BG61080B1 - Модифициран биологичен материал - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до биологично съвместим материал за използване в трансплантанти, до получаването и приложението му. Получената донорна тъкан е модифицирана, например трансгенно или по друг начин, с цел асоцииране с едно или повече вещества, които се отнасят като хомоложни комплементрестрикционни фактори /HCRFs/ и са активни в реципиентните видове, за да се предотврати пълното активиране на комплемента, вследствие на което може да се отхвърли при трансплантация. Изобретението се основава на това, че чрез алтернативния път за комлементактивацията в сравнение с класическия начин се предизвиква хиперакутното отхвърляне поради несъответствие.

Description

(54) МОДИФИЦИРАН БИОЛОГИЧЕН МАТЕРИАЛ

Изобретението сс отнася до биологично съвместим материал за използване в трансалантанти и до получаването и приложението на такз-В материал.

Заместването на непълноценни или притежаващи недостатъци (поспециално човешки) тъкани, включително органи, стана през последните четири десетилетия осицоприст метод за лечение в клиничната медицина Тези методи на лечение чрез заместване сс простират например от използването на полиетилен терефталат. продаван под търговската мз - DACRON от ОиРопдза възстановяване на оазрчщени кръвоносни съдове. уизползването на vena saphena като автотрансплантант при бай- пас • ο·-·π.ρ.4·ιΐ apmep-m и при трансплангшщин т- сьоие от един чоВск нз др\··

Орсинов arm- тр'шсплпнтация поен--om тВслсжитслт; разВитис елигоgoneние на модерните именос^преотти. чрез които ептнз Вътнки-есе печтеззиат Високи e'enexu пои отнесете.от с-псини тито-т. СяНкитс т нтнО mpiHicrumHmoLum сс тксишхн т- -Се iРеттт.т сВстс сс прок>Сеи псС-Оче - к;по(; <-реентк тззитиезнпншни '''Стап-з L·? представляват само ттВлстннслно · -си нсоох-'димите трзтт линеех π; според сега използваните критерии за оценка. (.Внтноцтнпстм межр·· стюцяВзнтпо и нузкунтз от сонорни органи <нп всички munoik но можи и з

I 111ШШ111Л бъде задоволено om съществуващите източници. Това се илюстрира може би най- добре със заявките за транстхантация на сърце. Първата трансплантация на сърце, осъществена от. Barnard в 1.967,даде тласък за много други. В рамките на една година бяха. осъществени 101 сърдечни транслантации в 22 страни от 64 различни хирургични екипа. Разочарованието, последвало получените лоши резултати,доведе до това, че в началото на 70-те години бяха провеждани по- малко от 30 трансплантации годишно. Въвеждането на циклоспориновата имуно супресия, обаче, доведе до революция в трансплантацията на сърце, така че повечето центрове могат да предвидят около 4(0 за успешните сърдечни транс плантации (и съответно оцеляване на пациентите). Според оценката, на експертите тази степен на оцеляване може логично да сс очаква да нараства и по- нататък. Успехът на тази процедура, разбира се. подхранва заявките. така че медицинската професия и обществото стават все поубедени, че сърдечната трансплантация предлага реална алтернатива на смъртта. Понастоящем сс провеждат над 2 ввв сърдечни трансплантации годишно.

. Днес най- големият риск от смъртност при сърдечните трансплантации съществува по времсто₇аогапт сс чака за подходяц: дон· ·ρο·-·· орган. Изклствснлпю сърце предлага средства лн крс^;пк-врсмйнно поддържане на тези пациенти, поради внт ··.: може да бъде рсиатсс на прлв\сма. в повечето центрове за. сърдечна транспла.нтация до /.наметна нз снабдяване с донерни органи. ί потенциалният брат на индивиди., кетто била могли да имат изгода от сърдечна тртмплпнптциярткога но е би-.· научнс' установявана но публикуваното оценява необходимостта от сърдечна трансплантация на възлизаща в интервала от 5() и 250 доиш на милион за година в зависимост от селекционните критерии. възрастта, на реципиента.

з

I II J I llllllll заболявания u gp. Ho каквато и ga е действителната картина, ясно е, че понастоящем снабдяването с донорни органи не може да посрещне исканията. Аналогичен коментар може да бъде направен за бъбречната и чернодробна трансплантация и изглежда, че след като веднъж панкреатичната или на Аангерхансовите острови клетъчна, трансплантация стана широко възприета терапевтична процедура за лечение на диабет, намаляването на тази тъкан също щс станс основна грижа.

Сегашната трансплантационна тергтия има и други недостатъци. Ьсз съмнение, това са случаите, когато донорните органи са неподходящи, тъй като са увредени (например при злополука), което причинява смърт поради увреждане на орган, различен от транса лантирания: може обаче да има и други допълнителни увреждания на или свързани е това трудности с органа ;? трансплантация.

11ещо повече - поради непрсдсказуолсстта. на. наличие на органи за трансплантация. транспланпъацисннат.'! хирургия нс може да бъде предвидена като рутинна операция. включ^Иаиш известен предварителен периои от време. Освен това, хирургическият екип и болничната администрация следва да реагират в момента, когато дттрният орган е идентифициран ида рзоотят - нсооишяшя патят м-ради кттт сс дооавят и ..еитрчднения с персонала.

ро-штс на птантлаипапиня на -.-юго, ^;;орт иооп п ··;, дроб. ш-. .-г оптпт птици;·; на ттваттт?. я·икиста·а· ги а язтня.4то π.ί сс твзтт: rmOnmpim ттплттт шятдя мят ай опие- т а шо.'ттшш*. е шумт; дшшрт орган в рамките -а кришик интсрш.·. от крррт

Освен изброените медицински опото-е;· оитш-шша тря.нсплантш<ионна прятшка може в някои -:0--33- да вклкш-я. и соитлнн затруднения. 11а първо място, може да ш-ш -аяоабшния от пелигнозе:··.

I IIM .lilllll.i .1 характер за отделяне на органи от потенциални донори, по- специално при култури, вярващи в прераждането. Има разбира се и други етични и социални трудности при отстраняване на органи от починали хора, например ако се изисква специално съгласие в някои страни. Накрая, появата на търговска дейност с живи донори на бъбреци представлява проблем, например в някои страни от третия свят_?и би било социално необходимо да сс потисне или редуцира подобна търговия.

( Вече има няколко примера за успешно използване на кссно трансплантанти в схемите за терапевтично заместване. Например, през последните години сме свидетели на използване на тъкан от прасе за заместване на аортна клапа, кожа от прасе за покриване на пациенти с тежки изгаряния и пъпна Вена, от крава при трансплантация на вена. Всички тези кссно трансплантанти имат нещо общо : те осигуряват само механично заместване. Използваната тъкан е биологично нефункционплна.

[ричината е в това, че съществуващиягу човека имунен процес незабавно -в рамките на минута или часове) разрушава клетъчната интегрираност на тъканите от повечето видове. Такива кссно трансплантанти са известни като нехармонични кссно трансплантанти.

Салата па това разрушаване е филогенетично о<5ус.ловено. Гака. тъкани ишмптглета, които са примати^близки до човека, могат да преживеят у човека по почти същия начин както един ало трансплантант: подобен кссно трансплантснт с известен като хармоничен кссно трансплантант.

Докато може де сс мисли, че хармоничните кссно транса шнпншши биха могли да осигурят отговора на трудностите с ало трзшеплт-тинтите. на практика случаят може би не е такъв. Шимпанзстата са малко по- малки от човека и органите ми са недостатъчно големина да работят добре у човека. В случаите на присаждане на бъбреци този проблем може де бъде

I il UIJIIIIII заобиколен^като се присадят два бъбрека на шимпанзс_?за да се заместят увредени бъбреци на човек, но за черен дроб и сърце това е абсолютно невъзможно. Нещо повече, шимпанзитата се размножават по- бавно в природата и още по- слабо^когато са в лабораторни условия и нуждата от шимпанзета като експериментални животни (особено в настоящия век на синдрома на придобитата имунна недостатъчност) означава* че отново нуждата надхвърля набавянето. В допълнение, възможно е да има известни социални затруднения с общественото възприемане на използването на други примати, като донори на кссно трансплантанти.

Поради това внимшшето отново е насочено към нехармоничншрексено тронсплантанти. Общоприето с схващ:шсто. чс причината, за бързото разрушаване на кссно трансп.мштантитс с съществуването на “ природно· съществуващи” у реципиента ча антитела срещу все още недефшшрани антигени от донорнитс вмвс (Shons et al. . Murop. Surg. Res. 5, 2b- 36. ^:i;‘ 3y Антителата са наречени ”природно срещащи сс. тъй като тс са намерен.; и индивиди, които нс си имали имунолоатъча провокация от донорнитс видове.

Острото спгевърлянс а>шит·'> кат·· хиперакутне· антитяломедиирано отхвърляне - на един органов трансплантант е добре документирано. В шимлсмт на 60-те години, когато 'ал ι тр.-шщьхантацията на оъсрсци стана рутинен метод на лечение, м;

тЗА 'ниКа.н-л но патоси чаншипанише бъбреуи -юнекто сс fMMxb-Mxnm ом

ОеЦиПНСНтлуЗОкППЮ ·ΗΛ'γ':λ-ЛОМ'. ·' еше К ΡΆ ход. 1 Н. С”СМС лч ,г\л·„МЧПМ транспопшпирлпс бъбрекът :товл м^л прави.у червен и с твърда копсис·’ -chua·скоро след кат е· кръвоносните съдове на донора и ртшпнешпа и-омн non·?

Гакивг. трапсплантаимт продуиират урина почти незабавно. ?в..в Формата на отблъсквано, косат·:· μιοοαμπημπ ос рлепо-.иивн тг времепъ у когато пациентът е още на с-псращАннатл масп (хипепакгтно 'мпхвър хянс^процесътйп

I Illi 1.11.1111.. I деструкция започва в първите няколко минути или също толкова след транспантацията. Когато това сс случи, бъбрекът става синкав и на петна и тогава отича. Консистенцията на органа също се променя. Като правило, трансплантантът l става едематозен, не се продуцира урина и новотрансплантираният бъбрек незабавно бива отстраняван. Става ясно, че в хуморално- медиираният имунен отговор са включени циркулиращите антитела в реципиента и антигените на донорния бъбрек. Единственият (' начин да се избегне това при ало трансплантацията е предварителната проверка за съществуващи в реципиента антитела срещу донорните клетки. С напредване на познанието за тестуване на такива антитела ( известно като кръстосана двойка) става ясно, чс оообщснието^чс антитяло от реципиента реагира срещу антигените в донораще е вярно и че хиперакутната деструкция на тргшсплантантигпс. когато това включва трансплантанти между индивиди от един и същи вид. се ограничава до съществуването на специфични видове антитела, известни като Г- образни позитивни кръстосани двойки: и почти сигурно тези антитела принадлежат към *gG субклас. Нещо повече, присъствието на тези антитела винаги с резултат от предишни имунизационни процедхрщкакто и резултат от предишни кръвопреливания или резултат от бремснностщли. в ловенето случашот неуспешна предишна, транспланшацшя.

Дълго време сс е считало, чс механизмът на хиперакутно отхвърляне на кссно тронсплантанти е същият като механизма за хиперакутно отхвър^лянс на ало трансплантанти. Литературата за механизма на. отхвърляне на кссно трансплантанти е много богата, даваща ретроепкщая от около 83 години. За това време само три публикации като чс ли предполагат механизма за отхвърляне на кссно трансплантантитс бе:’ участие на антитела. Предположението е. чс в отхвърлянето на кссно

I Ji ill IIIIIIIII транспланташпи е включен алтернативниятцикъл на комплемент активация (макар и да не е използвана същата терминология). Предположението за първи път е направено през 1976 г.от Schilling et al ( Surgery’, Gynaecology and Obstetrics, 142, 29- 32, 1976). Предположението е направено отново през 1988 и 1989 (същите данни са публикувани два пъти) от Miyagama et al.

(Transplantation 46 6) 825- 830 (1988) u Transplantation Proceedings 21 (1) 520- 521 (1989). Обаче тези резултати не са окончателни, тъй като и двата експеримента имат един и същ недостатък. АВторите претендират, че избраният модел е на ксено трансплантант. в който кръстосано- видови

j

за такива,·! че заключенията. направени в тези публикациите базират на неправ илни д анни.

Повечето мерки. Взети напоследък^а да сс избегне или редуцира В

химиотерапевтично въздействие Върху имунната система на реципиента, предимно на неспецифична основа, например с циклоспорин А и други имуносупресанти. чрез плазмафореза. чрез третиране с антитяло и т Гази подход естествено следва от химиотерапията. която стимулира ало трткплантантите.

Настс»ящешо изобретение възприема един радикално различен noq.v- у Вместо неспецифично въздейстВт но именната система на реципиент .. UioopcmeHueniG позволява сдновремсттто 'тилаганс на материал хоиги·:· притежава въздействието надонорния трансплантант по отнотснис на компонентите на имутмта система. В специално предпочитани вариапгн.· и тълнснис донорната тъкан е така модифицирана, че да изглежда, имунологично сходна с тази на реципиента.

I I!H 1 .IHIIII.....1

610S0

Установено е също, че хиперакутното отхвърляне на ксено трансплантанти незадължително е антитяло медиирано. Това следва от две наблюдения. Първо, в отсъствие на антитяло. но при наличие на комплемент, се наблюдава хиперакутно отхвърляне на ксено трансплантанти; второ, в присъствието на антитяло, но в отсъствие на комплемент, не сс наблюдава хиперакутно отхвърляне.

Изобретението сс основава на откритието, чс комплементната.

( активация е значителна при хиперакутна дсструкция на ксено трансплантанти независимо от това дали такава активация сс подпомага чрез свързване на подходяща антитяло молекула. Мотивацията на алтернативния път на комплемента може да бъде индицирана с различни клетъчни продукти. Тези продукти не сс ограничават до навлезли отвън клетки като бактерии или ксено трансплантанти. а съществуват в много клетки.Така, по принцип, много клетки от даден индивид биха могли да активират алтернативния път на комплемента. причинявайки масивна авто- имунна дсструкция. Фактът, че това не сс случва/гс дължи на съществуването на множество регулиращи комтчемента протеини, естествено съществуващи в серумни на повърхността на клетката. вот молекули (отнасяни тук към хомоложни комплимент рестриктивни фактори'·) предотвратяват пълната активация на самия комплемент и.·е чрез класическия или чрез алтернативния пат посредством продчупитт т\ самите клетки, предотвратявайки но този начин авто-тмуннат·¹ нм дсструкция. функционирането на такива молекули елегантно сс илюстрира :: пароксизмалната нощна, хс.моглобинурия. При това заболяване ед на, от т.с.-т молекули, които закотвят мембраната улесняващ разпадането фактор^, липсва. Но този начин протеинът не сс задържа в мембраната на червените кръвни клетки и се отделя от клетката, която активира мтюрнггнчвния

I 1.11 mill път на комплемента u тогава се лизира^като по този начин предизвиква, хе моглобинурия.

Съгласно първия аспект от настоящето изобретение сс предлага метод за трансплантиране на животинска тъкан в реципиент, където тъканта е получена от донор, който с видово различен от реципиента, донорните видове са несъответстВащи по вид на реципиента, методът^ обхВащащ присаждането на тъканта в реципиента и създаВане в асоциация с присадената тъкан на един или повече комплемент рестриктивни фактори, активни в реципииращите видове за предотвратяване на пълната активация на комплемента.

Терминът “тъкан'” така^както е използван в настоящето описание^ означава какъбто и да е биологичен материал, който е пригоден за присаждане и ВключВа органи (специално Вътрешни жизнени органи като сърце, бял дроб, чрен дроб и бъбреци, панкреас и щитовидна, жлгтл роговсио., кожа, кръвоносни Въдовс и друга съединителна тъкан, клеткифжлючително кръв и хематопоетични клетки. ЛангерхансоВи острови, мозъчни к \cmku и клетки от ендокринни и други органи и телесни течности { кат-; РНк всички от които могат да оъдат кандидати за трансплантиране т- едни видове в други.

! кхомоложни видове¹ са видове (предимно впскх.щризитнр.О кссно пф:нтпл.штанти. от конът нормално в рсщнтснптсс пдедтжпък хиперпкутно отхВър.хянс. като напр. отхвърлят.; с рамките на мин-ит или ^:тсовс. но нс и дни ( Caine ГгатрЬт Proc 2::?/. У' Ok Тгкот итъжъъ'.' отблъсквания са добре ижсстнн на специалиста. в ослгсттп.. Като сс тс настъпват в рамките на 24 h . в рамките на h h или ip-'u в рамките на I h след трансплантацията.

I 1Ш ΙίΙΙΙΙΙ. 1

Комплементът и неговото активиране · - . са добре известни и са описани 6 Roitt, Essential Immunology (Fifth Edition, 1984) Blackwell Scientific Publications, Oxford. Активността, приписвана на комплемент (С’)_?с в заВисимост от действието на девет протеинови компонента (С1 до С9), които действат в последователност, първият от които се състои от три големи суб- единици, означени като Clq, Clr и Cis. Комплементът. може да бъде активиран по класическия или алернативен път. които ще бъдат ( описани накратко по- долу.

X

По класическия начин антитялото сс свързва към С1, чиято Cis субединица изисква естеразна активност и довежда активирането и трансфера да съответства на мембранния имунен комплекс или най- напред на С4 и след това на С2. Този комплекс притежава СЗ- конвертазна “ активности разцепва СЗ в разтвор за получаване на малък пептиден фрагмент СЗа и остатъчна. молекула СЗЬ. които притежават твърде различни функции. СЗа притежава анафамшюксична активност и не играе п< нататък роля в комплемент амплифакационншна Верига. С“ЗЬ е мембрани^ свързана и може да причини имунно присъединяване на антиген- антитяло СЗЬ комплекса. у.\сснявайки по този начин последващата фагоцитоза.

По алтернативния път. (.’3 конвертазната активност сс осъщеспССа от СЗЬ В. чисто активиране може да бъде задействано от неспецифични агенти, по- спсциахно микробиалии полизахариди като сндотоксин. действащи независимо от антитялото. Конвертазата сс Формира ·-т действието на фактор I) +ьрлу комплекс от СЗЬ и фактор В. М? формира позитивна бримка за обратна, връзка, в която продуктът, на ратуиССмпт на СЗ (СЗЬХ подпомага формирането на разграждащия ензим.

Както при класическия. тика и при алтернативния път. нивото СЗЬ :с поддържа «рез действието на СЗЬ и «активатор (фактор 1). СЗЬ сс

I II. H 11 НИШ комбинира c фактор H за формиране на комплекс, който се разрушава от фактор 1 и губи своите хемолитични и адхсрснтни свойства.

Класическият и алтернативният начин са общи след етапа СЗ.С5 се разграждала да даде С5а и С5Ь фрагменти. С5а притежава анафилатоксична активност и е причина за хемотаксиса на полиморфитс. С5а се свързва като комплекс с С6 и С7 за формиране на термостабиле-н сайт върху мембраната, който е причина крайните компоненти С8 и С9 да генерират мембранния атакуващ комплекс. Това е една пръстенна структура, инсертирана в мембраната и изпъкваща от нея. която формира трансмсмбрансн канал, напълно пермеабилен за електролити и вода. Благодарение на високото вътрешно колоидно осмотично налягане налице е мрежест поток от натриеви йони и вода, които водят до диализа на клетката.

Хомоложнитс комплимент рестрикционни фактори (HCRl's), използвани в настоящето изобретение, могат най- общо да взаимодействат е която и да е част от к-змплемен.т активиращата каскада. Един ' 1CRL може да взаимодейства само с тази част, която съставлява, класическия път, или с тази част, която съставлява агтернативния път. или още невъзможно е да взаимодейства с онази част. ктято с обща както з?·, класическия. така и за ачтептттвнт път , Предпочита сс I КК! . н< регулаторът взаилнщеиства е оо-цаша -плсп' напатя. HCR! може иа. оъдс идентичен на. пгшрлдния 1К КГ ала прсът·· да притежава, подходяща •жа-жция.Синтетичните е wva· тнпктъ--т И κ вклкхшпщ.иъ' r-χпетнени е ре^омонна.нтна ДНК .·ι·..···..ι· ·..·. ·:·^ варианти. <’? -клвз-сни в термина IKK1.

Както е огпбе.мвино по- ’·ρπ. хомоллжнитс комплимент рестрикционни фактори са вещества. кх~п/·. регулират иι. в.;. .·. ·. :.j ^!алнплементна.та каскада по такъв на-ин. ^;с у· ;^;си^уцнрзн'· или.

I

I llll I 1111111..1 предотвратят нейната литична активност: те се използват за маркиране на тъкан от животинско тяло за избягване на автоимунна реакция. В това изобретение е възможно по принцип за HCRF да бъде както мембранно свързан, така и свободен в серума, макар на практика би се предпочело да бъде мембранно свързан в клетките на кссно трансплантантни тъкани. Но този начин е по- лесно за HCRF да бъде ‘‘в асоциация с’^? трансплантантните тъкани. Предпочитаните HCRF включват предполагаеми клетъчно мембранни фактори, включващи СЗЬ/СЗЬ рецептора (CR1), CA.dg рецептор ί CR2). разрушаващ акселерацията фактор (EEkF), СЗЬ инактиватор и мембранен кофакторен протеин (МСР). Вероятният серум HCRF включва фактор Н. разрушаващият акселерацията фактор (ВАР) и С4 свързван-ият протеин (С4Ьр). Тези всички HCRF регулират активността на комплемента чрез взаимодействие на етап СЗ. Хомоложният рсстриктиращ фактор HRF), който се блокира при С8. е също вероятен мембранен фактор.

Много, но не всички гени за подходящи HCRlkca локализирани в RCA 'регулатор на комплементната активация) локус. който се нанася във връзката q32 от хромозома 1 (Rey- Campos cl al J. Exp. Med. !6? 464- аем ; FBSR

Макар че е налице известно объркване с номенклатурата υ локализацията на HCRF. факторите C4BR CR1, DAF и Фактор Н са идентифицирани от Rev Campus et ai. и тяхно по-ранно гвслсдв-шс В. 1 .хр Med. 166 246- 252 (1987)). Мембранният .кофакторсн протеин (МС А а: третира от някои учени като синоним на С4 свързващия протеин (С4врц това може да са онези два фактора, които или са сходни, и.ш са идентични. Rodcr and Til’ ( ^rHic Complement System’’. Springer- Vcrlog, Berlin Ф88) разглеждат регулаторните фактори на СЗ конвертазтта в сектор 1. 2. 3. тс· изравняват С4 свързващия протеин (С4Ьр). който разрушава

I II. 11 Ullltll акселераторният фактор и фактор Н с BlН- протеин и СЗЬ Инактиваторния акселератор. Без съмнение номенклатурата, локализацията и характеризирането на HCR1 ще продължава да се развива, но следва да се разбере, че настоящето изобретение разглежда използването на всички HCRF като подходяща и предпочитана насока.

Други литературни източници за HCR1 са както следва: фактор I (известен също като СЗЬ инактиватор или КАЕ): Tamura & Nelson (J. Immunol. 99 582- 589'1967);

фактор II: Pangbum et a! (J. Exp. Med. 146 257- 270 (1977):

C4 свързващ протеин : Fujita et al (J. Exp. Med. 148 1044- 1()51)):

DAE (известен също като CD55 ): Nicholson- Weller et a! (J. Immuno!. '29

184 (1982)):

Мембранен кофакторсн ротеин (MCP: известен също като CD46 и описан най- напред като «р-45- 70 и по- нататък известен като gp66:?в): лепя ct al (J. Exp. Med. 163 837- 855 (1986)):

CR1 (известен също като CD35): Me do! el a! (J. Exp. Med. 15c I’m⁰- ^: ·' .• 1'942)) u Ross ct a! (J. Immuno!. 129 2051- 20'4·< r ! <>82)):

CR2 (известен също като 3d LBV рецептор и р 14(1: iida cl al (J. Ем?

Med. 158 102i - 1033 (1983)) u Weisel al (PNAS 8i 881-889 11984)).

0азпрсделсниетс) на luku <hh RCA ηι·^; ъоо/к c кпкто слсп-п

(.'R1: Мембрана (лнмшпирлно) : еритроцити: .моноцит.и: п^сче*.? В и тТсчсто Т клетки: полиморфноядрени \свк-н:ити: фплнкн\ярм-. екнррнтне клетки: гломерулни п.одоципш:

CR2: Мембрани (лимитирано): noC/cr— on: В клетките: фо.ткелъ·—·’ деноретни клетки: някои епителни клетки и няктл Г клетъчни линии:

МСР: Мембрана (широко): всички кръвни клетки от периферната кръв (но еритроцити); епителни, ендотелни и фибробластни клетъчни линии: трофобласти и сперма:

DAF: Мембрана (широко) всички кръвни клетки на периферната кръв: епителни, ендотелни и фибробластни клетъчни линии: трофобласти и сперма:

С4Ьр: Плазма: чернодробен синтез ; и

Н: Плазма: чернодробен синтез: фибробластни и моноцитни клетъчни линии.

Що се отнася до протеини, включени в хомоложната рестрикция на нивото на мембранния комплекс, използването на които също се приема съгласно настоящето изобретение, има. общо съгласие (но все още недоказано) относно формата на съа\асуванс на протеина, нс 65kD:i (или подобни) протеини са идентични:

С8 свързващи протеини (Schonermark et al. J. immuno'. 83 6^£C5 ί хомоложни рестрикционни фактори (11RF) (Zalman et a' Lmmunology 8.?· (1986)); u

MAC⁴- инхибиращ протеин (M1P) (Watts et al. (1988)).

('’Sbp/HRF MIP протеинът присъединен към клетъчната повърхност η·’ «ликолшшден прикрепитсл. каквито са CD59 v DAl·: тези пргщкини -: ::. известни като функционално липсващи при пароксихмалната нищи:; хехмоглобинурия.

11а ниво МАС също така, е включен и <?щт ю- 2^i: в‘е nnemcuaj ви ? се. че седните са идентични. ( но може ида не са }:

Р- 18 (Sugita ct al (J. Biochem 104 633 (1988)):

HR.F- 20 (Okada ct al (1ml. Immunol ? (I«89)):

(059 (Davies cl al (J. lixp. Med. (Sept 1989)):

I ΙΙΊΙΙΙΙΙΙΙΙί

Мембранен инхибитор за реактивен лизис (M1RI.) (Hologuin et al J. Clin. Invest 84 7 (1989)).

Основанието за вероятната идентичност на тези протеини е, че протеинът. и,или сДНК последователностите за CD59 и HRF- 20 са показани като идентични : вероятно те са същите като Р-18/ M1RL . Следва да сс отбележи, че е налице известна хомоложност на CD59T1RF.20 последователността с тази на муриновия LY- 6 антиген, който с включен в Г- клетъчната активация (Gronx et al (J. Immunol. 142 3013 (1989)).

SP- 40 също c включен в MAC регулацията

Д EMBO S. 711

Предпочита се. че HCRF взаимодейства с комплимент активтншт на стадия СЗ. ΜΌ.Ρ и DAF блокират позитивната бримка за обратни, вр·? жн в алтернативния път на СЗ активиране и те съставят предпочитаните HCRF.

HCRF се осигурява в асоциация с присадената тъкан. Това ш ш.нД HCRF сс въвежда по такъв начин, че присадената тъкан сс бележи сама други чужди материали, като заразяваща, бактерия например, сн незначително белязани по този начин. Може да бъде Възможно просто да сс въведат парентерално. но локално към прчсаДданмпя тъкан, отп cm а—· тптт HCRF Обаче, на практика това нс сс предат та. тъй наш ;· : нередно днес причини нткВаг-ша .ткализ-тия на 1 КΊ<ΐ^; cm пршаът· ··;· тикан и паради по- шитятъннш отронения, китни· 'Нос’ дп О <·:- - я'ъ ·^?· т изложи повторно въвеждане ν pcgmiumnm,c лед коня- просатунопт ; направених това. ооачс_?м<тс да бъде преодоляно иро : нтолзвснс ш тешо фармацевтични доставящи системи.

Обикновено много по- удобно е дп сс предлага 1И 'КГ по ηιηη.·η. нс д · инпясгпигтн с клетъчната мембрана на донернтм тин. МУ-··, т ..т·

I

I II! I .KIM има. някои неопасни инфекции на трансплантираната тъкан, които биха могли да причинят подходяща експресия, чрез далече по- предпочитания начин за постигане на този резултат донорната тъкан да е транегенна в това, че съдържа и експресира нуклеинова киселина, кодираща една или повече 1ICRK активни в реципиентните видове, когато е присадена β реципиента. Такава транегенна тъкан може да продължи да експресира HCRT неопределено. LICRT може да бъде генетично получена от реципиентните видове или поX малко за предпочитане - от такива тясно свързани в генетично отношение видове, за които хармоничните ксенотрансплантанти са подходящи.

Макар че по принцип транегенната донорна тъкан може да идва от клетъчна култура, за предпочитане е тя да произхожда от транегенно животно. Трансгснното животно следва да експресира (или да бъде способно да експресира) HCRI поне В тъканта за транспа\нтиранс,за препоръчване. Обаче, дори това не е съществено, тъй като е възможно да се свърже HCRf към клетъчните мембрани на донорната тъкан чрез някакъв свързващ агент (като хибридно моноклонално антитяло) (Milstein & Cud-о Nature 305 537 ( 1983) или рецептор. Реципиентните видове могат да бъдат предимно· човек, но не задължително. Други примати могат също да бъдат подходящи реципиенти, както и които и да са. други видове, които икономиката и етиката позволяват.

Донорният вид може да. th-де кс-йто и да е подходящ вид. кс-йгпо е различен от реципиента и който, имайки предвид физиологията на реципиентните видове, е способен да осигури подходяща. тъкан за транс плантация.

Съгласно вторият аспект н;· изобретението сс предлагат подходящи з? присаждане животински клетки или тъкани на донорни видове, които са асоциирани с един или повече хомоложни комплемеит псстпикционнн фактора, активни в предвидените реципиентни видове за предотвратяване на пълната активация на комплемента, като донорните видове са несъгласувани по отношение на реципиента.

Съгласно трети аспект на настоящето изобретение се предвижда подходяща за присаждане тъкан, която не дава начало на отхвърляне на ксенотрансплантанта при присаждане в или въздействие върху имунната система на поне един несъгласуван вид. Несъгласуван вид е този, който хиперакутно отхвърля ктенотрансплантант от животното.

В този смисъл изобретението обхваща приложението на животинска тъкан, получена от донорен вид и един ищ повече хомоложни комплемент рсстрикционни фактора, активни в реципиентните видове, където донорните видове са несъгласивани по отношение на реципиента при получаване на тъкан, подходяща за присаждане.

Съгласно четвърти аспект на изшрегпението се предвиждат подходящи за присаждане клетки, способни да експресират хомеложен комплимент рестрикционен фактор ши друг вид. Клетките могат да шшт от една отделна тъкан, такава какват.о е описана за първия аспект на изобретението, или от повече от една ши всички тъкани, в който случай животното може да. станс донор тжшс една тъкан.

.o.ccH'· пети пепек·' на ишбшюснист·* ·' шигирява нстрансформирана животинска тъкан, способна до. скспрссира един или мж-е хомоложни кттлеменге рсшнрижшшиш фактора активнивив жт жшо с нссъгласжжш спрямо жижшаяижяп''· тъкан.

Съгласно шести аспект и- ш/сбпспшнсстс се шигурява рскомбшшшш П Ио. която включва (НК. кодиращ? поне един хомоложен комплемети рестрикционен фактор и една изи повече пшшдователн·шиш. кш^:ш· дч ’ичзволят експресията на кодираидъна ДПК м· нстрансфермиранапш

I

I № I. .1111111.

животинска клетка. Животинската клетка може да бъде клетка от животно, генетично включващо структурата. Като алтернатива клетката може да бъде култивиран орган или друга тъкан като например Лангерхансово осторовче.

Съгласно един следващ аспект на изобретението, се осигуява генетична структуа, подходяща за включване в генетичния материал на дадено животно за получаване на транегенен организъм. Структурата включва ДНК, кодираща поне един хомоложен комплемент рестрикционен фактор и една или повече последователности, позоляващи кодиращата Д1IK да бъде скспресирана 1в поне една от клетките на транегенния организъм, генетично инкорпориращ структурата. Такава генетична структура може да бъде във формата на мини хромозома. известна като YAC. Както с показано по- горе, хомоложният комплемент рестрикционен фактор би бил активен Във вида, който е несъвместим с вида на транегенния организъм.

Съгласно един друг осми аспект на настоящето изобретение се осигурява метод, който включва инкорпориране в генетичния материал на животното на ДНК. кодираща, поне един хомоложен комплемент рестрикционен фактор и една, или повече последователности. които да позволят кодиращата ДНК да бъде скспресирана в поне една от клетките т транегенния организъм.

Методите за получаване на транегенно животно по принцип са станали широко разпространени и отделните етапи, през които следва да с: .· нзчумогат да са конвенционални за областта на техниката. Например. W* >· А- 8806239 разкрива етапите, които по принцип са необходими за конструиране на транегенен организъм.

Актуалният метод за инкорпориране н:.· структурата в клетката н-« транегенния организъм може да бъде чрез мико- инжДндня. чрез егмрмал!? ·

I 1. IIΙΙΙΙΙΙΙΠ I медиирано инкорпориране или чрез друг подходящ метод. Прсварителното генетично манипулиране може да бъде проведено В прокариоти, както се предпочита обикновено.

ДНК, кодираща HCRF^e подходяща както В сДНК форма, така и Във форма, изведена с помощта на онвенционални техники. ДНК, кодираща забавянето на фактора на акселерация (DAF).c вероятно най- добрия охарактеризиран и е описан от Medofct al (PNAS 84 2007- 2011 (1987)). изична карта на RCA генния сноп е дадена от Rev- Campos et al (1988) {loc. cil.) Варианти на DAF и тйхнопю получаване чрез рекомбинантна ДНК техника са описани в ЕР- Ь- 0244267: подобни варианти могат да бъдат използвани и В настоящето изобретение.

За по- доброто охарактеризирано на DAF и на познатата последователност на сДНК. кодираща DAI . DAF се състои от предпочитан хомоложен комплемент рестрикционен фактор.

Други предпочитани характеристики, от второто до ссдмото асисУпт на изобретението са както за първия аспект..mutaijs.mikandjs.

Изобретението ще бъде илюстрират· със следните фигури. В примерите са използвани фигурифакто следва:

фигури 1Адо 1Е показват електроклрдиограчи на засшк-> сърис. ••рис-тсно В новородени прасета в п_?ответстВие е · юимер к

Фигура 2 показва резултата от радиоимунол-гично изслсднз.нс. Фт •.••.-•чи. не използваните прасенца В Иунмсу н.чмап' гнз.чтт ко.чичестФ .·<·ηϊмкЩп антитяло₂

Фигта 3 показва същински етапи н'· аВс димтгтонл:ъ^л Фъспт.·--слсктпрофюрсзи. както са използвани В Пример 4:

фигура 5 показва 2D- ракетите*’, полудени капа?’ резултат В 1 у .·.\т· · В

I

I 11:1 I J.l Illi II фигура 6 показва резултата от изследването за освобождаване на хром при клетъчния лизис в Пример 5;

фигура 7 илюстрира титрите на литични анти^хамешерни антитело от реципиент плъх на трансплантирано хамстерно сърце, претрансплантант (О-ев ден) и дните 5, 7 и 9 след трансплантацията, както е описано в Пример 6;

фигура 8 показва графично OD на G200 фажции: хистограмата илюстрира титрите на всяка фракция от литичните анти- хамстерови антитела от реципиент плъх на хамстерово сърце, както с описано в Пример 6!

фигура 9 показва оцевтяванс по Southern на ДНК. екстрахирана. от км Ь10 и DB3 клетъчни линии, както е описано в Пример 7;

фигура 10 показва фигурата на освобождаване на Сг·. показателни ' ^: 1’5 човешка клетъчна линия, която е лизирана от зайчи комплемент. ш· ^:;с ·. от човешки комплемент в присъствието на свински анти- човешки антитела, както е описано в Пример 7;

фигура 11 показва, фигури на освобождаване, показателни за липса ичовешки антитела за лизиранс на Т5 човешка, клетъчна линия както е гм.ъши. така и със зайчи комплемент. както е описано в f ’рнмер ~фигхра 12 показва освобождаването на Сг, което демонстрира у. ¹ че човешки антитела могат да лизират миша.- мишо хибрид·-м.·’ 'DB а ··'. присъствието както на заешки комплемент. така и но човешки, както· е описано в Пример 7:

фигура 13 показва освобождаването на Сг'·. илюстрирмвш факт· · човешка- миша хибридомна. клетъчна линия В10 е лизирана от ^:--жи.жи антитела в присъствието на заешки комплемент. както г описан * в ' ’у;,··-··.

фигура 14 показва поемането на H^J аденин (преброено за минута) от CIЮ клетките, което показва, че тези клетки са убити от имунния плъши серум в присъствието на човешки комплемент или плъши комплемент, както с описано в Пример 8;

фигура 15 показва поемането на Н² аденин, преброено за минута от СНО клетки, трансфектирани е човешки МСР. което показваме тези клетки са убити от имунен плъши серум в присъствието на плъши комплемент, но не са убити от този имунен плъши серум в присъствието на човешки комплемент, както е описано в Пример 8:

фигура 16 показва ^U2D ракети, които сочатузс в условията. описани, във връзка с фигура 15. компонентът СЗ на човешкия комплемент не е разграден от СЗв, както е описано в Пример 8;

фигура 17 показва фигурите на освобождаване на Сг . които са показателни за ЗТЗ миши фибробласти. лизирани от природно срещащисс антитела в присъствие на човешки комплемент и πρ- >тсктивничгефек.т сксрссия на човешки МСР на мишите клетки: и фигура 18 показва анализа на Д1 Ik от втора генерация транегенна мишка с помощта на бс.лязяна МСР сДНК (горе.) иш бс.-\яз;ша DAP сД1 IK чето сонда.

ПЕИМЕЕ_.р.

0к;лвърля11С.ла.кссно.п1р.анса^М1У)нтн отсъствие на какМтн? .

Ш Jih-niukugobu аНШЦПАСШ

Като правиш· животните не син·, /игли иа оцелеят без :у.;ркулиращште имуноглобу.лини Гс сс продуцират от лшмфоцити в отгово-г· ни .антигенно стимулиране. В ранния пеонатзлен живот, обаче, пасиви·:·· щълШ.рляннтс лшйчини иминс.₍шЩишни зсйсшвшт· Pane временно

I I № I lil№ заместване за тева само- продуцирано антитяло. Този пасивно прехвърлян имуногобулин покрива защитата на младите^докато се постигне ранен имунитет. У бозайниците това пасивно прехвърляне на майчиния имуноглобулин обикновено става както трансплацентарно. така и чрез коластрата. В някои видове, обаче, структурата на плацентата е такава, че майчиното антитяло не може да бъде прехвърлено. Така, новородените още несукали прасенца са практически свободни от имуноглобулин.

Прасета от породата “Голяма бяла свиня” се взимат непосредствено след раждане и сс поставят в дървени кафези, затопляни от бутилки с гореща вода. За всеки експеримент сс Взимат по дВе прасета от всяко прасило. Тези животни са с тегло около I кд към времето на ражд<шсто им.

Като донори са използвани новородени Новозеландски бели зайци с тегло около 300 Тези донори се анестезират с хипнол и диазепам. гръдният им кош сс отваря и vena cava се канюлира с игла 1.9. Студена +4' С) кардиоплегична течност (ЗЪотаз N 2} се инфузира до спиране на сърцето и перфузията му с кардиоплегичната течност. Освен това охлаждане сс прилага и екстернално със студена кардиоплегична течност директно с шприц. След това сърцето на зайците сс отстранява с помощта на стандартни хирургични, техники и сс съхраняват в кардоопле-шшн рмпбер пдн 4' Цдокапю е необходимо. Тези предварителни мерки сс считат т необходими. тъй като е доказано, че заешките сърца, са пс-датливи ас иехе.мични увреждания.

i’emmuupaiuumc прасета сс анестезират отначало чг-с ; онлглашш с I biotin/ 02. Тогава в мамарната вена сс вкарва интравенозче пеперуднп игла {номер 23). за поддържане на анестезията е интравенозен кептмич. Същевременно чрез интравенозно прилагане на физиологичен разтвор. сс поддържа хидрираното състояние на прасето. Серумни и ЕДТА кр ъвни проби се взимат преди трансплантацията.

Заешкото сърце се присажда на врата на прасето по метода на Heron (.Acta Pathol. Microbiol. Scand. 79 366- 372 (1971)). Аортата се анастомозира край към страна. (6- 0 отвор) към каротидната артерия и пулмонарната вена се анастомозира към югуларната вена. Всички други съдове на сърцето се лигатират. Сърцата започват да бият в рамките на няколко минути от отстраняването на щипките. Скоростта на сърдечната дейност сс набюдава посредством диаскоп / ECG . Врата на прасето не сс затваря по време на целия експеримент, а сърцата се поддържат влажни чрез покриването им със залепващ филм.

Резултатите от ECG са. показани на фигури от * A go· 1Е. Графи.» шн.·. посочена на фигура 1 /^показва нормален ритъм непосредствено след трансплантацията. Смушения започват около 20 min π-· късн··· (фиге···.··. !В) и в рамките на lh ’’ (фигура 1'3) не може дасс огнкош сърдечна дейност, която да показва хиперакутно - ’тблъскванс.

Поради това този пример показва, че хиперакутно отхтн.-рлнне на нссъответстващи ксенотрансп.\антанти настъпва дори и в «шпсъствие на готи тела.

11РИМ1ж2.

1юИоп(ще1штсшряесша.изш1л>в;нш..Ь НрумсрД^ямцт антивиу.’^,:. щщшня

I I IIH L.H.IIIIIU

Заешки анши- свински IgG се бележи с радиоактивен йод по метода на Greenwood et al, Biochemical Journal 89 114- 123 (1963), модифициран от Davies u Howard (непубликуван).

В бърза последователност в полистиренова епруветка (1.1’2 6 cm χ 1 см) се добавят както следва :

25- 50 μΐ протеин ( при концентрация Img/nil)

3- 4μ1 Na¹²³1 ( 100 mCi/ml) μΐ хлорамин- Γ (*4 mg· 5 ml; 0. 5 Μ) натриев фосфат (pH 7. 5) * следва да бъде пресно приготвен преди използване

Тези компоненти следва дз бъдат оставени да се смесят за 30 s при непрекъснато разбъркване. След това бързо се добавят :

μΐ DL- тирозин (наситен разтвор в 0. 5 mi натриево- фосфатен буфер с pl I 7. 5к

300 μ! 2% В8Л PBS, азид

Белязаният протеин след това сс разделя от нереагиралия. йод с помощта на малка колона 8 смх 1.0 Sephadex G-25 средна степен, приготвен в PBS/ азид. Йодираната реакционна смес се прехвърля количествено към приготвената G25 колона а сс е тира е РВ5 . ^:ъ Фрнкщш --т п>' тест к-мт сс събират в полнстирстят епруветки (1.Р2). Колената сс е \уире.д;'тн'— протеинът u 1 йодните пикове еа елттани и раттактнвтттте ьт всички Фракции ее измери.

Радиоактивността, на протеина може да бъде нттслсна :т ··. С:.пн:.·· начин :

радиоактивните бройки в протеина = оригиналните <ющц бройки броя на йодиднитс пикове

Радиоактивният IgG ( съобщаван до сега като “изотоп”) след това сс използва за изследване на (свински) антитела в новородени прасета, както следва:

Материалш

PBS + 0. 01% азид - оксоид

PBS/ BSA 1% - BSA- Sygma

Изотоп - заешки анти- свински IgG цяла, молекула с 12 - 18 х W' бройки, min

Термично инактивиран серум (5о^иС 30min j

Антикоагулирали кръвни проби.

МСГЗД

Приготвя се 1G сеспсш и-·. -.--4 нср-сни крнвни клетки ни ;.:чш в PBS и количество от НЮ id сс добавя шт игивтикт·.· клетките сс :и\“'--р ·е-<·. · еп е п н ат ан т ат а.

2. При-зотват сс ссришш ртреждапи?- -ни инактивпрания серем в PBS BSA от възрастна свиня Чю.иикитсл.ни витло). ишпродено прасспи проба) или заек ’негативна you Добввт' сс к-' т-ист-а ат в -·2~ :ш вт -трвените кръвни клетки в д^шни г-рост. Lapvikmkcmc сс инкубирлт ι - -^;Ч ’ т л

к кв.сп ’.ш котиш а спт-кУ-·--,/--/γ -т пиша.:	U:: Ч РЦ\ П? - .....1..................	. Д
Чсд П'!-:С'· се д^т-рит У -'С .и ,— ’гттг'л 'и	-.: Λ -m г η--, vic · Γη е ·, и
-Чиирип дру- шч у- <
• ЧпршШтктпе сс προ—св-т -.π--··-·· —к-	:ур; -.ρ·;μ· в; -'4' < *·. 'Ч-и i <' . ЧиЧ 4' -ί. ' ....... - - - - ---·,-
е? —'Ул са 1 min в гама сита.

Ритлтатитс сс нанасяш сто брец min ; у-еще пшпт^;<р-_

Р,_?лелтаттпе са пика тне на. фт-шра а ЧсиЧит серем сс е атллв* к нно исеапшана контпола.. серумът ^: u?uuM^:j -Мине капи п-и.иу.26

I

I HILI I.IIIIIS контрола. Може ga се види, че нивото на свинските антитела в още незасукалите прасета 2^е сравним с това на негативната контрола.

на. комплсменп1.СЗ за.деструкшая _на

На морски свинчета с комплементен дефицит, подучени от щам. описан от Burger et al (Еиг. J. Immuno! 16 7- 1 '1 (1986)). сс присаждат сърца посредством същата тсхнологшцкакто е описана в Пример 1 за. ксснотрансплантация на заек върху прасе. Плъхове сс анестезират чрез инхалация с етер, сърцата се охлаждат с кардиоплегичен разтвор и сс изрязват^както е описано по- горе.

Донорите морски свинчета сс упояват интравеношо с валиум и тн-рлкмускулно с хипнол. Сърцата сс имялп.иптрмн на фн-нпжакто и описа.п··’ по- горе. За контролните морски свинчета., ш. е. тези с ноомплнс· ни.вл ._;с комп.лемента. отхвърлянето на .трансплпнтаъша оСм-лвсял настъпва рамките на няколко минути, като по този начин става, ненужнашвпрянето на врата. V експсримситахнитс ' животни вратът се затваря и

-ещин сс следят чрез двукратно изпиране заден. Нормали'.· !3.'С сс нполепдават в продължение на няколко часа слсс сскрмнсонп. кост·-· л с, _Ύ χ •с няма хинеракутно отхвърляне.

ПЕИМЕЕ4.

- V < конски Л1С1фОЦити..и.иьбрещщ С \спС оклшвцрщ-мвсвсш .·. НС в- - мплсис ц ачи в

Следвайки методиката, описана от Grabar и С нватс i Biochin'. Вюрн .Спа И! ВС ί 1953·). агарознигелове сс изливат вънао ο·π'^:··:<λοηη плочки с

I 1. I llllllll размери 8 x 8 era. (фигура 3)- Изискват се 10 ml от гелната смес, състояща се от 5т1 2'7 агароза и 5 ml веронал буфер (VB). (VB е 75 mM Na барбитон. 10

т.М EDTA. 10 mM NaN, .pH 8. 5). Агарозата и VB сс смесват заедно на 6(1 ··<

преди използване. Т еловете се отливат и се охлаждат $ьрху хоризонтална платформа. Когато се втвърдят, головете съдържат 171 агароза и имат дебелина около I. 5 тт.

На около ! ent от края на гела се изрязват 3 кладенчета е диаметър 3 Nim. ВсяКо кладенче следва да съдържа около 8 id от пробата. 1 Ipnoama нс сс Фраоотва по специален начин освен добавянето на достатъчно количество •’ромофенол олу за оцветяването й. Слее прихагансто на пробата гелът сотж.оо се поставя Върху auopqaa. ;о електрфюрептчдн танк

ВоТоНи тампони, настта с тпо.оВогоо Gpm? ί VLo_?<oo; m'k Gooone с -ритаскап: върху проповоположная ръ- i-с а.тр’тоПо > PaG·· a д,- -.·. о с, 'оо поГоопчВанс тттсмп-ттас В по< aGoooo Го Gpn ο. ' ’са·.; уха о no , сдг сс пуска rnok _L- G- 30 мАфркапт албуминът-'^?P oi oamc със Gpmo?! opoxaGcHoc' доспахте потпооСо с^уорун· mcoo .1 Goac -c с-то-о -ако.·,<) 2,5 до 3 h. .Ако сът^:о avcooo qBci ат тас , CipmGexK’oo· ·^; 'm'ococ. xmG amino са ттт-аче <- comma дп оъдс iioBmiama cm отесат < така че дВ.· т\- οοΡΡο ок сЛ ^;т Ι- т\ с пс о.

А¹ 'асо слеттс.Рхтс оат т,. ο- о -;оо·.<_ , οо, t cam е у ХооСоо -С· ’Ч'^; amoyoooioo mi'G А Ре ооооруд , ооо о,о_; ό. ^Л -.

' о. 'ОСсГо-Gy уС o-.oG χ-, УдА-оП-тоооо.

- о.,..шмс'Аио?ттс oyom'G те Ат уΦ роА - ί < cm yaj .>.

котт 11 (Фсгрт Ф охе-хотс.: улсото·,;.,._;ооуоооу оеоооа .· χοοοόο, ο у ,.о; у, ; о-оНоо Go о СХоо касУ Си УУко У то оо ДГоо к ,i

I

1:1 смес 15 om 2% агароза: VB съдържащ около 1°ί аншиссрум спрямо прогпеинара да бъде визуализирайте излива върху пластинката и сс оставя д; се втвърди. След охлаждане до температура около 50°С към сместа от агароза - VBS се добавя антисерум. Плочката след това се подлага на ο е описано по- горе.

единият край на гела.

съдържащ първата димснсионална ивица_;сс свързва чрез памучен тампон с катода 17 , а протибополсжниягкрай се свързва с анода 19. Теловете сс подлагат на електрофореза в продължение на една нощ с ток. в зависимост

че гел с дължина 16 сщ изисква 20 мА ток и т. н.

Протеините, се разделят с електрофореза в първата дименсия ир? определят количествено и визуализират чрез ехектрофорезл -и·; втерат·· дименсия, като • ’цвстяоансто за целите на визуализацията се ·κοίίχνπΒ,;5 както следва:

Гази процедура е същата, както при всяка конветтоналт слсктрофосза. 1 елът. който следва qa бъде оцветтусс покрива е кг с свободна от влакна хартия POSTIJP (запазена марка чи Ad kt rd Кит; A предварително навлажнена с вода. След това тн се покрива с в слоя абсорбираща абсорбционна хартия. Всичко пакт рлпсачкв;· в ^;а 1 /) . след което хартията сс отепцитя-а и прстстозтз сг ⁷-е<пс

След второто размачкване сслът сс тну кг с ъгагЛ. е- ·οο·ο .\ въздух и след това сс напоявас BBS з.а поне 1 Ь ? стсътиъктг и/ ъ преципитиралия протеин. Гелът след тека сс исесгекк япъвз и сс 'Уцвъ щ M/77H1Z1 в разтвор на 0. 5к νον комаси брилянт бло Кж 4? А Н и. 45·. .метанол. 16% оцетна киселина.

I LI HUE

Телът се обезцветява чрез продължително промиване в 20% метанол. 6% оцетна киселина^докато основата стане бистра. Накрая се изсушава с топъл въздух фигура 5 Възпроизвежда изсушения гел. Графиката 1 е отрицателна контрола, съдържаща 50 d нормален човешки серум (11118) плкч? 25 ul VB8. включващ 10 мМ EGTA. EGT.A е хелатор , който отстранява калция; калцият е важен за класическия път на комплементна активация и негов^пъ присъствие осигурява протичането на комплементната активация само гк* алтернативен път. Левият ( по- голям) пик е СЗ. а десният (по- малкия) пик е C3bi. разпаден продукт на активиран СЗ. Поради това в контрплата малкото количество СЗЬ: показва салт малко количество на ко.мплеъментщ активация.

11а графика 2 към оефешшн коктейл са добавени 75С. свински еритроцити (w.v) Налице е слабо, но вероятно незначително повишаване ш нивото на СЗЬн което пстаЛа. не свинските сритршшпш стт нчттлл. активират човешкия комплемент по з.инщшлтивния гньи· ’ (рочшееш' · топа лош отговоо нс с ясна.

ilu графиките 3 е в към беферния коктейл сс е ·Ρ;.ο_Ηηι съотвепиш -в^; < ^;.'^!.ки^;ск',1 соитпошшш ''' : < ц-,н , веер; ис (Щнскн m eia ΐΡ.Η η,·.-„η . - шепи πλ'-’-μη шие. ъй-ъшля·· μ ·6η·.η;ηη*Η€ и.еН-пш н- ^; Зш 4··ππ^Ί/· гниη-^;ίη L.MT'O·· J^r~ '{ НС НЯ ШЛНПвЛ Μ^ν'.!^:’ Ό'ΜΗΗΗ- ОТ Лш-Г К :j η Η '· ^;·τ.· H.V: ίΠ'Η ί тимор с .

Свиускищцмфщ.щти щ co ,и.гщрап' он- mouac аншителнр·· пишсъспФЗцщмо намвш.1С.кй;А<>лш.шс;снпц.н() се .ш шщнн в пшсшщш .ш^; а \ и ш > вт и к и. ко м п.и. \ тι ’ πι

I

I И1И .ll.lllllls

За наблюдаване лизиса на Lxemkumc сс използва изследвано с освобождаването на хром, медиирано от човешки серум в присъствието на свински комплемент, комплемент на мажи зайчета или човешки комплемент.

Материали

Среда за сепариране на лимфоцити - Flowlabs

RPMI 1640 + 10% инакт. FCS ( PBS (без азид) - Oxoid

V вълнисти плочки - Sterilin

Лимфоцити от малки зайчета. - Sera ~ lab или човешки или свински комплимент ( разреждания 14-7 в RPM1) Термично инактивиран серум (56°С 30 юпг/И).

Метод

1. Свинска цяла, дефибринирана кръв, ра.фсдс.ча : I в FBS.cc pace тича въдм сепарационна среда на. lucoll llypaque. Епруветките сс центрофугират при 1200 а за 30 Will на 20°С (

2. 11олгчените на междинната повърхности свински ..исфщти се отстраняват и се промиват еднократно в PBS. Утайката сс рссгспсндира RPΜ1 к)4Р и броят на клетките сс довежда т? 2 х ж -т

4. 2(жи1 Сг сс добавя към 2 х 1в клетъчна мас^:- и сс сс-ттдт т ешеш-ъ темпепагпера. за Е 5

4. Ъо.хясяните клетки сс цснтоофхсират двукратно при -МР ц щ т/л довеждат до крайно съдържание на клсткиф/сслитт н? 'е ml в REMP с. Количество 0. 03 ml от инактивиранич серум сс риссптлат заедн·? е Контролите. Разреденият комплемент сс довевя към см ежътт?

I Ll lllllll кладенчета 6 количество (1. 05 mi. последвано от 0. 05 ml от белязаните клетки. Плочките се инкубират за 1 Й) при 30^иС в пещ с CO

6. След инкубацията паничките се центрофугират за 15 tn)да на 900g и 20°С за утаяване на клетките. 100 μΐ от супернатантата сс отстраняват в белязани епруветки и се извършва, преброяване на гама брояч за 1

7. Резултатите сс нанасят като С от броя на оригинално белязаните клетки срещу титър.

контроли

11ълна контрола на освобождаване (ΗΒ'Ο - ш μΐ> клетки + в-0 ids Η. О + 0. 1ν 'т 1 ween

Отрицателни контроли - 50 id клетки - НС Ф нр\:.

Ксчмплементна контрола (СС) - 50 gJ клетки -ч _у>: pmpegea комплимент Ф ?0 id ki’ML

Еоултатн

Резултатите са показани на фиггоа в.Може, си пс види. че сЬинскиг· лимфоцити сс лизират от човешки серем семе н премшиеше чч не-м/винеш (заешки или човешки) кшшглемент. по че е н мнмчтмвис ч^ч свлюк;

КЛ¹XV,??. iCH П 1. Г'1>воуЪП1 е, ле CijUH -J.VU Πί'Ο-.,Π··.' McHMOCCU’j λΟΗΡ.ΛΌ.Ή:' рсспшскщ.юшш фФипш присиспАвищи н цс-^ц _;Γππ

VC ’в

7‘

ΜΠΠιΓΗΟ,Η НПСССНСКНН ΚΟΜΗ ν.'Ο·Π. ·; _; ^;;;вшвш ели заешки Φ ишлеме си·

ЧМГО ρ Ο.

LlcAiiirf. на този пример с да пСнжс. че ссшао чШс ш пм-м липепакдмне (шпхВъплшпл К' сам гише та. на пееш. ап кфнио с - сс лепели

I

I IIH I Hlllllll това описание, възниква като резултат от наблюдението, че хиперакутно отхвърляне може да възникне и при отсъствие на анти*-присадени антитела, но изисква функционален комплемент. Тъй като това е ново наблюдение, няма експерименти в литературата, които да покажат, че антитяло може да причини отхвърляне на ксено трансплантанти. Доколкото в присъствие на природно срещащо се антитяло е трудно да се определи дали тези антитела играят роля и.ли не, такъв експеримент не е лесно да се постави. В този пример рохчта на антитяло е представена, чрез превръщане на съвместим ксено трансплантант в несъвместим .чрез инфучия на антитяло с подходяща специфика. Използваните реципиенти в това изследвано са мъжки плъхове от щам PVG RT1C) (Banting & Kingdom. Bicckcr. Омт.. t K) ua възраст между 3 и 6 месеца и тегло 250- 300 g. Донорите на сърца са Сирийскихамстсри. получени сьщо от Banting & Kingman и тежат,:; ·<_;<ψ.ρ·.· Ф0 и g 1 присаждането на сърцата сс осъществява състои·'· метода -? Heron ( цитиран в Пример .;). Сърцата на хамстсритс сс присаждат на -ръта i-:a пл-ховстс чрез присаждано на аортата ксс к-шптиднапш артерия и белодробната артерия към югуларнапъ· Кеча посредством манщетната техника. Всички други, съдове сс лигаптрат. Сърцата тшочват д.ч. бият ни-цт'ш слей тжегюждаванс на ва.скуларните клапи и сс наклкуунжт χρο: еллледиглна па\ппиия Всички операции сс провеждат теш каж-шии.

u'cmcшитис 'inc паахщия c хлшшан и киеллрец

ИиС-ги-' ц;> антиштмепчеоншю хитично антитела'· следва. ф ш ап Г’в разтвор на хамстсрни еритроцити ашчжя към ж-^; от опшшшн сирим, който с разреждан серийно / флавап' ш ;ж^; ρ or: cm ί: Ί комплимент на. малки зайчета. { Sera Lab. Cran’cv i.Wn. Sumcc = и сс инкубира ·· [ К при 37^сС. Добавя сс тв и! от. жшплеменш ф'жсир:пцш< разредител и се центрофугира f Beckman ΜΚ,Φ.ΟΗ.’ΟΙ·. у·· цъ, ктрДз .

след което 6 супернатантатасе измерва (Думата M.1KROH JGL е запазена мярка). Положителните и отрицателни контроли са CFD и дестилирана вода, добавени към 1% разтвор от клетки съответно. (^>сзултатитс· от OD₍ отчитанията се нанасят срещу серумното титрувани върху оста. Както може дасс види от фиглрз 7. присъждай*, п··л на сърце от. хамстер върху плъх води до получаване на много висок титър т литични антиг-хамстсрни антитела у плъховете. Серум от някои от те ся плъхове сс разделят на техните протеинови съставни фракции чрез юммн;·· хромапу-ргафия върху Сефадскс G200 (Pharmacia GB Ltd. London) е помете на стандартна колона за хроматографска техника f mine use щ Scph ; -<··. : the separation, purification and characterisation of biobgicai materials . Cекна kxp. in khv-c·';. and Bu'chcrn. 3 kl^(?7i>) 417- 484 i G. Л. Kcrkeu !G > Лмжпн.

Press. · or-don and Vi» York. 197·)·. ( „(г-мата Ссфадгж·:- е знпл-шне мин- ‘кака от фракциите от по «έ, събрана от Колстата^сс. инштКс и· ί. ⁷— ·· анти^хгметерна. :.жтив--юспукактм е описано п·¹- го· ре. фигура 4 поктви. ш‘к?н ф:^;кп'.ш-^:/: тези антитела са шнултрани кяпю осолен т оп'if'PC'pp. i ?рр гр, ·. С^ррС ΜППЦккиювятП λλΗΗΎ'Ή' ^Г,С^ПХНЯ ;'О5>р'р нжлшчшислн<* 4 фракцията. След итштване за актиМ-тс-ц фйона ?

не ' ~ц.·е?а и.'⁷ CXic итрифияшпп ^: юшерц-еро е

'<ИШ? CHv i’i р:; п:, ; Ή·

.........* 1. л .

р'7· , р ·; ;;р:р \ ррр'> η Ρί^Η,ϊΗο'ЮХШНН'UHU НС 'С : ⁷ -?' 3 “'СНС U СРНСЯ P⁷.HC'.PHU ОрЩ СС ЯСНИЯ: Н'Н ’ Н; кНОПС ·' тслН^7Ja виене на сарцапн· не галн”-срс“'с. '.тент.с· ‘снеса ?с; ·<' ^vcm-G' -.нс с нч •-^cp'.-M -а.лс! к - та пеешсстсн им-теалшии⁷ ецържн.ц лнтишн.' а‘^;:⁷⁷отямстсинр янгпшне ш. L.-⁷ктя чссспмннаш⁷ и

I ι iih i шиш::

присаденото хамстерно сг1це в рамките на 15 ииД. · Резултатите от инфузията на IgG са непостоянни, като в някои случаи присадката сс отхвърля, а в други - продължава да бие. Когато се впръска албумин от (3200 колоната като контрола, присадените сърца винаги оцеляват и се отхвърлят в нормалното за този модел време, което е три дни. Това показва, че свързването на това антитяло към присадката може да индуцира неговата хиперакутна деструкция.

Данните, представени в това описание,показват. че деструкцият·? т кссно трансплантанти може да включва комплемент активация кал то π алтернативен път. така и чрез антитяло- медиирани активиране, на комплимента, (класически път). Нешо повече, комплимент регулатори н \ повърхността на ксинографски мишени могат да ги предпазят от деструкция чрез хомолжен, но нс нерез хетеро.лс.Ум Мтплсмет'. Критичният етап на активация. общ и за дватапьтя на комплементна активация^ разграждането на комплементния компонент СЗ. Това. разграждане може да се причини например от СЗ конвертазатг. Сжъж •класическия път СЗ кожкргпта) т: конверпъьапъ; то·.·;- зтт-оъв-т път СЗ конвертпза). Tow ензими разграждат СЗ до к’3в. който на М-е· - може да ангажира алтернативния пъп· ш. формиране о·.· a -3.--41 · '3 X· -о-ъ •звеното за обратна връзка). Като рсаттат комплехп.'нпшпш инч о м:, с способна. да амплифицнра отлагането на СЗв m_;pxv -04.,4.::-,:0 мддд.:.

• ювечето от СЗ обаче не взаимодействат активно· с нежента миела·': и. •стават в течна, фаза и. могат по този начин да се свържат безпрепятствено с клетките на гостоприсмника. Omcq предтеж - не····.· · тези клетки от свържанс с ктшле····.··· ежа е дд.д-г; раи у 4

I III I ,111.1 свързани със самата тъкан, са включени контролни протеини за инактивиране на компле.мевтните компоненти. Тези аликопротеини. които са включени в контролирането на С3,са генетично асоциирани вътре в една област на човешката хромозома 1. наречена RCA( регулатори на комплементната активация) локуе. В този пример се показва, че миши клетки, които са придобили чрез техниката на фузия човешка хромозома : н експресират протеини от ИСАлокуса на тяхната повърхност, се държат в един in vitro експеримент на ксенографска дсструкция като че те са човешки клетката нс миши.

Клетъчни линии ‘5 е една Bps- .cm Вшт вер-л·- ощашфлл-мнрана - movmo В- Улс·:··--οι линия, продуцирана а техниката на. Bird ct a·. (Nature 239 300- 301 -981)) Β·^Γ: чавешко анти^-тстанус монокле-м-ла-т антнтячо. opngypapaim- тюрид-’-'Мачол- е тюлучена от фуааяпш на ъюнк В .амфаЗ-штнро лоен В- : меня· мис.ит.н<а клетъчна линия ХЗЗ- At 7ч-?3 iKmcocv с' :н ф. ‘--—лес - 7' тия. ми ' ·нуч)у 17- н ШВ клептш-чт лншш о? :Н4/л'^;ш^!Фш' <ч'1 М- ‘4 ч кат :а ' * Ф \ [iHghes· Jones of the MRC MIT! < - τ'Λϊ/λ 4 Во.лШ.З ι-Λ '--ΠλΗΟ. ι-344'Λ- л4’4рНиОЛ-НИ клСМЪШН· ЛОШО кл'ЧШ^ Hpcumyuvi анГлЧгОИММСОлКр-ШΛ·4-;.··ι ί) л -,ли,··, ί ил--i; η И-.Λ . ' Ч V --) р Н>; г. И Са — !)-;- ’¹ ~ ,4 I ' :‘ЛМл Пл'лл.

Μ- 4 \·.'Η HUH'C 0Л1л 404'3.4(4' - 444 НИ 00 440 Н<-.дСИСЦ4ДИНН:И 4: ^г'^/4 - М 4 4 :

а нАЗгююЗ ? (ЗГА.Ас7МФСФю В- 3 -Ч73;М>\Га 7 - . и.

; (Λί' ϊφ ффф/ГйПЗЗЛли374/.,4)лфнф- 33 ‘ юф3 ВЯ \( f а 4 4444: Ъ-л'· '-4-^:’O -ИЪЛ-рг и -):)4.,-15-.---4.)447^,/-.4--,4 4-,4-4.1: 1.-.4,44)/5,: :; 4 4 : . 44 -.-4 , л, л ;

лос 4: който се -и-асу-ш а оса-на ложен в-т·' л-трт-л, .п.лл-.лл : : 'шс·. Α-,'λΒ Res. ’ ^? o-'-ЗЗ ; атт, Олнлмнаклш-пнфигпс wo“ · am t'-u-aаннтсаира.ш.· но шсаннкн. а •ос н·'отто .<а сослналнсна.' -< < '-aaaaaa36

I

Геномна ДНК с високо молбкулно тегло се получава по метода на

Herrmann and Frishaut (Methods Enzymol. 152 180- 18,3 (1987)). Накратко, 100 χ

10^й клетки от всяка култивирана клетъчна линия се лизират с 5 ml TNE (100 тМ Tris, pH 7. 5, 100 тМ NaCl, 10 тМ EDTA 1% Sarcosyl) и се третият с прасна протеиназа К (100

Продуктът (разтворен във вода и еквилибриран срещу 0.1 М 'Tris, pH 8) фенол хлороформ (1:1р ,ν/ν) и след това с хлороформ изоамилов алкохол (24: 1 vw ). ДНК сс получава чрез преципитация е етанол и дизлаза срещу ТЕ (1.0 т.М Tris pli 8. 0.

тМ EDTA), доведен go 100 мМ в NaCl и ТЕ самостоятелно при 4°С. Изолираната ДНК се анализира върху 0. 5% агарозен гел и концентрацията сс определя чрез оптичната плътност на 260 шп. I (олимеразната всршкна реакция (PCR) за всяка Клетъчна линия сс оо-шсствява както е описано от SaJki ct al. (Science 239 487- 491 (1988)). В ‘бог 11’1? _:.ц съдържащ 50и ng геномна. ;.U IK. 1. 2 ng от всеки праймер и 2 5 сишшци <чп EAgJ.HK полимеразата ‘Thermos acquaticus П'рс .·'· (Сш-ц Lu·. О-Апк-с. ЕКц сс поставя с-нзим^използвайки буфер. Нуклсотидитс (ONTO) ? hoerhov· Mannheim Diagnostics and Biochemical Ltd. l.o.vk·. «:'> ;t Sc'·?:·> I K) :·. c Концентрация 2 mM. всеки. ДНК сс амплифицир;: за .А шш: c шмещт;·: ш програмируем термееконтролер (Genetic ЕшлсшАлнсц· L'd.

Dunmow. Essex. UK) : дена.тмриране 934/ I Wifi .: лннспрнгдрянс - 55°C : \ min.. . :> скстензия 724? :?a 2 хп»П». . 10 d on' yc ’.кцшешш: продукт ос анализират директно върху 2'л - сн агарезен гел. пропуснат Ids сорно кисслинен EDTA буфер. Размерът на просуАт;: со слрсцоае ^ирс ’ сшацАж :: разградена с Hindi фагова X-17-U г? ...11 IK (Phamсос: ’ Sl·' BU'cchn:-iocy. Up-aka. Sweden).

Култивирани Г5. R10 u DBS китки се третират е анти- D М· (decay accelerating factor) моноклонално антитял- (К.н :Ud т и У · '.я. Ad 2:1337

I II: j Jill II

1985)> u свързано c флуоросцеин второ антитяло. Клетки (1 χ 10 °) сс обработват е мишо анти· DAP моноклонално антитяло ' АЮ (fgG2d 10 tig ml в 100 id от 10% PC’S 0.1%· азид. 1 АР) (Kinoshita et aJ. (J. Immunol. 136 33903395 (1986))) се получава om Dr M. Davitz om Num York University Medical Centre, New York USA 1 ‘разните контроли са само буфер. След инкубация з:· 2 & върху лед клетките се промиват трикратно, ресуспендират се и се инкубират в 1(Ю lj! буфер, съдържащ ! в L00 Р1 ГС- конюаатен кози Р ?ab’) 2 анти^миш.и “G { тежки и леки вериги афинитетът пречистени и абсорбираш с човешки 1G) (’Pago Immunochcmicai^ Inc. ВшАндаглс. (4f=ι \ \\ нас върху лед. Някои клетки сс инкубират cam· с лгюрогш т-титяло ктас ^пивстс^:ш контроли. .. lokamo DB3 е ъотмл' к=Г - оА-уол — л е тъан в! ГС·· ксчЯогирани. овчи анпни^шши k-Gko ·^; ; я -о ike ti-u-.Pau '-ас Lak. лгзтшдт. Р К. ) яли колаят счтзтиао ИГ .ттс. ъоо/аъъ: е oceOjo· лсо* •)ВЗ клетки също сс тсполсИагп за слллл/,ЪлЛ'л/ч. ; . ад' о рсаативносттз. кояпт с '.осдсткле на .οχο- ас а:· Гнт к ллр:. щ клетки сс оцветяват екстензивно и се рст/сясасират в кои ai opo¹ Da? λ'ολϊ'ако·λ клетка co оклацп- c o··:ouvc:: - л/.:^; *? 'Хаъх.л ί όό ·^;: / · нА·- '· · S i AR ;;i зинеш·; на AmiYmm е ретсола С/зАе ‘a V. л^; (Изразът ikH’S- к[ W ,. лос ле еокл.

PCR методът .оча.·. ..-.о уД:·

·.л л -.' ’ 3//<: Л : ·/ *3 *;.'· I ' ''' Ό л'·· 'Л/ S /\3^7; Н-/OH Д ' л Л -Л лл/С J. t . · ^; HC'.HK '- :. :/ ί ·Ο:λΟ/· Λ-ΛΟ-ό И iOO ^;шлл алчл 3λ.λλ'·\ - :-..:, γ·\-- ·,.· ... :

/;>;/.\'а'^,:.:клН;Й кл.к···'/ ; О-О/ С кк^;‘ -'-Ч'Л .- ' ,- . .:'·/.

омо лази ί злел l·)	Λ а· ·γ.	Λ - '·: Η ΛΛΛ ' 0'0.· 7 ·· Ο :	Ο е		< .ИДл
/: ·-/:?/ Λ л/ ί / e j Ν ί ;	.•Ροί’Α 0-411	Π 1 Κ ллНл/ч -Л :
οΑίόο· xmtaame *:	1Λη Μφί ,· Ш	ok Λ.ΟΟ .! ί Η	• φΑ-Ρ- .	.... .. . .. .'

I i mil I j и a

F ACS анализът за присъствие на DAF показва, че повсчепю от човешките 1'5 клетки (85. 7%) се оцветяват положително с анти- DAF моноконално антитяло. Подобно ниво (83. 1%) на позитивни клетки е установено в мишо/ човешки хибридомни в 10 клетки. Мишо миши хибридомни DB3 клетки показват идентични образци на оцветяване както за анти- DA1 третираните, така и за нетретираните препарати. Независимо от това, тази анти<ииша. IgG 1 реактивност сс отстранява,ако • I) сс използва 141’С- конюгиран овчи анти-^миши lgG2a. или (2) горният коза анти^-миши igG сс п ре абсорбира с DB3 клетки. Резултатите покагват. нечовешко- мишата хибридомна клетъчна линия BlOekcpecupa човешки ю.М върху повърхността на клетъчната мембраш^как-о. е утъшовшп ги специфични анти- DAF монехклоиални антитела. Гкютш не очсгтссия е същото както за човешката клетъчна линия 15. Мишо- миша \итъ ям. клетъчна, хинин нс експресира човешка DAik

Изследванията за особождаванс на хром при ццпю.токсиЧпотс· емъртвяв:шс на клетки са проведени въпхх клетъчните линии. ячшя; горе в Пример ъ фигура /в показва, че когато свински античовешки антитела сс инкубцрат с Ϊ5 човешка, клетъчна линия, сооатнтт на заешки Cm племе нп' пгяашнява лизис. цокате в слепия ш· добчшпш ^ч-зп;^!ики вшнплемепш. .лиша: не сс наблюдава штади това... т Г5 клепптнзеш лш-ш гштво:; чш-т-.шн HCRF. Това, е потвърждение на. пезуешнп·шш тн ί юшнер ъ Когапт св използвапз чоНсшки антители. въпш· ноАт-ш кленея--:· шиш. нс сс шюхюдава лизис както е човечеки комплимент таке н : ·- него комплимент. memo показва, че няма авто- антитела, i ехник .нпг освобождаване на. хрома нс позволява инкубацията да прод-ахж:юч поетапното дъ \.·^ време, че да. се \'ст:шовят каквито и да се ч^;ошмо ^т._л алтерн-тшвнин път ни. .жпснв‘ция на заешкия кпмп.ν.?мснш ^г-уу. човешките

I in 1 ,;„И;

клетки (фигура 11).Обаче, когато човешките антитела сс инкубират с DB3 мишо- миша хибридомна клетъчна линия (фигура 12), умъртвяването на клетките се постига както със заешки комплемент, така и с човешки, комплемент, което показва, че човсшкиЯГкомплсмснт може да функционира в такова подобно изследване. Когато сс използва ВИ) човешко- миши хибрид, притежаващ човешка хромозома 1 , за който е извсстно^че експресира поне DAP, тогава, заешкият комплемент причинява лизис на клетъчната линея, докато човешкият комплемент не може да причини лизис на клетъчната \иния (фигура 13). Обяснението е. че човешките НСКРфоито са скспресирани благодарение на наличието на хромозома I в мишо - чДкшкин хибрид, щ нилибиралч пйтшвнестта ни ’-'овешкия комплимент.

ИРИМРРщ > юсшлининт пример гюк-гжа, чс притежаването на хром- нм-о i ле-кс ря щмсушътоти клетъчната дсструкция на кссчо мрансплаипълпои. .колтова с строго шмтопптелепжечо свнщгтслстФ. че т/щ е О’ж. .лЩп. к а-.,, мощта-п миля·.пея к.'.спека — пя псспепекшея на kceo · пчя-яяе-лпнш-л-яошм'. тлее пример суесд.шгп формално докаотеслство. В плет ппимс- е ле монс'л--.Я'пн <лжжпъ^;:т —пе п'С'гзлфекп'Шм;м т Ря’—я-яни о·—л·- ' с'жпиУнтт' λΟο’Μ:; кч а* —'-,\'пп^г'^?лт·^г ч^ч' в-·- —--О — — е-еЩ к яояпояи оИж·.. - пу-лунш-мт МСфЬжм е ляло· ο- тщ- - :я^;пπ I .в кмн '-щя. 1'к щ - нм ущщу Същпвпяшнл тренлфежпщпне отточни .елши сс · лпъшостЬява посредством експииое-нният ояяое - оо -ос е пооющтп ял техникотп, -писана от ОнЬглще си ж. Рок хх поп Оо ^;о- мУ. мл.; орало ущ стщроФ ЛН V | щ му-_:,щ ут Мак Д-Ф. o_;u. е-. и; О, у·.. у уцлолчро у οο·.χ· Оте Ао-ж а· т чщтщ н<от_;

I I lllUJIllll

Клетъчните линии се получават от АТСС 12301 Parklawn Drive. Rockville. Mcryland, USA Използваните клетъчни линии са СНО- KI (АТСС CCL 61) и N111/ ЗТЗ (АТСС CRL 1658). Експресията на гена, е потвърдена с помощта на моноклонално антитяло срещу МСР (Andrews et al. Ann. Hum. Genet. 49 31- .в (1985) ) u FACS анализ, както е вече описан. В някои случаи клетъчните линии сс подбират за високо ниво на експресия на .МСР чрез подбор на клетките върху FACS с помощта на стандартни техники.

'Този пример показва ефекта, на трансфектиранс на СНО клетки е МСР. Тъй като тези клетъчни линии растат в монослой. умъртвяване.: клетките сс изпитва по метода на Bono et al. (Immunology 32 22! 22ο : ^{!ί; ;}· Накратко, това изследване включва инклбиранс на клетъчни култури ⁴ п-чсскодъ-иш стерилни плочки е ~в кладенчетл е комплимент и ·ιηπ'η·πη.·λ. Към края на експерименталния инкубтаисисн период жизнеността не клетките сс изпитва чрез способността на културата. да поеме радиоактивен адения. Жизнените к.шпжи посмат еренин.. ‘.’ap-'-v-nu - атака живите клетки си много на брои, ч мъртвите - 'тлю нс тб

Заедно е много трансформирани клетки < ΉΟ са не^вствите \ни к · ерпре-дно срещащите сс антитела и дсйствисъ'> са -лмернашм -ти път е комплимента. Но тези клетки са чг’вствитслнн -ъм ·ήπ а; антипъ т. аек.пт е пока-ано. причиняват деструкция ни жпешр:чнм.лшллмл. кякта е 'тисина в i !римср о. Тъй кмет СНО Μλ-·Α.μμ е тее -т— м-мстср. пъти антитела увиват СНО клетките клСш' е еттъ се·.: • ··.. шкн коми'/'Η:···, /фиггра Ор. Клип·· <’ ’ 1 ся тртамскптт.т: е <=·.·. МСР. клетките м-и.шт да. бъдат лизираяи само в пръстче··· -'мтечемплемент. Човешки комплемент е инхибиран яш: арнсъшшм.та· ^: · ловешкия МСР на. клетъчната повърхност. к/шипъ·. сс каса·.· а· ' к ев - синия от хахшпън· 'флаера 15? Д<А имаме ΜηΟ' ш-у е ^;мл л·. у-л :

I li. 1 ιΊΙΙΙί умъртвяване на клетките се дължи на липсата на СЗ конвертира, се заключава в анализ на разрушаването на човешки СЗ след инкубация на С1 Ю клетките чрез ракетна имунсуелсктрофореза. както е описано в Пример 4 по- горе. Както ι се вижда_} не се явява разрушаване над комплемент само в контролно ниво (фигура 16).

Тези данни потвърждават факта, че получените по пътя на генното инженерство комплемент регулаторни протеини върху повърхността н-* клетки, различни от човешките, защитават онези клетки от механи ?лште на хиперакутна деструкция на ксснот.рансплзштанти Стто притежз.в ”' като обща характерна черта аотрсоностпт <лп· разграждане ни ⁽ '' компонента от комплемент?.

нтщу·..

Следвайки процедирате т Примес S. ?13 зшиш фнвр^лнспъ

сс тра.нсфсктирагп със ·	С..1ПК. т-СНрллЦа МСИ : VM’H <··;; Кз Ъ· С-.
-лнеткиепс сс щтпКя Се	кУрръ. лпур'.Н(М( Ч·,:- Л7, л • - - · ‘ - ....... . . и , - - . - : . . - · . - -. - ' -

• мм от Клетките сс imk^vnug·’ е сунн т-ем ш¹ злснС месми-нн·

цн жпщвиран компАСмт

Η U С ' О?Ч;\< ЩУ-Ц, клл:с \,-лмл· ллл^л

ри 4 С е миши спестилите за. mic'i-рлнжллс па.

в.

^;.р^:т ; к

I Γ I lMI нстранскрибираната сДНК не води до значителна защита, както сс вижда от сравнително високото ниво на Сги

Аналогични на получените в Пример 8 резултати могат да бъдат получени е L1/210 клетки (миша левкемийна клетъчна линия), трансфсктирана със сДНК за DAF. сДНК е получена за DAlyкакто е описано в Lublin & Atkinson (Ann. Rev. Immunol. 7 35- 38 (1989)).

НЕИМЕРД1.

сДНК за MCP е получена и лигатирана в SELA hoc както е опие;'

1ример в по- горе.

С помощта на този препарат ся птучии птанегенни мишки, както ·: описано 5 Manipulating the Mouse В.пж—·. Л Пмъаоп' Μ-πιοί . В. рои с^; зс мин Spring Harbour Laboratory { · ,(..,- де тгннедеоет ’ КВЛ х нес е женски мишки на възраст 3- 4 седмици се тгуиергт ш ρ-е-опие ще интрпперитонеално инжектиране не е единици ссдсмсн оастиропсн -·— Ppe'ccHuu. косили‘ е т<>рговско наимсгскРиио i 'Вре' - ^:отжлс К h мшСНО мГП и.НПлП αΠ€ΏΙΙΠΊΟΗ€'εΛΗΕ? Lh жкСлП ΗΐΏ iC Η.: ' ф’ж?·.'-: ф. ж ж ж. - .-р , 'чеп :Π<.?·'’Π'Η^Ί,ΉΐυΗ ОГЛ. VpUHR j-ж. ODO’CHHU жж\^:. ; ·;:;-<.·-./.-·,· / :., ..·;· оо.дв-Жжж ί 'Рожену Женските сс осгпз/Жп ш сито! — е- е п·· _: — РЖо—се .

t umio. е о.'ВА х В'?)) ίΐ. мъжки е сидкио— сол тест е поънссо апишалки се умъптвивст чие цсивикои·— quo и тоо.о - : щсишос яйцеклетки сс изолират on техните яйцсщм<В.що

Триста до четиристотин яйца, изолираг-и .по men· -cpim. съдър.ооъ прснуклеуса. ясно видими е диференциалната. интерфкхшт·. .а. «анчтраспъ е еиппичсска система на kenyeski при уве.личение Ж; пъти. осен <?ш.

пронуклеуса се инжектира с приблизително 2000 копия на , U1К, съдържащи

Яйцата, преживели микроинжектирането. сс реимплантират в яйцепроводите на (СВА χ ΒΙφί'Ι женски, които са били съсшсни предния ден с мъжки, на които с направена вазектомия и поради това са с пссвдобрсменност (т. е. те са овулирали и техният хормонален статус е такъв като на бременни, но техните ооцити не са оплодени). I (риблизитс.··. — .Mi мнкроинжектирани яйцеклетки сс прехвър.лят в «йцспр-с-вЛдипк' на всяка птвшбременна женска под наркози и.\и за и-ция ден. си; следващия, котту' .яйцеклетките ся. на 2- клетъчен стадии. Слув·;· н^рщшнз бременноспг и от десет майки сн. родеш; ссд-мнедессш нс?в

Ре ущд сля но то на потомството е какпн^; -; ο-ί-ν.;,·-- a j моме и а соено· е ’з’и. ан-лш на ДНК : ;т клетки на к скии на — зове;.. ар;; е зае.оженен - е ос осеели е Р сонди ц пракмери. кзшп'·' ри и-· — щ.щ —рз;м--;и- куп· - — моите, меники. е дикззмн’· пушел зее - ор н . и ря е\моуКз;шм- м-;

U№ILPJ2<

/ грощедурзгаз от * кшлер I ; се си -Азс- ·.. и.б. е. _г.- .у -- _ у, м, : г ί баУ~Г' - ν V V,·, 3; ί.Ρ'-;’··'Μ' Рк СС — ‘*Щ

\.нуу е-щено си. мззсссоз: и него ш~нм^л. •,-ομ -лл-л Π-;

сДНК като сонда за определяне дали са онаследсни транегени. Резултатите са показани на горната част на фигура 18. Може да се види, че поколение ί), 1,

5. 7, 8 и 10 са онаследили. (Взети са четири контроли: човешка ДНК (И):

миша ДНК (М); миша ДНК, смесена е 10 pg човешка МСР белязана с/Ц !К: и мишн (ИК. смесена със 100 pg човешка МСР белязана сДНК).

11ЕИМЕЕ14Мъшката мишка, получена съгласно Пример 12. съдържаща човешки

1) λί^; сДНК транеген. се оставя да расте до достигане на полов:- зрялосп- е с^еии-ва е женска (СВА х B10>fT. За всеки от полчченшпе потомци сс скрипшр·’ ДНК от. опашни клетки е помощта ш белязана Г)ЛГ е. АНК като мор зп определяне онаслсдявансто нп трпнеген. Релити-шигпс са овали ·:;·· лната част от фигура 18. Може да сс види, че поколение 12 3 (женска* е иашкл. (Взети са четири контроли: човешка .ДНК Н>: чеши ДНК (Мр 'оо··: ДНК. омесени, е 16 pg човешка DAT бе.аванс сД1 -Р и миши ,·.. (ИК '’•'осен'·. със КЮ pg човешка DAT белязана е. > !К>.

листинг, д^

VTO'WOUpOPOH· UQHCH 'ШМСП ПОСЛСйсваГЧСЛНОСШШ!' (ж л.: в} \гЛ !

ип ч- :·<.-лисдовитслностпза ' ?ж.\еотидна ^;-θΛθ: ' ж uo'oo' — m; 1 :’О:ймсд ваш по чоНси/дпч ангпотромешяя· ’ АКО. :дн : · ’.·.'..-'’.ι''птел.ност:

Л.Д( AGCTGT АЛСАГРОТСЯ’ .ж

I IV ! ...ML

Идентификационен номер на последователността : 2

Тип на последователността : нуклеотидна .Дължина : 20

Качества : Праймер надолу по човешкия антитромбинов 2 ген (АТЗ) Последователност:

Claims (2)

1. ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

   1. Метод за трансплантиране на животинска тъкан в реципиент, където тъканта е получена от донор, видово различен от реципиента, та.ж че : донорните видове да са. нссъотвстстващи по отношение на реципиента^ включващ трансплантиране на тъканта в реципиента и осигуряване в асоциация с трансплантираната тъкан на един или повече хомоложни комплимент рестрикционни фактора (HCRFs), активни в реципиентните видове за. предотвратяване на пълната активация на компас мента.
2. 2 метод съгласно претенцшч -. къдес’<> пщкш.тн ор3. Мспшд съгласно претенция 2. където органът е сърне, сливица, - лае дроб. бъбрек, панкреас \н щитовидна жлеза

   к. Метод съгласил претенция 1. къдепа · тъканта okaM-Mc кд-ял/; хсматопостични клетки. Лангерхансовс штпрл-щ. моллаи калй.' ала к.четки от ендокринни орлиш ж Метод съгласно която и да е от претенции <.нн ί ес- в keccmo ί а ' 9тпрспяпнтЩ. онази част ^гнп комт\с020-- :жтп^Кацн/тп//'/^: в ··-mc.'ja coнлвпеменнл за класическия и па пл::ъ:л:/-//-/в:ио; π—η а/ 0-:0/-/0//-е Метод съгласял сляпо/ ц да е ,--3-/ по-·//·//-//·./ - ο \ /-, - '--,--,-- ..-. ι и :-е ариродна iи RI .

   , Mcmoq салон: срспо/нцся :\. ж-слоо. 17 вк- релтетл -а -с·'-. жовидип:/ при Св.

   в. Метод съгласно претенция 7. къостл 1 iCRl- е ял.: лп .шяпжп- -'п / '! * М · фщ.тс-ρ I ( известен по - рани като 07 пн.жтижот/'. ρ м у вкжтол f 0

   I 1И , ,ΙΙΙΙΙ.ί

   С4 свързващ протеин:

   DAF ( известен също като CD55 );

   Мембранен кофакторсн протеин ( МСР: известен също като CD-·'· и описан най- напред като gp45- 70 и по- нататък известен като gp 66/ 56):

   CR1 ( известен също като СЗЬ/С4Ь рецептор или CD35): и или

   CR2 ( известен също като CD21. СЗ. dg рецептор. 3d LBV рецептор ч ρ140).

   9. Метод съгласно която и да с от претенции от 1 до 8. където i 1CR.· има активността на природен ilCRla нийшо ген е локализиран в с ' \ (регулатор на комплимент активацията.) локес:·.. клапа:· е разпил- екен ηρ·.^: ивицата g32 от хромоз· /мл '.

   •0. Метод леглас η· ’ ппетоагшя 5. Кът nao · PR· регалара к. активмцаппа р/ 1 С8 ίΐ a Α Сч. Ϊ и Метод ъгласч·· пГЛтеаЦаН Ц/ , Λ hp еча - 1 Κ/ΚΓ ·α ала еа жпцС-латшг an С 3('О (ома.· ΙΓ'ΚοΟΗΟ kA ~ / Λ \ Ε ’ |< ί UM· МИС Р . ! Ч ‘ . Вл Метод '· UnBca-p- .ή кат·' 1 Η<1· 2^ > ‘^Г ла _ί;Λί; VUR3 л: е - Ш. χς '.Μ ί ли a • отечлао;. Л~' : 4'- : ! £ в к 1 η МСМООп; : ·- .-:4-7 py; .... - ... - ^! .. Μί'Π'ππ όηπΛΜΟο · 1....-. ηΟηΟ η 4 . - - ........ · . η • i'( 'R- е •κοοχΑη 3. Α·Λ _:-ο/Λ< Μ ΛίΟη. Α:η е ίυ В: / /черга : клала.· чч а an ρΟ'ΛηηηΗηΗ. a·; к a?;. ·.;. ΧΙ,-γ:-,·., ^: »-. ) ηΟ'ΑηΛΗ-ληΟ ;? _;л....... . ......... . ..... . ΜΌΟ-λΉΟ Π·η ·η· Α·'ΰη, ·.·,; ·Ο η ; η η С х! Ма . . .. *А‘ЧЧ:рп. —.. ,-0Л'.л -

   kaUUp-aa'; '.дНЛ иш ΰΛΗ.,η f|Ckj . лкшаЗш.· ар.; - ц-п, η .. ллНисНПа,.

   15. Метод съгласно която и ga е от претенции от 1 go 15, където донорният вид е човек.

   16. Метод съгласно която и да. е от претенции от 1 до 15. където донорният вид е свиня.

   17. Трансплашпирусми животински клетки или тъкани на донпрни видове, асоциирани е един или повече хомоложни комплемент рестрикционни •фактора, активни в предполагаемите реципиентни видове за предотвратяване пълното активиране на комплемента. като донорните видове са нссъствстстващи на мижмшинж-л ^;лиу към който принадлежи реципиента.

   .18. Приложение на животински тъкани, е•м/чени от донор?·:и ведчве ч; един или повече хомоложни кечмоош рл-шфолч pake-pe ФШ:н? в реципис.чтни видове къдсеш д·ш ллл-е -'-ер-ш · ;. могФспмпгвщи а · отношение на рецшиенпшипн? Фш-Ф ори хл-лФк: шт^:ве л транс тлантиранс в рсциписчн-ънинч ^;Jugok·.· •в-. Животинска, клетка, к-тте не ? сгеш^; м илшлрпл-. н·· · мм · саосоон.··· снί. екепрссира едни мл -чло.' ν ^ν·^!’? м лени м лш.чсмсич'· • 'Са7нмжиш'шни Фактор:·’, актив-е ов вии„ ел- - есишжшшве; ..; ж:.’вшмшн?вш вид. в:.е фсеш -^'9::. м-.мчл-еч.

   2в. вФомбина.нтнч '· ·Κ. - в м: —ме е ...в -в н мемще но:·: м-е·м- ·λ;' Нлн· вомелемент -me --4-: .--.λ -. --..--1 де -·. --· м’Н'\о..:н‘4.-шелносле. μ-ле -·,λλ. .. ... λ._;-—λ.- ·- е- ..в ж .·:· млели- ' лнвллеп-мо клетви, клел- : ·- ·-·-· ·.- ми. - всънл-1 -мл·..; л. нс-ммлфлекпне-л . ден нн .дм в- ДНК. съгласто прегпечци.н к-ч »hk.m? emeimum - -елф- клетка ил щр-рнегенно с-кит-тем леело mc-Hee е т у ми -пил

   22. ДНК съгласно претенции 20. където клетката е от култивирана, органова или друга тъкан като Лавгсрхансови острови.

   23. Генетична структура, подходяща за включване в генетичния материал на едно животно за получаване на транегенно животно, обхващаща ДНК. кодираща, поне един хомоложен комплемент рестрикционен фактор от несъответстванц вид и една ели повече последователности, способстващиекспрссирансто на кодиращата ДНК К ш-чс н«к/ч' клетки не транегенно животно, генетично инкорпориращо структурата

   2-1. Генетична структура съшяснс ппшпсицш с.к кштс е кс- фщмс -/ YAC.

   25. Мепн)ц на пазени· на пскшшинз·’-·^·: а· , Н Ни -:3300:03-3. Au-P-i инкорпориране в динен жиАъпннекн гении-- < у·е::: н · ,.Ц Ни -нгн-а: ш-ц: един хтеоложе:· комплемена: дссгну ..изу.: и- - уааг.:п:ш аз ?-ихи_?!/П'Ксс'сс'И;лц зид и едни, наш набие·.' за··:.-..- -атг.гнаспш. сине гсспи'а-из експресията, на кодираната ДГ1К 3 зони на·: - зезз-:.· и: АшНамн---и