejecția de grefă având loc în mod normal în câteva minute, astfel nefiind necesar să se închidă gâtul. La animalele de experiență, gâtul este închis și inimile sunt monitorizate prin două palpitații zilnice. Valorile de ECG normale sunt observate la câteva ore după intervenția chirurgicală, neindicându-se vreo rejecție hiperacută.
Exemplul 4.A.Limfocitele de porc și celulele de rinichi utilizați în metoda de baza alternativă pentru complementul uman activat
Conform tehnicii descrise în referate de specialitate de Grabar și WiUiams Grabar și Williams, Biochem. Biophys. Acta 10,193 (1953), gelurile de agaroză 1 sunt turnate pe discuri de sticlă de 8 x 8 cm (vezi fig.3). Este necesar un amestec de gel de 10 ml și acesta constă din 5 ml de agaroză de 2% și 5 ml de veronal tamponat (VB), (VB este format din 75 mM natriu barbiton, 10 mM acid etilendiaminotetraacetic EDTA și 10 mM NaN3 la o valoare de pH de 8,5). Agaroza Și VB sunt amestecate la un loc la temperatura de 60°C, chiar înainte de utilizare. Gelurile sunt turnate și răcite pe platforma de nivel. Când este stabilit, gelul constă dintr-un procent de agaroză și are o adâncime de aproximativ 1,5 mm.
Trei cavități cu diametrul de 3 mm sunt realizate la aproximativ l cm de la capătul gelului. Fiecare cavitate ar putea conține aproximativ 8 μ\ de probă experimentală. Proba nu are o preparare specială care prevede adiția unei cantități sufidente de bromfenol pentru a o colora. După aplicarea probei, gelul este plasat cu atenție pe platformă la rezervorul de electroforeză Dopuri de bumbac umezite în VB (tamponul utilizat), sunt ușor presate de-a lungul maighii gelului aproa pe de cavitate și alt dop este presat pe maiginea opusa agarozei (este important să se asigure că, capetele dopurilor sunt cufundate în rezervoarele cu amestecul tampon). Curentul de 25-30 mA este apoi trecut prin gel până când albumina (vizualizată cu bromfenolul legat) ajunge la dopul (anodul) pozitiv. Procedeul necesită un timp de aproximativ 2 h și 30 min. Dacă două sau mai multe geluri trebuiesc prelucrate simultan și în paralel apoi curentul este aplicat, acesta trebuie crescut corespunzător astfel ca, curentul aplicat sa fie de o intensitate ca cele două geluri să aibă valori necesare de 50 mA și trei geluri sa fie la valoarea necesară de 75 mA și așa mai departe.
Când electroforeză este completă, așa cum s-a indicat printr-o traiectorie a markerului 9 de albumen vizualizat cu albastru de bromfenol, atunci gelul este îndepărtat din rezervorul de electroforeză.
B.Imunoelectroforeza încrucișată 2dimensională (2-D rochefi)
Benzile numărul 11 (fig.4) conținând proteinele electroforezate de la (A), sunt tăiate și întinse la un capăt al unui nou disc de sticlă 13. Un amestec format din părți egale de 15 agaroză 2%: VB conținând aproximativ 1% antiser din proteina care trebuie vizualizată, se toarnă peste disc și se lasă în repaos. Se adaugă antiser la amestecul de agaroză și VBS când acesta s-a răcit la o temperatură de aproximativ 50°C. Discul rocket este apoi electroforezat așa cum s-a descris mai sus, capătul gelului conținând benzile de dimensiunea 1 conectate prin dopul de bumbac la electrodul negativ (catod) 17 și capătul opus este conectat la anodul 19. Gelurile sunt electroforezate peste noapte la un curent dependent de mărimea gelurilor; 10 mA este necesar pentru fiecare lungime de 8 cm de gel astfel ca gelul cu lungimea de 16 cm necesită 20 mA de curent și așa mai departe. Proteinele sunt separate prin electroforeză în prima dimensiune și cuantificată și vizualizată prin electroforeză în dimensiunea secundă, cu colorare pentru scopul vizualizării așa cum se descrie mai departe.
C. Geluri zdrobite și colorate
Acest procedeu este același pentru imunoelectroforeza convențională sau pentru rockeți. Gelul care trebuie colorat este acoperit cu un strat de POSTIJP fără fibre (denumirea comercială), hârtie (Adlard Evans și Co.), preumectat cu apă. Acesta este apoi acoperit cu 6 straturi de hârtie absorbantă. Ansamblul este strâns timp de o oră, după care toată hârtia este îndepărtată și procedeul este repetat După o a doua operație de zdrobire a gelului, acesta este uscat sub un curent cu aer cald și apoi se absoarbe în PBS cel puțin o oră pentru a se îndepărta proteinele neprecipitate. Gelul este uscat din nou și colorat timp de 10 min în soluție de 0,5% greutate la volum cu coomasie brilliant albastru G2 50,45% H20,45% metanol și 10% acid acetic. Gelul este apoi decolorat prin spălare continuă cu metanol de 20%, acid acetic 6% până ce partea inferioară este clară. în final gelul este uscat la aer cald.
Fig.5 este o reproducere a gelului uscat Rocketul (1) este un control negativ conținând 50 μΐ de ser uman (HHS) plus 25 μ\ VBS incluzând 10 mM EGTA. EGTA este un chelator care separă calciul; caldul este esențial pentru activarea complementului clasic de bază și astfel prezența EGTA asigură că, complementul poate fi activat prin metoda de bază alternativă. Maximum în partea stângă (mai mare) este C3 și cel de pe partea dreaptă (mai mic) este C3bi, un produs descompus al compusului activat C3.
în control de aceea este o cantitate mică de C3bi indică numai o cantitate minora din activarea complementului La rocketul (2), eritrocitele de porc de 75% (volum la volum) sunt adăugate la cocktailul tampon. Exista o slabă, dar probabil nesemnificativ creștere în nivelul C3bi, prin care se indică că eritrocitele de porc numai cele marginale dacă nu toate, activează complementul uman prin metoda de bază alternativă. Motivul pentru acest slab răspuns nu este clar. La rockeții (3 și 4), limfocitele de porc de 75% (volum la volum) sau celulele de rinichi de porc de 75% respectiv, sunt adăugate la cockteilul tamponat (volum la volum), în fiecare caz există o creștere apreciabilă a nivelului C3bi, indicând activarea complementului uman prin limfocitele de la porc.
Exemplul 5. Limfocitele de la porc nu sunt lizate de anticorpii umani în prezența complementului de porc, dar sunt lizate în prezența complementului uman sau de iepure
Analiza eliberării cromului este utilizată pentru liza monitor a celulelor mediate de serul uman în prezența fie a complementului de porc, fie a complementului baby de iepure sau a complementului uman.
Materiale: Mediul de separare a limfocitelor-flowlabs; RPMI 1640 + 10% inact FCS; PBS (fără acid) - oxoid; V discuri concave- sterilin; baby rabbit comp lymh - Sera - lab sau complement uman sau complement de porc (diluții 1+7 în RPMI); sera încălzită inactivată (la 56°C, timp de 30 min).
Metoda 1. Se utilizează sângele de porc complet defibrinat, diluat în părți egale cu PBS și se stratifica într-un volum egal de Ficoll Hypaque mediul de separare limfocitar. Tuburile sunt apoi centrifugate la 1200 g, timp de 30 min, la temperatura de 20°Q
2. Limfocitele de porc rezultate la interferența sunt separate și spălate odată în PBS. Pastilele se resuspendă în
RPMI 1640 și numărul de celule este ajustat la 2 x 107/ml.
3. 200 micro Ci de 51 Cr se adaugă la 2 x 10' pelete de celule și se incubează la temperatura camerei, timp de 1 h și 30 min.
4. Celulele marcate sunt spălate de două ori la900g, timp de 5 min, prelucrate și ajustate pentru a se obține numărul final celular de 1 x lOyml, în RPMI.
5. Se prelucrează în discuri cantități de 0,05 ml ser inactivat de testare sub formă de diluții seriale în duplicat, la un loc cu controlul. Complementul diluat este adăugat la cavitățile relevante în cantități de 0,05 ml, urmate de 0,05 ml de celule marcate.
Discurile sunt incubate timp de 1 h la 30°C, cuptor de bioxid de caibon.
6. După incubare, discurile sunt centrifugate timp de 15 min, la 900 g, la temperatura de 20°C, pentru sedimentarea celulelor. Apoi, 100 μϊ de supernatant este separat în tuburile marcate și numărarea timp de 1 min se realizează pe gamma counter.
7. Rezultatele sunt înregistrate ca procente de impulsuri ale celulelor originale marcate, față de titru.
Controlul. Controlul complet de separare (FRC) a celulelor 50 μΐ + apă + 0,1% Tween; controlul negativ conține 50 /4 celule + 100 μϊ RPMI; controlul complement (CC) conține 50 μϊ celule + 50 μϊ complement diluat + 50 μϊ RPMI.
Rezultate. Rezultatele sunt arătate în fig.6. Se poate vedea că limfocitele de porc sunt lizate de serul uman numai în prezența complementului care provine de la alte animale (iepure, complement uman), dar nu în prezența complementului de porc. Interferența este astfel că unul sau mai mulți factori de restricție complementari omologi prezenți în celulele de porc are acțiune plină de succes privind reglarea inferioară a complementului de porc, dar nu acționează și asupra complementului de iepure sau a complementului uman.
Exemplul 6. Scopul acestui exemplu
30 este de a demonstra că, anticorpul poate produce rejecția hiperacută. Conceptul prin care această aplicație se bazează pe o dezvoltare ca rezultat al observației că rejecția hiperacută poate avea loc în 5 absența anticorpilor antigrefei, dar necesită complementul funcțional. De aceea, aceasta este o nouă observație și nu există experimente în literatură care demonstrează formal că, anticorpul poate 10 produce rejecția xenogrefei. Deoarece în prezența unui anticorp produs în mod natural este dificil să se determine dacă acești anticorpi joacă rolul sau nu pentru un astfel de exeperiment, ceea ce nu este 15 ușor de realizat în acest exemplu rolul anticorpului a fost demonstrat prin schimbarea xenogrefei concordante în xenogrefa discordantă prin infuzarea anticorpului cu specificitate apropiată. Primitorii 20 utilizați în acest studiu sunt cobai femele, din specia PVG (RTTC) (Banting & Kingdom, Bicester, Oxon, UK) între 3 și 6 luni și cântărind 250-300 g. Donatorii de inimi sunt specii de hamster 25 Sirian obținuți de la Banting & Kingdom și cântărind între 100 și 150 g. Grefarea inimii este efectuată conform metodei Heron (loc.cit în exemplul 1). Inimile de hamsteri sunt grefate în gâtul șobo- 30 lanilor prin legarea de aortă și artera carotidă și artera pulmonară la vena jugulară cu ajutorul tehnicii de manșon. Toate celelalte vase sunt ligate. Inimile încep să bată în timp de câteva minute 35 după eliberarea clemelor vasculare și sunt monitorizate prin palpație externă. Toate operațiile sunt efectuate pe animale anesteziate prin inhalarea halotanului și oxigenului. 40
Nivelele de anticorpi litici anti-hamster sunt măsurate după cum urmează: 50 μΐ de soluție de eritrocite de hamster 1% concentrație, se adaugă la 50 μΐ ser de testat care a fost diluat serial. 50/ddiluție 45 1 la 7 complement de pui de iepure (Sera Lab.Crawley Down, Sussex) se adaugă la prima soluție și se incubează timp de o oră la temperatura de 37°C Se adaugă apoi750/xl de complement de diluant de 50 fixare și se centrifughează (Beckman MICROFUGE, cu 13000 rot/min, timp de 4 min), după care OD 415 este măsurat în supematant (MICROFUGE este denumirea de marcă comercială). Controalele pozitive și negative sunt CFD și apa distilată se adaugă la o soluție de 1% de celule, respectiv. Rezultatele citirilor pentru OD 415 sunt înregistrate față de titrarea serului pe axa X. Așa cum se poate vedea din fig.7, inima de hamster grefată la șobolan are ca rezultat producerea la șobolani a unor titre foarte ridicate de anticorpi litici anti-hamster. Serul de la acești câțiva șobolani, se separă în fracțiunile lor proteinice componente pe o coloană cromatografică pe SEPHADEX G 200 (de la Pharmacia GB Ltd.London) utilizându-se tehnicile cnomatografîei pe coloană standard (SEPHADEX este marca comercială), conform datelor din Curiing Exp.in Physiol and Biochem.3, (1971) 417-484 G.AKer kutedAcademic Press, London and New York, 1970 de utilizare a SEPHADEXULUI la separarea, purificarea și caracterizarea materialelor biologice. Fiecare dintre fracțiunile de 7 /d colectate de pe o coloană sunt analizate pentru activitatea lirică anti-hamster, așa cum s-a descris mai înainte. Fig.8 demonstrează că în ciuda faptului că acești anticorpi sunt induși ca rezultat al grefării inimii la anti-specii, activitatea rezidă aproape exclusiv în funcționarea JgM. După analizarea activității, fracțiunile sunt concentrate utilizându-se ultrafiltrele CX 10 (Pharmacia) 1a o concentrație de 0,5 mg/ml și se conservă la temperatura de - 70°C, până la utilizare. Pentru testarea abilității lor de a distruge o xenogrefă, prin opoziția chiar la lizarea celulelor roșii, inimile de hamster sunt grefate la șobolanii simpli, tn gâtul acestora. Pe cât de repede se stabilesc bătăile inimii la hamsteri, se adaugă 3 ml de ser de vite sau 0J5 ml de imunoglobulină purificată conținând anticorpii litici de anti- hamsteri care sunt infuzați intravenos la șobolani. Atât serul neseparat, cât și 0,5 ml de IgM cauzează consistent distrugerea grefei de inimă de hamster în timp de 15 min. Rezultatele de la infuzie cu JgG sunt inconsistente cu câteva preparate care produc nereușita grefei în timp ce la altele, grefa continuă să bată. Când albumina din coloana G 200 este infuzată ca un control al grefelor de inimă care întotdeauna supraviețuiesc, acestea sunt rejectate într-un timp normal pentru acest model, care este de 3 zile. Aceasta demonstrează ca legarea acestui anticorp la grefă, poate induce distrugerea hiperacută.
Exemplul 7. Datele prezentate până acum în această aplicație, au demonstrat că distrugerea xenogrefei poate include activarea complementului fie prin metoda de bază alternativă sau activarea com plementului mediat de anticorp (metodă clasică de bază). Mai mult decât atât, complementul regulator de la suprafața xenogrefei respective o poate proteja de distrugere de către compusul omolog dar nu și de către complementul heterolog. Faza de activare critică comună pentru ambele metode de bază de activare a complementului, este clivajul componentei complementare C3. Acest clivaj este produs peste tot de convertaza C3, C4b2a (convertaza C3 în metoda clasică de bază) sau convertaza C3bBb (convertaza C3 în metoda alternativă de bază). Aceste enzime produc clivajul de la C3 la C3b care în schimb poate angaja metoda alternativă de bază pentru a forma mai multă convertază C3 (reacție în circuit). Ca rezultat, sistemul complementar este rapid capabil să amplifice depozitarea C3b pe anticatodul străin. Totuși, mulți C3b nu interacționează cu succes cu acest anticatod străin, rămâne în faza fluidă Și poate astfel să indiscrimineze legătura cu celulele gazdei în vederea protejării acestor celule de atacul complementului legăturii indiscriminate, controlul proteinelor s-a dezvoltat pentru componentele complementare inactive, fie în faza fluidă, fie legat chiar de însuși țesutul respectiv. Acele glicoproteine care sunt implicate în controlul C3 sunt din punct de vedere genetic asociate toate în cadrul unei regiuni de cromozomi umani 1 denumiți RCA (regulatori pentru activarea com5 plementului) locus. în acest exemplu, s-a demonstrat ca celulele de șoarece care au fost dobândite prin tehnici de fuziune, de cromozomul uman 1 și proteinele s-au exprimat la locul RCA pe suprafața 1θ lor cu comportare într-o analiză efectuată - in vitro - a distracției xenogrefei ca și cum acestea ar fi celule umane și nu celule de șoarece.
Liniile celulare. T5 este un virus 15 Epstein Barr transformat, produs în linia celulară B tensil, prin tehnici descrise în referate de specialitate Bird și colab. Natura 289,300-301 (1981). B 10 reprezintă un anticorp monoclonal uman an20 ti-tetanus hibridoma care este derivat din fuziunea liniei limfoblastoide umane B (BLL) cu linia celulară mieloma la șoarece X 63-AG8, conform datelor din Kienmey și colab. J.ImmunoL123,1548 25 -1550 (1979). Liniile celulare T5 și B sunt obtenabile de către C-Carter și Dr.N.C-Hughes-Jones de la grupul MRC ΜΤΊΊ de la Babraham Cambridge. DB3 este o linie celulară hibridoma la șoarece 30 care produce anticorpi monoclonali anti-progesteronă, așa cum este menționat în Wright și colab. Nature 295, 415-417 (1982). Următorii primeri de oligonucleotide specifici pentru cromozomul 1 35 uman sunt procurați: (5’ - CCACAGGTGTAACATTGTGT - 3’) (secvența ID numărul 1) și respectiv (5’ - GAGATAGTGTGATCTGAGGC - 3’) (secvența numărul 2), și care sunt primeri 40 ai antitrombinei umane 2 în curent superior și respectiv inferior, antigrombina 2 (AT3) a genei cunoscută ca fiind cromozomul uman 1 (WU și colab. NucLAcids Res.17, 6433 (1989). Oligo45 nudeotidele pot fi sintetizate prin tehnici bine cunoscute în literatura de specialitate.
Acidul dezoxiribonucleic DNA. genomic cu greutate moleculară ridicată este preparat utilizându-se metoda Herrmann și Frischauf, conform referatelor din Herrmann și Frischauf. Methods Enzymol.152, 180-183 (1987). Pe scurt, celulele 100 x 10 din care fiecare sunt lizate fiecare din liniile celulare din cultură, prin adaos de 5 ml dc TNE (100 raM iris: la />11=7,5; 100 mM clorură de sodiu; 10 mM acid ctilen-diaminotetraacetic de 1 % concentrație Sarkosyl) și apoi se tratează cu proteinaza K proaspătă (100 /ig/ml). Preparatul este extras apoi cu fenol (apă saturată și echilibrată față de 0,1 M iris. la/>11 =8), amestec de fenol și cloroform în părți egale (volum la volum) și apoi alcool izoamilic o parte în amestec cu 24 părți cloroform (volum la volum). Acidul dezoxiribonucleic DNA este obținut prin precipitare cu etanol și dializa! față de IE (10 mM Iris, la pi 1 = 8,0: 1 mM acid etilendiaminotetraaceticE’Z)TA) .adus la 100 mM în clorură de sodiu și numai cu TE la temperatura de 4°C. Acidul dezoxiribonucleicDNA este analizat pe gel de agaroză de 0,5% și concentrația este determinată prin densitate optică la 260 nm. Reacția polimerazei în lanț (PCR) pentru fiecare linie celulară este efectuată conform datelor de specialitate Saiki și colab. Science 239, 487-491 (1988)’’. într- un volum de 100 μΐ conținând 500 ng de acid dezoxiribonucleic DNA genomic, 1,2 ng din fiecare primer și 2,5 unități de polimeraza acidului dezoxiribonucleic Taq DNA (Thermos acquaiicus tipul 3) (Cambio Ltd.Cambridge UK) utilizând amestecul tampon suplimentat cu enzimă. Nucleotidele (dNTPs) (Boehringer Mannheim Diagnostics and Biochemicals Lts., Lewis, East Sussex, UK) sunt la o concentrație de 2 mM fiecare. Acidul dezoxiribonucleic DNA este amplificat pentru 30 de cicluri utilizându-se sistemul de control termal programabil (Genetic Research Instrumentation Ltd. Dunmow, Essex, UK) se denaturează un minut la temperatura de 93°C; regenerarea 55°C, timp de un minut și extensia la o temperatură de 72°C, timpde 2 min; 10 țA din produsul de reacție este analizat direct pe un gel de agaroză de 2%, la care se adaugă acid boric tris tamponai cu acid etiien- diami notetraacetic. Mărimea produsului este determinată prin comparație cu fagul dizerat X 174 rf acid dezoxiribonucleic DNA (Pharmacia, LKB Biotechnologi, IJ ppsala Swedcn).
Celulele din culturi T5, B 10 și DB 3 sunt tratate cu anti-DAF (factorul de accelerare a descompunerii) anticorp monoclonal, conform referatelor de specialitate Kinoshita și colab. J.Exp.Med. 162, 75-92 (1985) și anticorpul secundar conjugat cu fluorcsccină. ('ciulele (1 x 10 j reacționează cu anticorpul monoclonal anii DAF’ IA 10 (IeG 2a lOwg/ml în 100 /il FCS 10% cu azidă 0,1%). 1A10 se obține conform lileraturii de specialitate Kinoshita ,și colab. J.lmmunol.136, 3390-3395 (1986) din Centrul medical al Universității din New-York, SUA de către Dr. M.Davitz. Controalele albe sunt numai tamponate. După incubare timp de 2 h pe gheață, celulele sunt spălate de trei ori, resuspendate și incubate în 100 μ\ soluție tampon con-ținând 1 în 100 FITC-conjugat de capră F (ab’) 2 antișoarece IG (cu catene grele și ușoare, afinitate purificată și absorbită pe IG uman) (Tagelmmunochemicals Inc., Burlingame, California, USA) timp de 1 h pe gheață. Câteva celule sunt incubate numai cu anticorpul secund pentru controlul colorării. Deoarece DB3 este o linie celulară secretată de IgG la șoarece, FTTC conjugat la ei, IgG2A an ti-șoarece (1 în 40, The Binding Site Ltd., Birmingham, UK) sau anti-șoarece-capră IG preabsorbit cu volume egale de celule DB3 sunt așadar utilizate în vederea eliminării reactivității anti-IgGl care se produce când celulele DB3 sunt colorate. Toate celulele sunt spălate extensiv și resuspendate în 200 μ\ de amestec tampon. Celulele DAF pozitive sunt detectate utilizându-se un aparat Beckton Dickinson FACS- STAR pentru analiza sortării celulelor fluorescent activate (FACS) (expresia de FACS-STAR este marca comercială). Metoda PCR este utilizată
109963 |x:ntru determinarea prezenței cromozomului uman 1 in trei linii celulare diferite ca culturi 1'5 (uman), B10 (uman- șoarece) și DB3 (șoarece-șoarece). Fig.9 arată că după simplificarea atât a 1'5 cât și a B10 are o mărime a bandei de 495 perechi de bază din care DB3 nu are nici o bandă (hibrid șoarece- șoarece). S-a raportat că produsele PUR utilizându-se primerii AT3 constiluiți din 2 alele, au mărimea perechilor de bază de 572 (alela
1) și respectiv 496 perechi de bază (alela
2) , conform datelor din literal ura de specialitate. Benzile găsite în acizii dc zoxiribonucleici DNAs genomici '1’5 și B10. corespund alelei 2. Aceasta demonstrează că linia celulară a hibridului om șoarece B10conține cromozomul uman
1. Analiza b'ACS pentru prezența DAF arată că majoritatea celulelor umane T5 (85, 7%) sunt colorate, pozitive cu anticorpul monoclonal anti DAF. Un nivel similar (83, 1%) de celule pozitive au fost găsite în celulele hibride B10 șoarece/uman. Celulele de hibrid DB3 șoarece-șoarece arată perechea identic colorată pentru ambele preparate anti-DAF tratate și netratate. Totuși, această reactivitate anti-șoarece IgGl este înlăturată dacă (1) se utilizează FITC conjugat de ei, anti-șoarece IgG2a sau (2) IgG anti-șoarece-capră de mai sus este preabsorbit cu celule DB3. Rezultatele arată că linia celulară a hibridului uman-șoa rece B10 exprimă DAI7 uman pe suprafața membranei celulare așa cum s-a detectat cu ajutorul anticorpilor monoclonali anti-DAF. Nivelul de exprimare este același ca pentru linia celulară umană T5. Linia celulară hibridomă șoarece-șoarece nu exprimă DAF uman.
Studiile privind distrugerea celulelor citotoxice prin eliberarea de crom sunt realizate pe liniile celulare de mai sus așa cum s-a descris în exemplul 5, mai înainte. Fig. 10 arată că, atunci când anticorpii anti-umani de porc sunt incubați cu linia celulară T5 umană prin adiția complementului de iepure care cauzează liza celulară, nu se produce nici o liză când complementul uman este adăugat, deoarece desigur linia celulară 1'5 posedă HCRF uman. Aceasta confirmă rezultatele din exemplul 5. Când anticorpii umani sunt utilizați în linia celularii umană nu se produce nici o liză, fie cu complementul uman sau cu complementul de iepure, arălându-se că nu există nici un anlicorp. Tehnica de eliberare a cromului nu permite ca incubările să fie continuate un timp lung suficient pentru detectarea oricărui nivel semnificativ de activare a bazei alternative a complementului de iepure prin celulele umane (vezi fig.l 1). lotuși, când anticorpii umani sunt incubați cu linia celulară hibridomă șoarecc-șoarcce DB3 (vezi fig. 12), distrugerea celulelor este realizată, atât prin complementul de iepure, cât și prin complementul uman demonstrându-se astfel, că într-adevăr, complementul uman poate funcționa într-o astfel de analiză. Când hibridul uman-șoarece B 10 este utilizat posedând cromozomul uman și fiind cunoscut că exprimă cel puțin DAF, atunci complementul de iepure produce liza liniei celulare pe care complementul uman o slăbește, pentru a cauza liza liniei celulare (vezi fig. 13). Explicația acestui fapt este că HCRF uman fiind exprimat pe baza posesiei cromozomului 1 în hibridul uman-șoarece care a inhibat activitatea complementului uman.
Exemplul 8.Exemplul precedent demonstrează că posesia cromozomului 1 poate, preveni distrugerea celulei xenogrefei. Astfel, aceasta evidențiază circumstanțial puternic că locusul CRA este cel care protejează celula de șoarece de distrugerea xenogrefei, prin acest exemplu fiind făcută o dovadă de formă, în acest exemplu, efectul liniilor celulare neumane de transfectare cu MCP uman și expunerea lor la acțiunea complementului uman sau a complementului de iepure, este demonstrată.
Conform datelor de specialitate, Lublin și colab. J.Exp.Med.168, 181-194 (1988) acizii dezoxiribonucleici codificați cDNAs sunt produși pentru MCP. Construcția liniilor celulare transfectate este realizată utilizându-se exprimarea de plasmid neoSFFV utilizându-se tehnicile menționate în Uhlbrigge și colab. Proc. NatLAcad.Sci. 85, 5649-5653 (1988). Aceasta conține focusul splinei Friend de formare a virusului 5’ cu repetare pe termen lung (SFFV.LTR), menționată în Uhlbrigge și colab. Proc.Natl.Acad. Sci. 85. 5649-5653 (1988) și Clark și Mak, Nucl.Acids Res.10. 3315-3330 (1982) și Proc.Natl.Acad.Sci.80, 50375041 (1983). Liniile celulare sunt obținute de la Colecția dc cultură de tip american 12301 Parklawn Drive. Rockville Maryland. SUA. Liniile celulare utilizate sunt CHO-Kl (ATCC CCI. 61) și NIII/3T3 iA'ICC CRI. 1658). Exprimarea genei este confirmată utilizându-se anticorp monoclonai la MCP, așa cum este menționat în Andrews și colab. Ann.Hum. Genet.49, 31-39 (1985) și analiza FACS este deja descrisă. în unele cazuri, liniile celulare sunt selectate pentru o exprimare la nivel înalt a MCP prin sortarea celulelor ]x FACS utilizându-se tehnicile standard.
Acest exemplu ilustrează efectul de transfectare a celulelor CHO cu MCP. Deoarece aceste celule se dezvoltă ca monostraturi, distrugerea celulelor este evaluată prin adenina terminală în analiza de absorbție, descrisă de Bono Bono și colab. Immunology 32, 221-226 (1977). Pe scurt, această analiză cuprinde incubarea culturilor de celule în discuri cu fundul plat cu sterilitate bună de 96, cu complement și anticorp. La sfârșitul perioadei de incubare experimentală, viabilitatea celulelor este stabilita prin abilitatea culturii de a absorbi adenina radioactivă. Celulele viabile absorb adenina, și nu celule moarte; astfel celulele viabile au numere ridicate, iar celulele moarte au numere scăzute.
în comun cu multe celule tranformate,
CHO este intensiv față de anticorpii care se produc în mod natural și acționează ca, complement în metoda de bază alternativă. Totuși, aceste celule sunt senzitive la celulele de anticorpi, ceea ce demonstrează cauza distrugerii xenogrefei de inimă la hamster, așa cum s-a descris în exemplul 6. Deoarece celulele CHO suni derivate de la hamster, acești anticorpi distrug celulele CHO, atât cu complementul uman, cât și cu complementul de iepure (fig. 14). Când celulele CHO sunt transfectate cu MCP uman, celulele pot fi numai lezate în prezența complementului de iepure. Complementul uman a fost inhibai prin prezența MCP uman pe suprafața liniei celulare de hamster (fig. 15). Evidența că slăbirea celulelor care trebuiesc distruse este într-adevăr datorită slăbirii convertazei C3, ceea ce se dovedește prin analiza de descompunere a C3 uman după incubarea celulelor CHO prin rocketul de Imuno- clectroforeză, așa cum s-a des cris în exemplul 4, de mai sus. Așa cum s-a observat, nu are loc nici o descompunere deasupra nivelelor de control numai pentru complement (vezi fig. 16). Aceste date confirmă că proteinele de reglare inferioară a complementului de tehnologie genetică pe suprafața celulelor neumane, vor proteja acele celule din meca nismele de distrugere a xenogrefei hiperacute care au, ca o caracteristică comună, o cerință pentru clivajul componentei C3 a complementului.
Exemplul 9. Urmând procedeul din exemplul 8, celulele fibroblaste de șoarece 3T3 sunt transfectate cu acidul dezoxiribonucleic cDNA codificat pentru MCP (clona MCP K5.23). 51 Cr se adaugă la celulele respective așa cum s-a descris în exemplul 5. Un volum de celule este apoi incubat cu un volum de complement uman inactivat la cald și un volum al complementului uman inactivat la cald și un volum de complement uman-preabsorbit la temperatura de 4°C cu celulele din splina de șoarece pentru separarea anticorpului anti-șoarece de complementul uman. Amestecul și diluțiile seriale cu complementul sunt îndepărtate de pe discuri. Condițiile generale și caracteristicile analizei de eliberare a cromului sunt descrise în exemplul 5. Rezultatele pentru dona K5.23 sunt arătate în fig. 17, care dealtfel, arată că un control, efectul MCP cDNAfiind introdus în orientarea reversă (în care caz, acesta nu este reprodus). Corecta reproducere a MCI* cDNA conferă protecția celulelor de distrugere, așa cum s-a evidențiat prin nivelul relativ scăzut al eliberării 51 Cr, și astfel cDNA ne-reprodus nu conferă o protecție semnificativă, așa cum s-a evidențiat prin nivelul relativ ridicai al eliberării de 51 Cr.
Exemplul 10. Rezultate similare cu cele descrise în exemplul 8 de mai sus, pot fi obținute cu celulele I .i/210 (linia celulară leucemică de șoarece) transfectate cu cDNA pentru DAF. cDNAssunl produși pentru DAF așa cum s-au descris în literatura de specialitate de 1 .ublin & Atkinson Lublin & Atkinson, Ann.Rev.Immunol.7, 35-58 (1989).
Exemplul 11. cDNA pentru MCP este preparat și ligat în SFFV.neo, așa cum s-a descris în exemplul 8 de mai sus.
Utilizându-se acest acid dezoxiribonucleic DNA au fost preparați șoarecii transgenici așa cum s-a descris în literatura de specialitate, în manualul de laborator A privind manipularea embrionului de șoarece (B.IÎugan și colab. Manipulating the Mouse Embrye, A.Laboratory Manual, B.Hogan și colab. ColdSpring Harbour Laboratory (1986). Astfel s-au utilizat 10...15 femele de șoarece (CBA x B10) fl, în vârstă de
3-4 săptămâni, care au fost induse la supraovulație prin injectarea intraperitoneală a 5 unități de ser gonadotropinic de la iepele pregnante (produsul comercial are denumirea de Folligon), iar după un timp de 48 h se injectează intraperitoneal 5 unități de gonadotropină corionică din urina de femelă gravidă (denumirea comercială este Cherulen). Femelele sunt aduse apoi la împerechere, în ziua injectării de Chorulen, cu masculi (CBA x B 10) și a doua zi femelele cu tampoane vaginale sunt omorâte prin dislocare cervicală și ovarele fertilizate sunt izolate din oviductele acestora.
Un număr de 300 până ia 400 de ovare sunt izolate în acest fel, conținând 2 pronuclei clar vizibili sub contrastul optic de interferență diferențial Nomarski la 400 x magnificare. Unul dintre cei 2 pronuclei s-au injectai cu aproximatv 2000 copii de acid dezoxiribonucleic DNA preparatul conținând transgena MCP cDNA în concentrațiile de ordinul a 0,5 până la 2 ng//zl.
Ovarele care supraviețuiesc microinjectarii sunt reimplantate în oviductele femelelor (CBA x B 10) care s-au împerechial în noaptea precedentă cu masculii vasoctomizați și de aceea au fost pseudopregnante (de exemplu, acestea au avut ovulații și starea lor hormonală a fost de pregpregnanță, dar proprii oociști nu au fost fertilizați). Aproximativ 30 de ovare microinjectate sunt transferate în oviductele fiecărei femele pseudopregnante, sub anestezie, fie în aceeași zi a microinjectării, fie a doua zi când ovarul este în stadiul 2 celular. Gestația este normală ca desfășurare și 17 șoareci sunt născuți de la 10 mame. Se realizează apoi screeningul urmașilor, care este făcut cu ajutorul testului de urmă de pată și/sau pată sudică (vezi exemplul 8) și așadar PCR, analiza acidului dezoxiribonucleic DNA din celulele din pielea din coadă, utilizându-se probe cu 32 - P marcat și primeri care recunosc transgenele. Unul dintre urmași, un mascul, a fost probat a fi transgenic pentru secvența MCP DNA
Exemplul 12. Procedeul din exemplul 11 este repetat, cu excepția că cDNA pentru DAF așa cum s-a descris în exemplul 10, este utilizat în locul cDNA pentru MCP. Un număr de 23 de urmași sunt născuți de la 10 mame. Trei dintre ele (două femele, un mascul) sunt obținute transgenice pentru DAF, așa cum se arată prin testul de pătare, sudic.
Exemplul 13. Șoarecele mascul, obținut în exemplul 11, conținând o transgenă umană MCP cDNA este lăsat să se dezvolte la maturitate și este împere109863 chial cu femela de tipul (('BA x B10). Rezultă 11 urmași. Celulele de acid dezoxiribonucleic DNA din coadă de la fiecare din acești urmași sunt supuse la screening prin analiza urmei de pete, utilizându-se MCP cDNA uman marcat ca probă, pentru a se determina dacă transgena a fost moștenită. Rezultatele sunt prezentate în partea superioară a fig. 18. Se poate vedea că 0, 1, 5, 7, 8 și 10 sunt urmași care au transgena moștenită. Au fost apoi efectuate 4 controale: DNA uman (H); DNA dc șoarece (M); DNA de șoarece în amestec cu 10 pg MCP cDNA uman marcat și acidul dezoxiribonucleic de șoarece DNA amestecat cu 100 pg MCP cDNA uman marcat.
Exemplul 14. Șoarecele mascul obținut în exemplul 12, conținând transgena DAF cDNA umană este lăsat să se dezvolte la maturitate și să se împerecheze cu o femelă (CBA x B10). Pentru fiecare urmaș care rezultă, celulele de acid dezoxiribonucleic DNA din coadă sunt supuse la screening prin analiza urmei de pată, utilizându-se ca probă DAF cDNA umană marcată pentru determinarea dacă transgena este moștenită. Rezultatele sunt arătate în partea inferioară a fig. 18. Astfel se poate vedea că urmașii 13, 2 (o femelă) au caractere moștenite (4 controale au fost efectuate: DNA uman (H); șoarece DNA (M); șoarece DNA în amestec cu 10 pg uman DAF marcat cDNA; și DNA șoarece amestecat cu 100 pg DAF uman marcat cDNA).
Lista secvențelor
SEQ ID No.l
Tipul de secvență: Nucleotide
Lungimea secvenței: 20
Proprietăți: primerul cu cursul superior al antitrombinei umane 2 (AR3) gena
Secvența:
CCACAGGTGT AACATTGTGT 20 SEQ ID No.2
Tipul de secvență: Nucleotidă Lungimea secvenței: 20
Proprietăți: primerul cu cursul inferior al antitrombinei umane 2 gena (AT3) Secvența:
GAGATAGTOT GATCTGAGGC 20

Claims (17)

  1. Revendicări
    1. Genă care codifică cel puțin un factor de restricție complementar, caracterizată prin aceea că, cuprinde o secvență care codifică cel puțin un factor de restricție complementar omolog al unei specii și una sau mai multe secvențe care permit exprimarea acestei gene întro celulă animală transgcnică a unei specii discordante.
  2. 2. Genă, conform revendicării 1. caracterizată prin aceea că, este sub formă dc YAC.
  3. 3. Animal transgenic, caracterizat prin aceea că, are un țesut transplantabil care nu duce la rejecția xenogrefa la transplantare sau expunerea la sistemul imunitar a unei specii discordante.
  4. 4. Metodă de transplantare a țesuturilor sau organelor animale, caracterizată prin aceea că, țesutul sau organul de grefare provenind de la un animal transgenic descris în revendicarea 3, care aparține unei specii discordante față de primitor, se asociază cu unul sau mai mulți factori de restricție omologi activi (HCRF).
  5. 5. Metodă, conform revendicării 4, caracterizată prin aceea că, organul transplantat este inima, plămânul, ficatul, rinichiul, pancreasul sau tiroida.
  6. 6. Metodă, conform revendicării 4, caracterizată prin aceea că, țesutul transplantat cuprinde celule sanguine sau hematopoetice, insulele lui Langerhans, celule neuronale sau celule de la glandele endocrine.
  7. 7. Metodă, conform revendicării 4, caracterizată prin aceea că, (HCRF) interferează cu acea parte a cascadei complementului de activare care este comună pentru ambele metode de bază, clasică și alternativă.
  8. 8. Metodă, conform revendicării 4, caracterizată prin aceea că, (HCRF) este un (HCR1'') natural.
  9. 9. Metodă, conform revendicării 4, caracterizată prin aceea că, HCRF re glează activilatea complementului (C3).
  10. 10. Metodă, conform revendicării 4, caracterizata prin aceea că, HCRF este sau are activitate de: Factor / (cunoscut ca inactivator C3b sau KAF); Factor H: Proteina de legătură C4; DAF (cunoscut ca CD55); Proteina cofactor de membrană (MCP. cunoscută ca CD46 și descrisă mai întâi ca gp 45-70 și apoi cunoscută ca gp 66156)·, GRI (cunoscut ca C3b/C4b receptor sau CD 35) și/sau CR 2 (cunoscut ca CD 21, receptor C3, dg, receptor 3d/EBV și p 140),
  11. 11. Metodă, conform revendicării 4. caracterizată prin aceea că. HCRF are activitatea unui HCRF natural a cărei genă este localizată în RCA (regulator al activării complementului) la locul care este schițat la banda q32 a cromozomului
    1.
  12. 12. Metodă, conform revendicării 4. caracterizată prin aceea că, HCRF reglează activarea complementului la C 8 și/sau C 9.
  13. 13. Metodă, conform revendicării 4, caracterizată prin aceea că, HCRF este sau are activitate de C 8 bp (cunoscut ca HCRFsau MIP); P-18 (cunoscut ca HRF20, CD 59 sau MIRI.) sau SP 40.40.
  14. 14. Metodă, conform revendicării 4, caracterizata prin aceea că, HCRF este o legătură de membrană.
  15. 15. Metodă, conform revendicării 4, caracterizată prin aceea că, HCRF poate ti integrat cu membrana celulară pe țesutul donor.
  16. 16. Metodă, conform revendicării 4, caracterizată prin aceea că, primitorul este uman.
  17. 17. Metodă, conform revendicării 4, caracterizată prin aceea că, speciile donoare sunt porcinele.
RO92-200502A 1989-10-12 1990-10-12 Gena care codifica cel putin un factor de restrictie complementar, animal transgenic si metode de transplantare a tesuturilor sau organelor animale RO109863B1 (ro)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB898922987A GB8922987D0 (en) 1989-10-12 1989-10-12 Modified biological material
GB909017198A GB9017198D0 (en) 1990-08-06 1990-08-06 Modified biological material
PCT/GB1990/001575 WO1991005855A1 (en) 1989-10-12 1990-10-12 Modified biological material

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RO109863B1 true RO109863B1 (ro) 1995-06-30

Family

ID=26296038

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RO92-200502A RO109863B1 (ro) 1989-10-12 1990-10-12 Gena care codifica cel putin un factor de restrictie complementar, animal transgenic si metode de transplantare a tesuturilor sau organelor animale

Country Status (27)

Country Link
US (1) US6495735B1 (ro)
EP (2) EP0709459A3 (ro)
JP (1) JP3302358B2 (ro)
KR (2) KR100317106B1 (ro)
CN (2) CN1122719C (ro)
AT (1) ATE139562T1 (ro)
AU (1) AU654116B2 (ro)
BG (1) BG61080B1 (ro)
CA (1) CA2067235A1 (ro)
CY (1) CY1996A (ro)
DE (2) DE69027535T2 (ro)
DK (1) DK0495852T3 (ro)
ES (1) ES2060561T3 (ro)
FI (1) FI921618A (ro)
GR (2) GR940300004T1 (ro)
HK (1) HK48497A (ro)
HU (1) HUT64584A (ro)
IE (1) IE75345B1 (ro)
IL (2) IL95970A0 (ro)
IN (1) IN171948B (ro)
MY (1) MY107433A (ro)
NO (2) NO303502B1 (ro)
NZ (2) NZ235657A (ro)
PT (2) PT95580B (ro)
RO (1) RO109863B1 (ro)
SG (1) SG72614A1 (ro)
WO (1) WO1991005855A1 (ro)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5705732A (en) * 1989-06-12 1998-01-06 Oklahoma Medical Research Foundation Universal donor cells
CA2062969C (en) * 1989-07-21 2000-10-10 John P. Atkinson Recombinantly produced human membrane cofactor protein (mcp)
EP0537171B1 (en) * 1990-05-11 2002-09-18 The Austin Research Institute CD46 isoforms
US5846715A (en) * 1990-05-11 1998-12-08 The Austin Research Institute CD46 variants
WO1993002188A1 (en) * 1991-07-15 1993-02-04 Oklahoma Medical Research Foundation Universal donor cells
US6916654B1 (en) * 1992-06-29 2005-07-12 Oklahoma Medical Research Foundation Universal donor cells
WO1994006903A1 (en) * 1992-09-22 1994-03-31 Dnx Biotherapeutics, Inc. Delivery of proteins by intermembrane transfer for preaccommodation of xenogeneic organ transplants and other purposes
US5627264A (en) * 1994-03-03 1997-05-06 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Chimeric complement inhibitor proteins
CA2196311A1 (en) * 1994-08-19 1996-02-29 David H. Sachs Genetically engineered swine cells
US6030833A (en) * 1995-08-04 2000-02-29 The General Hospital Transgenic swine and swine cells having human HLA genes
US6166288A (en) * 1995-09-27 2000-12-26 Nextran Inc. Method of producing transgenic animals for xenotransplantation expressing both an enzyme masking or reducing the level of the gal epitope and a complement inhibitor
AU1933897A (en) * 1996-03-22 1997-10-17 Imutran Limited Surfaces which prevent or reduce complement activation
JP4243355B2 (ja) 1997-03-26 2009-03-25 インペリアル カレッジ イノベイションズ リミテッド 細胞膜に固定された抗凝固性融合タンパク質
AU7935598A (en) 1997-07-14 1999-02-10 Nippon Meat Packers, Inc. Transgenic mammals
EP0996461B1 (en) * 1997-10-31 2005-01-12 Walter Reed Army Institute of Research Use of a complement activation inhibitor in the manufacture of a medicament for inhibiting side effects of pharmaceutical compositions containing amphiphilic vehicles or drug carrier molecules
SE523817C2 (sv) * 1999-02-05 2004-05-18 Corline Systems Ab Användning av ett koagulationsförebyggande ämne i samband med transplantation av insulinproducerande celler
GB9905503D0 (en) 1999-03-10 1999-05-05 Adprotech Plc Novel compound formulations and methods of delivery
WO2005009134A1 (en) * 2003-07-21 2005-02-03 Lifecell Corporation ACELLULAR TISSUE MATRICES MADE FROM GALACTOSE α-1,3-GALACTOSE-DEFICIENT TISSUE
KR20180036810A (ko) 2009-08-14 2018-04-09 레비비코르 인코포레이션 당뇨병 치료를 위한 복수 형질전환 돼지
US9420770B2 (en) 2009-12-01 2016-08-23 Indiana University Research & Technology Corporation Methods of modulating thrombocytopenia and modified transgenic pigs
KR20140014064A (ko) 2010-09-03 2014-02-05 스템 센트알엑스 인코포레이티드 신규한 조절 인자 및 사용 방법
CN103492576A (zh) 2011-02-14 2014-01-01 雷维维科公司 用于血管化异种移植物及其衍生物的异种移植的遗传修饰的猪
BR112016009178B1 (pt) 2013-11-04 2020-12-15 Lifecell Corporation Método de preparação de um produto de tecido e uso de um produto de tecido
CN114686427B (zh) * 2022-05-23 2022-07-29 中国人民解放军总医院第一医学中心 一种脾脏调节型b淋巴细胞及其制备方法与应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1982004443A1 (en) * 1981-06-12 1982-12-23 Ohio Univ Genetic transformation of zygotes
US4431636A (en) 1982-05-24 1984-02-14 American Cyanamid Company Bis(4-O-polyhexaose-thio)-phenyl ureas and method of use
US5109113A (en) * 1986-05-02 1992-04-28 Genentech, Inc. Membrane anchor fusion polypeptides
JPS62104594A (ja) * 1985-10-31 1987-05-15 Terumo Corp クエン酸塩利用能検査用培地組成物
JPH0742235B2 (ja) * 1985-11-08 1995-05-10 三共株式会社 自己免疫性疾病の予防・治療剤
IL82390A0 (en) * 1986-05-02 1987-10-30 Genentech Inc Nucleic acid and methods for the synthesis of novel daf compositions
GB8615942D0 (en) * 1986-06-30 1986-08-06 Animal & Food Research Council Peptide production
IL89790A (en) * 1988-04-01 2002-05-23 Johns Hopking University Sequences of nucleic acids encoding and cells producing CR1 protein and methods for its production and purification
DE3830271A1 (de) 1988-09-06 1990-03-15 Goetze Otto Mittel mit immunsuppressiver wirkung
US5573940A (en) * 1989-06-12 1996-11-12 Oklahoma Medical Research Foundation Cells expressing high levels of CD59

Also Published As

Publication number Publication date
IL95970A0 (en) 1992-05-25
NO921438L (no) 1992-04-10
WO1991005855A1 (en) 1991-05-02
KR920702410A (ko) 1992-09-04
NZ248153A (en) 1997-07-27
IE75345B1 (en) 1997-08-27
JP3302358B2 (ja) 2002-07-15
IL120795A0 (en) 1997-09-30
EP0709459A3 (en) 1999-01-07
MY107433A (en) 1995-12-30
JPH05503074A (ja) 1993-05-27
CY1996A (en) 1997-09-05
AU6539290A (en) 1991-05-16
DK0495852T3 (da) 1996-07-15
FI921618A0 (fi) 1992-04-10
DE495852T1 (de) 1994-03-31
AU654116B2 (en) 1994-10-27
NO982131L (no) 1992-04-10
FI921618A (fi) 1992-04-10
KR100317106B1 (ko) 2001-12-22
HK48497A (en) 1997-04-25
NO303502B1 (no) 1998-07-20
NO921438D0 (no) 1992-04-10
DE69027535T2 (de) 1996-11-28
ES2060561T3 (es) 1996-08-01
ATE139562T1 (de) 1996-07-15
EP0495852A1 (en) 1992-07-29
IE903649A1 (en) 1991-04-24
CN1122719C (zh) 2003-10-01
NO982131D0 (no) 1998-05-11
PT101896A (pt) 1998-02-27
CN1051199A (zh) 1991-05-08
BG61080B1 (bg) 1996-10-31
CA2067235A1 (en) 1991-04-13
GR3020741T3 (en) 1996-11-30
ES2060561T1 (es) 1994-12-01
PT95580A (pt) 1991-09-13
NZ235657A (en) 1994-05-26
GR940300004T1 (en) 1994-02-28
PT95580B (pt) 1999-05-31
CN1491624A (zh) 2004-04-28
HU9201240D0 (en) 1992-06-29
HUT64584A (en) 1994-01-28
US6495735B1 (en) 2002-12-17
SG72614A1 (en) 2000-05-23
EP0495852B1 (en) 1996-06-19
DE69027535D1 (de) 1996-07-25
IN171948B (ro) 1993-02-13
EP0709459A2 (en) 1996-05-01
PT101896B (pt) 2003-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RO109863B1 (ro) Gena care codifica cel putin un factor de restrictie complementar, animal transgenic si metode de transplantare a tesuturilor sau organelor animale
JP7285578B2 (ja) 遺伝子ノックアウトブタ由来の血液製剤およびその使用
McCurry et al. Human complement regulatory proteins protect swine-to-primate cardiac xenografts from humoral injury
KR102659529B1 (ko) 이종이식에 적합한 삼중 트랜스제닉 돼지
CA2113089C (en) Universal donor cells
US20060015955A1 (en) Alpha(1,3)Galactosyltransferase enzyme that assembles the Galalpha(1,3)Gal xenoantigen
US6482404B1 (en) Transplantation of tissue comprising a DNA sequence encoding a homologous complement restriction factor
EP1004238B1 (en) Transgenic pigs
RU2252533C2 (ru) Способ получения трансгенного животного
Voskoboynik et al. Stem cells, chimerism and tolerance: Lessons from mammals and ascidians
Wang et al. Production and functional verification of 8-gene (GGTA1, CMAH, β4GalNT2, hCD46, hCD55, hCD59, hTBM, hCD39)-edited donor pigs for xenotransplantation
WO1994006903A9 (en) Delivery of proteins by intermembrane transfer for preaccommodation of xenogeneic organ transplants and other purposes
Raza et al. Pigs in Transplantation Research and Their Potential as Sources of Organs in Clinical Xenotransplantation
CA2144767A1 (en) Delivery of proteins by intermembrane transfer for preaccommodation of xenogeneic organ transplants and other purposes
AU2003268864A1 (en) Transgenic non-human mammals expressing the human complement inhibitor (DAF/CD55)