BG98718A - Състав за въвеждане на комплекси на нуклеинови киселини в по-висши еукариотни клетки - Google Patents

Състав за въвеждане на комплекси на нуклеинови киселини в по-висши еукариотни клетки Download PDF

Info

Publication number
BG98718A
BG98718A BG98718A BG9871894A BG98718A BG 98718 A BG98718 A BG 98718A BG 98718 A BG98718 A BG 98718A BG 9871894 A BG9871894 A BG 9871894A BG 98718 A BG98718 A BG 98718A
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
gly
cells
ala
nucleic acid
virus
Prior art date
Application number
BG98718A
Other languages
English (en)
Other versions
BG62740B1 (bg
Inventor
David Curiel
Ernst Wagner
Matt Cotten
Kurt Zatloukal
Christian Plank
Max Birnstiel
Bernd Oberhauser
Walter Schmidt
Original Assignee
Boehringer Ingelheim International Gmbh
University Of North Carolina At Chapel Hill
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim International Gmbh, University Of North Carolina At Chapel Hill filed Critical Boehringer Ingelheim International Gmbh
Publication of BG98718A publication Critical patent/BG98718A/bg
Publication of BG62740B1 publication Critical patent/BG62740B1/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/775—Apolipopeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/79—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10211—Aviadenovirus, e.g. fowl adenovirus A
    • C12N2710/10251—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10211—Aviadenovirus, e.g. fowl adenovirus A
    • C12N2710/10261—Methods of inactivation or attenuation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/10363—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/11011—Alpharetrovirus, e.g. avian leucosis virus
    • C12N2740/11022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32711—Rhinovirus
    • C12N2770/32722—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32711—Rhinovirus
    • C12N2770/32761—Methods of inactivation or attenuation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Съставът е за трансфекция на по-висши еукариотни клетки с комплекс от нуклеинова киселина и вещество с афинитет към нуклеинова киселина, което евентуално е свързано с интернализиращ фактор за тези клетки. Той съдържа ендозомолитно средство, което представлява свободен или свързан вирус или вирусна компонента или един вирусен или невирусен пептид сендозомолитни свойства.

Description

Л-101ДЗ-ГП СаСШ ЗД ЗйЗЬВДНЕ НА КОьйЛЕКСй ЙАйумвдшшд кашляй з ϊω-шшшм еш- дакш шето Реферат Лзосретението се отнася до състав за травдекция аа по-внеш еукарао2ни клетки с комплекс от нуклеиново киселина и 6 4е. Ъ ‘ Ц-t·,)! V- · ведество е афинитет км нуклеиново киселина, което евентуално& свързано q интерналвзирай фактор за то зя клетки. състава® v ? еъдъряа ендозошпштно средство, което предай вляза или свободен щш евърьан вирус иди вирусна компонента пле един вирусен или'Т ' и? не+варусен нонтнд о ецдозсиолатиа свойства. С/
V A-iOI/93-Ш
« #t Λ · « * · · <
* · ·
CdCTAB ЗА ВЬВДЛЙЬ НА ШШЕШй НАНУЮЬЙШЖ 1Ш.ДДНЙ й BQ-ЖШ ЕШ- ?ОТ ЖШ: изобретението сс отнася да въвеждане на нуклеинови кисе-лини з по-висви еукаржотни клетки. Нвобдадкноет от ефективна састеаа за ваведдане на нуклеи-иоаа киселина в киви клетки съществува преда всичко з област-та яа- гойната терапия. При това а клетките се вмвкват гени, зада се постигне на диво синтез us лечебноактивиа гепни продукт.:,като напржер в случел на генетичен дефект, да се нодаени лшю-аацин ген» “класическата” генна терапия се основава на принципа,чрез еднократно лечение да се постигне трайно излекуване. Пра това съществува необходимостта от методи на лечение, прикоито терапевтичноактавната дйк (иди ещо така мКП0 да сеприложа еднократно ала многократно според цукдата, като ле-карствено средство (генно лечебно средство'·1). Пример® загойно предизвикани засолязаная, при които геннато терапия шжес успех да се пршшая, са хемо/ллията, бета-толасакията и ос- • · · · е · · · · ·*· · »·' r * * * 2· ···· · · »«··· · ··»·«*· Ο» · · · * *4 ··· · ·· · ·· · трата комбииярава иуваа ведостатътаост” (5С1Д)» сищром, кой-то се 8ялп»п от генетично обусновав недостиг на аваямвадевовиядеажюава, Съществува! по-нататък и други възможкоотиаа приложение врв имунната регулация, при които чреа давеяе зафункционална нуклеинова населява, която кодира секретирането ва протею-евтягеж вля ва яевецеринрав протеив-ентигвн, чреа вам»синации се постига хуморажев вая вътреиноклетъчен имунитет, Дру-ги примери ва геветкви дефекти, при ίίοκο могат да се приложи нуклеинова киселина, която кодира аа дефектния res, като напри-мер се дава в индивидуална форма съобразно необходимостта» самускулна джотрофжя (дистрофвв-геи), цветова фиброза (Cyetic fibrosis trsjauBmeabrsae coaduotanos regulator geae"), ""’r“хслестеролживя (Й1р-рецвптор-ген). Гевви терапевтични методи ва лечеиве ва тогава от съществено значение, вогато в органмзж-ма трябва да ое сятеажрат ходови, растежни фактори или дао- ИВАИММЯВИЯЯЯ МНВ ачямташл аТМВОТтя ВПМЪЯЯЯМЯПВЯ ХОКмнКХВ ЯВИ И^уДЙИОДуIIД^йЩЦ вЯЙЕШЖЖ BpOSOKHw Гавватв терапия представлява също така и переопентнввавъзможност ва лечението на рак, врв което се врявата така наре-чената "ракова ваксина"* За да се воят ицувогеввцжтетвоеттана туморви клетки, те биват променяни аа да ее направят или по-силно антигени· явя аа де ее предизвикат да произведат опреде»деви юдтаюделиражи субстанции» като например цитокини, коитослед това проявяват имунна реакция. За да се постигне гордото,клетките ее тракофицират е ДНК, която е кодирана ва някакъв ци-токин, като например IM, 11*4, ШХ-гама, TNF - алфа. До ое*»га генкия трансфер в автологични туморка клетки ое ярими^дц^иа чреа ретровирусни вектори, йай-иапредвалитв до вета технологии ва приложение ва нук- ттимаввАтвяв fnMMiwieMB η по ittf until ма тмитмвяе "Мвтъаяпмя sssw^ss пиъаатмркм. aWWIJHI 1ПКЮДВДЦ1 в JjHHlOHHI SB РВВИИЯ1 ЗЩДВжиш ННеИОД ЖИИX JpBXjPH** вирусни система зо трансфер на гени в клетките ( цсоп et е1в#1930, Kasid et ai., 1930). Използването обаче на ретрови-руоа създава все пай проблеми, тъй като, макар и в малък процент,съществува опасността от странични явления като инфекция с ви-руса (чрез рекоьзбянация с ендогенни вируси или заразяване спомощни вируси и възможна последваща мутация в патогенна дама)шш образуване на рок. Освен това, стабилната трансформация насоматичните клетки на пациента, капвате се цели с помощта наретро вирусите, не при всеки случай е желателна, тъй като при по-явяване на примерно странични е-дата, то asцента труда може дасе зърне в изходното ну състояние. Освен това, при тази терапияе трудно да се получи достатъчно висок тигър, за да могат дос-та т «но клетки да бъдат заразени. Нуклеинови киселини се използват освен това като терапев-тичноактивна вещества за инхибиреае на определени функции наклетките. Така например безсмислени РШС а -да се оказаха зк-тлвни средства за селективно инхибмране на определени генпосле-дователности. Начлнът им на действие дава зъзаолност те да сеприлагат като терапевтични средства за блокиране на експресаро-нето на определени гени (като дерегулирани онкогени или вируснигени) ш живо. зече беше показано, че къса безсиислени-олмго-цуклеотида могат да се импортират в клетки и таи те могат дапроявят своето шошбиредо действие (2aa@enik et β1β> 1д8б)>въпреки че вътрошодклетъчаата им концентрация е твърде ниска,между другото и поради ограниченото им приемане през клетъчнатамембрана въз основа но силно негативния заряд на нуклеиновитекиселини. друг начин за селективно ишшбиране на гени е чрез прила-гането на рибозиш. Тук също съществува необходимостта да сеосигури възможно висока концентрация от активни рибезони в • «
клетката» пра което транспортирането към клетката е един οιогриничааащате фактори. Придоавпнвто на гойната терапия за постигане на вътреино-кдетъчен имунитет обхваща траведукцията на гени, които притежа-ват защитно действие срещу вируси (тава наречените ’’защитни ге-ни") » например трансдоьшиантни мутации на гени, които кодиратза вирусни протеини, или ДйД-аолекуля» които кодират 0 такана рачените декойе". порада тове сдцествува пзобжодйдостта от методи» които дададат възможност за експрееиране нз ДЖ в клетката. вече са предложени иаого решения за подобряване на транс-портирането ва нуклеинови киселини в жяац .оютка, което пред-ставлява един от ограпачиважте ^кторп ври прилагането ш катотерапевтични средства· Зв геяво трансформиране на клетка от бозайници аа ватро саизвестни различна техники. Тяхното приложение обаче на живо етвърде ограничено (към тях се числят техниката за въвеждане ваДШ< посредством дппозоаи, олоктропорация, шпероиижектираве»клетъчна уузия» ^Аб-докстраи или калциедафссфетния утаечен ме-тод)· Разработени са рекомбинантни вирусни вектори» които осъ-цестаяват трансфера на гени като използват ©фициентния входящмеханизъм на изходните вируси. Тази стратегия бе приложена приконструирането на рекомбинаитни ретроваруени и адековируснивектори за да се постигне високоефективен генен трансфер инвлтро и на живо (йегктг, 1988). При цялата тяхна актив-ност» теза вектори представляват ограничения и то по отношениена големината и конструкцията па ДШС която до се трансферира.освен това теза средства са рискова ао отношение на Cto-трапофе- • »
ра на жизнеспособни вирусни ген-елементи па изходния вирус. За да се избегна! тези ограничения» резреботенн са алтер- нативни стратегии за гевтрансфер» в основата ав чиито неханиз-о лежи обслужването на клетката ара транспорта от макрсмозе-кули. Пример за това © жшортйрааето на гени в клетката презнай-продуктоносаособния път на рецептор - ендоцитоза (« ц и «и, 1967» i.agner et al., 1990 и ДР-&amp;1 0388 758). Този начин използва бифункционаяни молекулни кошагати» коитопоказват един /Щй-свързващ домен и домен със специфичност аакяеташ повърхностен-рецепгор ( uu а ви» 198?» eagner etai.t 1990). Когато познавателните домени се познаят от клетъч-но повърхностния рецептор, кошогата се интернализира по пътя нарецептор - пооредаачест на ендоцитоза» при което свързаната спонитата ДИК съдо се транспортира. 0 немощта на този штод мо-гат да се постигнатгентрансферни количества, конто го правятпоне равностоен не съществуващите метода Uenke е* al., 1990). дожеае да бъда показано, че чрез тази система транспортира-ната да в клетката може да бъде експериментира.>а и в случай чесе използва инхибнращо действаща нуклеинова киселина, нейнотоинхибирацо действие не се повлиява от транспортната система. РСТ-заяаката W091/I7773 се отнася до систеш за транспор-тиране на нуклеинови киселини със специфично действие за ϊ-клет-ки. Тази система използва клетъчен повърхностен протеин на Т-клетъчвата-изходна линия» например СД4» на използвания от HIV-вирус рецептор. Нуклеиновата киселина която трябва да ое транс-портира се комплекеира с иротеии-псдашатМмонЕгат, чийто про-теинова част представлява протеин, който иаа способността да сесвързва с Т-кдетъчния-повърхностен протеин, примерно СД4, иклетки, които експрюодрат този повърхностен протеин, се поста-вят в контакт с получените протеин-поликатйон/вуклеинова. кисело- • в
не комплекса. Доказано бе, ме трвнспортараната с пошда на та-ва система в клетката ДНД» моке до бъде есперинентдрона· Общ признак а тези две изобретения е» че използват специ-фични клетъчни функции, за де направят възложи транспорта нануклеинова киселина а клетвата шш де го улеснят. j з двата случай приенаците механизми протичат при участи-ето на фактори, колта в рошите на настоящето изобретение сеозначават като интернолизираця фактори · Под това трябва дасе разбират «актари, които, в по-тесен или в по-широк смисълса специфични за ялетъчния тип, евентуално при съдействието надруги фактори (депример клетъчен повърхностен протеин), коитосвързват към повърхността на клетката и янтернализират. (Придвете поегоре споменати изобретения интернализиращаят фактшетрансферни, съответно протеин свързващ с подобен на Т-кле-тачната повърхностен протеин, примерно едно анти-СД4-антитоло)·Пнтернализиращият фактор е коюзгиран с вещество о поликатйоненхарактер, които въз основа на тяхния афинитет към нуклеиновикиселини образуват съединение между интернализиравдя фактори нуклеиновата киселина. (Поради това, такива вещества се ое»начеват като "вещества с афинитет кън нуклеинова киселина” иливъв връзка е ДйК "ЩЖ-свързващи домени”. Догото такова веществокато съставка на конюгата образува съеденеиие между нуклежова-та киселина жтернализиращ фактор, по-надолу де се означава ка-то "свързващ фактор2'1) · В хода па дези две изобретения бе установено, че nose дасе постигне един оптимум ара приемането аа нуклеинова киселинав клетката и то тогава, когото съотношението конкгат : нуклеи-нова киселина е така подбрано, че материализиращият фактор -поликатИон/нуклеинова киселина - комплекса е в широка степен • ·
електронеутрален. 1Сато се иазеовд от това наблюдение, подобря*ВмТ се методите, коиТо изподзает материализиращ фактор-еаързззцфавтор/нухлеивове каселида -комплекси за дшюргироне на нукаеа-нова киселини в ао-висаи еукараотни кяеткп. 0« i&amp;aep и съввтора, I99io, е опасан метод» о помощта asкойто мода да co подобри еддцентността да система, при коитоприошаото на нуклеинови киселини се извършва чрез интернали-аираща фактора. шоличветвото на приетата в клетката нуклеино-ва киселина не се намалява, ксгато част на трансфеян-лодика-тйон-коюгата се замени с нековаявнтно свързан поддкатйощ вотделен случай даде да се постдгае дори значително увеличаванена приеме на ДсШ. изследванията на молекулното състояние натраисфераичюликатйон-плазмка-.в! - кошшлксите, които се по-лучават ара оптимално съотношение аа дайС/кондавт, показват, чеаяазмидаата-ДНК в присъствие на копитата се намира в уплътнениторовдни структури (подобни да ’’понички") с диаметър от около66 - 106 вш. Проведените опити esc свързани кш ϊ-кжетките протеини ка-то интернааазиращ фактор дават подобни резултати. Прибавянето на свобода субстанция яли субстанции с афини-тет към нуклеинова киселина съдейетвуаа съда така за повишаванеефициенцията аа импортната система, дори ако се използва катосвързващ фактор друго вещество с афинитет кж нуклеинова кисели-на. Описаните от Вагнер и съавтори 1991а» комплекси» които сепоемат от πο-висши еукариотни клетки чрез материализиращ фак-тор през евдоцитоца» съдърдащ нуклеинова киселина» подалексире-аз о един антернадизираж фактор-свързаащ фактор-кенюгат. Допъл-нително комплексите получават ода илй повече субстанции с афи-нитет към нуклеинова киселина» които евентуално са идентична със Q »······ ..*··· ·.»··»· — C — * ·.,* , ,. . сзързвзда фактор, в нековолентно свързана форма, по начин, чечрез кояюгата получената 'лнтернализация а/или експресия ва нук- С-6 декиовата киселина покачва. Това на пърмс място мода да се дъл-ги на конданзирадо въздействие, по сад така е възможно да седължи и на други механизми. Дори ако е помота на тази метода могат да се повишат екс-просмаяните количества па импортираната нуклеинова киселина, тявсе пак подавай ка ограничения, използваемостта на тази системав дадена връзка не се определя изключително чрез наличието надажеп за системата кдетшен повърхностен рецептор» ограничения-та при приложението на тази система се дължат вероятно на това,че еидезоюте ,в които са инторнализирани конюгат-ДНК-комшюксй-тс, попадат в лпзозомате, пъдете те се разграждат ензимно· Зада се увеличи частта от нуклеинова киселина, която попада в яд-рото па клетката и там съгласно своето предназначение се екс-аримира, са проведени скити, които предшествуван настоящето изо-бретение, я с която се опитва, да се проведа траасфекцмя иаклетки в присъствие на субстанции, които янхнбирет ензимната ак-тивност в лйзодамите, така наречените лизозоматропни субстанции.С помощта на тази мярка, ножа да се постигне едно пс-силнс вкс-пресиране на ампортиранйте ,ШК; постигнатите реакции бяха зеепак в зависимост от използваната субстанция много различна -подбрана знзоматропна субстанции предизвикват усилване на ген-трансфера, додето други го дори инхибират. Така например бешеустановено, че ех.:щиеатния импорт на ДШС зависи от присъствие-го аа олаОага бвз» хгорсаш (>Bto at al.f 1990. 0ott.B a^J,,Постигнатия с хлорожн е^ект не трябва до се счита, или поне несе дължи изключително аа това, че хлорохин повишава рП-стойнесг-«а на ливогомите· въз основа на разлят експерименти беше уста- 9 ноаево, че други субстанции, които съдо като хлсрохян притежа-ват способността ж модулират стойността на ри, като монензин,амониев хлорид или цетилашиш, не могат да заменят хлорохин, ка-то при различни опити, някой от тези субстанции показват дорийшшбираж ефект. Освен това беше установено, че различни целе-ви клетки показват различни реакции върху еднакво лизовоматрсп-подействало вещество· Тъй като гевтраисфера по физиологичен пат, както го показварецептор-посредначаш на ендоцитоза чрез нуклеинова киселина -комплекси, показва голяма предимства (нетоксичен механизъм напреминаване през клетъчната мембрана; възможност за приемане набиологично активни нуклеинови киселини, като гени, гении отря-зъци или клетъчни пункции иа специфично инхабирани нуклеиновикиселини, по прекъснат или непрекъснат начин; възможност за спе-цифично за клетките торгетинг; получаване на ксиюгати в голяшколичества), съществува пеобхеджостта, тази система да се на-правя по-е^ициентиа. Задача ва настоящето изобретение е, да се подобри импортааа нуклеинова киселина в по-васши еукариотки клетки. (Подпорт*, съответно ?треисфери в рамките на настоящето изобретениесе ш предвид освен влизането на комплексите на нуклеиново ки-селина в клетката през клетъчната мембрана, но съда така и лока-лизирането на комплексите, съответно на получените от тях осво-бодени нуклеинови киселои вътре в клетката до достигане на под-ходящо за тяхното експреоираае място). По-васиите еукариотни , клетки са известни за специалистите; дрождите пе се числят къмТЯХ (“Stson et ol·, 1987). .погобройнц вируси осъществяват проникването са в еукари-отния гостоприемния чрез механизми, които по принцип отговарятна рецептср-поереднйчест на ендоцитоза. ъирусна инфекция на ба- — Хи — · · · · »» · · - за на този механизъм започва най-оодо със свързването на вирус-ни частички кж рецепторите на клетъчната мембдана. След товаследва антернализярането на вируса кж клетката. Това интерна-лазаране следа общ път, отговарящ на навлизането на физиоло-гични лиганда или на макроаояекудв в клетката: рецепторите аър-нупов^ъ-жостта на клетката се подреждат първоначално в групада да образуват тшш наречения пкотед tuT!!(cooted pit > , след което мембраната се всмуква на вътре и се образува обграден отобвивка ьезикел ( veeikel). След като то за аезккел се освободиот своята 1йштрин-обзивка, във вътрешността ду се извършва под-оеляваие с помощта на локализирана в мембраната протовова пол-па. С това се предизвиква осзобслдазането на вируса от ендозо-аа. В зависимост от това дали вирусът притежава дййядйз обвивкаили не притежава, co имат предвид два начина да освобождаванена вируса от ендсзома: в случай на така наречените годйг виру-са (например аденоварус, полиовида, рпновдрус) cfese предложе-но, ниската рй-стойност да предизвика кон-ормзцлонни промени ввирусния протеин* С това се освобождават хцро&amp;обна домени, ко-ито при хпзиояогично рй не са достъпни, v това, тези домени по-лучават способността да встъпят с евдозов .мембраните в обменнидействия и с то^а да осъществят освобождаването на вирусния ге-ном от еадозома в цигопдазмата. За вирусите с яиаида обвивка (като например Veoicular ^toaiatitis Virus, ienliki forest Virus,influenza virufO6 олята, че ниската pH стойност модифицираструктурата или конформацаята. на някой зидапрстеина, с коетосе насърчава фузията (сливането) на зиданата мембрана с ондоз-ошюта мембрана. Вирус , които с помощта на този механизъм про-никват в клетката, показват определена молекулни особености, ко-ито т&amp; дават възможност да розчупат ендозошюта мембрана и с то- XI - ва да си осигурат вход в цитоплазната. Други вируса, като напришр притежаващите обвивка вирусиsend«l » й някой -oiouey -леакемичим вирусни щамове, или испритежаващат© обвивка вируса Sy4o и polyoma нямат необ-х~ к, даеттз от ниско рй на средата зз да проникнат в клетката. Ϊ© могат директно върху повърхността на клетката да предизвикатфузил о мембраната (saMai virus » вероятно Ш) или те могатда развият механизми е които^зчуп^ат клетъчната мембрана игада е арешядат. ирисш се, че и независещите от рй-етойвостта зи- могат да русиХШползват ондоцатозиая път (icciure ot ai., 1990). Пра решаването н© поставената задача се излиза от предаоао-жсЕието, да се използва ьшханизяа на определена вируси с коитоте навлизат а еукариотии клетки, за да се подобри импорта нануклеинови киселинни комплекси в клетките и с това да се пови-ша експресията. опитано бе, протеини заедно с вируси да се интернализиратв клетката <otero и cerraseo, 1987). йрн това бе устано-вено, лермеабилизаренетс на клетката от вируса се използва аазмъкжше на макромолекули. Йрл протичащите при това процеси мо-же да се касае до течнофезови механизми. Зъз основа на впи де омаяния растежен доктор ( vp^eraalGrowth factor, да?), аовиРирвн токсин, бе установено, четоз-5 еетестзен лиганд, който след свързване със своя рецепторчрез ендоцитозз се поема в клетката, заедно с аденовируса, кой-то също така се поема з клетката през рецептор - ендодитоза, по-пада в садя ендозом и от него, съда заедно с вируса, се осво-бождава В цитозояа (MtssGeraid st да., 1983). С изненада бе установено, че присъствието на определениагенти (например вируси, вирусни компоненти или други активнаведаства), които по отношение на входящия си механизъм в еука- - Ϊ2 - рнотни клетка показват свойства аз определени вируси» садеяот-вуаат за зазчптслио повишаване на окспресираното количество начаст ог кокадакса на ишюртирвпата в клетката нуклеинова хлсе-даша· Тона откритие бе преда всичко за това изненадващо» твйкато аристзивв клетката нуклеиново киселинна комплекса са мно-го гсшша. настоящето изобретение се отнася до състав за трзасфокцияна до-васма оукармотнн клетки с комплекс от нуклеинова киселинаа субстанция с афинитет нвм цуклаинсве киселина» конто езепту-слис а цупедузап (свързан) с аптсрнализирац уактор за тези клет-ки. Съставът се характеризира о таза» чс· съдъраа средство» ков-ка яда способността» поначало ала като съставна част но нуклеи-новокиселшвия комплекс» да се поема от клетките които ще сетраясфщшрат и да освободи сшриаиието на еадошшште» вкоито кошексо се локализира след навлизането в клетката» ацптоддазиата. По-нататък» това средство ще се означава като *ендсзомоли-тне средство0. Способността по ендоомодитнотс средство да се приема вклетките за трансфизиране и едършшаето па ендозоните» в кои-то след навлизането в клетката те се локализират» да освободив цатошшвмата» по-нататък да се означава като ’‘приемащафункция”· Таза ярискада функция се състои от способността» ак-тивно» през редаптор-зависевдевдоцитозви жданмзнн» али пасивно»през течната фаза или като съставка на цукдеиаокиседяшшя коа-ддекс» да се иатернализира в клетката» а от способността» даразпука ендозсиите» конто най-общо се означават като ”евдожшо-длтична актавиост'* ала "ондозоаодиаа”· к едно от изаъааенаята на изобретението ендоаомолитичнотосредство е вирус. Съгласно друго изпълнение евдозодалитното сродство е вирусна компонента. Вирусът, съответно вируснатакомпонента, които се използват съгласно изобретението, се оз-начават по-нататък като «сзободза вирус" съответно като «сво-бодна вирусна кошюнеота". в рейките на настоядас изобретение бе изследвана но раст-ящо доза от адановируса върху геитрансферная капацитет наконстантно количество траксйерпн-пслиакн-кспюгзт в Bela -клетки, при кс'!то коте репортерен геи се използва ауцифе-резон ген» Предизвикания от адевовирусе усилен геатравефор ,усилването достига един даксаьун при I х вирусчастички наклетка, число, поето отговаря на приблизителния Орой от адево-вйру<ж-ре«епюри ве йеХа - клетка. До 200 пъти усилената лу-цл.ерззиа-експресия спрямо експресията, която се постига самос трейс$0ряй-полилизйв-1Ш1шгатй, отговаря иа по-високата ви-русна доза. й друга серия от опити се изследва капацитета вадаштираци количества от ко{шгат-дШ{-кокплексй в присъствие наконстантна адс но вирусна доза. Установено бе, че нрлоиавето наадояознруся в клетките при последвичеството на травофериа-аади-лизин при гентревсфере се усилва при орок диапазон от ДшР-до-зировки. ^аксяжлнате сила аа геаексяресаята, която се поетатачрез кеявгет-ДШО-коналекси, отговаря на силата, която се пос-тига с ΙΟυ-кратво по-колко дНК, когато се използват адевовиру-си за усилвана im трзнсйрекцйонефйцйеяшшта. действието на адеиозирусите върху гентравефера бе изследв-ано както с кекомплексирани, тока и с които са с полшш-зин или с трансуерин/коиитати кожшексиранй Uxr. 2Λ). Съг-ласно тозл анализ, присъствието на адевозирус усилва през времепа траисдекцията трансфера на голя, ае-комплексиракн ДЕК самонезначително. За резлика от това, тракемра на кошшекси-раии с пслилйзйн иди с трьнс-ерйн-полкдизин-коиюгатигсе усилва • · пр-л прибавянето да вденовсрус, при което този ефект е значител-но по-силен пра трзпаЛарин-аолш1йзип-кошзгатате. М като по»дмкзтйонката част а кошзгата не служи само за създаване дасзръаката аеяду Ж и трансферни» но cw тека предизвиква иявни структурна продаци а структурата на дМ (конножеаране атороиднй структури; Вагнер а съавтори 1991а), но® въз основана експериментите първоначално да не мой© да се направи разли-ка, дали наблюдавания ефект се дш на усшгез транспорт аакондензираната с аодшатйон ДШС в течдата фаза -ю се дължи напредяззикено от вируса увеличаван© ва траке дерта да рецеятор-свързан кошгат-да^Исожаок. За да се направи разлика между те-зи две в&amp;змоъпости, бдха продадени допмкитолшв опита за свърз-ване <ф'.тР7ре 35). Свързването да трБЖфзрин-аоймлизиц-дНК илип<шлизин-лУпЧ-к13Ш1дексз прк ниска температура без интернаяиза-рене доза възможност, преда третирането с аденовярус, излишниякомплекс з точнота фаза дв се отстрани (*даераяд а съавтори»1985). Когото се подхода така, транспорта да рецеатор-свързани-те трйноферип-полпйизий-ДйК-кокплекси се увеличава значителнопри прибавянето на оденовирус-чсстички. Това не се случва принолйля8ШнЩЖ-<юш1лекеите. поради това» специфично се усилванавлизането ns Ж з осткота през рецептор - евдоцятоеа· •повея това беше изследвано, коя спецйфйчне функция на аде-ногфуса способства за усилване ва йзподздания лото посредникрецептор геитрансфер (фигуре 50)· Слабо третнрене с топлина навирус-частичките не променя тяхната способност да се свързватс клетъчната мембрана на целевите клетки, да повлиява на спо-собността иц, ежд навлизане в ютчеата да разпука евдезода(даГзг et ai., 1990). бъз основа да тези дадености, молехаразличните ефекта на вируссвръзката а да навлизането на вируса 15 » ,, ,: ,|· а клетката да се изследват по отделно. При проводваите в рамки-те на настоящето изобретение опита босо установено» ме топлинноянактивираие на способността на вирусите, аротима дий преа ре-цептор - еадоцетоза гентронофор де бъде усилен, нададш отдаде,ит тук бешо направен жзжде» не усилваното на генетраасфвра чрезтрапсферия-^озптаона-^ошората се дъда специфично на способност-та в® аденовируое де регпусква (рсзградо) вцдовоми. Факта» череяликоцповно-де^вктеа вирусен щад »ose да доведе до усилванена генепспреоията, потвърадава сзсвдоиете, че тоси феномен се дъл-жи· на на репдтоцдажж фуквдя» а па приемащата Функция ноBH1W. Зв да се изключи зъзизаността» усилването ва геввшшреешг-та де се да на евентуална тронеактоацйя из йшюртйраийя генчрез вируса, бяха проведени опити с клетъчна ллжя» която коа-ститутивйо акспримирв SS У-дуциферааайЯ - гея; лдешожрусатоне показах® при тази клетъчна ляния ефект» даете в паралелна-та клетъчна линия» в която генът е въведен посредством транс-ферймоложзо-нотоатй» предизвиква ясно усилване as. геаеко-пресията. Тази констатация пояснява» че сдевозаруеа повлиявана събития, които настъпват преда транскрипцията, че тяхното .·усилващо действие въздейстзуаа върху гешишорта, о това ваниво на геиидпорта» а но па ниво геавясдресиране (фиг. 5). В рамките на настоящето изобретение беше проверено и дру-го» какво въздействие показват аденовирусите върху гентрансфа-ра посредством трвнефер^да-по^тжжзйн-коцагатй а подбрани клетъч-ни лмвии· Установено беше» че надачиетс на тренеферив-рвцевторивърху целевите клетки е необходамо, но не във всички случай тое достатъчно за да се направи възтен гентрансфера посредст-вом троасфераа-полилизиа-конвгата. Специфични за клетките фак-тори, които са във връзка esc сзйбата па иитерналязиранатв в • · - 16 ендсжжда кокягот-Ж^о^шлексхл, изглежда че пграал. ©швдаво*не роня ъв резяере ио ревлразюферо, даШ шж© да оо продадепо лозя тал. С оглед да лова, изследвани бяха няколко водЗра-ни клешвв линия, owe да отношение на геатревсдер жредс»·ои лренс^рш!^ж2дао-даняр©ли, каяло и за усидвене на ген-трвнсфера чрез ед©аозйруда,(фйг. о). Кзнт® аз циелична фаб~розно-клелляно линия (СРТХ) показаха ударена здифврваве-геи-екепресия след третиране с лр^ис^юрш^аолиддая^ШК-ксшпдвкси самостоятелно» Слваента на експресия заачиледда се поаниава црмлрептрапв е вденозирус 012» ?а разлика от лова, КВ-каалда, коило са лреларени о лреисфеда-^ожпдана-даишкЕмвдая, вал-реки наличието на лреас|врйй-р©цеплора, показвал луциферазнагеиекепреепя, която едне надавана надало на фона» Трслиране-ле е адеповярус <й312 предизвиква все пак при лози клало ясаодоказуема яущ^ерет-далгвведа· Но подобен наш да проявяваи третирането е адеаовяруск иа НеХа-оелкя, πρε каело този гефакл при леда каолин е тчялше по сода» Ш кале йеХа-оел-о 8 КВ-каелкз притежавал приблизително еднаква брей рецептори № е* в броя не т^неС^н^родадаркте, хвт да харак-терни за дадсв клелзпев тил» За реалжз ол лш резужтатг, кле-тъчните линия VYI-38 a &amp;Ж-5·, за кожле е ззвсствс, ле ара ляхинфекцията с аденовирус сода слабо да развива ( а шжзеп, 1935)· с кок© да да подаат езда много слабоусилване ве чрез конюгат-ДНй-ксмпдекса самостоятелно целенатагедокдаредаж· Третвревело ^&amp;лк.а2вкт-<;н;><агд^е^’ с адашивнрус даже де усет геадарадафера посредством яоавлал-да-аомв-лекеа дамо в теза случа!, пра поило е зшжн гснлренсфер през • · - 1? оздя път я той да протича пнейщйентио, кцдто при ПеХс- и ICB- Това клетките. ме етевентз as усилване при различните цслезя клеткизначително варира, може да се дължи на щектс, че тсзд ефект екакто пункция на броя на зярус-рецептсряте, копрже? на адено-варуо-рецепторзте, да дадзи определен клетзчеа тма, жакет иот броя да транеферин-рецепторите. й случай на използване на свободен вирус, то веществото еафйййтат кш нуклеинова киселина е предано органичен поляка*тйоа, който предано е конгягаран с един ннтерналйзиращ фактор. ,» радеяп» не настоящето изобретение беше установено, че пдаопределени обстоятелства, Дйл, която е комплекеяреда сако евещество е афинитет към нуклеинова киселина, също бед интзрно-лизирвщ фактор, в присъствие па свободен вирус коже де бъде въ-ведена в клетката, освен това беше намерено, че при някой кле-тъчни яим, приемането де комплекси, състоящи се от нуклеино-ва киселййв и вещество с афинитет към нуклеинова киселина, мо-же да се осъществи през течната фаза, когато »юпцеитрацйята накомплексите е съответно висока. От опитите, конте а рамките нанастоящето и на предани изобретения бяха преведени, бв'«ве изп-реден извода, че съществен елемент аа способността as пряемаиена нуклеваовокиселиннате комплекси е тяхната компактност, коя-то се дължи не кондензацията да нуклеянозата киселина чрезвеществото е афинитет кж нуклеинова киселина. Лко веществотое а-Л-виитет към нуклеинова киселина освен способността ся давъзстанови широкоразаростриредетв се електронеутралиост накомплекса и да уплътни нуклеиновата киселина в компактнаструктура, притежава и достатъчна способност за свързване кжповърхността на клетката, за да проникне заедно е вируса вклетката, тогава няма нужда за повишаване на приемащия капаци-тет, де се свързва интернзлязиращ фактор кезаяентио кш ведест- • · • · - 18 вото с афинитет към нуклеинова киселина» за да се прехвърли ком-плекса през рецвдтер - евдоцатоза в клетката. Някой клетки по-казват относително висок афинитет кш определени вещества сафинитет към нуклеинова киселина, така че кошатетите от нуклеи-нова киселина и свързващ ч>актор се приемат з клетката, без дае необходимо съдействието на жераализзрад фактор. Това се от-нася например за хепатодгтоза» за които в рамките на‘настоящетоизобретение беше установено, че приемат дйй-аодивмаив-кшашекси. Хари еднс предпочитано изп-ълаение на изобретението, ендозо-колйзното средство е вирус, който е свързан нтм веществото сауинитет към нуклеинова киселина и което жа способността» дапроникне в клетката катс част на кошагат/нуклеиаов© киселина-'комплекса а садърданието на екдазоште, в които се локализирааошшекса след навлизането в клетката, да изпусне в цитеплазпа-то. 1фй друго предпочитано изпълнение евдозомолитаото средствое вирусна компонента» която е свързана към вещество о афинитеткъм нуклеинова киселина и което притежава способността, да про-никне в клетката като част от конвгат/нуклеинова кнсеяива -йимплекеа и да изпусне ©здърдатаето не ендозомите, в коитокомплекса се локедизира след навлизането в клетката, а цато-пдездата. -•ирусите яли вирусните компоненти, които са свързан» къмнуклеинова киседина-сзързващ домен, независимо от начина дасвързване» по-надолу ще се означават като вирусни кошогати”. бирусните кошагатм» които също тека са предмет на насто-ящето изобретение, съдържат вируса таи вирусния компонент ка-то интегрална съставка са функционалната ж конструкция и обе-диняват предимствата на векторните система на базата па антер- • * · · · · - 19 - нздазарад фактор - копагат с предимствата, които дспранасятвирусите в системата. Освен това» .имат вирусните кошарата съгласно тези изпълне-ния да нзобретеняето предимството, че избягват основните огра- ничения, конто са присад не познатите бифувкциовадни коногат-»нп системи за гентранефер нреп рецептор - евдодаоза, като раз-полагат със специфичен механизъм, който прави възможно освобож-дадането нмс1летъчио-всзйкулната система* вирусните кошагатисъгласно изобретението представляват основно концепциовелво от-връдане от рекомбикантните вирусна вектора, мето тази, коятотрябва да се транспортира чувда-дНК се носа на зжвшата странана внрионите. Поради това, с помощта на коаигатите съгласно изо-бре те клето, могат да се поенесат в клетката много голями ган-кснструкц-п, арк което, с оглед на последователността, не съ-ре стзузат ограничения* . рлгодността на .даден вирус, който като свободен вян катосвързан вирус или вирусна част це се използва в рамките на нас-тояцето изобретение, се определя от неговите приемащи функции.Подходящи вируси са от една страна тези, който притежават спо-собността, при троисфокция па клетките с нуклеановокиседийнияК01ТШЗКС, през рецептор - ендоцитоза да проникнат в клетката итяхното освобождавана - и с това освобождаването на нуклеинова-та киоолипз - да проведат от ендоаома в цатошхазмата. ъаз даискаме да се свързване с тази теория, този механизъм може нашдпртлр?нглте з клетката нуклеиново киселинни кошшенон дстшнкезе да п« е от полза, доколкото те попадат при интсрашшза-рзкзте в садто едозома както и вирусите и заедно с вируситеco пренасят от спдсзсмптс з цнтоллазмата. Ако нуклеиново кпсе-лшшите комплекси съдържат вируса в свързана Форма, те сеоблагодетелстват от ендозомолитнате активност на вируса и се • ·
преместват от ендозома в цитопяаааата. При тоаа, би грабвалоФузмята мааду еадозоготе и лизсзомйт© и е това нормално προ-тичащото в тези части аа клетката ензимно разградете Дв сеизбегне· Примери на вируси и яз по-аасзн еуязрчотаа кявтки, в ко-ито те могат да проникнат са например описаните от -^иилдс иКнайп» J990. Шзнрнеживестта из дадена нли^ъчва л^н-л :¾)трансформация чрез вирус, ноШ под фошете тш оясбода л?тпуеco използва аа облекчаване навлизането но нуняетеодакиселпшж-те комплекси а клетките, зависи от наличието л от броя да по-върхностните рецептори зв вируса те целевата клетка. Но о?но-шевае на рецепторите върху клетъчната повърхност за рденози-рус, оаисзии са методи за определяне но броя о зър^г ИеХа -й ωί - клетки ОТ Svensson, 1990 и Defer. 1||0. Към вируси· които оз подходящи за състава съгласно изоб-ретението и чиято ари започване на инфекцията протжеда фучк;ния на приемане се извършва през рецептор - свдоцитога, себроят от една страна вируси без лизида обвивка като аденози-рус» полисаирус, ркаовирус и от друга страна вирусите с обвив-ка /eeieuler Stomatitis Virus. Semliki forest Virus, Influenza virus. ucbok това са подходящи и шшовсте от лоХопеу -вирус, ко-ито зависят от стойността да рй. Особено предаочятани зпрусчза прилагане съгласно настоящето изобретение са адеиовпрус, под-група С» ТИЯ 5, caaliki rarest Virus, Vesicular Stomatitisвирус, полиозирус· раноаяруса и boloney - левкемия тпиρ/сна щамове. дзлсдззааето на ifiA- вируси» които но пр^егкадат ттекс-криятазв» за настоящето изобретение жш предаството, че • · -21 з резултат на треаофскцля в присъствие не такъв вирус ие qq об-разува влрусна ДЙК. В рейките не настоящето изобретение бешепоказано, ме ротовирус HW2, предетажтел на шшсрйавирусватагрупа, аовжаава експресията ка репортерен ген. Прочзводаелност»та на ракозяруса беше аекззааа кекто в свобода рерме, така апод формата на вирусен конктат. В обхвата на настоящето изобретение, под вируси - при пред-поставката, ме те се приемат от клетката и садьрнанието на ез-да аошто, в който те попадат, се освобождава - се разбират ос-вен давите типове,но и мутанти, при които «адедаа или повечемутадаи Мутации на дивия тип, които преда приемащата Функцияса бои различни, по-специално рсаяикацконнатс т< способност,са се загубили. Х’ак»ае мутанти се получават чрез мутации, съответно де-дитациа в вирус-йротеин-регионите, които са отговорни за репди-кацаонките функции и от които приемащата Функция ио&amp; да се да-та в които могат да се компяементирет чрез свакоаъчпете линия,при използване ва обичайните щутагенезнл метода. Към тях сечислят например в случая на адааовирус, и-мутентит· (темп©-ратурпочуастватеяни мутанти), Ш» и АХВ-мутаитн, мутанти, дай-те проявяват в uiX- култивирани гена (ъсркер, Σ9Β8) и мутанти,които показва? а области определени капсидпротейни. Подходадса съда така вирусни щамове, които проявяват съответните ес-тествени щутацни. Решпвкационвета способност на вирусите модапримерно да се изследва с помощта на познатите в литературатаплан - опити. При тях клетъчни култури се наслояват със суспен-зии с различна вирусна концентрация и е помотае на плата накоито те се виждат, ск установява броя аа лизирвияте оетки(Dulbecoo, 1980}» «* 2^? ** «··«·>- - « ·*»· ··· · ·· · · · · поддадяда за използване в решат па настогмсто изобрете-ние са освен това тока паречепито дефектни вируси. Това са ви-руси» при коитоведан зли повече гена липсва необходимата функ-ция за автономната вирусно решшкацмя и за воято те използватпоиоцви вируси. представители на тази» група са Л частичките("defective interferir^j particles·) , КОЙТО се отличават от инфекциозния стандартен вирус, притежават съдае структурнипротеини κοίίτο стандартния вирус» показват мутации и стандарт-ния вирус ян е необходим като помодав вирус за тяхната репли- w'. кадия С нивдз» T9CTi Holland, 1390). представители на тазигрупа са освен това сателитните вируси ( Holland, 1990).друга група е класата на парвовирусите, които са означени като"adeno - associated virus" (Herns,1390). ibi K8T0 приемащитецикли на много вируса в клетките все ода не са напълно изяс-нена, приема се, че има и друга вируси» които проявяват ендо-зомолипи активност, която е необходима зе де бъдат тз пригодниза прилагането им в настоящето изобретение. освен това в рхпште па настоящето изобретение подходящиса атенвирани дивя ваксини ( siaeber*, 19G0) или дамове заваксинация. исвен това, под понятието вируси в рамките на настоящетоизобретение попадат икактивярани вируси» като например чрезхимическо третиране, като въздействие с фораалдехад, чрез УЗ-облачаане, чрез химическа обработка комбинирана с УЗ-облвчване,примерно псорален^Уй- или броадезокеиуридин/УВ-третиране, чрезгама-лъчи или чрез обстрелване с неутрони иноктивярани вируси. йактязярени вируси» каквито например се използват и заваксини, могат да се получат чрез познати в литературата стан-дартни метода (oovis и ЛиХЬесоо, 1980, Moarst и Thiry, 1977)а да се използват зе позянадане на импорти на йШ-кооплекси. • · При проводените в ролките па настоящето изобретение опита,аденовируенц препарати бяха йнвктшзярени посредством обичайнаУз-стерилизаднонна лшша, съответно е ^орпалип. С изненада бсустановено, че степайте но инактивиданс на вирусите е значител-но по-голяш от тази не отнедаае не гентданеверния ефект, кон-те бе постигнат, когато аденовирус се прибеви към тренефевди-опната среда* Също при опити, които се пдааедаха с препаратиот асориалон/Уб-инактивидан бнотинилидан а де но вирус, който екопюгиран esc стрептавндан-купелуван поля лизан, показват, чев резултат на инактивирането, вирусния тптър спада значителнопо-силно от гентравеферная капацитет. Това ясно показва, чемеханизми, които при активния вирус са във връзка с нормалнияинжекционен механизъм, могат да бъдат разрушени, без да серазруша ефекта който е съществен за гептрансфера· йод понятието "вирусни компонента” се подазбярат частиот вируси, аеприаер освободена от нуклеинова киселина протеи-нова част (празният вируедапевд, кайте моме дз се получи с по-модаа на рекоабиаантнй метода, виж например Aneardi et о1
Urotaws et al., 1969)? протеини, които се запазват пра фрзвдонирането, или пеп-тидя, която притеззззт съществената за приемащата Функцияендозомояятна способност на иктаютия вирус* Тези вирусни ком-поненти могат да се получат и синтетично, в зависимост от го-леаината им или посредством пептздна синтеза или посредствомрскомбииавтви метода, й рамките на настоящето изобретение, модада бъда дево за вс, че аденовнрусна протеина, които са кошзгиранкчрез бйотии/стрептааидан с аолилазин, могат да усилят гептраа-суера. Примери за протеинови е рагнанти от да злачни от аденааи-руса вируси, конто са съществени за интераализнраието на ви-руса, обхващат ннфдуеицзвйрус-хе^шгглутдамн (ПА). Азотния 24 край на последователността на инфйуенцавйруса-хешгглутиджиниД2-подеданйца е отговорна за освобождаването не вируса от ен-дозома. показано беше, чо пептади, които се състоят от 20 ама-пекаседшш от тази последователност , могат до разпукат/разруаатлдодаи домбраю ой да га ДузиониратСйПа^ос et ei., 1988). В настояцето изобретение бяха използвани с успех автентични имоднлщпрана пй^луенцапептиди в различни изпълнения. Друг при-мер са обвавъчни протеина на ретровируси, например йхУ <jp4I(iafelski et cl., Ι99ϋ), съответно части от тези вирусни про-теини. използването на вируси, конто сами по себе си притежаватспособността до проникват в клетките, представлява само аспектна настоящето изобретение. Вируси или вирусни компоненти, които само по собе си неносят способността до ое свързват с клетката и до навлизат внея, се използват предимно под формата на по-горе дефиниранитевирусни конюгати. Копелувонето на един ДЦД-сзързвад домен, на-пример пожкатйон, дава възмсжлост, вируса или вирусната дойкпопента да получи силен афинитет квз ,биС-молекули, с тове до /,;W· се компленсира и като съставка на ДпД-кошиекса, който съцотока съдържа интервздшаиращ фактор/ДШ^-сзъравац дошн-конетат,да бъде транспортиран в кротката. Допълнително к«л такапостигнатия транспортен оект може свръзката на вируса, съот-ветно но вирусната компонента с нуклеинова кйиедйна-евързважядомен в резултат на това да ида подобрение на своите ендозо-МОЛЙТПЧНИ свойство. Чрез подбора на други интераализираж Ф-акторм може прак-тически всяка ао-висна еукаркотна клетка да се тренсфедира съссъстава съгласно изобретението. Дали даден вирус, съответно дадена вирусна кажонента • · — 25 — ··· · .. · ·· · шие да бада приета в смисъла на настоящето изобретение и сто за да е подходяща за използване при усилвано на гентрансфе-ре, шже да се установи чрез прост опит из скринаране. В такъвопит, например за тестузането на даден вирус за приложимосттаму като свободен вирус, целевите клетки се поставят в контакте да-кошшекеа в присъствие или в отсъствие ка вируса. Коли-чеството дНК-кошшекс» което се освобождава в цато плазмата, мо-же след това чрез доказване с иаркергенен-продукт, например лу-цифераза, да се установи. Ако арисъстваете на вируса осигурявапо—голямо количество ,Ж-комплекс да се приеме в клетката и дасе освободи в цитоплазматз отколкото отсъствието му, то тазипрнематавна функция да се дължи на вируса. Възможно е същотаке, тостування вирус да се сравни с друг вирус по отяоиеииена приемателната му функция» зз който е известно» че притежаваподходяща приемателна функция, например с аденовярус, подгрупаС, тип 5. 1акива тестове могат да се проведат също така и е ви-русни кошогати, като при тези тестове могат да се включат н до-пълнителни параметри като различни интерналазараад фактор-ксн-югати, в различни количества. Освен това един среден специалиств областта моме да използва опити от този зид, евентуално заед-но с друга изпитания, като например опит зо пропуекаивоет налапозомате ( *Ь1розоаап Lesle&amp;ge Assayо") , върху вирусна когл- понента илн други средства с потенциална екдозомолитна актив-ност, зз ж га изследва за способността им до повииават геа-експресирането. в случай но използване на антзктни вируси, целесъобраз-но е» успоредно с предварителните опити, в които вирусът сеизследва по отношение способността «у да усилва гентрансфера»да се изпита дала вируса е способен да се реплнкара. Изследаа-н ята за роплшшциоина способност з случай на цатапатичнк вируси таи в сяучьй ас вируса, който значително повлияват рас-тежа не гостопрмемкмка , се извършва с помощта на опити върхуплаки (сравни по-горе), при други вируси се използват доказва-цл метода специална за дадения вирус, напршер хемаггдутионатз-о« тоста или хшико-фцзачви методи (елакронно микросвопокв)· 3 ражате на настоящето изобретение, по-специално когатоси използват свободна вируси се предпочитат такива вируси, ко-ито се добиват във висок татър, които са стабилни, които катодив тип показват незначителна патогенност и при които е възмож-но целево изключване иа реанимационната функция, по-специалноаденовируса. догето трябва да се траиефшира определена кле-тъчна популация, предпочитат се вируси, които специфично ин-фацирвт тази клетъчна вопулация. В случай, че трансфекциятатрябва да обхване различни клетъчни типове, могат да се изпол-зват вируси» които са ш^окцйозий за повече клетъчни типове. Изискванията към вируспрепарати са по същество възможнонай-еоляиа чистота, както а аапасван кш дадения вирус стоби-Лйзнрац буфер. Във всеки случай за лечебно приложение па настоящето изо-бретение иа живо могат да се използват caw такива вируси,съответно вирусна компонента, при които рисковете по отношениена сигурност, по-специално по отношение на рапликацията на ви-руса в клетката както и рекишзпнирането на вирус-Дйл с госто-прлемник-дал, са сведени в най-исляма степен до минимум. С предимство може да се използва входящия меха низш навируси, който заразяват други животни освен хора, за да сеусили приемането и освобождаването на ДШС в по-висаи еукариот- ia клетки, по-специално в човешки клетка, докодкотоХпоказваспособността в клетките да разпука ендозомите. членове иарадйлмята иа аденовирусите бяха изолирана от птича видове, • · ♦ ♦ * * t *»· · * * · * . 27 - : ‘ ’ · ···· ··· от амфибии и от различни други животни (виж например barer et al., 1971} Brass et al., 1991·, Akopian et al., 1991} Takaae etu Reece et al., 1987). al., 1990; Khang u Ragaraji,1989 Амфибиини-, ПТИЧИ- , говежди-,кучешки-, миши-, овчи-, свински- и маймунски аденовируси, как-то и човешки аденовируси могат да се получат от Американскататипова културална колекция, Роквил, йериланд (виж Американскитипов културален каталог от животински вируки и антисеруми,ChXamydae and Rickettsiae, ¢. Aufl,, 1990, C. Buck u. G. Pau-lino Hag., S. 1-17). Възможни предимства при използване на вирус, например нааденовирус, от отдалечен вид може да бъде намалена токсичноств целевите клетки (примерно не се е очаквало от птичи- илижабешки-аденовирус да се реплицира в клетки на бозайници илиекспресията да инициира по-ранс гени), един в сравнение с чо-вешки аденовирус намален риск за изследователя, който създаватози вирус от отдалечен вид, и намалено смущение чрез антителасрещу човешкия или миши-аденовирус. Липсата на смущение чрезчовешкия или миши антитела е особено важно, когато вируситеще се използват за генна терапия при хора или при мишка. Птичият аденовирус CEID (Chick Embryo Lethal Orphan Yirus)не показва реактивоспособност с антитела, които разпознават гла-вните групи впитопи на аденовирусите, които инфектират клеткина бозайници. Освен това, СЕХО-вируси могат да се отглеждат вяйца с ембрионално развитие, за да се получат голями количест-ва вируси (0.5 мг/яйце; barer et al., 1971). Както се вижда отпримерите, СЕЗД-нолилизив-конюгати усилват ДНК-транспорта вНеХа-клетки в степен, сравнима с човешкия аденовирус 61312.Използването на СЕЮ-конюгати за усилване на ДНК-транспортае поради това за хуманната генна терапия много обещаващо. « ·« »· ” * « ·* '1 » · ч • * * » · * I - j — к£ — · · · · ' · · вируси от отдалечени видове се предпочитат като съставкине вирусни ковсгатй в кспбинационка комплекси (съгласно дефи-ницията в рашже на настоящето изобретение). 3 кошзгатзте съгласно взобретонаето, които съдържат вирус,^ода свързването на вируса ш нуклеинова каселина-свързващдомен да бадо ковалентно длл да не бъде ковалентно, като пое-додето поде до е през биотиа-стреатааадааов мост шш, в случа!че вируса аритедаза въда повърхностния оя протеин региона, ко-ито са кпоеля и поради това могат да ое евъраат е пояшсатМон»през Зоака връзка. Дри опити в рамките па настоящето изобретение бяха обра-зувани комплекси» която позволяват йонно обменно действие даждуаденовируса и полшшзйн преда компяексирапото с Дйй. аато кон-трола бяха преведена опита при условия, пра които полиямаин оенеутрализира първоначално с ДШС и обреда тона не е свободен дасе свърже къи одаповарусе. Дра тези опити комплексите с йонносвързан адаиозирус се оказаха по-дебри. Примери за вирусни компоненти в кошагатите с ендозоиолит-ва активност съгласно изобретението са празлите вирусни капси-ди или вирусни пептиди. Свързването на вирусните компоненти къмнуклеиново каселипя-чг^рзвада-домни поде да бъде кова лентяи,например чрез зш-ичееко ксплуване as вирусния аептад с полилй-зта, г.ли ае-кезодентво, например Йонао в случай, че вируснитекомладааги имат кисела остатъци» за да се свъраат вън аолика-тиои. Съотношението на вирус или вирусни компонента към зещест-с© зотс с аййнитет кан нуклеиново киселина аозе даЧварире. В слу-чая на ^шфлувнда-хожгглутйиашшатйд-йодаййзиа-кешйгата в рам-ките на настоящето изобретение беве намерено, че гентранофорвсе усилва в по-голяма степен» щогато съдърксняетс не вирусен • «»*«*· - 29 - .:. : ·..’ : .. - аешвд а кашсгзтпте е по-високо. Настоящето азобретешзе се отаасл а дар аспект до методаза получаване на кошагзти от вдас(кожоненти) и вецества е афя&amp;штт към нукеянози киселини. Вирусните коштати аогат (както татернажзиращ фактор-по-дддогйовиюндоатнте} да се получат чрез свързване (котиране)на компонентите ш» а случай че вирусната компонента и полипа-тйова са пептида по рекомбйпайтен начин. По отновеете на мето-дите на получаване се има предвид описанието не ВР Ж 75&amp;. подаването (свързването) на вирус, вирусен протеин или-пептида с полиаииновмте съединения по химически начин иоее дасе осдастви пе сау по еебе си познат път за. свързване на пеп-тида, при което, ако е необходимо, отделните компоненти предиреакцията на свързване се ок. бдяват с яинкераи субстанции (та-зи мярка е тогава необходима, когато няма налице по-начало под-ходяща Функционална група за езьраването, примерно меркапто- злиалкохолна група)* При лиакерните вещества се касае зз бданкцио-нзлаи съединения, които първоначално реагират с функционалнитегрупи на отделните компоненти и след това се провежда свързвано-то на модифицираните отделни компоненти. Свързавето шж да стене чрез а) ДасулФидал мостове, които при редукционни условия от-ново могат да се разцепят (например при използване на сукцин-имидшши!ждилдитиопрош<онат (Joag ·1 al., 1981). S) йри биологични условия пра което се получават стабилнисъединения (капридер тиоетер чрез взаимодействие на маяенждо-лннкери с сулфхидразпш групи на свързаните към втората компо-нента линкери). о) При биологична условия при които се получават лабиши -30- ... , .. - ... мостове» примерно естерни връзки» или при схшо кисели условияco получават нестабилни аце талии или кеталнн съедоне шш. и ремките на настоящето изобретение проведените опити» еп-дозомоявтнм йпфзуенца-хеаагглутйнин ПАк-пеитпди с ислкдйзин сесвързват по хмчен начин чрез сукцзшшидо<лпнр:1дадетиопрот!о-нат С6РД?). показано беие» че модифицирането,па пептида е пола-йкзон увеличава еддезонойитната активност» Треп&amp;рекцаотш ексае-римеитя показаха, че ефициенцията чрез посредничеството на тро-кс-ериа-лсшойзкЕ гентрансфер значително се покачва» негатаиндаенцваептчдай-полалазйн-ко1Шратите заедно с трансферан-чю-днлизии в /.Ж-вомпяексйте се аалица. йо-нататък» а рамките на настоящето изобретение» аденоаи-рус бе свързан о помощта на различни метода къв полилизин. гдан начин на свързване към недилазин става по подобенначин както ара получаването на тренеферин-аелилизин кошйгатиС iiasi»!· st si·» 1990) след модафицкрене из дефектния аденовмрус <ЯХ312 чрез зсетеробифункдаонален реактив. Несвърза-ният аолилазан се отделя чрез центрофугиране. Способността засвързване на дйл се потвърждава експериментално с радиоактивномаркиране ДНК. л KS62 клетки в отсъствие из хнорохпн дока с комплекси»състоящи се от доШ» адеповируо-полилй8йк а тр^нефериа-полшш-злн кока до се постигне значително по-висок геитрансфер откол-котс с немодифициран аденовирус, който не е свързан вам дом. Осен таза беше намерено» че з Heia клетка чрез поямяизйн-мо-дафицаран аденовирус се осъществява ясна гепекспресия сено сО.иООЗ мкг ДйК в 5 х ХО^ не1в клетки. Ако вирусът» саотзетно вирусните компонента показват под-ходяща въглеводородна верига, че могат де се свъркат с зедеет-вото с афинитет към нуклеинова киселина чрез едие иди повече 31 ьмезодородни вериги не глякопротеииа. Подходящ метод as получаване на гзикопротоин-полшдатйои-конигати е описан в германска патентна гаязка Р 41 15 038<4;писана на кратко от йегнер п съавтори, iPSub. друг предпочитан метода за получаване па копюгатите cw-ласне изобретението е ензима ното свързаене па вируса, съот-ветно по внруснате компонента към вещество с афинитет № нук-леинова киселина, по-специално полношш, чрез трсясглутоийна-38. Групата пе трансглутаминазят© обхваща повече различни ен-зими, които между другото се врещат в епидермиса (евдермаянатронсглутааиназа), в кръвта (фактор ШХ) и в клетките на раз-лични тъкани (тъканна транеглутаминаза) ( Folk, 1985). Трансглуташгавзите катализират в присъствие на Са** и приотцепване на образуването на £- (^-глутаетл)лизин свръз-ки. Предпоставка зе това е, в протеините да присъстват съответ-ните глутамини и ггазиж, които ^огот да се превърнат от ензима.Освен £-а?4иногрупата на лизана, могат да действуват като суб-страт (поли)амййй като етаноламин, путреещод, саершш илиеперкида ( Clarke et el., 1959). За сега не е изяснено от как-ви фактора зависи, дали даден гяутанин или лизяп на протеина илиподиамин на ензим могжда бъда превърнати. Дззсотио е, че мно-гоброния клетъчни Протеини, като цитокератин ( Zatloulcel et si.,1989) , тубулян, клетъчни мембранна протеина a cw та- ка повърхностни протеини на ивфдуенц^цируси ( iv/imij, 1977)могат да бъдат свързани към полиамяни посредством трзнеглутами-наса. и рамките но настоящето изобретение шжа да бъдз показано, - 32 че аолшшзин иозю да се сзьрке аденоазруси посредствомтрззоглутаминйзс. Установено бопо, че свързването мсвзс да сепрсзоде в присъствието на глицерин. 7с^ дава предимството, чезпрусен преперат, штрпмер ez^u едсн^ярусеа препарат« койтосъдържа глицерин в буфера като стебилизкрацо ередстзс» кокс дасе използва директно за свързваното. С помоцто as аденовдрус-пслгдиайич^опюгетц, кситс съвмест-но с тренсхерий-полиййЗйй-ко1аагатй с ндазвд-д«д са комааекси-рааа, поло ;ш се постигне многократно по-висока гевексдресияотколкото с тр&amp;нс^ерин-пслшшзйп-ко1Ш1*ати в присъствието непе-подплази1»-свързен сденозирус. друг в рамките но настоящето изобретение предпочитан методss получаване иа кснкгаздте съгласно изобретението се състоиз това» че зкрус или вирусна компонента се свързва посредственбаот^нп-протеотов moot* за предпочитане бпотиа-стреатавадаовмост* към папжтЗошз. Познатото силно асоциирано на биотвн с стрептазидан» съ-ответно а вада ( viiehefc et ai.t 1968} од използва за свър-зването as si^sc вирус кш палелвзин» коте аденовируса ес йода-imnps с биотиа и стреаавада по подобен начин които при съз-даването за тргвсуорян-полжиеанконюгатате ( ««адпог ct εΐ.»1590) се свързва хпгжческл е аодпжзиа. .{ошиокси» състоящи сеот ,Д1К и стрептзвадан-яолилизж, къа които е озързац биотда-но-&amp;дд£Цйра1шя вирус, и евентуално още не-ковалеатно свързания по-ллзизйн, показват много висока транефовциоанз ефдцаенцая, дорипри плени .Дйл-кояцйнтрадйа* Особено в^даеатпп кодплскси се об-разуват, когато бпотйв-нодарацираимя комплекс се свърне първо-начално кж етрелтазпдшьподпдлзия и едва във зтер;· етап доследва свързваното към .ЩК. Рзеитуелпо свързването с_ Сдесгнн ложе де ос осъществи иЧрез аВНДНП. Освен теза е възможно, свръзката между вяруе(компонентата)и иолиаивип се осъществи, коте от еж страна зярусс се био-тлншшра к е? друго се кештире едно аж-бпотшмштотеяо е по-йжзйя я свръзката между вирус и полилпзин се създава чрезбпотин/онтптело-свръзката, при което мотат № се изпеяззот търтааокдаетъвпи ноазклодалпябНСТЯВ. :: лепоклензлии ентитала срещу Свръзката иед^ вируса и полилпзий демде съда така да сеиилучя, дата по.дежгаина се свърже с лектин, който аритеяоваофинитот йж аируо-йсвърквоотенржксвротеяп, при :гоето свръз-ки то прй такъв конятат се осШстмва чрез свръзката междудеотлна и гликоаротеяна. Лко вируса сам по себе ся ае притежа-ва подадядя аздлждрзж странични жфиги, той мезе да бъдеО.иОУВ:? ϊ ДО здОДнрИЕцйрОЗ» ">·.трусът мо.де също та де де ос свърже л с зедество е афини-тет към нуклеинова дясслинз, дата първоначално на повърхносттаоо модифицира е чужд за вируса аатгшен (например ДягоксятаюгаД£$, коЗта може де се закупи οι ъьориигор .денхайм, или с Оио-тйн) и едедпксппото между модифицирания вирус и веществото сурлантат към ^деюлндеа дееделна се реализира през антитела,поето са овързва с този антиген. ДеЗ яетед за получаване нз кзаптатоте съгласно изобрете-нието де е<; използва, се определя от различия критерия. Така,депдедер» сдръзкота чрез биотии о най-поопсцну';чпа и поради най-мдроко използваната методика, тл представлява ината силна не-козалаптиа дръзна, дезлдешта реакция с зролеглутаделаза имапредимството, че моме да се провежда и в ноа-делки мащаби. - 34 Химическото свързваае даД-обдс са използва» когото трябва да се сяптсзпрат вс-гслши количества конкгати, този метод еобиквовако цедесвобразсп, ксгато трябва да се сзърлат ваденипротеина шгл вирусни пептдди. Когато се използват инактавира-ш; вадси, обикиоданс вдактиваронете co предприема вредисвързването» дадато оздравете ада да оо повлияе 02 инактп-пирвнето· когото един вирус, шшранер аденовадс ааи еидозомолитнапотопа кокаонепта, притслава дретмши свързваци домени, пример-но кпссаа домена да свързвана към подшг&amp;т&amp;ш, моме свързванетона вируса, съответно иа вадената компонента кан полииатйонада бъде и йонно. В scan случай положителните заряда на аояима-тйсна, който евентуално моие да е конвгирвн с иятернаднзцращФактор, ое неутрализират частично с киселите домени на вирусаад вадената ксадавнтвк., остатъкът от положителните зарадсе неутрализира з голяма степен от нуклеиновата киселина. Ако ката вецество с афинитет кан нуклеинова киселина сеизползва йитеркздираца субстанция, то то се модифицира е под-хедоц за съответното свързване с вируса или вирусната конно-конта линкер, например за свързването с трапоглутаминаза, съсспариш i-sia с бмфункционално, за химическото свързване воина-тешена група моле примерно да се използва активен естер. Съотношението на вируе(компонента) : вещество с афинитеткда пуклекновз киселина коне да се варира, обикновено се уста-новява емпирично, като например сз коквгарат постоянно количес-тво аадс(койвснецто) с различни количества пелплизкн и такасе подбира онтамълная коаха?ат за трексфекцаята. 4 друго изпълнение па изобретението, поле задсксмаонен-тата, например епдозошиштеи вирусен пептид, да се модифицира,за да мек© директно да сз свърже с Дйл. да таза цел жше лев- твда csm по себе ся да притежава ДНК-свързвоц деен, който ши•ке де се запазя, като пептида се получи чрез пептидио синтеза,при което се предвижда отрязък от положително заредени ашгао-касединй, 39 предпочитане чрез удълзаваие иа пептида, особенопредпочитано те въглеродния крей. При едно друго изпълнение на изобретението, ендоземелит-иото средство е не-вирусен, евентуално синтетичен пептид. йеа^гид ода тези тип се съдържа в състава съгласно изобретениетокато е свързан йонно с веществото с афинитет кш нуклеиновакиселина, примерно към полилизин в случай на ДНК/ивтерважзирацФаетор-полплизин-комплекси. йо този начин се осъществява аграж-дкнето на ендозомолитния пептад в нуклеицовокиселинияя-комп-лекс, като пептида чрез езойте кисели аминокиоеланни остатъцисе свързва с положително натоварените нуклеиново кйседишт-езързващи домени, за предпочитане пояшшзин. В зависимост отхтагческате структура на аептида, по-специално по отношение накрайната *ty група, може овързваното е полиднзнн № се извършии чрез описаните тук методи за свързване па пептндн с аодиаи-зин. За тази цел, когато се използва срещащ се в природата леп-ти д, този пептвд да се модифицира с подаддцв терминална ами-нокиселина като "дръжка" за котогирането. друг начин не-вирусни ендозомолитни пептиди да се вградятз нуклеинозокиселинните-комплекси е този, те да се снабдят споследователности, които се свързват с Дши положението на та-зз последователност трябве да е такова, че да не смущава елдо-зомояптпата активност на пептида. Парада това,примерно· пептн-дн, чийто М—край отговаря за тази активност, се удължава (елон-гира) в С-крей със свързващи се с ДЯК-последователности· Удълже-нията от теза вид могат до бъдат хошловшили хетерожжни ка- <#»
W
оретеяаего дава пзпло-..иос?'да да яо-впсоко еъсгпсвеаяе на екда·
да псдздатйони, да да постигнат ве-впеона произволителност на Де-даруедате ендодаждатнп яелтвд трябва да датозаряг ааспедате изаеквення: По огзояешю па еадозозаожгаазй адавноег трябва оедее»-аеазга чрез пдаедв провусоавосг на лпа^яа^а жгбраза ж··е да предпочитане по-висока пра ниска рй-сго2носг (5 - 6), от·aoxtiQTO пра рН-етоляосг ?. Освен гова, рсзрукеннте част; на
гях да проял даг по-иоляш дДК-ксмпдексп (дад;сп поря пе са доо-гагзчаа}. 3* да се уогааов.·’ дала дадон иегкшд отговаря на та-пи ’лзнскдааня» погаг да да ароведаг опити пи аигро, а коигс
пусшшвоог аа динозоии или еритроцита ( "leakage аеа&amp;уе*)а дасаердаиштд с кдазчна култура, а конто се определя усилва-ното да геаоага експресия. Тестове от този тип са описани зпрадарпте. .да,власти количество пеятдд аохе да се установиа предварително хитруване, каго се ояредеда произаодеаяносг-2u на подучения j резултат ттраисЗер. Прк това трдбва да сеяда арадад, че ароизводпгелносгга аа различите почтидй а да- β· » « тимвлистс ст-отнсгекие ис гогжексз гсгз» лз бе-дят · зависими отКГ РЕЧНИЯ тттп. Роптлдктс i цогтс рг соево? гембряжте, сьд^ржет обвв взе-то ахфтаттлпс! пестсддатежост, е именно едня хидрофобна стра-па, конто годе ?$ изведа е жп^дато иембропе ебгечнн действ-ай, !* едно глцрс*нтда отрптс, която но мястото пя резгясвяие нагсиСрзнгтс етобиггзгрс ведата фезя» ,‘ нр-^сж??· :”:л· ’жгсда прмгере ня пепжж, гойте pec’tsc-ж? мембданте, обикновено зе гетш пепткди ихя зе лвптндан до-нот* ко по-гсжп пептпдй· Теги пепткдя юте? съобразно тяхнатапункция в пстестзен контекст до бжде &amp;ч8С1Сдарени» е киеннот*лг RS7O лептоя лоруиеващг шмбрвяитв (нопримар лепткж яа го-нг зярусл) нДлп (’.узпеяирвщг тираните пелтнди (например па»-тндг пя вируси с обвивка)» Зе резпуктенето на екдозош? зтвгпъгке ow е’0-тс?’*чг? поптиди кога? ж се използват н дата.дасе пс7г??лг лоспедоветшшоетц» Повечето естествени пептядегота? ж обржуза? айфяпагтчш* ос -хвлдая. Чрез вграждано ж кисели остатади hs хт,дробовете странано иредложгаек ог^жзтжн «ч -жяю по вж, че хежихса даложе > се образува casso при жееж рК-стойнсет, ао не я призеутр?лчс рН» прл което отбдавежята *© зарядите между негатив-но натоварените гноели остетж* пред&amp;тврезжаат образуването накежке, мже ж co получи рН-еялцайнчноет. Това свойство сесреда оъцо тока и при естествено ере^ди се последователности(папрдар пзотоя крой ж ж^енца--я.А2-пептда)· 0? Sabbemo е* аХ., ПЛ? е ОТ Panento et *X.f 1990о описал изцяло синтетичен ж-дпотдаеп лелтнд с рй ояецяфячнясвойства за разкъсвал© нп обрали# От този палто, (з свободна•)opjw) бепз глокозаио че образува в мезгбраик само малки пори* - 38 - ... . - . ·· · който позволяват освобождаването само да малки съединения (parente et al., 1390). При едно от изпълпенията на заето w то изобретение, прикоето се използват не-зжрусни, евентуално синтетични пептида,се предприемат обикновено следните стъпки: От -трупат® па естест-вено срещащата се ааи синтетична пептида се избира еда аШо-патжчна пептида последователност* Пептада от този вид принад-лежат кш ша-зото на техниката; преглед на арпиерк са дадена втаблица 2. Ако е необходимо, се въвеждат кисели остатъци (*1и»Asp) за да се направи активността на гюдардае, да разкъсватмомбранн, по специфична от рП-стойността, (например двойнокисе-лия мутант аа йвфлуенца-хемагглутишшпептида с означениетоР5б отговарящ на пример 3?)· Ако е необходимо, могат киселиостатъци също да бъдат въведена, за да се улесни свързванетона пеатвда към подияазина. възможност да се предвиди такъвполнкатионен-свързвад домен може да се състои в това, да сеосигури кисела удължения в въглеродния край, например едваол иго-clu - опашка. подходяща за настоящето изобретение ендезомолитни лепти-да могат сшо така да се получат като срещащи се в природатаи изкуствени последователности се обединят. В процеса не нас-тоящето изобретение проведени са примери с различни пептиди»произведа на описания от Даренте и съавтори х9А0 синтетиченпептзд ЗАХА. някой от опасаните в примерите па настоящето изо-бретение използвани производни бяха получени, като пептида&amp;ААА или аегоай кодификации се комбинират с последователностипа инфлуенца - иептида шш негови моджуикации, например пептя-дае о означенията ^ХА-инф и AAU-P50, съгласно пример 3?. джкйнета на пептндата последователност мож? с оглед да амуипстпчния хелакс да е критична; повишаване нс стабплнссттака къси домени, които са производни на естествени протеини ипа които липсва контекста да стабилизиращия протеин, може дасе постигне чрез удадазоне на хеликса. са да се увили ендеоасяшшата активност на пептпда©, ас·гйт да сс осразузат ховдщдара, хетеродаера или оапгодеери;в примерите на настоящето изобретение беше показано, че В50-да-кора полазва жсго по-силна активност от моно перо. Изобретателите са показали действието но синтетични поп-тади за ирпедапето но посредством трвцсферпмолизиа^н-ко-юогати. Синтезираш: са мкогоброМнк различни пептиди, определенабеше способността ж да направят ливсзоште и еритроцитите про-пускливи и беше изпитано действието км върху дужуеразната-еке-прссая в ίί.> ?3 -клетки п в ШИ 5Т2 - клетки. г. друго изпълнение на настоящето изобретение евдозонолит-нотс средство представлява вв-пептидна амфиватична субстанция,изискванията, на които такава субстанция трябва да отговаря, зада съда подходяща за приложение в рамките на настоящето изобре-тени», са ао същество евдте, както и за амфилатичвите пептиди,а именно да амат способността да се интегрират в нуклеиновокиселинния комплекс, да са pH специфични и т.н. лаобретендато се отнася з друг аспект и до комплекси, ко-ито се приемат а по-висши еукаркотни -зтеткн, съдържащ нуклеин-ова киселина и един попитат, които тш способността, де образу-ва комплекс с нуклеинова киселина, за въаелдаве на нуклеиновакиселина в до-аиеши еукариотни клетки, искллекснте се характе-ризират с това, че съдържат еда конвгат, който се състои отвещество с афинитет ш нуклеинова киселина и от зндозошшт-но средство, което е свързано към веществото с s./лактвт към ЕО <· * нуклеиново шшелипо е еостс ирлтодспс слоспОлсотта, коте съо- хзкс us почпрет/пуклегаозс еесслинок-:й..;ллс1сс ..д. боде прието клетката я дуббддрлсилсто -- опдсссдпте, ~ есеес лхпе елсл» слод наадиза-пе в лл-tests сс дсгхтттпа» д- Длдс ссвоболдзпо в цнтоязиз^тз· :рлдавсзо ллеслтптс лс^л-дстен, лоетс sc еспслзжт вродплтс лг есстонцотс лзсбЕлтсчие, os поедлжс такдвс» нрлксгтс тдЕлепчсвсто еесс;лл*з. е коЕЩлшслрлла е bcwotbq с афа-ЕЕТСТ EST E"EEC*E'Q.3S ЛЛЛЛДЛЕ5 пл еелйе» чс дслддедса G ПС сз> ::,- сос ег.ситронеутрелсн.. При едно плсдлсчжпо изпаднекпо на изобретението ендоао-дслетеотй с-родс^зс е знр^с лл ' знр^сна кошклшпта, което е кова-понтис свгрггно кж лоликзтйон* I? роиптте но квстоя^то изобретеше еадозсможгжте кои*кгети обхзащат - допадютсяно кзй ковтшяее» при ковзо андо-ооисяитиото средство е сзлршше йонно кж ДШС~сжарз?ж дошн «слгдлонл ждпгщкл съд.с й евдозородатш средства, конто са свзьр-геи?; д-рс;;тпо кее ДЕК, пспрг: ср чрез слеело басячло продаде-ше» мирски че '’коиогети* ст този зйа строго ззето «е се по-дучозат през кспюглроие, теза де рече чрез сжрззане ns дагешоиеитя. пункциите ке еидозс; слегне срсдсж от този тип ка-то еъстезш из състава стгплсно изобретението не зззися σε to-ss, допи co сгптеелрепл »рез кснЕгнрсве на еадезошншгао сред-ство п едни -КК-сгързвад долен лпи дели в ецдсссиояктного сред-ство е ееслс чързонечгдпю един ДЕК-езърззад долен. При едно продчочятано изпьлковче кс изобретението» кои-плекенте спппадзт дапъгинтелпо иж зкдезололлтнйя кенюгег иедин допълнителен кодагот, н който вещество е а^йЕпгет кзд нуа-деинозб зпселда, в одучаЗ по свдовсшолйзд волгчкагйонеп-доп-EPST най-обде съдотс конте таза не хончгста, е съединено с • · шстериолнзирац уактор е зишштет кал целевата клетка. Това из-пашение но изобретението се прилага преда всичко тогава, коте-то целевата клетка няма или прлтедава сода малко рецептори завируса, който се прилага като съставка на ецдезошштная кон-агат. Друго приложение аа това изпълнение е, когато се използваВсфусно компонента, съответно природно средац се, евентуалношда^ацарен пептад, не-вируоен, евентуално синтетичен ендезо-молитен пептид или вирус от отдалечен вид, които нямат способ-ността сами по себе са да проникнат в трансфицирани клетка, йприсъствието на един допълнителен интернализиращ дактор-евьрз-вад фактор-коиюгат използват теза ендозомолптин конигати интер-пализирадата способност на втория конюгат, като заедно с негосе ковдоюксйрат към нуклеиновата киселина и като съставка натака получения комплекс, по-нататък означен като "ксмбянацис-неп комплекс или "тернерен коьшлекс", да се приемат от клетка-та. ^еа да исшше да се обвързване с тази теория, комбинащюо-нате комплекса се приемат от клетките или чрез свързване къмспецифичния за интернализирадая фактор повърхностен рецепторили, а случай че се използва вирус или вирусно компонента, чрезсвързване кш вирусния рецептор яям чрез свързване с двата ре-цептора по пътя на рецептор - ендоцитоза. up ;* оезобоадааанетоно ендазомолитното средство от ендозоште сс освобождава исъдържалата се в комплексите /Щ1С. в цитоплазмата и с това се из-бегна яизомаяистичното разграждане. При опитите съгласно иаетоядато изобретение с иеда клет-ки можаха почти всичка клетки да се трансфицират със свободенадспоаирус. Производителността за хепатоцити иша допълнител-но да се дожи, когато се използват тернерни ДШС-коьшдекси,в което репортер-^Ж са комплекеирани с полилязии-транСфСрин-
конюгати и са свързани с аденоанрус. 1‘ук се осигурява общо ло-кализиране на садозомолитния вирус в вв лпгавд/рецептор-коиплек-са в ендозома» при което пра различни клетка» да то BMI..CI2-а ИерСЙ-клетки се поетата практически във всички клетка· Така-ва сходна Ситуация мода да се създаде ,за опитите» при които тер-перни, трвисферан ездърваш» комплекси навлизат в хОо^-ооткитепо-скоро през транс^срхн рецепторите отколкото през адановирус-пате рецептора· изненадващо, терааернв комплекси транспортират ДИК дорп вппого ниски количества. Така» пр.: прибавяне на 50 ру ДИК за5 х W5 плетки се получават 1.8 х 10^ светлинна единици ( в ре-зултат от експресията на подучена върху шшзмид съдържаща се»за вдй‘2@рааа кодирана последователност). йрл такъв инпут върхуедва клетка се падат само 60 ДШИюлекули а 1 й*ц на вирус С’Plaque porains Unit·). 30 сравнение: по-малко еуицвежт-ното кзлциеаоутаителио предписание използва 2 х У? Дги-модеку-ли за клетка ( Sambroak et βΐ.» 19S9). йоредв това» настоя-щето изобретение представлява съществен напредък» тъй като поз-волява ефициевтно трансформиране на по-висаи еукариотни клеткис много малки количества дМ. присъствието на вируси» вирусни кошоневти или не-вируо-йй ендозомолитни средства като съставки аа епдозолитпи копита-та в ДШФ-кожшексите има следните предимства: а) по-мярока прилошшост на генпата трансферно техника снуклеанавоквеедитш комплекси, тъй като ендозомояитното сред-ство само по себе са» особено в случай» че се използва вирусиди вирусна компонента, мода да образува иптернализиращия фак-тор или също така в комбинация с друг интернализиращ фактор(например трансиерин или азиалофетувн и т.и.) мода да се кои- * — ,., , ... ·· « пяексира към ДШ. Поради това е възможно, положителния ефектна вирусите да се използва и за клето, които шшат рецепторза дадения вирус. 2) Подобряване на гонтрансфершзта ефедиевцая» тъй като еъасвързването на ендозолитните когагати към ДШ£ се осигурявасъвместно приемане в клетките. Чрез кординзреното приемане иосвобождаване на вируси и да» по-нататък се създава зъзпомнос-та за намаляване на веоходамото количество да и вируси за дасе получи ©фациентен гентрансфер, което, особено при прилага-не на живо, @ от особено значение. Под интераолизпрал фактор трябва в рошите на настоящетоизобретение дв се подразбират лиганди иди фрагменти от тях, ко-ито след свързване кьп клетката през ендоцитозв, за предпочита-не чрез рецептор посредничещ на ендоцатоза, се интарнализират,или фактори, чиято връзка/интернализация се осъществява чрез^усиране с клетъчни мембранни елементи. Кш подходящи интернадизиращи фактори се броят лкгавдитетрансферна ( Uaunev et al., 1983), ковалбушга ( sennettet ai., 1981), азиалогликопротеини (като азаалотранеферин,азиалокозо^коид или азиаяофетуав), ( Asfcweii et al., 1982),Л6КТИН ( Goldstein et а1.,1980ц Shardon, 1387), съответносубстанции, които съдържат галактоза и които се интервализи-рат през азиалогликопротиенрецептора; маннозилиравд гланопро-теина ( Stahl et al·, 1987), лизозомални ензими ( Sly et al·, 191982), I»DL· (Goldstein et al·, 1982), модифициран LDL( Goldstein et al., 1979), липопротиени, които co приемат Вклетката чрез рецептори (аро dloo/WLb вирусни проте-ини, като HlV-протвйп <|pi20j антитела ( Neilson et ε1·, 1984,,»uhn et al., 1982, Abrahamson et al., 1982), съответно - 44 Фрагменти os тях срещу антигени на igioswoass повърхност, на-пример аяти-СЖ, аоти-СД7; щшотшш като антераеукиа-Х С niseiet al., 1967), Ш17ерлеукин-2 Umith et ul., 1985), ΪΪ.Ρ(laamure et al., 1967), ИНТерферОИ (Anderson et al., 1982), CSP("Colony-etimulating factor*1)» (welter et el., 1987),фактори и раствзкш фактора като инсулин (Marshall, 1985)» вар("Kplfteroel Growth Factor*), (Carpenter, 1984)j PDGP("platelet-derived Growth Factor"), (Heluin et al., 1982), JGP a (Transforming Growth Factor Д"), (Jeseague et el., 1986),нервен растежен фектор (nosang ot а1.,198Йк^лтаоподабен pee-текен Фактор X ( "Insulin-like Growth Factor"), (Schalch et ©1.,19ft), LH, FSH (Aacoli et al., 1978), роСТСЛен ХОрЖШ (Hi- zuka et al·, 1961),йролаюти (Posner ot al·, 1982), ГЛЖОГОН(Aseda - Kubota et al., 1983), тпромдна хормони (cheng et al.,1980), л-е-^а кроглобулин-протеази (.,apian et al., 1979), кавто и "обезоръжени^ токсини· Други примера се акупоглобуланиили тяхна фрагменти като лиганда за FC-рецеаторо или антп-ивунорлобули»-аитатола» които се свързват кш eigs (surfaceImmunoglobulins"). Лятоидете могат да са от естествен шгл от синтетичен произход (вя. trends rhaiwicoi. ci., 1989 aтам цитираните източници). Съществено за пригодността на такива антернализирадефактори в рамото на настоящето изобретение е а) да могат да се интерналазират от специфичния клетвентип, в които трябва да се въведе нуслеиновата кисели-на и тяхната интернализираца способност да не се по-влиява или да не се повлиява съществено, когато секонюгира със свързващия фактор и б) да са в състояние в рамките на това свойство» по из- -ад - t ·*···« 4- * » * · · ч- *6 »· » ·· * ползвания от тях нът, до пренесат пна гръб” нуклеино-вата киселина· Ь опитите в рамките но настоящето изобретение Оеше показа-па широката проошост на изобретението по отношение не ин-тернализиредия фактор, съответно на допълнителен антераадизаращфактор в комбинираните комплекси с помощта на човешки- и ши-трансфертиполидиаий-конюгатй, аззалофвтуип-полилизин-копюгати,гад8кто88-подилизин-коню1’ати, аглутпдин от пшеничени кълнове-рй-понитата, Т-оетки-спецвужни |pi20-pI и знтиСД7-р1-кошаг8ти,па 1Д1-рХ-кошагатй, lp-pr- и авти-Хо-рХнсонхгати, както и с по-мощта на Д^Ш-подпдизиФ-коьшлексп, които но съдържат интерналннзцрвд фактор· Освен това, е помощта на комплекси от ./ЦЖ и поли*лизин-кошогяраи вирус (съответно вирусни компоненти), които нссъдържат допълнителен янтернализиред фактор-свързващ ^ктор-коивгат, беше показана производителността на вирусните конага-чи съгласно изобретението· й предварителни опити шже да е© установи, жш в случай че се използва свободен вирус като ендожшолитно средство, из-ползването ас : аптернализарац *актср, или дали в случай, че ендозомолитното средство е вирус шш вирусна компо-нента или един не-вирусен пептид като част но ендозомолнтенкопитат, ’’допълнителния" инторнадизиращ фактор прави възможноили подобрява приемането на нуклеиново киеедннии-коипяекеи.Такива опити обхващат паралелнй-трапефекцйй с нуклеиново кисе-лднни-кошшекси един път без (допълнителен) интернализиращректор, например в случай на вирусни конюгатк с коглплексп,състоящи се от нуклеинова киселина и вирусен конюгат, и единпът с комплекса, в конто нуклеиновата киселина е с друг кошзгат,който съдържа друг интерналпзиращ (фактор, къи който целевите a* як «I. · ’·· · ·· · злегкв жат рецептор. При използването аа иптсрнолизаращ изктор ала на допълни-телен иатернализиращ фактор* т.е. когато се използва конбиви-ран-комллекс, той преди всичко ще се дефинира от целевите клет-ка, напрямер чрез определени повърхностни антигени адз рецепто-ри, които са специфични зз даден клетъчен тип и е тезе даватвъзможност за направляван транспорт аа нувлеановата каселннав този клетъчен тип. й рамките ва настоадето изобретение, подходящи вещества сафинитет към нуклеинова киселина са даарнаер хомоложни органич-ни поликатйони като пояияязин, полиаргинаи, полаорнитан или хо-торолоаии зояжкетйонй с две ой повече различно положителнонатоварени аминокиселина» при което теза поликатйонп могат даимат различна дължана по веригата, също така не-пептидаи син-тетична поликатйони като полиетиленимин. подходящи също такавещества е афинитет към нуклеинова киселина са природни дасвързваща протеини е поликатМонеа характер като хистови авгапроташши, съответно тяхна аналози или фрагменти, кажто исяерок или спершеднн. Дължината на иоликатйона но е от критично значение, довол-ното комплексите е оглед на предпочитаното изпълнение сз посъщество електонеутрални. Предпочитана дължана из полалазино-зата верига е от порядъка на от около 20 до около х ойО лизйнмономерж. Не съществува обаче предписание за ЛШ-дълживата,която да е критична за подидатйона. Котата да се състои от&amp;ми Ьр и от Χ2ϋϋϋ негативни заряда, то количеството на полнка-тпона за мел ДПК примерно да бъда: CO мола аолилизин 2бО т. 30 мода аолилизин 4U) или Х20 ноле аолилизин ХОО и т.н. 4? • · · · Среден специалист а областта шже чрез рутинни опита даподбере други комбинации ие дължина па подикатйопа а модноколичество. Друга подход» вещества с афинитет кш нуклеинова кисе-лина като съставки за конвгати са интеркадираци субстанциикато етидаумдоери, акридан зли интеркалиреци пептидм, коитосъдъркат трпптодан и/или тирозин и/или фешоаланте. По отношение на качествения състав на нуклеино- зите-комплекси най-общо първо се уточнява нуклеиновата осел№>на» която це се импортира в клетката. Нуклеиновата киселина пре-ди всичко се определя от биологическия ефект, еоИто се цели дасе постигне в клетката, п случай че се прилага в рамките нагойната терапия, от гена който трябва да се доведе до експреси-ране, съответно де геиния отрязък, например с оглед да се за-мести дефектен ген, шш от целевата последователност на генакойто ще се инхибира. При транспортираните в клетката нуклеино-ви киселини шже да се касае до да-ни или РШС-ни, при коетонс отношение на нуклеотидата последователност не съществуватникакви ограничения. Когато изобретението се приложи върху тунорки клетки, зада се използва като ваксина срещу рак, то кодира в ДШС въведе-ната клетка преди, но за пнуномодулираща субстанция, напримерцитокин като IL - 2, IL - 4, iPN- гама, Т-Ш* -оч . От особенапалта могат да са комбинации от ДШ&amp;-ни, които кодират за цито-кййй, например хх>- 2 a iPN-raaa. друг геи, който е полезен завъвеждане в туморни клетка, е ° _ „„ „ , . ( adr}.^ наотоядето изобретение c успех са използвани трансфе-рин-полилизин- и ниско плътиосна-ддасзротеш-кошагатй заедно садеаовирус-кошзгата за трансфекция на туморни клетка (меланоу- - 48 аа клетки). 8 зависимост от специфичното приложение ж»ае а пред-варителни опити да се установи» кой лигонд е иодада за коп-кретаате туморни клетка. Възмоднс е също така да се въведат две шш повече различнинуююавово-киселшши последователности в клетката» напримердлазнид, който съдържа 6Д1Ш-йй» кодиращи за два различим про-теина, под контрола на подходяща регулатори’ последователности,или два различни шшзмида конструкта» съдържащи различнасдйК-йй. Еш терапевтикноактивките мнхибираци нуклеинови киселини,които се въвеждат в клетката с цел да инхибират специфична ген-ии последователности, се числят генконструкта» от които сетранскрибират безсшсленз РИЕ йяи рибозоми. Освен това е вда-шжно, а клетката да се въведат олагонухаеотад» аапрмшер без-смааяева олагонукдеотада. йезенаслените ол^одуклеотада обхва-щат предимно iS нуклоотида ала повече, бдигонуклеотидоте могатевентуално да са луятимерязкрани. Рибеземите се въвеждат вклетката предимно като част на гевковструкт, който садържа ста-билизираща генелемента, надрмнер ИШ-гевелементи (тМиген-едевента). Генкокструкти от този тип са описана в йР А и 387775. Лихибираж нуклеинови киселини и тяхнате механизми надействие са познати на специалистите от областта; в това отно-шение могат да се ползват обзорните статии на Heidne u youlme199О;Текауаие й in0Wy©t 1990, както и том цигарените източни-ци. Освен молекулите не нуклеинова киселина» която апхибираген.', например вирусна гени» въз основа на тяхната кожшоментар-нсст, могат да се използват гени с друго инхлбдрещо действие,йрмжери за това са гена» които кодират да вирусни протеини, • · • · ** it 9 «» ♦ ··♦··* **···· ··»···· *«,·»« „ « ··· · · · · · · · тъй нарочените трансдошиантни мутации пришиваща.(wits, 1907). «кспросаятс на гените в клетката дава протеини доийнират над съответния див тип протеини и по този нзчзн пазятклетката» която аря^с.йва целуларен имунитет» като възпрепятст-вуват вирусната репликеция. подходящи са трапсдоминентни мута-ции не варуени протеини» конто са необходими за реплаквцаята иекспресията» например aag-.t .js$_ и il@v -мутанта,за. които бе-ше показано» че инхабират idV-pcmMieaimara ( тгопо et al., 1989} Дгевп et al·, 1989} ^aiim et al., 1989). Друг механизъм за постигане на интрацелуларен имунитет об- хваща експресията на йШ-цолекули, които съдържат мястото пасвързване за жизнено важен вирусен протеин, например за така наречените в тай Decoys* (£ull@ng@r @t al., 1990). Примери зе приложимите в рамките еа сожзтичнзтй генна те- рапия гени» които с немощта на настоящето изобретение като със-тавка на генконструкти могат да се вмъкнат в клетката, са фак-тор ¥Ш (хенофилия А), ( виж например όΟ0ύ et alw> 1384>>фактор XX (хеаоджшя 3), (вж например ,;upachi ei aXe> 1982)tедеиозяндатюве ( ocid), (яж например ?aierio et &amp;ι.» Ι9β4),<χ- I ентитринсин (белодробен ефазем), (виж например ciliberto et ο1.» 1985) ИЛй Cystic .fibrosis transtosiabrans conductance re-gulator ;ene” (niordan et al., 1969). Тези примери не представляват никакви ограничения· До отношение на големината на нуклеиновата киселина могат да се използват нуклеинови гглееллнн с различни големини; с по-мощта но настоящето изобретение могат да се вкарат в клеткатамолекули на нуклеинова кноелине е големина от около 0.Х5 кЬ(в случай не съдържащ рибозом-ген тРШС-ген) до около 50 sb иповече; по-малки молекули на нуклеинова киселина могат да се - 50 -
Ht · · * · · * • « · · · ’* · в * * • »··· · · · ···· · ······· • « · · * « * ··· · ·· · · · · използват като олигонуклеотида. очевлда е, че настоящето изобретение не подлежи аа ни- кзквя ограничения по отношение на генвзта последователност,както к това,че о пошощта на изобретението могат да се транс-портират и шюго голяйй гепковструкти, дава възможност то даvias над-ширскс приложение. лато се изхожда от яувяеиновата киселжш се определя ве-ществото с афинитет към нуклеинова киселина, предимно това еорганична яоликатйонна субстанция, която осигурява комплекси-ре нето на нуклеиновата киселина, като получаващите се комплек-си са предано по същество езектроаеутрални. Ако комплекситесъдържат заедно с ендозомозитиия кошвгзт и конюгат от единйнтерналйЗйращ фактор и едно вещество с афинитет към нукдеино-. за киселина, то катйонизта част иа двата кометата се взима подвшшшгае по отношение на аспекта па електронеутралност. При разработването на предани изобретения беше установе-но, че може да се постигне еда оптимум за импорта на нуклеи-нова киселина в клетката, тогава, когето съотношението конюгатхнуклеиново киселина е така подбрано, че комплексите антервали-зярав! фактор - полякатйоа/нуадеивово-киселйнки комплекси дасе в голяма степен илектронеутрални. Установено беше, че ко-личеството на приемащата се в клетката нуклеиново киселяла несе намалява, когато част от траксферин-псликатйои-кошогата сезеклеии с пе-ковалентно свързан полшгатйон. ь определена случайтова моме дори да доведе до значително повишаване на ДШНфие-ма ( кедаег et cl., 1991ε)· при това беше наблюдавано, че ДШСвътре в комплексите се намира з уплътнена форма с торояда ' структура с диаметър от 60 - χύΟ ни. Количеството нолккатйонзе подбира с оглед на дата параметри електронеутрал- иост и постигане на компактна структура, при което количеството • · - 51 • « · · поликатйои, което се определя с оглед постигане на електроне-утралаостта от заряда па нуклеиновата киселина, осигуряза най-общо и едно шжпактмране на ДШи Евентуално, съгласно друго изпълнение на изобретението,комплексите съдържат допълнително вещества, свързващи нуклеино-вата киселина а ие-ковадезтно свързана форка, които могат да саеднакви яли различни от свързващия фактор, значи от веществотос афинитет кьа нуклеинова киселина в кошагатяте. в случая, чеевдозомедйтното средство е свободен вирус, комплексите обхващатнуклеинова киселина а интернализиращ фактор-хоиюгатЗ' й случай,че се използва ендозоможтеи, например вирусен ковюгат, то нук-леиновата киселина е компяексирана с този конюгат, евентуалнозаедно с една кошигат на допълнителен иитерналйЗйраж фактор.Лзборвт на но-аовалентно свързано ’’свободно” вещество с афинитеткъм нуклеинова киселина но зид и количество освен това се опре-деля от конюгата, съответно от конюгаже, ирц което предавсичко трябва да се вземе под внимание съдържащия се з кошаратасвързващ фактор: ако свързващия фактор е вещество примерно кое-то няма или само слабо притежава способността за се кондензирас ДйХ, то с оглед на ефвдиентно иктернализиране на комплекситее целесъобразно* такива вещества с афинитет към дШк да се из-ползват, които притежават тази способност в по-изразена степен.Ако самият свързващ фактор е кондензираде нуклеинова киселинасубстанция и чрез него се получава о оглед аа ефавдентната ии-теришзация достатжно ухомаактуван© па нуклеиновата киселина,целесъобразно е* де co използва вещество с афинитет към нуклеи-нова киселина, което въз основа ва друг.: механизма съдействузаза повишаване на експресията. Съгласно настоящето изобретение, към подаодацкте но-кова- • · лентно свързвай звцсотза s афинитет към нуклеинова киселина сечислят съединения със способността да кондензират нуклеиновакиселина п/ала да я пазят от неделено разграждане в клетката,особено вече въведените вещества с педакатШшен характер. Другагрупа подходяща вещества са тези, които чрез свързване кш нук-леинсва киселина, съдейстзуват за подобряване на транскргшция-та/екснресията, като подобряват достъпността на нуклеиновата ки-селина към експрееаоввия механизъм на клетката· Пример на тако-ва вещество е хромозоъния нО-хлотонов-аротеин йй&amp;1, за който еустановено, че дритехаза способността да компактдра ДШС и да ядоведе до експресия в клетката. Нри определяне на модерните съотношения на ецдозомедитнотосредство п/шш ннтернализираж «актор/аедеотво о афинитет къмнуклеинов». кисел л на /нуклеинова киселина илк киселина трябва дасе вземе под зандани©, че се извършва ксиадексираае на нуклеино-вата клеелда© йлл да нуклеиновите киселина и че трябва да сеобезпечи образувания комплекс да се свърже с клетката, да навле-зе в клетката и било самостоятелно или с помощта на евдозомо-лдтното средство да се освободи от ендозода. подбраното съотношение антернализиращ фактор/евързвад фак-тор/ауклеаасва киселина се определя преди всичко от големинатада полинатйоаната молекула кайте м от броя и разпределението наподоиитодно натоварените хфупироака, критерии, шито са съобра-зени от големината и структурата па поддаващата на транспортира-не нуклеинова киселина иди нуклеинови киселина· С предпочитаниесоларното съотношение възлиза па интервалязирад фактор:веществос афинитет към нуклеинова киселина от около чб : i да околоА · чб · След конструирането и сиатезата да чонюгатите и определяне - 53 - ·:· : *'·* : ··’ · на оптималното за ефициешцшта на транефекцията съотношение накоаюгат(и) : дак, може е помощта на татрация да са определи ко-ллчеството на частта интернализиращ фактор-кошагат, която евен-туална мода да се замени със свободно вещество с афинитет къмнуклеинова киселина. В случай че се използват ноликатйони кай-те като свързвай фактор» така и като свобода вещество е афини-тет към нуклеинова киселина, поликатйонате ногат да бъдат ед-накви ала различни. зри изпълнение на изобретението, при което се прилагат ви-русни конвгатм, съдествуаа подходяща датодлка за определяне насъотношението на съдържащите с в кожлексите компонента, катопърво се определи подлежащия за импортирано в клетката генкон-структ и» както е описано по-горе, да се надари вирус или вирус-на компонента» които са подходящ» за специалната траисфвнщия·След това вируса или вирусната компонента се свързва кш поли-па шопа и се коиилексира е геиконструкта. Като се изхожда от ед-но определено количество вирусен конкгат могат да се проведатотредни, като целевите клетки се третират с това (константно)количество коюгат и намаляващи Дйд-концентрацяи, или обратно. По този начин се установява оптималното съотношение ДНП : ви-русен кошогат. при използването на допълнителен интервализиращФактор се подхожда примерно така, че като се изхожда от постоян-но количество дал чрез титруване се определя съотношението меж-ду вируеен-кошогет к интернализиращ факторен-копюгат. комплексите могат да co получат като се смесят компоненти-те ί) нуклеинова киселина, П) вирусен конюгат» евентуално Ш)материализиращ уактор/свързващ фактор-кошагат н евентуалноП) не-коаалектно свързано вещество с афинитет към нуклеиноваклеелииа, които се намират под формата на разредени разтвори. 54 л случай че се използват полккзтйови като свързващ ректор исъщевременно като ’’саободаи” ооддаатПови ааП-осда е целеооб- ·рззио» първоначално да се получи смее от кошарата със свободниаоялаатйааи и тази смес да се съедини с ДШи При това оптимал-ното съотношение на дйК км конюгат(а) к псликатЗсни се опреде-ля чрез титрпращи оси та» т.е, в поредица от травефекциоани еке-пер;шейтн с псстошю количество и пошшазащо се количествопопитат(и)/пеликат&amp;онна смес. Оптималното съотношение от коню-гат(и) s подикатлони в сместа мода е помощта на рутинни експери-шонти д се получи, съответно чрез сравняване на оптималнитеоъстполешш на използваните при титрационните опити смеси. получаването не ДН^аоншлеком може да се извърши при физа-одогичня концентрации на сол. друга възможност е пра използва-нето на високфсонцеатр&amp;ции да сол <приблизително п м ШСх)п след това нзгдасяне на физиологични условия чрез оавно раа- реддане, съответно даализа, паЦ-асдадядата последователност при смесване аа кошюнев-тате нуклеинова киселина» кони?ат(и), евентуално ие-коваяевтвосвързано свссодпо ъещестзс с афинитет към нуклеинова киселина co определя чрез предварителни опити, В някои случа! може дасс окаже вз целесъобразно, първо нуклеиновата киселина да секешшекспра е кошарата и едва след това да се присави свободно-то вещество с афинитет към нуклеинова киселина, например поли-котйова, примерно в случа! на трацсферйй^Т14даувд1шер--конкг8-та й псдилизин. При едно предпочитано изпълнение на изобретението (допъл-ните лазя) йлтерколлзйрзщ фактор трансферни и свързващия факторе един пел идат дан. код "трансферни" трябва да се подразбиратпакт© естествените травсрерини, както и тези трансферинови мо- — 55 — .......... дадакацми» които се свързват с рецептора и се транспортират вклетката· приспаното на нуклеиновата киселина стзва под формата накомплекси» в които са комплекскрани интерпализирад факто*нпо-лакатйоа-конюгат о нуклеинова киселина· π сдучзм че се съдържане-комалеятио свързано вецеств© с афиинтет кш нуклеинова ки-селина» предпочита се то да а псликатйон» който е еднаква илиразличен от пояикатйена садркац се в кошарата· ,> случай на комОинирани-юмплекси» нуклеиновата киселинасе 'латернилизира под формата на ксшшекси» в които от еднастрана йктервадизирац фактор-конюгат и от друга страна сакопялекеирени еадозомолитните с нуклеинова киселина· *шаюгатите интернадизирац ^актор-аоликатйои» които се при-лагат заедно със свободния вирус или с вирусните кошзгати вкомбиняраните-комплекси» tioras да се получат по химичен или»в случай че пслакатйоиа е аодмнептид, по рекомбинантен начин,по отношение на методите на получаване се има предвид описа-нието на й? obb 75ь. конюгаткте :догат да се получат съцо така» като гликопро-теип» например трансферно, и свързвадия фактор се свържат чрезедна шш повече въглеводородни вериги на гдикопротеина. 1‘еаикон&amp;гатй се за разлика от конигатите получена посредством оби-чайните методи не свързване«свободни от модификация# които аре-изхоздвт от използваните лшгаерни субстанции. Тези кошарата вслучай на глмкопротеиай» конто притежават само една или малкояододади за свързване въглеводородни групи» например трансфе-рни» инат и предимството, че са по отношение на мястото им васвързване гликодротеин/свързвец фактор точно дефинираш:· количеството на използваното евдозомолитао средство» с>- • 4 * «· · β « ответно носовата вокдантредая се определя от конкретната пред-приета транофевция· далеоаоОраано е, да ое пзподзге шяпшално-ίυ кодпчестзо зпрус, съответно вирусна вошшеата, os необхода-дато, за да се гарантира ннтерпализирааето ас акруо а яуадвазз-аолкссяинвия-вошиевс и освободдзваайто ду от дадизсша, вода-чеството os влрус<понжш) оо определи от дадения клетъчен тип,дада са да«аа збд памида преда всичко анфекциозността as зй-русе з» тозй идетъчев тип. ^уг вратерип е дадения интерналв-зарад ^автор- садрзад даадар- коткат, по-опоциалао no ornowe-ако на дпдарпзд да сралия Фактор, за пойте дадедата клетка арите-дада определен брей рецептора, пода топа лолжеотвото се опре-деля за вируо( кожата) от количеството да подаеаедата за шзгпортдране дав. да отобжша тран&amp;ревдя, за поето е необходаносода изяло количество дак, най-ооцо е даетагъчно малко количес-тво вирус, давате за една траваиектиа тренефекцая, за което е„еиоходшдо по-геупшо количество ^iK, използваното кодичеотвовирус е лз-дадяда. За специално прилодакие, в предварителни опи-ти се определя оитмдаднате вокцектрвцяй на вирус чрез титриранедати сь рдаотк с предадените цолови клетви, евентуално сасснесена оетшда дааудадад, а с продадената за травефекциятавекторна сйстоиб. При тоъо е целеоаобре&amp;но коте Дби да ое из-ааязува еда ронвоаструвт, който а© отношение да голеианатасъвпада в отровя гракяци е предаденото за конкретното приложе-ние а който с оглед не по-просто измерваш нс ефшяешгввта нагентренсфера сьдърае един р&amp;вортерев ген. п радвате не аестоя-дато изобретение сода показана пригодността аз луциферазния-е па /.· -гада ято з ида зжп гев като реперторев ген при такиваопити., в друг ?спе:кт изобретението се отнася до метод ае eases- • · • · ··· ··· ··· • · · · · * · · β * · 5-^ ······· ······ ······· / «· · · · » · · · • · · · · ··· ·· · дене да комплекси os нуклеинова киселина, вещество сгаразазенуклеиновата киселина а евентуално една интервеоаярач фактор,в по-мела еукар/отш: клетки. иетода се характеризира с това,че кдеткж· се поставят в кошеект със средство, което притежа-ва способността, бпдо самостоятелно иди като съставка на нуоа-лкозскисежшпи вомнеяпсй, да се поевш в клетките и да освободиа етоплазмата съдържането да екдозомже, в конто нуклеинов*·кпседякпкя комплекси се локализира след навлизането з клетката. Еей-сбда се предпочита еднозромешю .даване на ендозомо- <* лятното средство а нуклеиповокпселйшш недалеко, so - даванетозеше да стане и последователно^ като в случай из разделено ири-дедаиле последоватедностте по о от критично значение, дотолковадсколпото даването става непосредствено едно слод друго, за дамело да се обезпеча но възможност едновременен контакт на клет-ката с компонентите. В случай че се използва свободен вирус впо-опзщшлна фор..уаирозка, може едновременното даване на вирус-ния препарат и кошшекейте да се гарантира така, че вируснияпреперат да е съставка аа тревефекцаонната среда, която сдаро С ауклекновскиседннная-ноидлекс. Догато се дават едаврекенне съссвободния вирус, те нукяенаавокиселиннйте-кошиекси и вируснатаформулировка се смесват непосредствено преди употребата· Лрл едно предпочитано изпълнение за метода съгласно азо-бретенлето, еадсаонолатнс2о средство се пр^ага като съставначаст на комбанйрайня-кошмшке· да да се усили го ината експресия, могат съставите съгласноизобретението да се приложат и повторно. Ери едно предпочитане азпздвевае, клетките се първичнитударам клетки. Ери едно особено предпочитано изпълнение нук-леиновата -киселина е ДШС, която съдържа една ала повече после- • · - 58 дителаосги» Kcase кодират за ицуноподедарад субстаада» asпредпочитане за един цижокин· при едно да\ге изп'лшькке» клетките оз шобдасти, за пред-кочитапе п&amp;рвйчад шюидзогй. 2 ри друго пзяжшеиио» кжшшгс са рОро&amp;хзсгг» за предпочи-тано първични ivcopototmi. кри друго Hsu»iiaeiaje« клетките са хзпашдац за предпочи-тане пързжпа хештцаги. Црз друго нзнвшюшш, клетките са пързачпи еадотслан кгют- ii*f· пра друго азй&amp;ндсййе > каеткитс са лзраачаа еалте&amp;ни клет-ка as даагедййя път· ^ри друго лшшпюаае, ююгкзте ос ϊ-оеткп. ..ра друго иодъджлше, клетапте as с-клетки. Па табдаца л ©а показана успзсна трансфевцая е жшода аасаотояцето асосрогони© пряиерк© при разажиа кяегжш! гшюзе· Съетсзът ссглсоно исосретзниого беае проаереа ся» така прагрсасфедаа яа кучежа-хонофаяви ^иОроСдасгн. При тези едчаМмогат да се ексараайрат дакто дуцифораза, гада а >mem-зйдаза. севеа таза изпадзаана беш ©иегеадте да се заведе в•хеад фаСроадйстй 1.4-кучоака фактор IX сДЦХ· Чрез Сашнм-ШОАмажа Фактор IX да се докаже 24 часа оаед граперевдията. 4 шшой сяучаХ е цеяеежгорздао» доаепнитаяао док ездраоде-лягасто срздстес де се иззедззб една яизазоаатроаав суботашщя»ааармяер, иегете ейдезожадткезга сродство з пептидеа коаютат оарегрезярус» тс «©rems оадозоноотяа аятяваосг ае зазисистржтао от сюйчостга ка ρ2· известно е, че лизоаежатреаки субсгаает зедьржа* аяшз-восгга as яржеелгз и ayoeaause к о това .;югат да йахлСарй» - 59 разграждането на нуклеиновите киселина Cmfehaanc ада£-oueson* 1983). Двг тези субстанции се числят хлорехиа» аоаеа- зян, огерацаи и «отизшуяп. можа а» бш показано» чо псяепзпнможе да предизвика покачване не репортараатз геава експресия аслучай на използване за аолони зирус. ;..ода дс бзд© псказеао, чеприсъствието на хзорокин в практически 1U0 % от 15 62-клетки во-ди дс ексйреож на репортереа геа, като хюрохииа е звзедеп з 1слеткяте чрез Дги-теансфвр аря посредник трансферни. в«ь.бД2али Нерез -зепатоцатп не реагират така добре но хюра^ин пал-то :552~даткпт©« все пак ножа да баде 5 до хб ,> трацегицирено,когото ее използват сидсзопожапте свойства ас прибавения ре- алпкацяонио двОектеи или зсшичзскн инзктнвнраа адоповирус. С донедта на изстопдето изобретение се усилват прединст- зо2о на биологачсските вектори. аьз осаосо дс рсазределониетодс роцзлторкте ида троиязъг кодсо зе иптерпалдсирадип фздар»така и за вируса. След сдглссуване ко тези да кешоиента ш съответната клетъчна популация се постига по-високо еелектив-цесс,. която особено се използва преди всичко при прилагано наиастсдцето изобретение за торшшзтячна цеди. Този аспект даио-спецаазно значение при терапевтичното прилагане нс настоа»цето изобретение «ри бал дроб, тъп като розлпчаитс клетъчнипопулации в белия дроб иритежевзт различил редоитери» коетоподе до изисква конструкции на вектора е зисок свързвад адини*тот за опре делене клетж-m популация, донрдар за реапичеста-2« клетка зе дихателните птязд. Като лигзнда се игат пред-вид например лектикп. йснстукцията кз такда кенкгати изиска©между другото потвърждаване па ездезецкте свойства на дьдалдапдеа-кандлдат в коштоат-корфедащша. Това потзържддашзможе да се проведе наартгер с антитела сре.^ лдаадлто с па- кодте ке mimicsoxmtлик сщюжолнн rs^·: а тьдаките, s коз-ен се проаодс scpcKcuiviHOSc lipiuicEoime· д A^,yr пенест hacsoj^sc изобретение co стпзся до фервдев-жни састезк, доите case srshbus световно чест ездьраат кош*мине ;ь терапевтично встквпе нркждюсе длсе.т.г.ш, за лредпочн-хапс: a-'.-sc uses иа Еепкецструкт, кеито и еодезошшгаячае срод*coo, псета ежпгуояно е пехорена п свсптузлко интерпщшзи*ред рзктор-исшсгат. .юски инертен, форпоцевтично прчезшив носа*тел мода да co наподззв, например рсатвс» на гсгазрскс сап шши.есда оу^рпроик разззор па готварска сол шш зсекй носител,в който да> кекшдекелтв прсаедадат подходяща спассбжсти зарезобрже, аа бздат ярадоазни з рашшее но пастоодезо изо-бротспис. Отпоспс ^тедите ..а чюрпудирене пс сармзцевтнвябпрепарати се W) предвид nccd.ng-i,im’a i-I^rcccoutiwU Ceiemses,П80. пйстоядж ззобрсеешю дава зьзшзшее за голшва гама-вост при чржожспйеес, шдг другото :: като фйркацевткчж пре-Пирзта* Спсзазат сакшско изобретението швз пате днофпдкзат пан С з доддедац буфер дз ос езнроняаа в далбокоз-шразеяо саетояние, 7о меко ездо тапа ш?о готов за употреба реактив в разтвор,е предпочитание при охледвне »да зе транспортира я яагерува.Цеобходожге за еразарезцяята лошюшзнтз, а ипоано ДШЦ видра®-аоаятйо срсдстзо, евентуална кашлшраао зли аодгатвоио за ко~иптиранв с отделен копагирзд партньор* ДПл-сззрззацо вещзстао,евентуална катзгарако с ашгернадйзпрац Уантер, евентуално сво-боден Пилпкйтйсц, в подадяц буфер, раздоени язи частично раа-дезсйп пето сзстпвпя па трапсуваппспап набор, който вад пред»етпияза предмет на нзезоядае изобретение. Трансувкциошп-штнабор се отстои от паелкел, коДто ездардп едно изп повече евд- €i - • · чета, като тръбички, шишенца илл други яодобшт,’ която·’съдържат даторналнте необходими при трансфекцията но по-аасшняе еукари-отни клетка съгласно изобретението. б такъв трансфскционсп набор (комплект) можа първото сед-не да съдърна едаа или по а че различна ДШС-пи, напрдаер кодира-ни зс различни антигени. Втора съд даже да съдържа еда ала по-вече различна интернализядац фактор-конкгати, пра което използ-ването на трешмренционния комплект може да стане под формата наиграта "строител*', дали отделните съставки да са под ^ордата наготови за употреба формулировки или да са поставена разделени,за да се смесят непосредствено преда употребата, зависи освенот специфичното приложение, но ода и от стабилността на ком-плексите, които могат чрез тестове да се проверят и да се уста-нови стабилността им. Дра едно предпочитано изпълнение в едаот съдчетата на комплекта се намира траисглутаданазно-свързанаденовирус-полялизиа-конетат, конто се е оказал стабилен пралагеруване, при друго предпочитано изпълнение баотиналиран аде-иоваруе и стрептавидин-полилизин са поставени а разделени съд-чета и се сдасват преда употреба, при използване гъвкавосттана изобретението, един среден специалист поле да разработи шю-гобройна различни транофекцаоиии комплекти. Терапевтнчвото приложение не състава съгласно изобретени-ето като фармацевтичен препарат даже да се извърши системно,при което се предпочита ннтразенозшш път. целеви органи затази уорда на приложение се шшрздар чер дроб, далак, бял дроб,костен мозък, кзкто и тумора. Примера за локално приложениеса белидробните тъкани (прдажение на състава съгласно изобре-тението като течност за капково влизане или под -ордата нааерозол за никелиране). Заедно с висока специфичност на легендазз дефирвицираняте белодробна клетки може пра това да е иеоб- ** — ··· * ·· · ·· · хедаао» като съпрововдада мярка, различни «акторд, който се на»шрет в съседство на белодробната тшан и конто могат да по-влияят на гентранефера, да бъдат повлияна (например парализи-ране на ресничеетите движения, разтваряно на броихиалная аукус,завеждано на иротеазни инхибаторя). Освен това фармацевтичнитепрепарати съгласно изобретението могат да бъдат приложена чрездиректно инжектиране в черния дроб, в мускулната тъкан или втумор или чрез локално приложение да попаднат в стомашно-чрев-ния тракт· Друг метод на приложение ав фармацевтичните съставие през жлъчното система. Таза метода на приложение позволява ди-ректен достъп към хепатоцитните меабршш на жлъчните каналчета,при което се избегна обменното деИстже на състава със състав-ките на кръвта. Напоследък беше показана възможността, шобласти (иезряли1<скулни клетки) да се използват за да се въведат гени в мускул-ните снопчета на мажи. Тъп като беше показано за жобластите,че сецернлрат генпродукта в кръвта, този метод може да намерипо-широко приложение от третирането на генетични дефекти на пус-кулна клетки, като например при дефекта във връзка с мускулнадаетрофия. При това могат да се използват манипулирани жиоблас-тн които да дадат генпро^кти, които ала въздействат в кръвта,или се транспортират от кръвта, опитите от позтоядето изобрете-ние показаха, че както миоблаетни- така а шютубни-кудтура, до-ри примерна» могат да се трансфицярат с висока ефициентност.Трааефекцаонните среди, конто дават наН-добри резултати, съ-държат коаб:шйран:?-кош1лекси от биотиналиран адеповирус, транс-ферда-полалйзян и стрептааидин-полшшзин. Освен репортеркитегении продукти луцифераза и р-гаяактезидаза, в мускулните клет-ки се екепражра а фактор Vili. Освен това беше приложен5· и · · · · · · * * * · · » « ** 65 ···· ·· « ·· · птячи адонсаирус СПЛ) а комбинирани комплекси, свдъркат аглутв-шш от пшеничени ,.;ълнове като допълнителен антернализиращ фак-тор. Терапевтичното третиране може да се извариш също така иex vivo при което обработените клетки, например клетки от кос-тен мозък, хепатоцити или вдобдасти се връщат отново в тялото.Примерно zander et el., 1991, Phamm et al., 1991· ,руГ0vivo приложение на настоящето изобретение се отнася до таканаречената ваксина срещу рак. Принципът на този лечебен способсе състои в това, тужориа клетки от даден пациент да се изолирати плетките да се транофицират с ДПК, кодирано зе един цятокин. В последващ етап клетките евентуално се инактоират, напршерчрез облъчване и то така, че повече да не се умножават, но всеода да експримират циганина. След това, генетично промененитеклетки се прилагат вато ваксина на пациента от когото са взети,в околността на мястото на ваксинирано сеценираните цитокиниактивират имунната система, между другото като активират цито-токеачните ΐ-клотки. Тези активирани клетки могат да проявятдействието са в други части на тялото и нападат и нетретиранитуморни клетки· По този начин се намалява риска от туаорни ре-цидива и образуване на метаетази. предписание зо приложениетоно ракова ваксини за генвата терапия ©написано от noeeaberget oi., 1992, Вместо предложените от хозеааерг ретровируснявектори, може да се използва гойната трансферна система на нас-тоящето изобретение. При опити съгласно настоящето изобретениеуспели- се трансфицират мелааомни клетки с репортерен ген,който се съдържа в комбшшрана-кошжекеи от полилизин-свързанаденовжрус и трапсдарин-полилизии - аелилизин. Настоящето изобретение може да се използва cw така вопити зз определяне на имунния отговор на даден антиген. Ан-тигеаспецафачни цитотсксичет Х-гптйвдтти (СТХ), които убиватзаразени клетки, играят важна роля при защитата срещу вируснаинфекции или тумори чрез хазаина. обменното действие междуТ-клетки а антагеапредетавляваща клетки (АРС) се ограничава от Ш («Human Lymphocytic Antigens» » МИС, ”^ajor HistocompatibilityMolecules»)· За д а се установи умъртвяването на клетки, които вхйринира! антиген, чрез ой, в in ntro «си. xllllns
Assay*» трябва антигена да представи СТ£| в презилен HIA -контекст, което обикновено означава на автоложната цоловаклетка. mctl Killing Assay» може да се проведа както следва: АРС j се трансфицират с един дйй-конструкт, който съдържа после-дователност кодирана за антиген. Антигенни ©питони се свързваткъм МИС клас X молекули и на клетъчната повърхност предетевля-зат като цел за специфичен СХХ - отговор. След инкубиране с про-ба от серум ва пациента в зависимост от наличието на специфичниСТ1 се лизират АРС. Аизирането на клетките може например дасе измери чрез проследяване освобождаването на радиоактивенхром, който е прибавен в АРС преди прибавянето да серума. Уста-новени предписания ( walker et al., 1989) използват 3.JjCLСг>лийфобластоадни клетъчни линии), които чрез транарекадя с ре-комбинватии заксинни вируса се андуцнрат за ексаресираяе наантигенни гена. При това обаче умират клетшпге, които околоедин дан са ефицаентно екепримаршш антигена, дара да античнотодалстзае да ваксината. Хези затруднения могат да се преодоле-ят с помощта на ° q^L Killing Assays» използвани ОТ ген- травсрерната система да настоящето изобретение, за да въведатв клетката за антиген кодиращи ДЦК, например за да въведат във • · - 65 - .:. : *··' · - * Фибробдастат© конструвти, кодиращи за iliV- или туморни антиге-ни, за да могат те да експрииарат антиген. Дршерни фиброблао-ти шгат лесно да се получат от биопсии, лесно се отглеадт ис повдта на настоящето изобретение се оказаха особено ефици-ентно траисфвдрувма (около 50 до около 70 д). Тези опити саполезни за да могат, с оглед разработването на ваксини, да сеидентифицират епитопи, които се разпознават от убиващите клетки,Освен това те могат с предимство да се прилоаат за определянена ША - ограничени®. имунен отговор на даден човек към даденантиген. бъз основа на голямото количество, което с помощта на нас-тоящето изобретение транспортираните гена в практическа всичкиклетки се експримарат, изобретението нозе да co използва за произвеждане на рекомбинаитии протеини, 2 а този случай няма илималко ала сало/ограничения по отнепение на последователността, съот-ветно по отношение на големината аа подлежащата за трансферира-не ЦИК, освен теза съществува аирок спектър клетъчни типове,които са транерицаруеми със състава от изобретението. От тук,почти всеки клетъчен тип меле да се използва за получаванетона рекомбинаатнн протеини, който гарантира, че реконбинантнияпротеин ще бъде произведен в близка до природната и напълно мо-дифицирана посттранелзцйонно преработена форма, която осигуря-ва високата биологическа активност на продукта. Рентрзнсдера з клетките може да co постигне, както беше възоснова аа луциоераза и на iPM- д в преданите опити показано,като леле да се транспортира всеки генконструкт, който вода досъздаваното на лелаа протеинов продукт. Щелаиият протеинов про-дукт шже 24 часа до една седмица или по-дълго след транефекца-ята да се подучи от клетъчната култура (или от клетъчния оста- - 66 - ......... тък шш от подходящ клетъчен хомогенизат, съгласно предписани-ето за дадения протеинов продукт). Лзпоязнането аз гойната трансферно система съгласно насто-ящето изобретение за получаване на рекомбинантни протеини имаследните предимства: 1) Породи високата тренсфекционна ефициенция (повече от 90 % на траисфициранате клеткфогат да експримират гена в голя-ми количества) не е необходима предварителна селекция на транс-фицирани клетки; освен това не е необходимо да се установяватстабилни клетъчни линии, клетъчна култура в малък мащаб може дае достатъчна, за да се получат използваеми количества протеин. 2) даат да се транспортират голями гевконструкти; могат48 кб успешно да се транспортират. 5) Генната експресия може да се осъществи в клетки, коитоосигуряват съответното сле^-транславронално процесираае и моди-фициране (например витамин К-завиееци карбоксалирания на факто-ри не съсирването, виж Axwetano et el., 199ο, или клетъчноспецифично глмкозилиране. 4) Чрез системата от изобретението има ао-голям избор нацелеви клетки, които могат да се използват за генекспресия. Преглед на фигурите: ,-иг. 1: въздействие на адетовируснета - инфекция върху ген-трансфера чрез трансферин-полилизин-коишгат ,-иг. 2: 1£ощзгат-,доК-комплекс-е.:.вкт на дозата Фиг· 5: Усилване на трансферин-аолилизин- гентрансфера чрезаденсвируси осъществен през рецептор-носредничащ наендоцитоза: А) вьдействие върху комшшксирана ДНХ ь) въздействие върху свързано с рецептор ДйК - 6?
С) вьздеИстзие върху иентраисфора чрез трансферин-подяяизии-кошагати -иг. 4: Въздействие на аденовируснаняндекция върху рентранс-фере посредством трансферин-пелиллзип-коиюгати в под-брани клетъчни линии Фйр» 5: Изследвания дали усилването на генната експресия седължи на ниво на генния транспорт или на трансакти-виране фир. 6: тетра-радактозен пептид-полилизин-конютат фир. 7: трансфекция на HepG2-oewi с рй371~дНК-комплекси в присъствие на аденовирус Фиг. 8: Транефекция на Нер&amp;2-клетки с рСйТП^ДйК-комплекеив присъствие на адеаовзруе Фир· 9: Трзнсфевдя на Т1873 с рС^ЬгДйК-комплекси: A) Сравнителни стойности с аюрозпга B) в присъствие яа аденовирус Фит· Ю: йапортяраве на рС»ЛЬ-да в Т-клетки в присъствиена аденовирус: А) Й9—клетки в) първични лимфоцити Фиг. II: УВ-инактлвиране на аденоваруси: А) усилване на гентраноферния-ефект в йеХа-клетки чрез УВ-инактивирана вируси б) сравняване на Уй-инактизиране е гентрансфернияефект •.ир. Х2: лнакт ганране на аденовируси чрез формалдехид Фир· 13: Трансфекция на ШйЗТЗ-кяетки чрез трансферпн-полили- зин-дйК-коиплскси в присъствие на йолони-вирус яр. 14: Изследвания дала рентраисуерния-ефект при трансфек- -68 - цая на ШИЗТЗ-кдетки с травсфериц-йолилизиа-ДйМ-хомдлекси се дъна® на .„олони-вирус Фш*< 15: мбменна действие между трансферни и неговия рецепториграят рола при гентрансферния ефект че ,алони-зируса Фиг. 16: Влияние па ^-стойността върху гонтренсфера на рет-ровируси чйг. 17: днфлуенца-хенагглутйнин-пептид; изследване за пропус-кливост на дипозомите Фаг. 18: Тревофекция на К562-кдетки с тренсферин-полилизин-конюгати в присъствие аа йифлуевцапептвдчюдмяизин-К0ЦЮГ8Т Фиг. 19: Тракефевдя на йвХв-кдвтии с тренсферин-поладизиа-конюгати в присъствие на инфлуенцапептид-полилязин-кояюгат =-зг. 2ϋ: Па място доказване на ^-галактозидезна експресия след транофекция на НеХа-клетки с трансферин-аолияи-зин-рШ-$ -jai-ДНК в присъствие па аденовирус Фиг. 2н На място &amp; -гзяактозидазнз експресия в Hela-кяетки вприсъствието на аденовирус фиг. 22: Транофекция на клеткнес 4Б кс козузд в присъствиена аденовирус. A) Heia-клвтки B) иеуробдастошш клетки лтг.23: Получаване на еденовируополплизип чрез химическосвързване ф^г. 24: Трансрекдия на К562-йлетки с химически свързанедеповирус-коиюгат чиг. 25: Транзакция на Пода-клетки е химически свързанадено ввде-коаагат - 69 - • · W'; w. »6: Свързване as подилизж ш адеаоваруе чрез трано-глуташгааза >иг* 27: Транзакция на шпии-хепатоцити чрез трвнсглутамшжза-еаързеи аденовирусчюлилйзиа-конш^ат Фит. 26! Усилване на зранс^екциоината ефвденцая чрез тракс-хщтзмжаза-свързен аденовйрус-полализинмсошарат всравнение е не-свързан вирус ,-иг. 29: Трвнсфекодя на йеха-клеткд с биотж-стрептавида-свързан аденоаируе-конетат Сйг. 305 Траасфешщя на хйбг-кдетки е биотин-стрептавидан-свързан адеаовирус-конюгат ля. З.л Трапсфекодя на кевробластожи клетки с един 42 кЬ козодд посредством биотин-етрептавида-свързан адено-вирус-кошзгат «иг. 32: Трансферния на хенатоцита в присъствие на хлорохиниди на аде но вирус л?р. 35: Трансфекния на К562-клетки в присъствие на различниендозоиолитнн сродства Фиг# 34: Сравняване на трансфекоденните протоколи аз клетъчнон ?во с /а -галактозядаза като репортерен ген в при-съствието на различни ендозополитни средства ;w. 35: Далгосрочнз-луод-еразпа експресия при коирлуенти,не-деяявд се хепатоцита vht. 36: експресия в йеха-кяетки, траноминирани в присъствиена свободен и чрез биотин-стрептазида към полилизжн«вързан СьХО-вирус ли». 37: Трансфекция на етобласти и маотуби в присъствие насвободен и чрез биотин-етреятавидин кж аолилизиасвързан аденовирус - 70 - - · ” · Фиг. 38: Травсфекция на първични миоблаетни- и ниотубиикултури war. 39: Сравняване на еденовирус 61312 и СЕХР-вирус притраксДекция hs йе1а~клето и С2С12-етобяаети Фш»* 40: Подобряване на трансоекцията с СЕ10~вирус чрез из-подзване на лектии-лигавд ФиГв 41: Експресираве ва фактор vxil сдпк в С2С12-уис6лйстжи мистубни-култури ,::г. 42: /сетзоне на Д1П>трааспорта чрез аденовирус-протеиниЛ) Не ^-клетки>) Фибробласти Фиг. 43: Галактсза-ивфщуенцанептаднсонигат за ДНК транспортв хепатоцяти »ит. 44: Ралактоза-йдвновирусисоайгат за ДШС транспорт в хе-патоц^ти «:w. 45: ΓουτρδΗΟψορ в З-ддафобдастоадда й-клетки дш». 46: ДШС-тралефер е трзнсферин-полилмзиа в присъствие парнновярус А) свободен риновирусй) кокирирен рииозирус >иг. 47: Трансфекцяя на първични хуманни меленсмни клетки скомбинирзгомшмпяексн садърдащи треноферин- и адено-знрусин-конюгатй гиг. 48: Трзнсфекция на първични хуманни мелановаи клетки еномбиииракй-комплекси съдържащи аЯ - и аденовирус-кошогати «дц». 49: Гентранащер а епителни клетки аа дихателни пътищапри 1ЖК030 на жзо Фиг. 50: Изпитания за пропускливост на лллсзоуй с амфипа-
тични пептвди Фиг. 51: Налягания за пропускяивост на еритроцити с амфипа-тични пеятиди • иг. 52: Трансфекция на .ММХСЦг клетки в присъствие на амри-патячнч пентиди да. 55: Транофекция на ДЦНЗТ-кяетки в присъствие на амфи-петишш пептиди иг. 54: Експресия на П’а1-о< в Иеха-кяетки, траисфицирани вприсъствие на различни ондозомолитна средства В следващите примера, който илюстрират настоящето изобре-тение, ако не е казано друго, са използвани следните материалии методи: получаване на трансферин-полилизан/щЕС-компленси а) Човешки трансферан-полшазав-кошагат Използва се метода описан от ьагиер я съавтори ±9916, при който свързването на пслшгазин се извършва нън страничните въг-леводородни вериги на травсферана. Разтвор от 2ьи мг (5.5 шшола) човешки трансферни (свобо-да п от желязо, Сагма) в 6 нл 5о tu натриев ацетатен буфер, ph5, се охлажда до 0° 0 а се прибавят 750 шш Зи мм натриев аце-татен буфер ph 5, сздързд 11 мг (51 шшола) натриев перйодат.Сместа се оставя да престои в ледена баня в продължение на 90мснути на тъмно. За отстраняване на нискомолекулните продук-ти се провежда гелно филтруване (Сеиадеке 6 - 25, Фармация)при което се получава разтвор със съдържание на около 256 мгокислен трансферни (измерване чрез нинхндриаов тест). (За дасе докаже окислената форма, която съдържа алдевди а пра оцве-тяване с анасонов алдехид дава цветна реакция, просата се на- 72 - капват върху еияйкагелна-тънкосяойиа плочка» сушат се и плочки-те се потапят в р-енизоя алдехид/сярна киселина/втанол (1/1/18)»сушат се и се нагряват)» кодифицираният трансферин-разтвор бър-зо се прибавя (в разстояние на 10 до 15 минути) към разтворкойто съдържа 1.5 шшола флуоресцентно маркиран поли(2)лизинсъс средна дължина на веригата от 19ϋ лизинови мономера в 4.5мл ЮО мУ натриев ацетат pH 5. Стойността на рй на разтвора сеправи на 7.5 чрез прибавяне на 1 1» натриев карбонатен буфер. Към сместа, з интервали от по един час се прибавят 4 порции отпо 28.5 мг ¢450 мкмола) натриев цианоборохпдрнд. След 17 часасе прибавят 2 мл 5 2 натриев хлорид, зе да се направи разтворас обща концентрация от около 0.75 У. Реакционната смес се нана-ся върху катйонообшсина колона (дармация ..око 1Ш хо/Ю) и съссолов градант от 2.75 2 до 2.5 л натриев хлорвд с постояно съ-държание от 25 m2 рЦ 7.3 се фракционирв. високата концен- трация на сол при зареждане не колоната и със започване наградиента е съществено за получаването на поликатМон-конигатите.далко тренсферет (около 30 ϊ>) заедно със слаба флуорясцевтнаактивност елуират при протичането; главното количество флуорес-центно маркиран копюгат елуира при концентрация на солта ме»-ду к.35 2 и 1.9 м а се събира в три уракции. Тези фракции дават(по реда на тяхното елуиране) след двукратна даализа срещу 2 л25 уш НьРВ$ pH 7.3 една Фракция A (TfpllSOA) със съдържание 45мг (0.56 жшода) трансферин» модафацдраа с 366 вмола подллазан,една фракция В (TipUSGB ) със съдържание 72 мг (0.90 мамела)трансферна» модифициран с 557 имала полилизин» и една фракцияС (x-pU90C), съдържаща 7 мг (25 нмо&amp;а) трансферни» иодафици-ран с 225 нмояа пояилнзин. Трансферновйте-кспюгати» ако не сеизползват незабавно, се охлаждат шоково в течен азот при -20° С
4 се съхранява в свободна от желязо форцц. Преди вграждането изжелязо пробл (0.5 дс х ж·) се дазскдат с натриев хлорид да физи-ологична концентрация на солта (150 ж). Вграждането на желязо-то се извършва чрез прибавяне на 4 мкл 1Q &amp;,. желязо (Ш) нит-ратен буфер (съдържал 200 ш цитрат, чрез прибавяне не натриевбикарбонат се наглася на рП 7.8) за мг трансфержново съдържание.Съдъргедае желязо кеютати се получават в малки количество пре-да използването кх зе образуване на ..Ш-кодалекси, охлаждат сеьоковс в течен азот или в сух лед/етзнол и се съхраняват при-20° С. (Тази корка се оказа .· целесъобразна, след като сепоказа е че многократно размразяване и замразявай» вода да раз-валяне на коютатите). б) ь.ици-трннефертлн-полтоп^зйн-кон^ат Работи се аналогично по метода даден за човешки трансфе-рни, като сверавонето става през въглехидратните страничнивериги. »т 4.1 пг (51 пмола) миши трансферни и 2.1 мг (34вдала) рШО ое получават аювюгати от 15.5 амола живя транс-ферни и 13 виола рХ29О. Плегвд-Ш е) да - Д1К 6 мкг от ДНК-плазшда рВДХ (садържад phot inue pyre lieдуциферазния ген под контролата накоигз sareoraa virus ьта.jahBncer/Prrwotera (Ifehida et el., 1977» De Wet et al«, 1987),получен чрез тритон X лизяия стандартен метод (Moniatls), по-еяедвайоот cscl/ к tsr ра виовеснопл ъткосв н-гре даентноцентро- фугиреяе, обезцветяване с бутакол-ΐ и даализа срещу 10 мйтрис/RCI рК 7.5, 1 Mfc WA) а 350 жл (150 мМ HaCI, 20 HEPKS рц 7.3) ое ешеват 30 минути преда прибавява кшклетките с 12 мкг трансферин-пояийнзшмюнюгат в 150 мкл iiBS· • · Q) pCMV-ДНК яяозмида pQhV се получава» като *>мит -инсерта на плаз-мида >STCX556 (Severse ©t cl,, 19S8) cc отстранява» плазмида ce третира енюм» -фрагшнт π lUadm/sept,кайте и Kteoow -третирания фрагшепт os алаззда рнзи,,който съдържа за луцифераза кодиращата последователност» cyjs-аетно за β -галактозвдаза (^а^ге^ог -ice^ey, i5C3) се при-бавя· Образуването аа комплекса os извършва аналогично изpuSVL· получаване аа плрус-дрепарати а) Адепсаирусни препарати Лзползва ое описания οτπαββ8 и shank,1973 аденоьару-сен шап бШп» който показва делецая з КХа-регионз· Размножава-нето на вируса ос провоада в КХа-трано^омшхсшитлраца клетъч-на линия 293» при което получаването ое аззърлво голямо-йзцаб-но» както е описано 02 pavidsan п Hassell» 1987. Пречисте-ният вирус се съхранява в оаясранявац буфер (1Ш лд Тряс» рйь.б» Χϋϋ ш ХЧаСХ» u.i Явла, 50 % глицерин) дяя з ϊβλ/λο %глицерин в алаквотна· части при ~?ΰ° С. определянето па зираоа-пспцсатрацяята се провежда чрез Уй-спектрох.ото:хтрг’чеп анализна екстрахиран гоноочеп ззде-ДНК ( гогаеЪ сдпс оптичнаалътностаа единица (wM> Α?6θ) отговаря ие 10^ вирусни частич- ки/шп (cfaardomet u Ог.1сз» 1570))· б) Ретровзруснн препарата УоХ0аеу-.шшилевкеютпия-ретрозйрус N2 се опаковз з еднаекотронична отаковъчна линия ( teller ot cl·, 19G5, nzramtano ©tai.,1987). Остатъци от вирус екепряааращи клетъчна лляна се съ-бират» шоково се замразяват в точен азот и се съхраняват яри-20° С, Остатъците» които се използват в прозрете» инат ти- - 75 - твр от около 10&amp; cfu /мл, който се изясрва посредством нео-мицан-резяетентни- колониини обра зувааия с ШНЗТЗ - клетки. • е експериментите,с вирусна концентрация остатъците се изпредапод налягане на азот през 300 кЬ мембранен Филтър ( утьт.чск)в amigos - разбъркван® хяе?ка-кенцентратор.Нермално при това10 - 30 мл остатък коке да се концентрира десетократно. Клетки и среди
Hole - клетки се отгяелдот в ДЖ. - среда, допмнапа с5 % тюввввю инаЕТиаврен зародишен телешки серум ( pcs),певицшов до 100 I.S./hs, стрептомицин до да/мл и 2 к2глутаняв. wi-38, хяс-5 и КВ - клетки се култиаарат в -среда ( Bagle*8 modified essential media®), дм пълнена с 10 % W·" топлинно йнактнвираа pcs, антибиотици като /О.о.и - средахо I&amp; иоккйзиеновошш аминокиселини и 2 цо гяутамин. cm,една респираторна диетична фпброзна епителна клетъчна джя(създадено по описания отугтквзказ et si., 1991, метод; ορ?ι .-клетъчната линия се характеризира с това, че е хомоциготназа д Р5О8 - деленията СР - мутацията) се отглузйда в РХ2-7Х-среда (vviiiussen et si., 1983). За гентреяейерийте опита, клетките се култивират в 6 см клетъчни културални плат-ки, докато сз около 50 % коифлуектни (5 х ХО^ клетки). Средатасе отстранява и се прибавя X нл ДЖР- ой жи/2 % - среда. След теза се прибавят конвгат-ДНКнкошшексите, непос-редствено след това зденовирус <£Ш2 (0.05 - 3.2 х ХО* частич-кл/клетка) и сразиш обем от вирусен ?-йбгеруаац буфер (X -80ша). Платките се поставят обратно за един час в инкубационеншкаф (5 % СО^, 37° С), след тозв се прибавят 3 цд коиплетнасреда. След нови 24 часа ииаубиране клетките се реколтират, зада се определи луциферазнзто лепва експресия. случай наертх - - 76 - клетки, клетките преди гентрансфернате експеримента co от-глеждат 4 часа в £12-7л-среда без човедка тронсферан. Слодате клетъчни линии се набазят от АТСС, достъпна под дадените каталшшп шжера: йехв-оетка: СС2.2, дЗИ-остки: CCII45, UopGI - клетва:II 8065. ΤΧΙ - 75 - клетки: III 73 (i5XLCI.I)t Ш№ -клетка: СИ Х658 » 193 - клетки: C2L1575, кз~ клето: CCL17»WI - 38 - клетка: CGL75» ЛС - 5 - плетка: CCL.17*. Н5 - клетка: получават ое от дх^ neoeareh and referenceiJec/jWifc Рзро^ул&amp;з, ο. ο. ol* and Huo&amp;n bexvices, каталожен I a?. Първична йан&amp;одаи се пелучезст като проза от £5 ж кръвот пъпна връв се постави в пробно тръбичка еадардай Шь. Али&amp;вотнл частд ос педолояват е 4.5 нл Picoli-bypaqua (Фар·асцид) и в epe^saseuse гю 15 ьинутп сс цешро^ухарат ара <Ζ3νύоб/жв. кафеникавият Ca-Oxl· X*QJpIIXxii. ΐ.*ΦίθОй*wii адид, м O*oOфйволвй слой се отделя (около хи мл). ирЛбЗВЯТ 00 4‘<j МЛ Ιι,^ν*“плюс 10 % fCj, пробата се цеитреуугяра 15 а.щутд ар.; ilau об/ шш а клетъчния подет се поставя в 50 ет просен ^.>4- пдьс ίο ф д 1Сб клетки I, Дйрко) ос нра-з пра Дадлс пи е PCз (плътността да клетките възлиза на опело 1в ж). Алаавст от 150 ккл фатодажгглутии (РИДбавя, културата ос анкубира пра 37с С а 5 £ С0^ ва 48 часа» след което се прибавя рекошЛиваптвп XL- I (В«4) (концентрация: 18 едишщиДд). След това клетките са ^здздяте 4Ж/20 % РС£, I едшпци/мд 1L - в 1:3. Х.топзстни части от клетките се закрепват в течен азот з ГС > шп>с 5 % дпиетилеул-фсксцд. Преди употреба клетките се култивират в КЖ шше LX 4 ГС5 плюс Z едетпци/мд II - 2. Хе изследване на свързваното на последователностите НеХа- клетки се еквилибрират при 4° С в 1 мл ДМЕй, допълнена о 2 % PC з . Кектс при другите опити се прибавят конютат-^Ж-комплек-сите к платките се инкубирот 2 часе при 4° С. След това плетки-те се прожвет изобилно с ледено студена 2,^-/2 £ ?С$» кетослед това 'W тази среда се прибавят ? мл. отгоре се наслояваеденозирус <1131?, съответно вирусен буфер» клетките се затоплятбавно преди да се поставят нови 24 часа з инкубационен шкаф.След шп^бирепстс клетиите се рекоятират и се кзелодват залуциберазне-генвкспресия. Луцжреразии изпитания
Получаването ка гжеттчни екстракти, стандартизирането напротеиновото съад&amp;ание, кгото и определянето не лущ^арааяатаоктнзност се прозеггда както е описано от genic© at oi., 1990,Cotter ©t εΐ.» 1990, съответно K3KT0 © описано B UP 388 758. ПКноР i Определяне действието при третиране с адепсвируевърху гентрансс^еро чрез транефврж-оалзлйзий-конагати Първоначално се изследва действието не позиаввада се ви-рус-дозировка върху способността на определено количество во-^храт-дйй-копплекс ж постигне геятранефер. Па това се смесват6 пат от злазждя pfipVX с 12 мкт човешки тренеферин-полилйзан-itcworaT (hTxpXI90B) зо да се образува комплекс» Кш Heyj-клетките се прибавят кошагат-.ХНК-комплекс плюс различни коли-чества от аденозируоа oU3i2 (0.05 - 3.2 х κή вирусни частичкав клетка). Резултата от този анализ е даден на фигура X. Дуци-феразната активност е изразено в светлинни единици за 50' жгобц клетъчен протеин. Според този анализ се получава че пови- далаци се количества прибавен злрус вода дс усилване ва гентравофера» да фигурата са дадени средапте стоЛпости от 2 - 4 отделнопродадели еиспс рлнтг; стжбчетс-та псеазват стандартнитеотклонения. ’Л, · '/'»} p.fc-i »' ·)'..'«* ί - 1шшзг:?7-“;Д,;>ло:,лйеко ~ еОект ст дозата .^сгарлТдаялл .^'зрездашш кз хсийтат-,..;вь- комплексите» по- да чел;.: ,χκτε .'.далсопо з аин^ер I, се прлоолда зъл Иелз-оетвнV* #Хл*О 4*1x0 0 ««fi.i V 4# W прибавяне да кепетентпе де за еденсвирусЗдада ζΣ х лО* злрусин чаетзчкй/клетка). Дуцзферсзната актив-ност се определя келте е подачзно в ярпвд ... Резултатите сададен:; във ф;тура 2. даМ.лР 5 Усилване да генстизофера осъществен «раз трввофериамюл»- ллгип чрез адеиовируси реализиран през рецептор- като посредник да ендоцитоаета ε) двздейетлге при тречлдано с адекозирус върху трансфе-ра не кешпдакеирзиа ДНК Зе тренлфенцдаа се използват спадате компоненти:б цкг pibVx - ,даК без т^сюфершмюдаамзин-кошзгат (ЖО: в ьвкг pgpVk- ДН;С ж с мкг не-кошотиран полйдйзин2?0 (ДЙК ♦рХ); G шег ρΜ'ΛΧ- ΛλΣ плюс IP ми» от използваните з преданияпример транс^ридапслллизх^-кекдгатй (ДЛд + ьТ|рП90В)· Тазитрапофекаиоазп материали се прибавят квд 1х«да - клетките е шшбез едайсзтрус оп.да (оЦ.3.12) G х 10* злруеда· частдчкяДяетка)·Цозучовеаетс да клетъчните екстракти» стандартизирането съглас-ие обдия протези л определянпто на луцлферазнета активност сеизвърива ктето в продадалс опити. Резултата от проведенитеопити е даден зъл ч-игура ЗА. - ? ;· - б) МгдеЛстгяе зе гевтровсфера на рсцептор-свтрзаво ДНК Е£2, Т£С ДИрСНО 0 ВДЗШВЗруС йанию^^ЕК-коуллеаса (ДЕл * пТрШОВ) или полтезжн- i ДШНкйааехсг (Д1Д f р!) се свързват № Keia - акетки, безда се йктернблкократ, катс «е ;шкубврат при 4° С. Ке-свърззнякслвдсесж аред^ првбазянгто се стстржзат с оденсвяруе <С312(1 х 10* зкруски чсстиики/овткз) тк със срввкямо количествобуферен ебе#· Псслодзе^та ик.чубеция се превежда при 37° С, за де се деде зьг&amp;схнсег зе нктерналязиране εο свързаните да-хоазаевси и адешззпрусиге· Опредедяветс ка кучи срасната актив-аосш се иез^ша аакгс е дедеве (Фигура Ж). с) ДеДстзке па здетюпир;скотс третиране зсрху гентргноОора чрез траноСерпн-колпкизпк-ковпгзтиКош;га2-дПК-кош1лексв, екдъркацк С ш.т рЕ VI - ДЕК ддао 12 мкг тропсфсртгв - пелвлвзпв (ДпЕ ·;- НЗ?хрИ9ОВ) се пои- бояг арк лоацептрзщш от 1 х 20* адеиовирусви частички (сц 312)/клетка или срсшвшо кеджетво тозлютоивзкттерввв аде-аекируси 0X312 (41312 к.1 ♦) ж Нелв - клетките. Л«активиране-то чрез топлина са пззърЕза чрез 30· жцутко тубирене при 45° С V Ooiei· olr г.1«< ГЛп). Ш7Е1Р 4 льадеЛотснето ип третиране с адевовирус върху гентрано-фер чреи трепсХоркв-поливизив-конктсти при подбрани кле-тъчни пикни йснюгат-ДЕЕ-пемвлзвсп (6 шо» pSSVl + 1? шет иТ,.рЦ90Н)е·, добавят как клетки от клетъчните лиани СЛк» Кела, 73130 й ОВ'5 з ;ед боз одопазирус oll.i.2 G х Ш4 вирусни час-т.лхц/оетха. Жлцкентпзстте не геатравсферз зз регугчвите клето данни ос свредели кекте в предходните примера чрез — l/J — .1. "..... лущ&amp;зразнл изпитания Оях». 4). ПР.*^ 5 Усилването на лущтдеразйатз-генетшпресия Функдаииреяа ниво пз гон-трзнспорта» а не на тронсактавцранеСъздадена бе дуцифераза констнтутивно екепржпраща целева ляния с означението £С5£2 10/6, като клетки се трансфжщрат еплазмнд» който съдържа един лдг -яуцаферазеи-геифрагмент(един ApaX/?vul -Ф/ЮРТЮНТ от рдт Coe -‘et et el., 1987)),клон:-рая з съх-частото αα prjc μ. ~ жжуса ( coiiinr et ai.»1990). Този шшзяяд се кошшекеярз c едни тренсдоршьшоли-кпзйи-ковюгат и К562-?леткйте се трансхздрат с този комплекс»прл което се по..даща пс описания от cotton at ai., 1990 метод.Тъл като - яопуе - плезгдда съдърка едаи неовдин-резис- тентеп ген, ?ш въз основа на неотдиция-розистепцията де се се-лекционират клони екопримираця върху нущгеразв. За по-следад-ято опити се подбра клон с означението ;С562 jU/6. Дладевотяи части от парентзяязта клетъчно .тири ιζ5ί·3 (в200 дал ®?U £640 :®с 2 % PC;? ; 500.000 клетки/проба) се трети-рат или С 12 МЙГ Tfpb ПЛЮС 6 Ш£Р pRSYI. ИЛИ е 4 MKT PL90 плюс 6 жг ржзуь, всеки път в $fX) йкд Н3$ · Дадените количества адеиозяруе dX312 (еж*. 5) се оставят 2.5 часа при37° С де въздействат върху клетките» след което се прибавят 2мл Я?й1 и 10 % ?сз. След това токубиронето при 37° С продължа-ва нови 24 часа след което клетките се подготвят за определянеактивността на луциферазата. Намерено беке, че инкубацията саденовирус допринася определено за увеличаване активността налущвИравете (диг. 54). Това ззжи кокто за Tf?L - комплексите,(200 светлинни единици срету Д5 СЮО светлинни единици), така аза р!30 - комялексите (0 срещу 1.3 х 1OV светлинни единици). - 81 - ** · w· От тука произлиза, че 8562 - шпадакяостта дв нятеряалязара рКз>7Х/вояяжмяв1 ·· комяжекоя я че товаиктернализжраве» измерено чрез дуцифвразвата — експресия, яда»в нрасъствяето на вденовирус.ве провеждат е 8ЛХ- дуцифераза - геневвврмараяя К 562 10/6 - клетки, при което оеприбавят подобни количества &amp;* аденовирус <312. Адиквоткихи от 500000 клетки (в 200 шсл IPM1 плюс 2 % РСо ) ое инкубярато посочените във фигура 53 количества аденовирус 01312 в продъл-жение яа 1.5 часа вря 37° С. След това» както вря наренталнятеклетъчна линха се прибавя 1PMI плюс 10 % PC , инкубиранетопродължава ода 24 часа и ое определя луцяферазната активност.Както се вяяда ох фигура 5В, третирането с аденовярус на тезиклетки не дава доказуеми промени в луциферазната активност;контролните стойности са в съдите граници както тези ва проби-те третирани е вирус. ВРЙЖР 6 Трансфекцжя за чернодробни клетки е азнадофетуяв - псля-лжаян - кокюгатж (АРрХ) съответно е тетря - галакто: аептид - р! - кошагатя ((oai)4pl) в присъствието вя адешивирус 3.5 мг (1.92 мкмода) от разкдояеяхя аептид Хуъ -№„ ·
Xye-01y^ep-01y^ly4ttiiM21y4lly-S«iM;iy-iXy-Cy» »подучен по ^д _ метода при използването яя. .... г. ... сюхезахоо. съдъпкая днтяодноядииовз гваг— ва за Оув ое трвтжрат в разтвор ва 7.85 мг лактоза в 40 ма10 мВ воден разтвор яа натриев ацетат рй 5 при 37° С. Кън раз- ·♦ · • 82- — · ’·· * ·’ ‘твсра οβ прибавят 4 порти по 0.6 мг (10 шока) натриев циаме-бороххдрнд в ивтервали от но окове 10 часа. След обцо 64 часапри 37° С ое прибавят 0.5 мг Й£РЕ ?, pi 7.3 и 15 до дитмотреитвл(ДТТ). След фракциовнрадо чрез гелно филтруване (Свфадвке 0-10,32 х 130 мм, елуеати: 20 мМ натриев хлорид) в среда ва аргон сеподушат 3.6 мг разтвор ва дактолязиран пептвд в свободна иер-каптоформа (1.73 докова* сьгдасао теста ва йлман; 84 % добив).Пробите от мода№нрав пептвд показват цветна реекция е адосо-«оз аддкквд· но ке дават цветна реакция с нинхидрда това сдо-пада е ехведовето, че всички 4 крайни аминогрупж ое лактозирани.Тетра · галактоания пептвд · поляддодо · ковюта е показан вафигура 6. б) Получаван© на З-дитаопирвданпропионат-модяфициранпслилнздо Мям гед-фвдтрирен разтвор от 0.60 домела аоди-1-лизин ссреди долина на веригата от 290 дизивовв иономере (р!290,хидробромвд, Ситна) в 1.2 мл 100 Mi НЕРЕ<г рй 7.9 се прибавятпрк интензивно смесвай 400 мкл от 15 ма етааодов разтвор вазрдр (6.0 мкмола). След една час се прибавят 500 мкл 1 М нат-риев ацвтет рй 5$ след гелло филтруване (Сефадекс G-25) е100 дош натриев ацетат кш разтвора се прибавят 0.56 домелар!29О е 5.77 домела дитиопиркдин - линкер. с) Кемдоврем до пептвдв о аолилизин Кондоати се получават като ое смеоят 1.5 мкмоаа от получе-ния в а) лактозилиран пептвд в 3 мл 20 мМ натриев хлорид с0.146 домш от получения в б) модифициран р!290 в 620 мкл 100мМ натриев ацататев буфер в атмосфера до аргон. След прибавянава 100 мкл 2 Μ НВРВ5 pH 7.9 реакционната смес се оставя врвстайна температура в дродохевие на 18 часа. Чрез прибавяне до * *· -85 - датрве» хлорид концентрецията не оол се довежда до 0.66 У икондаатнте се изохирет чре8 катойохвообмвняз хроматогрефня(Фармации Моно Ь колона BS 5/5; гредионтно едуираае, буфер А:50 мУ HEffi- Я 7·3· буфер В: буфер А паве 5 м натриев хлорид).Фракциите от продукта елуират ври концентрация аа сол от около 1.2 м — х.о х х се събират в 2 конягатжи фракции коиягатнхтефракции се еамиават е (|»1)4рП и (<jal)4pl2. При даалвахрадасрещу 25 мХ ΒώΡΕ. pfi 7.5 дава коннгатихте фрекции (р®1)4рП,сшрпм 24 имала модифициран pI29G в (§а1)4р12, съдържаща 24.5 кмала модифициран рИ90. д) Получаване не азиалофетутн - дашатхЕонвгатите се получават да същия принцип, хакто трансфо-рив-конигвтхта; подобен метод да получаване на азяояоорода-муксхд-ашшиахв-кокйгатй е описан от и* и та» 1988. Свързването на аахаяофетухн към полилизин се осъществявапрез дисулфаднз мостове след модифициране с бифункциояаднихреактив 1РДР (Фармация). Разтвор на 100 ш» (2.2 шшеле) аак-алофотухн (Сит) в 2 мя IQ0 мХ НдРДо pH 7,9 се подлага нагадно филтруване върху Сефадано О-ч25-тсда. От така подучените4 мв разтвор 550 мкл се прибавят при енергично смесване кш15 мХ етанолен разтвор на 5РДР (5,0 мкмож). След одая часпри отоВна температура се пречиства чрез повторно геляо филтру-ване (Софадеко 0-25); получават се 5 мл разтвор на 1.4 мкмодаазиалофетуиж, модифициран с 2.25 нкмоле датиопиридяп лимкер. Конюгати се получават като 1.4 мвдада модифициран азиадо-фетуин в 5 мв 100 мХ ЙЕВ рй 7.9 се смеси с 0,35 шшода мо-дйфяцираа рШО (съдържащ 1.07 мкмола мердаятвяропяодатпх гру-пи; при това се подхожда точно както при получаването да транс-ферна - контихте) в 6.5 мл 200 мМ йШз ря 7,6 в атмосфера 84
as аргон. Реакцжокната смес οβ остаая да арестон 24 маса вркехаХяа хемверехуре. Хонирвтнхе се изолират ех реакционнатасмес чреа катйевобмевна хроматсграфия (Фармация Мото -го-лова О XO/IOs градтовтно елунраие» буфер As 50 att iXfSS рй7.9; буфер В: буфер А шше 3 М натриев хлорид) като предиворелдавето ва колоната се прябавя натриев хлорид де вреХааконцентрация ех 0.6 м. Ф^оящия» оя продукта wipe вра коацеа-храция ва сод ех около 1.5 м. Даалжаа срещу НВ- даае конлгатв»съдържащи о»52 мкмола азиалофехуин» годифицирен с у.24 мкмоларН90. е) Трзнефекция на Верб2*ввехки е pXbVl - ДИВ -комплекси НерС~2 - жлехки се култивират в ДШ * среда плюс ХО % ГСь 100 Х.К»/мл пеницилин» Х00 мкг-мл стрептомицин и 2 кйглутамхн в 125 -филета. Тренсфекцията се провежда вра плътностот 400.000 кнетки/шше. Преди хравефехцвкха клетките ее проми-ват с 4 мл пресна среда» съдържаща ХО % ИЬ. Непосредственоареди трансфекцнята се прибавя хворохжн (Ситна)» така че крей-наха конценхрацкя в клетвата суспензия вшива на Х00 миМ(плюс Ж * разтвора). ХО мкг pJfcVL - Ж в 330 но йВь се смесват е посечени»във Фигура 7 количества ох Х|.рХ190 - кснютат (AfpX), волилиж290 (рХ) или тетра-гадактоза-аеатвд-позшлвзвв-кошвгат (oei)4plв 170 мкл ВЖ> . в сравнителните експерименти се прибавят след30 минути 240 мк? ааиалофатуин ((oai)4pL * (^al)4). Сместа сеприбави кш клетките» клетвите се инкубирвт в продължение ва 4часа пра 37° С. След това транофвкциоаната среда се заменя е4 ма пресна ДЮ - среда плюс 10 % Ж > . Сдед 24 часа дуциферве-нате клетки се роколхират ва луциферазаотс изпитание. Оосоченв- • · -85 те ι» фигура 7 стойности показват общата луцвферезда активностда тражофвдарахвте клетки. Както се вижда от фигурата» рЬиT+dX показват во-мвлке лтшк&amp;епазда актнвноотг (озХ)4оХ показ·*м « т. «0« «Otaoc» накто itpit араОои. η (оа«4т Д| конкурира* за, а8иалогликопротеидавия рецептор в вой»·ват» както ое ешва» стойиоотите. р Травофекция ва НерС2 - клетки е pCMVX - ДйК -комплекси iepG-вветкв ое култивират в 6 ек платки да плътност ваклетките от 300.000 sssiffl/maisa, кзкто е дадаве в е}· Предатренсфекцаята клетките ое промиват е X мв преспа среда» овдарва-ща 2 % PCs. 6 «кг pCMVX - ДНК » НВ ? ое смесват о дадените ва фигура 8количества Т|рП9ОВ-кошрат (Tf рх)» азиадсфвтужа-рХ-конвгат(АГр!)» полилизжн 230 (ply 250)»(oai)4pll или (οβϊ)4ρ12 в 170мкл ш*> След 30 минути към всеки ДШБ-дадагат-йШдекс ое при-бавя X ms Wi садржаща 2 % PC, и 50 дал адевовируо - разтворат даде 6X3X2. В сравнителните експерименти» както е показано»ое прибавят 30 вкг дактозжран пептид (оеХ)4рХ ((oal)4pli ♦ (oai)4 съответно (оа!)4р12 + (оаХ)4). Сместа ое врвбавв към · я г клетките; клетките се шубирет в продължение ва 2 часа при 37°C след веете се прибавя 1.5 мл среда овдарвеце ХО % ГС · След24 часа клетдате се реколтжрат за да се проведа дуциферазяжятест. Стойностите да фигура 8 показват общия луциферазен акти-вите! да травефицираките клетви, ply 290 ошава ефект» (cal) 4pi, показва по-шев ефект; прибавяне да СоаХ)4» който конкури-ра за азиалоглжкопротеиновмя рецептор» редуцира отойдоотяте дастойностите получена от волилизвв. • ·
о) Треясфекция ва ΤΙΒ73 - клетки е pCMYI - ДНК -юшиишюи Клетки от ембряояалкз южва - чернодробни тпт лпнпяAICC ИВИ <мь СЬ.2, S-.Uk е* .1., 1978) «· ЧРНИ0Ю BJ. 57° С » 5 %COg - атаоофвр· в 1!жж. ДШ5Н (0.8 % гликоза), дометена е 10 % топлинно пнактпвмрав ГС., съдърмащ100 ттО) 100 мкг/мл стрептомицин и 2 мй глутамян, в 6 см -«на платкя. Транефекцжята е@ провежда при плътност на хжжзве 3GG.0Q0клетки/платка. Преди трансфекцмята шшп се промиват е X мгпресна среда плос 2 % ГС;,. 6 т рСМН - ДНК в 300 мкл 05 се смесват о дадените ко-личество ммая трансферни - полилизпн29О - кошгат ( я^ь),Азямофетужн-рХ-конюгат (АГр!), полмлизян 290 Свв1)4рь1 1001 Свв1)4рЬ2 в Х70 мжж НВЬ· Сгед 30 минути ммвсеки ДШБ- конвгат-комплекс се прибавя X ми ДЮ» съдържаща 2% ГС я 50 мжж аденовирус - разтвор от щама 013X2· Сместа саприбавя квм кратките, клетките се жпвубярат при 37° С в про-дължение ма 2 часа я след тона са прибавят 1.5 мг среда, съдър-жаща М % ГС; > След 2 часа трансфекцконната среда се заменя с4 мг пряспа среда· След 24 часа се събират аа луцнферазното па-питаква като показаните аа фатура 9А стойности представляват За сравнение тренсфекцжата се преяжда без адеаовцрус вприсъствие на хлорохжн. Травсфекцияте са провеждат при плътностпа клетките 300.000 клетки/платка. Преда травефекцията клеткитесе промиват е X мг прасна среда, съдържаща 2 % ГС> Непосред-ствено преда трансфекцията се прибавя хворохин (Сигмв), таваче крашта концентрация в клетъчната суспензия (плюс дм&amp; — -87 - • · · I * * t * * · • · » · · · · • · · разтвора) възлиза на 100 дам. 6 миг pCMVi-Ш > ^ί) ш O;©е смесват с дадените количества Ϊ·ρ1> Aipl, pI<&amp;250, C^al) 4pII ма (oai)4pI2 в X70 мкл ©6 · След 30 шшутж секък клетките ДйК- момпждаите. Млетките се нннубнрвт в врода&amp;й-жедае за до часа пря 37° С и след това се прибавя среда, о-дърлада 10 $ KL и 10G ши ллорозови Два часа по-късно транс»фекцдавдата среда се замезя с 4 мл пресна среда· След 24 часаклетките се събират за да се определи дуциферазата им. Получе-ните за луцвферазна активност стойности са дадени да фигурав В. ПРИМЕР 7 Въвеждане да ДйК в ί - клош а) Получаване да аат{0Д7-полшшХ90*ковтт Кш разтвор да 1.3 мг азтяСД7-с1Тни^ДС (ймунотех) в 50 да W&amp;b рй 7.9 се прибавят 45 мкл Хмж етададея разтвор дасРДР (Фардация).5След X час при стоДда температура^ След Iчас при стайна температура оа филтрува през галкедада Сефадакс0-25 (елузвт 50 мм НЖ - буфер pH 7.5) при моето се получа-ват 1.19 иг (7.5 Емода) аати СД7, модифициран с 33 даода пир»*доденопрсаиодатни остатъци» Шш|(Ъ)яивиах5о. флуоресцентнамаркировка чрез Р1ТС, се медитира аналогично с ЬРДР я чреатретиране с датиотреитод в аослсдода гедаа филтрация се поду*чада ьюдифацирапа със свсоодал маркаатсгрупк (форма. Разтвор от XX наела полийзиаХ5О, модифициран о 35 вдаламеркаятогруп», з 0.2 мл 30 да натриев ацетатен буфер се смесвапри отсъствие да кислсрод с медифицарав аатнСД? (в 0.5 мл 300мМ ПШг рй 7.9) и се оставя в продължение да едва нож прие^айда температура, чрез прибавяне да 5 I» натриев хлорид,реакционната смес се довежда да съдържание да приблизително - 8? - .:. : ’··' · ··’ · Ο» 6 tt. Изолирането на канигажс oe извърива чрез йокяообмеикахроматограХая (Моно Фаруация, 50 ш ЙЕЖ5 pH 7.3, солов»гредавжт 0.6 а др 3 й затрясз хаорзд); след дашигза срещу 10мй ЙЕРНс рй 7.3 се получават съответните кОЕйгатя, скюяця сеот 0.51 мг (3.2 мшш) ата^Д?~а™$еяа, моджрицираяя е 6.2ата долшж190, б) Получаван© яа <р120 - подмята 190 - коншгзтиСвьрзвеветс се завършва по познетм οι литературата метода чрез таоотерао - сзъразанв след модифициран® о б^ааеямвдоквпро-нова киселдаа-М-хадаксисукципдаадов естер (ВШЗг>> Сигмв) ( Р«ЗХжнт et ai.» 1381). Таоетер-свързап qpI20 - лодияжзян Х90 - копюгат: &amp;в&amp; резоор ас 2 *а» рексмбоата ср!2С а 0.45 мя 100 мМ НЖо ρΐί 7.9 се арабеааг 17 мкя 10 ай разтвор ае SMC.> в да*метилфориемид. След I час ари стайна температура се филтрувапрез годна колена Сефадвкс С~25 (елуент 100 мМ йЕРВз -буфер7.9). £зм разтвора на продукта (1.2 ма) зедааге,при отеъотдаена кислород,се прибавя разтвор не 0.3 вмела пожяояи 190,фдуореоцеатю маркиран к модифициран с 30 кмела меркаптогрупи(в 90 мо 50 мМ натриев ацетат 5.0) н се оставя една нощ ирщстайна температура. Реакционната смес чрез прибавяне на 5 Мнатриев хлорид се довежда дс съдържание на околс 0,6 М. йатпиревете па кашата става чрез йонообулеипа хрекатеграфкя (Моноо ♦ Фармация) 50 мП ШЖ; рй 7.3, солеви граджект 0.6 М до 3М натриев хлорид). След фрекционираяе и двалйза срещу 25 мМНЕЖЬ рй 7.3 се получават ^р» фракцт: от нонвгати А, В и 0,състоящи се от 0.40 модифициран с 1.9 нмода пели- лизий 190 (вря фракция А), състветяс с 0.25 ггз-gp ш модифи-циращ с 2.5 имода подшиаян 190 (фракция В), съответно 0.1 мг rg> 89 120 модифициран ο 1.6 кполз полижиаин 190 (фракцая С).рСУ71 - ДЖ (6 Min’/проба) се ксмпяекеират е дадените лячзетва полгагаинЗО но о додзното количество попизтзин - кон-ют в 500 вет ЙВ5. Междувременно бяха получени зпквотнн частиот Н9-клетки (XQ6 клетки в 5 мя 1PMI с ?. % РС5) или първичничозеааи яяяфсцнтя (3 х Ю6-здшткй в хасотв*8 модифицирана сре-да за Dulbeeoo (мш) пляс 2 % жиД Полилязмк-Ж-как- 'W; пяексите co прибавят към всяка клетъчна проба. Пет минути следтова се прибавя посоченото количество адоновирус 0X312. Клетки-те ся янкубират при 37° С Х.5 часа, след това към всяка пробасе прибавят 15 мл ЕРМХ (в случай на 89 - клетки) или ЮТ (припървични лдафоцити) пляс 20 % PC·. Клетните се култивират при37° С в продължение но 24 часа, събират со и се изследват васпраделяие на луциферззпата активност както и при другите при-мери. Резултата от проведените опити е даден шз фигура ХОА (89-кдеган), съответно на фигура 10 В (първични яимфоцити): При 89клетка показва знтиСДТ-конвгата (фигура ХОА, колонки 7 - 9) иорХ2О - копитата (колонки 10 - 12) най-добрите резултати ас от-ношение на постигнатия с аденовирус гонтрансфер, като при товаpI2Q - кскюгатз постига ясна експресия аа луциферазен-ген дор!при отсъствие па адвиовируо. Забележително е, че при проведени-те опити само 9?Х2О - кояюгата е в състояние, да въведе ДШС впървични гимфецити, и това само в присъствието на дефектен аде-но вирус (фиг. ХОВ, колонки 7 и 8). SW 8 йнактивиране на аденовяруоиа) УВ - йнактивяране /деасзирусен 6X3X2 - препарат, получен и съхраняван кактое епкеаяе във въведението към примерите, се аоставм в 2 е» жджъб- - 90 аатинн ас плетка еа клетъчни култура (500 мо/здяъбаатжна) вър-ху лед па разстояние 3 см от две УВ - лампи (Филипс OTI5). Ви-русът се обзжза с ултравиолетова светлина за времето посоченона фиура Ш 'J алмкзотзд части от всеки препарат се язсяедзатао отвояеше из зарузтзтъра з&amp;кто и по отношение на способност-та, дали а з яаое степен са з състояние да усилват ревтраюфа~ре с положннв-транс^ерин-нсдаати в Не 1а - клетки» Отглеждането за клетките и травефекцкята се иззърава глав-но кансс е дадено по-горе в ”о©ткн и среди*? звзаазванитв затронсфекдатв компоненти се виждат от фигура ПА. Комплекситеот рСШ - НК н 12 т/кг 7* р! се получават в 500 мкл НВ> и сеприбавят 2 х IO5 НеЬ - клетки (в I ил дай ялюс Z % FC;)· След около 5 моутя сс прибавят по 54 кил от всеки вирусен пре-парат кж всяло култура е културата се инкубира при 37° С едаи полезйна до два чеса. След това се прибавят по З^ликвотии части ДЮ плюс 10 % РО; ит« всяка култура, инкубирвнето при37° С продължава оце 24 часа» културите се събират и се изслед-ват за яуцнферезна активност. Количеството от 54 жл иесбяъченлзде нс е s обхвата на изеивднота, теза де рече че теста ечувствителен кж поне три пъти по-годшао количество от вируса.Получените стсйисстн за луциферазяата експресия са дадени не фигура П-З (затворени ннадатн)· Вирусният тигър вз аооо препарат се определя ара използ- 4 зове зс Ш лоаплеаснтнрзз» клоттйиа жй 293. Първоначалносе прдаогежлвзт сераннз ргзрекдаоя ва необучените и облъче-на вирусни проби з дам плюс 2 % РС2. Паралелно с това ое под-готвят й проба от 5 х 10* 293-клетка (зъз вдлъбнатина от 2 см)а ос поставят в 200 вил дет плюс 2 < Алжними 5 тапробж от всяко разреждане се поставят за сравнение във втора
вдлъбнатина· За до се осъществи свързването на вируса кък клет-ките се култивира час и подавана при ?7° С, след това ад» зел-ка вдлъбнатина се постаплт по 2 ил ШМ юше 10 % ГС -. След 48часа културите се броя*, на де се установя цятспетйчвяя ефект·Онова разреждане, над тези конто покепвет по-мажо от 50 % отклетките на културата след 48 часа ясен цятопатпчея афект,показва относителното количество инфекциозни вируси във всекиот вирусните препарати, Получените стойности еа дадеж па фи-гура IIB (отворени квздроти). Резултат? от проведените в тозипример ©пити показва, че при ултравиолетовото облъчване докатовируститъре се намалява е около 4 десетнштаодик» то прилуциферезния * гентрансфер яма само 20 крстн? редукция· Товапоказва че механизмите, която са меродавни ts офекцисзносттана вируса, wops* да бъда? разруюенн, без при теза да се поети» наспособността на вируса да успява геитрансфера. Наблюдава се, че пря по-яискн вирусни дозировки, многомалко се намалява усилването на гентрасфера чрез зируса,(й^. Фигура ПА, колонни 3 - 6) и че топи ефект се проявява по-яснопри високите дози (коленни 7-10). б) йаактивиране на аденовируса с формалдехнд 2 ня зденовирусен препарат се пропуска през ХО ил 025 ко-лона (Фармация РД ю 0, 25 м), предварително екзнлябрирана е150 мК натриев хлорид, 25 «М НЕРВ?-. pH 7.9, 10 % гляцернн, исе събяре обем от 2.5 шг. Алжстотж части от получения вирусенпрепарат се иикубжрат върху лед без (0), е О.ОХ % или X %формалдехнд » продължение на 20 часа. Върху пробите се поставятрие рй 7,4 до концентрация от 100 «М, след това пробите седаализират първо в продължение па 2 часа срещу X r. Х50 мй нат-риев хворид, 50 мК трие ра 7,4 и 50 % глицерин и не крак, след — 92 — · *·»* · .· · престояване една ад* срещу 2 х I x Х50 кК натриев хлорид· 20мМ RSPB5 pH 7.9 и 50 % глицерин» ДЛИКВвТНИ Ч8СТИ ОТ ВЯруС8 СЛСД ТСВ8 СС йЗСйеД38Т ВВрХУ29’ - клетеи ?а ЙЯЬРЕ те (СТВ -?latiaa . лцзцу. и вивзех, 1335). ^ле- ?С5а ее определя действието па третирваи-те с фержвядахид вируси втрху гентргшефере в Hals - клетки(300 000) канте в преданите опит»* кето се измерва дупаферав-нете ектяжяоет· 90 мкл от вирусния препарат предизвиква ДНК -трансфер, който отговаря на повече от 10® светлинни единици.Третирането на вируса с 0.01 % ней с 0,1 % формадахид деваеаж? малко понижаване на геястрвнсферната активност (около 10-кратно намаляване пои 0.1 %). При все ч® при третиране ο I %фермаядюаи вод« до очевдаа нагтба та генстранофврнвта актив-ност* всс пак 90 ж.л от вируса гонат да предизвикат ревна еко-пресян отговаряше не ГО* светлинни е дошли. При третиране с 0.1 % формалдехнд вирусния титвр намаля-ва яа Х05ррп c«n.«~m ferine units"), -сзт° °3зче s саързааоc намалявана ns луцнферазната активност csao s около ГО Рез-ултата от продадените опити е посочен та фигура 12А. е) йнаятявнране на аденовярус е ззягавъдиов УВ/В-мвтскснп соралея Алжвотян части от прочистения вяруези препарат ов довеж-дат до концентрация от 0.33 мкг/мя - В-уетоксипсоралеи (изход-на концентрация 33 ?пггЛш Р-мотоисияеорепен разтворен в дике-таясухфснсйд) и се поставя върху лед hs разстояние 4 см от дан-дания фяятър не 365 ям ТВ - светлинен източник ( гу? вдел33). Вредатрсенето на облъчването е от 15 дс 30 минути» кактесе вижда от teype I2B. Вирусните пробп след товз сс прекарватпрез Сефвдекс G-&amp;5 колона (Фармация» РД-10) вквялчбряраяа с Ос - 93- t 40 % пия&amp;уа. и са съхранява вря *-70° С. Вярусвяте препаратисе изследват οι едва страна 98 способността им да усилват чрезрСМУ1Д'Ьр! - комплекси гевтраисфера в НеХа - клана (отразенокато еяедаяяк адавадж, ляжГос 8в фигура 12 В)» от дара стре-да да способността и, в 295 * клетки да реплицарвт (вярусеитнпр, лява ос вяв фигура 12δ). ДЖО 9 Трааофекция ва 1Д1Д5Т5 - клетки о мохопеу * вирус В тази я в следващите примеря, всято показват усилванетова явтеядапяеярвнето ва травсферяй-оодидазин—ДШ£ ** комплексичрез ретроякруся, ос използват, ако не е казано друго, следитеьатермадя к методика: ТрайСфе^н-ааломзтиУ^-кошвгети я конвгат-ДйК - комплек-си се получават аналогично ва преданите примера, с тази раз-лика, ме реакцията за образуване на комплекси се провежда вобем от 50Q мая натриев хлорид, 20 ми ЙЕЖ, рй 7.4. ШШ - клетките се култижра* в М£й - среда е прибав-ка да 10 % £‘Сь9 хОО 1.й#/мл пеницидяи, 100 мкг/ал стрептсаадинв 2 мй глутамяв> За траисфекцяята 5 - 7 х I05 клетва за Y25 -дае се навесят ва плочка 13 да 24 маса преда травсфекцията. Не-посредствена предц травсфекцжята клетките се поставят в праснасреда я различните използвани при тренсфевциата компоненти сеприбавят в следния ред: хлорохжн С100 мкм, там кадето е дадено), полилязян-трано-ферия-дНК · комплекс» ретровжруоен препарат. След това клетки-те ее инкубират в прсддаедае ва 4 маса при 5?° С, следа смянава средата в клетките се свбврат след 24 маса. получават сеекстракта, при която cq предаат три земразявада/разтопявада цикъла. Аляввотви части от екстракта, ставдартизиравя по отне- • · жше яь (гздашвзо иг протеин, се изследват ва лрцифереетеактивност, какте ® дадено за яредаяатз примери.
Spa посочените условия се проведат траяофекции вв 10«ΜΠ13Τ3 - жю: cT.pl- Ж ’г’оипл?кси в присъствие яли вотсаатшш аа хлорсхяп, текста е показано па фигура 13. Устано-вява os» че без хлороон стойностите за луцяферозна активностпостигат сш»о даете нз фсза (колоико I) $ докзто в присъствиена хлоро^ла, аажа до са измери птесте експресия па рК Д1 -репортераия ген (колонка 2). Повзтетеня се колпеотва теМо1охау-зешгекя1ная-внруе, кайте се прибавят към клетките е%~ecspeueaac с «Ж&amp; - ксжеясйте4 кога? ж предизвнхат яотетцвсе увеличат© те луппфереатета геена експрес». (Кзлвчсстжлз посочете те Фигура 13 са ш).ie Пзоаодзапж, дзли покачването на геитраадфера са дожида ратровируса •Лзпелззензяс в п-жмер 9 терусся пропорет представлява су-роз» ие^ракдиотлрай остетък от ртерслнрус екенрюгираии клетки,са да се подучи лотпърдетеа п пожзетеп.стзо те това, че увея»-чаьапено ае .W - еторта» тезуче» с тези вирусен преперат» садължи дайствнталЕо иа вируса t ©етатъте се подага те пенеораоьиевнос далиаз/Еспцетерециспте пречистване, прз каете ретро-злруеетя остатък (леден във Липурете като EV?) се нодаптрнреоколо фактор 10. Лкс р*тротерусъ? е отповореи за уеиявеяете»so осггтшз з небраната трябва де яма активност {независимоот езехтусяпе дактптерапе те крвйяо лабилния ретровпруе в ©те-па шз коачеитрпрапето» приблизително десетократен те яажодаяостатък. Гжто з предходния пример 10$ ΝΙΠ373 - клетки сатравофшщрат при посочените във фигура 14 условия. От фигура 14 »·· ···· - 95 се вижда, че в остатъка от мембраната има геатрансфор-уеилвадефект (използвани са 20 - 600 мкд, колонки 5-6). Освен товасе вижда, че 200 и 600 акл на десетократно концентрирания пре-парат са приблизително да половина активни, колкото 2 или 6 илиа изходния, неконцентриран ретровирусен препарат (колонки 7 и8). Паралелно на това се преведоха опита е човешки К562 -клетки, които не показват рецептори за екотропния миши-ретро-вирус. Кекто се и очаква, не се постигна усилване на генната «*»> w експресия.
ПРййЕР II При гентрансфзрния ефект па Moloney-вирус играят роляобменяйте действия между трзнеферин и неговия рецоторЗа да се изключи възможността, трансфера на T|pVpE6VI - комплексите в клетките да сс дали на неспецифично свързванена полилизин към ретрсвкруса, и за до се доизясни входящия ме-ханизъм, ретровйрус се изследва относно способността му давмъкне плззмид -ДНК в клетката, която е комплексирана само сполилизин. Количеството но използвания полилизин отговаря иапо-рано установеното количество-оптимум, псето предизвикванапълно кондензиране на плазпид * ДНК и е подобно на количест-вото полклизин, което се прилага е полияизин-траноферин-коню-гата ( Wagner et el., 1991ε). Опитите, чиитс резултати сададени на фигура 15, показват, че репортерния ген при отсъствиена хлоро^ин не се експркнира нито под форма на х. lipL-pKSVL -комплекси нито под форма на рь-р1ШУЬ - комплекси (колонки I а2). 3s разлика от това, в присъствио на рзтрсвируса, приложена-та като - комплекс рояортзр-ДНК окспроира, не обаче под формата на pL - ДНК - комплекс (сравни колонки 5 и 4 о колонки 5 х 6)· Освен това, проведените опити показват, хе присъствие-то не яахяиея свободен трансферни способства за намаляване наулеснения чрез ретровирусе ДНК - импорт (колонки 7 ι 8), И тв8нрезултати потвърждават представата, же обменни действия междугравафери и неговия рецептор играят еъществева роля за усилва-не иа приема па ДйК, осзяествев чрез ретровируса. IMffiP 12 Влияние яа рй-стойвостта върху гентрансферют афект наретроввруся проведените в този пример опити щат за цел да изследватвлиянието яа рй-стййоотта върху способността и© ретровирусктзда усилват геитраяофера· Транофекцнонняте опити се провеждаткакто в предишните примери. За да се установи, дали ниско стой-ност на рй е от съществено зиажепха за гентраяоферияя ефект,използват се двата добре характеризирани инхябитора «а евдо-зомалното понижаване яа рй стойността моиензии и амониев хло-рид· Като изходна точка служи разсъждението, же тези две ве-щества тогава яа повлияят на гептранофера, когато ретровиру-са за гевтраяеферниа-ефект се нуждае от по-виске рй-отойнсст наввдозома. Ако обаже оа използват други механизми за този афект»а именно директна фузия върху повърхността на цятоилаамата»подобно както при HXV - входядня мехакх8вд, то тогава този ве-щества или няма да инат негативен ефект, дори евентуално даинат усилвах афект» ако променят пътя яа Т-р! - ДНК - комплек-сите· Вжоаарвмеитаднжте резултати, които оа дадени на фигуоя 16»подкрепят по-скоро последната хипотеза. Изследвана бе въздейст-вието па двете вещества върху Т/рХ - да -тренефера и се надари»же някоя от двете вещества ве може да замени функционално хяорохин. Същевременно се установява незначително повишаване ва луца-
фзрезната-генва експресия при пс-висски кинцентрации на апо-ниев хасрад (кодовия 1-5). Самостоятелно ретрсвируса показванаблюдаваното и в предишните примери леко усилване па ДНК - тран-спорта (колежка 6). Наблюдава се силно усилване, когато ретро»вируса се прилага в присъствие на I шШ жщезж (колонка 7).малко до-малко силен ефект се наблюдава при по-висока концен-трация на монензин (колонка 8), кзкто я з присъствие на амониевхлорид (колонки 9 и 10). ПРЖР 15 Усилвам на постигнатия чрез тренсферан-кстагат гентраао-фер посредством il-крайяия ендозомолитен пептнд на иафзу- еяце-домаггяутжна НА2 а) Синтез на пептида Пептида на последоветедностте (ssq id жм) siy-Lei>-?be-
Sltt-Ala-Ile-Ala-Oly-Phe-Ile-Olo^Asr-Oly-Trp-Glu-Gly-let- ιΐβ-Αβρ-oiy-aiy-oiy-eye се получена е помощта па *е®е (фвуеревядотокеикарбовхл)-иетодз (Athertor et a!., 1979),чрез синтеза, при което се използва Applied Blcaysteme 431* Ρ·ρ- tidsyatbielser. Защитните групи не страничните вериги са терц.бутна за eye, siu и а«ф и троял за Asa. След реакцията пасвързване се провежда нинжадринов тест, който показва градус пасвързване повече от 98 % за всеки етап. Започвайки с Λ-19 сспровеждат двойни свързвания. Н-крайната гтос - група са от-странява от част от пептидната смола с поиоцта ка 20 % апперж-дин в Ш (ϋ-метилпиролидон. След това з^ос-завдтопйте ине за китен в фракцвж се промиват с ДСК (дахлорметан) и co сушатпри висок вакуум. Добивите възлизат на 293,6 кг свобода отмое пептндва смола, съответно 366.5 мг -зажтзна нсатид-на смола. Ш.1 мг от гаюо-евободатз пвптндна смола в продал» - 98 - ·· « иение на 1.5 часа ое подаете не разцепване с трйфлуороцетнакиселина ара което ое използва смес οι 10 на ТГА» 0.75 г фенол,300 мкл ЕДХ (етакдитюл), 250 мкл етстметклсулфид и 500 мовода. Пептида се отделя от смолата чрез филтруване върхустъклен нучфилтьр. Смолата gq промива е даяорматан и промив-ния разтвор оо прибавя към филтрата. Филтратът се концентрирадо около 2 мл в след това на капки се прибавя кш 40 ил етерпри бъркане. Утайката от аептида «е отцентрофутарз и етернияслой се нахвърля. Утайката се промива три пъти с по 40 мл етери се суии под висок векуун. Получените 58 мг суров продукт серазтварят в 3.5 мл 20 № МгЦШЖ, еъдъраащ 300 акл 25 % аш-няк/л. Разтворът ое пропуска през Сефедеке 0-25 колона (Фарма-ция РД-ХО) сра използване на садя буфер за гелнс филтруване. Пелият материал ое нанася върху йснс-0 - колена (Фармация χΟΟх 14) (гралюит: 0 - Х0 мия 100 % A, ХО ~ 100 мин 0 - I0Q % В. AJ 20 Юй ШдМС03 «· 300 мкл Х1Н5/л. В:А ♦ 5 М нзтрвев хлорид.Лзмервавия ври 280 мМ, Тгр-флуоресцентпо доказване при 354 нм.Скорост на протичане 1 млДин). Продуктът се елуира с I М нат-риев хлорид» Главната фракция кз йсно 0-колоната се пречиствапо-нататък чрез фазова високоефективна течна хрома- тогрефвя ври използване ма BteaAD-st-роге rp-XM - КОЛОйа (^50х 10 мл) (градзент: 50 - 100 % буфер В в 12.5 мин, 12.5 - 25мин 100 % В. А: 20 Ш4НС05 + 300 МО hLH3/st а: А в 98 %метзнол. Скорост на протичане: 3 мл/мин. Измервания при 237 нм).Продуктът алуира при 100 % В. Фракцията с продукта се концен-трира върху speedvec. ра^^ря се отново в буфер К и накраясе даофидиаира. Добивът възлязе на 8.4 кг не HPIC- пречистенияпродукт в цистеинзеимтенате ферма (пептида бе означен с *Р16·)).За да се получи аептид в свободна меркаптоформа, терц.-бутиа- 99
зацитената субстанция се третира в продължение на 30 минути пристайна температура с тйоакизод/етевдюол/триф^герсцетйа кисели-на /трлфлуо{нйетансулфоров2 киселина (2/I/4G/3} трифлуорметанеуя-фоновата кяселина се прибавя след другите компоненти в посочено-то съотношение)* Пептидът се утаява о етер* провежда се геляофилтруване (Сефадеке ο- -25) е горепосочения буфер А в атмосферана ерген и така се изолира. б) Свързване на инфлуекзапсптида е аолилизянб X) директно свързване през СРДР (оукдгаимидилпарида-датнспропнонат) 19.8 кг полидязза(р1)3'А1 - хвдроброжд (Сагма) се гелнофиятруват върху Сефадеко G - 25 колона (Фармация рД-ХО) в нат-риев ацетат pH 5, за да се отстранят нискомолекулните фракции.Въз основа на нннхндррпозня тест» рХ - коццзнтрецаятс следгедното филтруване възлиза на М6 йг/ия. pH стойността на раз-твора си наглася на 7 - 8 с помощта на X д натриева основа. Кък2.5 мл на р! - разтвора (7.9 :дг pi ~ о.п аашола) се прибавят0.64 мкмола СРДР (Фзряещш Λο ι·^ разтвор в абсолютен етанол).Това отговаря на йодно съотношение на ОРДР : р! от 5 : I. Смес-та се оставя през нощта да изреагира и геляо се фжлтрува в 20иВ ХХН^НШ^ рй 8.2 върху 0-25 кслсва. След редуциране на аяи-квотна част от филтрата с ДТТ (датмотреитсй). измерването натвопиридон доказва, че реакцията е протекла цялостно. 0.3 мк-иола рХ-СРДР (по отношение на икмол СРДХ) в 2.2X2 ил се оставятде реагират в тиолната форма с 0.35 мкмсда аептид. полученатапри омесването на пептяда о рХ боа утайка се разтваря при spi-es аянето на 2 м гуаниджидро хлорид» при което реакцията проти-ча ври прзетоявоне едва нощ. Фотометрични измервания на тзолир»- - 100 - дой в реакционната смес отново потвърждават цялостното протича-не на реакцията. След това сместа се диализира два пъти срещу2 л 20 мМ Н2?&amp;У0.5 М гу8нидинхидахлорид. Полученият разтворсе нанася върху .«оно -колона (0.7 х 6 см, Гармация) (грздкент: 0 - 20 MBS I0Q % А, 20 - 140 мин 0 - 100% В. А: 20 мй 8Ш0 рй7ЛА5 М гуанидинхидрсхлорид, 3: 20 Ш ISKSy рй 7.5/3 й гуада»данхидрохлсрид, 0.3 мд/мга. Доказване при 280 нм к флуоресцент-но доказване при 354 нм, активиране при 230 нм). Фракцията отпродукта, която се елуира с 1.5 М гушшданхидрохлорид, ое Анали-зира срещу 2 х 2 л И3> Последващото определяне чрез кивхйдржво-ш тест на р! - концентрацията показва концентрация от около I.I4 мг/мя. Пептвдното количество в разтвора на менютата се на-числява от абссрбцняте му пря 280 км: получените резултата гово-рят so коларю съотвонение на пестил : pi от MI.б 2) Свързване през пслиетиленгликол-динкер 14.6 йр pi 500 хидробровд (Сирма) ое сеяно филтрувзт, дае-те е описано при 6 1). Въз основа па вднвдриноьиа тест pL- кон-центрацията след годното филтруване възлиза на 4« 95 мг/мл. рйстойността да разтвора се наглася на 7 - 8 с поаощта да I Мнатриева основа. 2.7 мл pL- разтвор (15.5 мг рЬ« 0.22 мк-мала) се прибавят 4.55 мкмояа СРДР (Формация) 50 му разтвор вабсолютен станел). Това отговаря иа шзлно съотношение от С2ДР:pL от 20 : I. След 1.5 часа реакционната смес се годно филтру-ва върху Сефадеке G - 25-колона з 0.1 й натриев ацетат/5 й гуа-пидавидрохлорад. След редуциране на алйквотна част с ДТТ, сепровежда определение да тиопиридоз, при което се установи съ-държание да 5.62 гдкмола СРд? в фракцията на продукта. СРДВ-мо-дифицираная рХ се редуцира чрез прибавяне на 79 мг ДТТ в раз-твора. След 2 часа редуциране разтворът отново се гелао фждтру-
в® въряу 0-25 пра посечените по-рано условия. Твеявото опреде-ление чрез йшан * теста лакавва тиолаа концентрация от 5.15икмола з 2.224 пя. 17.62 ар « 5 мкмола POS (нолиоксяетилей-бис(6-аш|нохевс«1л)»Ситна) се разтварят в 500 мкл 20 м» ШШХ^/З М гуанндмнхидрохло-рид рй 7-8 и се остевят да реагират е 15.8 мг £МС$ (£»-маяеин»-докапринова киселина-К-хкдроксисукцинижцов естер) (Сигма) (е 44.7 шшола)» разтворени в 300 шсл Д&amp;Ь’ (дтаетоформамжд). След 30 минута разтворът се гелн© филтрува върху G - 25 (20 мМнатриев бикарбонат/5 «* х^уанидинхидрохлорид). Ютометричвоте оп-ределяне не малеимидо - групата при 300 нм показва концентра-ция от 6.36 мамела реагирал SMG5 s 2 и разтвор. Към 1.049 мл от този разтвор (отговаря на 3.34 мкмолаКкСг) при ййтензивяс ре змеева не на Вортеко ие капки в поток отаргон -·β прибавят 1.39 мкмояа от аеятжда в тиелка форма (в 2.5вя 20 ма натриев бнкарбсвет/З ь гуанидинхидрохлорид). 15 минутиао-късвс, е тесте на Влман вече не могат да се докажат свободнитиолаи групи. Разтворът на редуцирания СРдР-модифицирен р! чрез прибавя-не as X м натриева основе се докарва до ри 7 - 8« 1.373 пя оттози разтвор ври интензивно разбъркване е помощта на вортекссе прибавя към горната реакционна смес. При това модерното съот-ношение на яеитнд~;< НгЖ-£&amp;&amp;огр1>е I;2.4il»4 (по отведатка £шС6» съответно Л). След изреагиране в продължение на 2.5часа с теста иа Едааи не могат да се дакалат повече тмолаи гру-пи. Продуктът се диализира през нощта срещу 2 л 20 м» НОКо рй7.3/0.6 М натриев хлорид в след това ее нанося върху йоно □ -во-лове (градоент: и - 20 минути 22 % А, 20 - 150 мин 22 - 100 Άн: 20 Mi ПЕРЕ- ри 7.3» И: А + 3 м натриев хлорид. Скорост па -102- .:. r ··..· : ··’ · протичай· 0.3 цл/мия· Измерванията ое навършват гря 280 на, аФлуоресцентното измерваме ара 354 нм). Продуктът» която се елу-ира е 1.5 - х.6 ш натриев хлорид, се диаажзмра срецу 2 л НВо .илредоляне аа рХ - концентрацията чрез няахидриясв тест и фото-^тричното определяне нь вептвдтз концентрации spa 28о имдево пресметнато лоличестао на аеятмд t р! от 12 : X при рХ-концеатрацня от 6.49 мг/мд в обц обем от 4.5 ши с) Дшшзомяи препарати чрез BV - метода («revsree-pBaea eraporatioa^ce получаватЯййОЗбММ (Ssoks g Papchac^opoulos, 197eisiraubUgerB Papahad-jopottlos, 1983) i аоде фаза io мй ВКЙ.6 рй 7.3, 100 им кал-цака 150 им натриев хлорид; органична фаза: разтвор от 300 мкмо-ла X -сх-лецитин (от жълтъци» предимно иалжтоилолаоилфосфатя-дйлхолив» Araiiti ι-alar Lipids) в 280 жл хлороформ се концен-трнрат о пошжта на ротационен изпарител. След това материаласе суми под вйсол вакуум и след това отново се разтваря в 3 члднетйЛОй етер. 1 ю от йодната фаза се смесва основно с етерна-та фаза чрез ^ртеко я се третира с ултразвук в продължени© на5 минути дрз 0° С ά .онякетор (тип бана). ^дед престояване 90минути илрцу' лед, материала ©ste паднах в нродьшеаие на 10 жасе третйрз о ултразвук, получената а резултат стабилна енулснябавно се изваряла алрху ротационен изпарител. След отстранява-не us диетилолия етер при ίου нбарл co прибавят 0.75 мл от вод-ната фаза. Останали следи от етера се отстраняват чрез ново из*парпваве при 50 маври за 30 минути, йслучената емулсия (1.7 мд)се центрофугира при 50и об/ник и след това се екструдира праззушшоаерна поликарбонатнембрана (0.1 мкм) при което се получа-ва краен осем от 0.7 мд лиоозомен разтвор» дипозомжте се отде-лят от не-инкораорирения материал чрез годно филтруване (Софа- * 105 ** · ’*·* ’ ·..* : .·’ · • · · · · декс £ - 50 средз, Фармация; 23 si ггл-обек» 10 аШ KKPSS рй 7.3/150 аМ встриав хлорид). Събират се кест Сракций от no 500 isuuЛяшцдои фсбфбр се определя по метода ks Кпртлат» 1955» ο 2м.ч д) йштаания па иропузглйзъсй иа жшсз.же ОотобОадванст© яз сздврлтето не кипозомято {се ззавряа ме ©слова ка тявавето и» вклечсйкй малцов я оттам преваляващото разрежда® t лрл aceto ос пъдуч&amp;аа самсаагао-Х.ПС за ддуоресцейЩШЗ (Bondeson efc el#» 1984). £amesno3GT8 фдуоросценцзд се измерва е доатрон 25 апов*тралеа флуортштър (възбуждане при 490 ам» емасет пра 515 им) За целта 100 шочш аяшгавтет чаотя от горния разтвор на дапо-зокя се разрсздв 100 кратао с 0,1 й натриев ацетат адя 10 ШН£Й£5/Х50 яН натриев злорад буфер със съотзотвата pH -стойност(4.5» 4.5» 5,0» 6.0 7.3)» за де се получм обем от I пз. Как те*яя разтворя се прибавят 2.5 да от иептида (терц.-бутвя зада·*ва форма? X даДш разтвор в йЗ;>)в кяветв яри смесваме escслаб поток от арров .(краййм жрдатпеция 400 ям пептяд). Кгж-цегвозата флуоресценция се измерва в различни кемевти след ар»~бовяке ва аептиде. Стойностите ss 100 $ ляха* (пропуоюшвоот)®©определят чрез прибавяло на 2. мо тритон а~Ж (-·лула). По cw печел се работи за измерваме as кегщеяаеаета |яу-ореецешш след приба-аяке as пеятйд-рЗИшдает аък лапоасиввмразтвор. 2.5 да от кедаата (I да/жл» киацеорпциа етвеездасзсамс зе количеството р!) се врябазш ж I мг разтвор за яяво-зоми (крайяв мевцентрзвдзя 20 пм модифицира пептид). /лалета·
Sv, 2.5 iM ЕСЗГЛ^»П0Л^й8№-а0гетаТ след 1 5 аиаутао жуб«ра-ве с 5 да Дйй се подлага ка язитеняя зз аронусалж-ст яа ж*лозовите (ш&amp;вд - мзлитанжя). - IO# - ... *··' · ·· · Намерен© бзпе, че пептиде способства са освобождаването изсъдържанието иа жтясзеумте caw в кисела среда (фда. 17). Пеятм-давят котета* е активен при значителна яо-виска рВ-етеШяеет, ка-то при това и при неутрална pH-стойност е силно активен, коятоактивност при яенмвавене sa рй сше се усялзе. Конплексирането а а котетата с ДИК еяижотре активността принеутрална рй-стойасст, доьсто ари оселе среда иш ясно азразе-Н8 активност. е) Трансфекция иа К562 - клетка К562 - клетки се култивират в суспензия а 1РИ1 1640 - оро-да (Рибко BIX пмю < г натрие» бикарбонат/!) ишос 10 % PCs , 100едивди/ил пеницилин, 100 ккл/жп стрептомицин и 2 вй гяутамидо плътност 500.000 кяеткж/мд. 12 до 20 часа преди травафевд-ята клетките се поставя* в пресне среда, която оъдърка 50 укУдесферкоксанмк (този чярка се предприеме зе де се увеличи брояна транс^ерязрецепторяте). Сутринта преди тракофешшята клетки-те ое събират, суспендират се в пряспа среж съдържаща 10 % PC пл»с 50 мкМ десфериокеамин (250.000 клетки/мл) и всеки 2 илсе постазят в бдвдо с 24 вдяъбнатиая. 6 мкг аС.Х/Х, - ЛИК а 160 икл Вь се смесват с пооочзнитена фигура Х8 количества 74 рХ - конпгят етя е рХЗОО а 160 ккз1LB. # и елзд 15 мипути се прибавят посочените количества инфл^-ендейпептид-рХ-иотесат (,!Р16рХ1’). След нови 15 нияутн сместасе прибавя към К562 - клетките. Клетките се ннкубират при 37° С з проджеиле as 24 часа « след геза се еъбире? за определя-не на луцяфорззатв· луциферавната активност се определя както?. преданите οπντκ. Дадените във Фигура J6 стойности погазватобщата дуцнферазна активност не траисфицарентге клеми» $ ) Транафакцйя ва fleis - клетки -105- ··· · ..... НеХа - киш ее отршж в 6 сантиметрова датуралниблвда* как» · описано в "Клетки и оредя”. Траисфекдяя» сепровежда при плътност ЖЮ.000 кяетки/пявчка. Преда травефен-ция» клика» се какубират с 1 из пресна среда* съдардада 2 %ГСо* 6 шо» pCMVl - Ж в 160 да НЙ5 е® смесват е посочвайтева фигура 19 колячестаа Tipi - кошагат ао е рХЗСЮ мля със смееот да» в 160 пял IBS. След 15 мадам се прибавя посоченотокодаеотво иИлуондвнеатяд-рхмюшогат («ΡΙβρίτ) и след нова 15мядая се прибавя сместа към клетки». Клетките се иикубирет 2чеса пря 57° С* след това се прибавя пряспа среда е добавка от10 % £С5 * Клетките се инкубярат ара 57° 0 в продължение as 24часа х след дева ое проверяват за дуцяфарззе» ЛучИферазаата ак-тивност се определя* яакто е показано в предени» опити. Дада-яете във фкгура 19 стойности представляват облата луциферазнаактивност на транефидирайяте клетки. IP4M&amp;P 14 Усилване яа предизвикаш чраа трансфермй-конюгзти гея-трансфер с помая» » допълнителен ХЧ-крайен садозомо- лятея и^луеица-хемагглутик!га-пА2-й©атад w пептщ- йептяда на последователност» ( seq id но«?) ciy4^u-?he-«ly^Ie-Xle«Ale-SIy~Phe-Ile-aia-.AsB431y»Trp-eitt-31y-Met-I1e-AoP-Miy-ciy-Giy-cys е означението P4.L) се синтезира иоаналогичен яачяв из олисанля в пример 15 а) пептид. Свързвьна-то не пептда към иокнлизина (р!500) се проведа как» в при-мер 15 61) чрез овързва» чрез 51ДР. при това се получават ко-шетн с модерно еъатаовандо па пептид към поодоив от 4 si. б) травофекция на йа!е - клетия с мнфлуеидапептяд -ковягатя -106 * .·.* · ··' : ·· ·
Halt - МШИ(| K8K2G бв&amp;в K83880t Св ОХГДвЖДвТ В € СайХИ-мехроан баю» хранефещта св йрозедда при похаосх ох 500 000штл/&amp;вв&amp;* йрвдд травефввдяха квехдихе се иняубярат о 1.5мж врмвп среда > сдава 2 ь шд‘ ре^^ДШС в ХбО мкк йВз (Х5и ий &amp;ахрдев осрад» &amp; &amp;*- рй 7.3) се смесва? с6 ш· ах мешаха 1>рШчШ в м жя пи- « след 15 ши ее при·бавех Х0 мкр мм^вяцаяоях1а*асдП!Я4а1Тйко1й-2*ах Шр! яяв, аа оре-жеш· ж8 ш ицдаенцйпоп5ид~лолшжзю*оцйгах ПбрХ/(виж арм-мар Х3)$ восвчааяхе долачссхва за дззха асяхлдзи авшаха бяхахвсхуааш «а аредсхавжяввх едкдпвдйзхв дадйцеехзз за усваввнена гокхреаофвра* слаА ааая *5 плоухк се ар^баия csseexe ох кдвх-мм« Сдвд Ж шава &amp;»&amp;cj «х&amp;#1 Lu и' vu w vd /0.1 wO i'l ЗОдРхО^ <3i5 фарааа· асвбчаамхв взш ^ВД п^схсдаисхд кредехзмяавхд^цяфвразиа аахмввздх па ^рвив/йцараддПС ..λ;ι.:η. ixjpH UjpH&amp;XiMft&amp;iifcMu» uiu wi»4f«4>в*хс C —i#-1X2*328 вю ttoaeue ox ^«5 йвхй £iC~as»cQiw уссдждю дз геахрвюфврв чрезпвпгадаия яоажш r4xp^ о) ТраааЩцкя да ШХ 0*2 стехдя е лшдаойцааезхждаuwrilux’ai ШХиХх» 2 ядеш св ^хдх&amp;рдх» дедха з адаер 6» ймфжу-еадваеаздв Р4х сь яв«»ж‘яр&amp; е додйо&amp;яйЗОО врг шларву свохаа-маама маахмд $ домавдшш ex is..« Ш и b:i. Кеядлеяси ах 6 доpufeVx»- /liA м <.и ша» αχ д»ппд?ихйхе с&amp; драбашк ksh кжегте· Завразнвшге се иадсдзвах 20 «ж? рХЗОП ади 20 шш РХбнходмяхаюимошахм, оазучвии аа*хо в диксзяа з зршер 13. Маехаяха се мя-мубярах ярм 37с 0 ά ирвддоашзе as 4 uace* сдед хова се приба-вях 2 мж вреда* еддардадз 1ь % РС.>> С.шд 24 маса жаехавхе свввсярвх за яуцафвравяйй двсх» реаула-стс ах aeisxo оа дадввяаа фшурв 2а а ддйоееявохс яел&amp;ддс zcnzTsaaa (фхг. 20 С), луця- оадзта се хоетс ас арсзезд в яраж-р j.3 е окле&amp;ьо, ахговатв гаДСИВГЙТЗ (СЪОТоеТСТърЖч Яе Д.О lUif ;кЖЙЗМД» ph CSOiib'OC» 5)co bmsss esc свд^Р^кие^с не «кчг-ид Ъ i/U. ζϊ»0 йягурбЯб РДХе озвачзв то ?Д;п:ди*5‘’}» гп-,;.4Ф in -ь„: Тр^нсфегда -J д hiu-0»Ou‘f:^ ,»z ;~Х’£ЛЬ№ЗХДбЗ<* - рв&amp;ОргО" ргсави A0£0i^uS и Hv cacsv дехаьйаие ie р-гададтозадз-та - експресия a) яуатияжраяе &amp; йраисфт-дп аа ялет«е р. сроисд^адиячо ос aeha - taesiat в - сра- да* с^роадс 0 р ГО.;, тсидиим» стреад«,смжи s 1’л^«дмяи» кай·»о е ждао з предппапхе опита» ο ί си нущрездег Овдд а$р*заогржажб cswie (Зх хЛзают/бздо).
Se трано^кция^с С w:r и? г -йд дук ·εο зида co-pcaopTeprcanwi дскоздгк» (р(Х7~ - - 1»8я) з >С0 та -еч лскядекенрй е 12 tssg T4pI,i.90h в ici .мкд де'· ? сд ''к^Д/ре ?ν х.нутд сцщ cmUug resale-; релурч, hpv адг ear? к икг -гал д 160 жа USS се ^йау(&amp;~ра» с € да ΊΟνΠ,Χ/ з ct: ш? 15 и’‘.ъ:**гд при сде "ке деипо*рстура. Саед тс?»е се пркбейят 1г; да а подучения з пример 13 а«*фдуеицйпедж-«си^’82 (ГХбрО) s ео ддз hb; it сучете се инкубир»нови 15 Ш1Еуки· Хсзи ДШНюйкке^иеа-кешиа.иса се соосааз сдодзейа с I ωι -й ;, лл,л 2 Д -ГСЗ» ен-хкОйотакд ц гяутеавм, йекто ададено яо-горе, 2в да се acaase ефекта от хаерохая а $дао«а-Р7С яхрзу крезе асдателаостак» аа храисй^та* да сдедзвдаеексяержжгеи сс прабазв хяорохин ярк иридия яенцвигреда о» 100май ада 50 жз. от ряатаера яа адеиоаирусиш да &amp;3Ι2δ дсо&amp;е-ййтелно й®а средата, «ояго еадьряв ЛйК * поликвгйен - кошмек*са»»· - ΙυΕ - .:.····· ;за трансфекциято пьраоначадиата хултурадиа среда co от-странява от клетвите и ι ий среда, сцдарвгаща .ХШ- комплекситее или без хлорехин яли вирус Qz прибавя шесто нея, След инку-бационно врепе от 2 часа πρ-л 3?с С кш клетките се прибавя Xця садркащ 10 2 т*Со» антибиотик и гдутамиа и шшубира-аето продаваемо още ;·:. часа» блед това се отстранява цялата сре-да а клетките се стряоздт з 3 пя пресен шцве 10 2, анти-биотик а глутаииа. б) β -галактозидани язвитаяая 48 часа след трансфехцията средата се отстранява, клеткиите се пробват а х с фосфатно буферираи разтвор на натриевхлорид (PdS) и се фиксират с и.5 2 гдутордйаддехлд в 236 а про-двоанае па 5 шцута прл стадна температура. След това средст-вото ос чикснрапе се отстранява и клетките се пробиват 1 х силед това се инкубира с оцветяващ разтвор (хб к, фосфатен бу-.>р рп 7.и, х5и а., натриев хлорид, а &amp;.·, магнезиев хлорид, 3.3д- K^eCC.hQ^ibJ, 3*3 йм; и с.2 Ф 5-брои-4-хлор-3- индолнлч} -галактониранозоид) при 3?° С 2п ииаута до 3 часаСиа я сьае, 1989). ^л°д това покриващите стъкла се изядох-ват с Хмз, вода и % ф-ен етаиол, сушт се а се покриват с ио-зиод. бе анализа се използва цайс Аксиаот микроскоп. чигура 21 показва снижите на жкроско&amp;ските увеличения( х х12). А: небе - клетки, тронсфицирони е € до pC;XV-^ -гал,комплексирааа с 12 до ТЛрцжУил· цветната реакция за ,-5 -галак-тозидаза се аровеад за 3 часа. чигурата показва, че много мал-ко клетки (55 клетки; групата па оцветените клетка е ноказвиасъс стрелка) експримлрат β -гадзктозвдазния ген. я: Яе1а-кяет-ки, транефицираиа с 6 до р&amp;Л-^-гол, комплексараш: с 6 шHpUMo и х2 до Гхбри цветна реакция: 3 часа. ,,адко клетки 109 ··· » » * ъ * ъ * e » « * -' * * f * • ···· · · ····· · ··»·*·· ··· · · · · ·· · (250 КЯЗТВН) «аямиам* -л^аяяктппижаяяяя ΓΟΗ. Ряяиияятя кяΕ5β«Κβ 8 Вбв Β8Ϊ по-силна ОТКОЛКОТО В А· С: ВеХе-КЛеТКИ» трев-фкциреиа е 6 να рСМТ- -гал» комплекоиражи в 6 шег UpII90B и12 мкг P16pL в арисютвжв ва 100 меМ хлорохии. Дветва ршщя: 3 часа. Много групи клетки поканват силно позитивна ршцп (по-вече от 1000 клето). Д1 Bela - клет* трансфициранж с 6 атрСМ¥-В-«д, ковдавоврамв е 12 мор Т,р1190В в присвствве па аде-новируе 01312. Цветна реакция: 20 ивв. Почти всички клеткв (по-вече от 90 %) показват положителна реакция. £: ме тревефициренжHole - мм» (контрола за специфичността ва - гаяактоаидватапяяяияяК Цвета овакпия: 3 часа. ЙРШО 1< а) Получаване аа козиид» втдт аа луцифераза кодираща 3.0 ко sail — фоагиевт. еяляомвв едва единствена поливанааа Р. ядоНа дуцмферазиа последователност под контрола ва1Л - проматора се янтара ва единственото sell - място ва коз-мидияя оов С1-7з1» за да образува конкатамерв. (С1-?а1 садьркаедин 37 so хуманен геяомаи ДЙХ sauBA - фрагмент ( ТеПгегйеи).ва явви гена» клонираи в вюйп - мястото ва>р pW15 ( strete«ea·)). дшжяояяяя реахцжождует олед това см опакова жн витро и алжквотва част на аолуче-вита фагаи частичка се жифжцират в E.ooil мвзд в ое ялата*рат влряу IB «*р платки. Рекомбинантите ое екранират чрезвию хибридизираве врв използване ва 3.0 ко sail - фрагмент(Зг«$-марвжрвв чраа равдокшрав вравмю) като хибридизираца «Т ми И» »·· · · « ··β - no - картираха* Козмидея-ковструкт ( сееше), съдържащ едноваао копае «а sell- инсерта, се култивира и се пречиства върхуцезмев градхемт (обща големина! 48 кО). Един малък контроленкозмид (12 ко) се получава чраа γ«ζ*»« от соен» с set ι, ре-джгжрева, трансформиране на баетерии х изолиране на правилноплаамжд* Том дево 12 ко ДШС - молекула, на конто липсва частот хумахнхя Ш - мхзерт « една част на полклхжорв от соен»,аяазмждм ршееше (8 ко) о аяазмида описан в пример 5« вдай£bV -луцмферазен гвафрагмент (един АраХ/ prui-фрагмент от pasra,кловжрак в СХаХ - мястото ма денк - яокуса)· б) Транспортиране на козмида в ИаХа - клетиBela - тт (3 х ХО* клети за 6 см блюдо), покрити еX и ДЮ t 2 % ГСзсе комплексират е T.pi/ДВК - комплекс·,получа» както а ошкаво ввв вмвдаиио към примерите, «държа-щи посоченото количество Г р! , свободен полилизян х ДйК, иое мнкубирет* Допълнително инкубационната смее получава вля 100мвМ хлорохкв (колонки х х 2) ххв 10 мкл аденовирус 0X312, съ-държащ 5 х ЮП частички за мл (колонки 3 - 12). След двучасо-во ивкубира» при 37° С ким всяко бледо се прибавят 4 ма ДЮ♦ 10 % PC · След 24 чаоа клетките са събират и се измерва лу-22 А* о) Транспортиране на козмида в OX-XS-X (DOBtl et el*, 1998) (X X Х0б КЛОТХХ SB 6 ОМблюдо), покрити с В ма дю ♦ 2 % ГС се комплексират еГ рХ/Ж - комплекси, получени както беше описано, съдържахапосочените количества terfpL, сзсбодев аолилиахн х ДНК* ЯйП<дииимиии> иц ИНКТбАШЮНВЯТй СИВОМ СЯ ПОИб&amp;ВНТ ИЛИ IQQ Mtttхлорахжх (колонки 3 и 4) или 10 мкл адановируо 0X3X2, еадф” - ill - • β · · · • . · * * * · • » · · · · ·.···*· « fc * * •« · · · · 381 5 X XOiA ЧЗСТИЧКИ 3 МЛ (КСЛОЯКИ 5 B 6). СЛ8Д ВС8КИ ДВ8 48-сове инкубиране ора 37° C към всяко блюдо се нр.юавят по 4 ил + ХО % ΧΌ6. След 24 часа оеткито се събират и се измерваяуцифврезяата активност. Резултатите са дадена па Фигура 220.ШМмЬР X? Гентранефер посредством хщшесци свързани адевезируе- ЗОДШШЗЙИ - кошутата а) Получаване на аденоваруо-полализан - копират чрезхимическо свързване 2.35 пд от геяфидтруван (Сефадекс G-25 2ДХО, лзраация) раз-твор на аденсварус 6x5x2 (около хО11 частички) в Х50 натриевхлорйд/25 мо , рЛ ?.9/Хо % глицерин, се смесва с χΰ mbs(ХО шшла) X аь разтвор от («армация). След 3.5 часа при стайна температура модифицирания вирус се отделя от издишайтереактиви чрез редно филтруване (както по-горе). Разтворът се из-плаква с аргон и се модифицира при отсъствие на кислород в сре-да на аргон с 42 мкл разтвор на ХЧТС-шаркараа полилизин (1пшод), а сс оставя де реагира с 2.3 нмола деркаптопроиионатна-групи (подучени както е описано в ЗьЬ 752). След х8 часапри стайна температура, половината от разтвора се прехвърля вепруветка за цетро^угирапе, внимателно коте долен слой се въвеж-да х «а цезаеахдорид в разтвор (плътност х.ЗЗ г/лл) и 2 часасе центрофугира при 35000 об/мик (5П 6о ротор) при стайна тем-пература. вирусният слой се събира като 200 нкя цевиез хлоридафракция и се разрежда с гШ5/5о глицерин де х ад. да-язпйтаннята за свързване се провеждат с 300 шел отмодифицирания вирус; вирусният разтвор се разрежда с х мл йй5и се прибавят Χόο мкд разтвор на 35 5 - маркирана (15 кгpBSVX^ получен чрез Иаа-транслацяя). Оа контрола, екснеришен- - 1X2 - тате сс провеждат със същото количество немодифициран вирус01512 успоредно с първите. След 50 м*иути пробите вре прехвър-лят в епруветки за цантройурироне» ж-мателно се подслоява 1мл разтвор но цозиев хлорид (плътност 1.33 , гДл) и пра csatoтемпература се центрофугира да часа прн 35000 об/мпв (5VV60ротор). Греднентът се раздела при всяка па 3 Фракции; фракцияX» 1 мл; фракция 2, 0.6 кл; фракция 3 - 5» по 200 мши Радиоак-тивността па всяка от 200 шл -овите фракции се определя и едадена на фигура 25. При това зъв фракциите съдържаца вирус <3де 5)» главно фракция 5, има значително по-високо радиоактив-ност откоякото ь контролните опити. Това се дължи на специфич-ното асоцииране па полализин-додиОяцлращш адоноямрус с маркира-ната Дпл. б) Трансфекция не Й562 - клетки Е562 - клетки (ЛТСС СС1, 243) се култивират в суспензия в1РШ. 1640 - среда (Гибкс 3MI плюс 2 г натриев бикарбонат/я)плюс Ю % ГС2, 100 единмци/кл пеницилин, ЮО мкя/мкя стрепто-мицин и 2 ми глуташго до плътност от 600 000 кяетки/ми. 12 до20 часа преди трапсфекцаята клетките се поставят а пресна среда»която съдържа 50 в. десферяоксашга (тази мерка се предприемаза да се пови©? броя па трексферин рецепторите). На сутринтаas трансфекцияте, клетките се събират» суспендират се в пряовасреда съдържаща 10 % PC;, плюс 50 ик.й десферпоксамин < >50 000клетки в ми) и пс ? мл се поставят в блюдо с Ά вдлъбнатини. Прибавят се п се смесват посочените „оличеетва рО.М-,Ж (6, о.б» 0.06 шгг) в 100 нкл НВ> с 50 шш полплйзте - але-но вирус (рИденс)» състветио със съответното количество (35мкл) контролен а депо вирус О.ЛХ2. След 20 минути се прибавятсъответна количество (12, 1.2» 0.12 миг) Т.'рП5Юй - конюгат в • · · - 113 150 мкя ΗΒ~· След нови 20 минути смеете се прибавя към К562 -клетките. Клетките се инкубирет при 37° С в продължение на 24часа и след тов© се подлагат на луцаферазии изпитания. Луцифе-резвате активност се определя кекто в предишните примери. Даде-ните във Фигура 24 стойности представляват общата луцв&amp;е,разна Ш-г активност за треноданраните клетки,с) Траюзфекция на lie is - клетки Един !-ютод за установяване на активността на до ден пояили-зин-вйрусен Еонюгат е чрез проверка на копитата по отношение наспособността му де транспортира шого малки ,'ΠιΚ - количества(по-мелко от мкр). очаква се лозисен ..;ДД - тронсферишсопащттет»котето аденовирусе е свързан директно към лодлтйзчн-коздснзйра-на ДЖ» тъй като интерналязиращяте фактори (трансфер® и аде-аовирусен-фибропротеин) са директно асоциирани с подлежащата натренспортиране Д44< -’q да се провери достоверността иа това твър-дение» константно количество от полилизин-сденовирус-конюгата η (2.5 ша» около 5 х кг вирусни частички) се комплексира с раз-лични количество (3 мкр до о.иииЗ ш<г) от репортерКЕя плазмидв 476 шф ΗΒό· След 15 минутно инкубиране при стайна температу-ра» къй всяка проба се прибавя съответно количество от тронсфе-рйв-яолилизин» отговарящо на масата 2Ж (това количество Т>pi-·беше избрано» тъа като осигурява цялостно n packaging"(едектровеутраяноет) на 50 % не идазквдцата - ,,КК и съдо вретенообезпечава свързващо - свобода пространство за зпрус-полидн-зин комитата. След прибавяне на pi, смесите се инкубират 15минути и след теза всяка смес се поставя в култураянс блюдо»оъдържщо 5иб бии «еха - клетки в! ия ^.,у2 % ?СЬ. След товаклетките се янкубират х.5 часа при 57° С и сс прибавят 4 мл,у«ЖД0 &amp; ГС„;, . .Успоредно с това екаиголентаи количества да - Л4
е® комплекеират о двукратен масов излиешс на Tipi- (количествоза напълно ДНК, - кондензирано) и се прилага за ре трансфер зHole - клето (вецнаа самостоятелно и аедааж в присъствие нз25 шй! ав не-по.ллл;?зян - свързан аденозируа d!312 - преперат).След 2А часа клетките се събират, получават се екстракти и здм-каотни части се яаследаат за яуциферазно активност. Резултат:т-те от тези опити са дадени на фигура 25. При отсъствие на але-но вирус, корато количеството яа ДЯК е пад 0.3 акт, но се дааз-за яуциферазна активност. Докто полилизил-сзързания, така ане-евьрзашя адепозирус функционират добре при по-гояеми ко-личества ДНК (3 ма’ и 0.3 акт). зее пак, при не-свързания аде-ио вирус се наблюдава бд^зо НОС - протно намаляване на активност-та при 0.03 акт п пренебрежително малко активност под това ко-личество ДДС. Д.» «хззяика от това, полштизж-свързаная вирусзапазва гевтмонорнта си капацитет кекто при 0.003, така а при 0.0003 мкг , -ДС. Дож» количество отго.....$$ не около лОО ДКД - йсяекуяи вб клетка ,.'ШК и и® около I вирусна чаетзчка/Д;1К - ко-локудз. ИРД,БГ 18 Геитронефер посредством ензимно свързан към полялизанηдеповирусs) Ензимна реакция 2 12Л Аденовирусен препарат (вид 01312; 5 х ΙΟ^θ РРмДа) сенанасят на СеДоекс G-25 гелфилтрираад колона (Сармация), еквк-либрирана с 25 мл реактивен буфер (0.1 Е Трис-HCl; рй 8.0, 2 мУДТТ, 30 % глицерин). Олуирането се извършва с 3.5 кл реактивенбуфер. Реактивната добавка за ензимно свързване се състои от1150 икл от вирусната елуеятна Фракция, 0.5 шюяа трансглутами-неза от чер дроб па морско свинче (ТО) (Ситна), 2 наола, съот- * Ii5 - .:. : ··* · - ’ ветно 20 шаола пояилизиа290, 10 уф калциев двухлоряд и реакти-вен буфер в краен обеи от 1500 ш<л. 15еакцията се провежда при37° С в продължение на 1 час и след това co прекратява чрезприбавяне на 30 жл 0,5 о ЕДТЛ. За контрола за специфичносттапа свързването се провежда реакция без трапсглутаминаза. Но ин-корпориран полияизин се отделя от вирусите чрез центрофугираневърху СйСХ-градиент (плътност 1.33 г/мл; Ли>.о0 хр, в продъл-жение яа 2 часа), '.'ракциятз съдървда вирусите се изтегля й серазрежда с разен обем глицерин> замразява се з течен азот и сесъхранява при -70° С. б) ДемоЪтрираке свързването на яолилизин към адено-вируси Реакцията се провежда с полилизин» маркиран чрезБалтон - Хънтеров реактив (Амервам), както е описано по-горе.След CSC1 - градиеитното центрофугиране,вирусната фракция сеизтегля и се разделя над нов С^СХ-градкент. След това градива-та ее фракционира и се определя радиоактивността във всичкифракции с помощта на сцикжациснен брояч. Както е показано нафигура 26, е видно, че при прибавяне us 70 (613X2/TG-pi), ви-русната фракция (вирус) е нзбогатеяа us радиоактивен пояои-зин. При контролата, без TG (6X3X2/рХ), нямо иабогатяваае навирусната фракция е радиоактивен пояйлйзин. с) Запитване на полйлнзин-иодафчцирапй оденовнрусняФракции по отношение на тяхиия ефект върху транс-фешдаоаката ефициенция X) Клетки и среда •Фз транефекцията се правят посявки от 5 х I05 клетка(шмихепатоцити; ATCC fe : TIB 73) в ДБЕФ с 10 % топлинно инак-тнвиран телешки зародишен серум (PCs), 2 и- глутажп, 100 1.К./ - 116.·" ·:· · ...... ο пеницилин и 3.....ю шгг/мл стрсптошадн з С сантиметрова кул- турална блюда. 11) Образувания на зируе-Ж-трансферип - комплекси 50ао на съответната яалтзйн-шздифицирака вирусна фракция сеспесвзт с 6 ша» as /Ж-яяазмда рС.Л1 в Ю шс »Н5 и се инкубярат20 мкзути при стайаа теааоратура. След това към сместа се при-бавя! S шсг маанзриасферйн-аслйдязин200Ь GuTlpL) и се жнку-бира нова 10 минути· Ш) Траассскцпя па миши хепзтоцита Вирус- ;Н?>«трансфории-ксш1лслеите се енееваг с 1.5 мл средас 2 /й iXj, 2 αχ глуезмпн и антибиотик) и се прибавя! кай клетжте след като па тях предварително е била отстранена ста-рата среда. След нтгубиреме в нреддаенде на 2 часа при 57° С,ш клетките се прибавят 2 ад с 10 1C глутакин и ан-тибиотик. След допълнителна фаза на анкубпране os С часа, ця-лата среда се отстранява п ж плетките се прибавят б ул прес-на ,..v—·. с хе Ри-» рлузашга п антибиотик. IV) Определяне на дуци^еразната експресия 2к часа след трапсфевдято клетките се събират и се про-веда дуциферазном изпитание, по начина описан по-горе· Кактс се вида от ригуре ?7, вирусния препарат, при койтоаденозжруеяте os третирани с TG и с 20 жола попйлкзие (Ш312/TG-20 тшова р! ) дават най-силната експресия (153540000 свет-линни едижтци). вирусният препарат с TG и 2 ииояа полияизин(С1512/ГО - 2 нмола рЬ) е цел но по-малко зктавен (57830000светлиняи единици), контролната фракция, зри която адеповиру-еяте са обработени с 20 амола поязяйзнп, но по и с ТО, с бли-зо около фактора 500 ао-мзлко активна. 1о сравнение се използ-ват за транофекцйята комплекси с ~злодните препарата от адена- » *“ ··· · .. · » зарус* коиго ае са третирана с 10 или пъп с далзлзпн '<ЙЖ),при теза препарата се подучаззт ХОЗХО сзслл :;лл? еддацд. д) пивциазпдс дп хрзнофекцлослда Хдаенст чрез поли-лдадамюдифадрека пдековируси в спсвисапе сйсдодд^ацлрлдл аделзвпруед, лсХда при нискиНОЯНЧСОТВС ДХ Трснсфскципте се прлсслдс .дати е опасано в пример Зс) припсето за образуването па копалеколте се използват 50 акл отадсиовнрусната дралчна Ш.; Х/Х-Х плела л :' ллг рСХ1/<, акг - ’£· pi, J.C &amp;3W рл ЖХс/Хе лкг ,.т· рХ да 0.06 «кг рСЖ/ьшг Χρί. л срсвпсллс аз дадада също таке трансфе»- щш с 6 ш»к, о СХ- лег, XQ6 «кг pC./.vi/4-bTipI - коигошкеи и еаслодалицйроал йдаовпруег (оХХ). Слаза се, че комплексите споддаз>и~модзфдарззй аденозярусл д ват ллоотт стойности неекслресиране дерл ’ при ичда данчестза яз ХЕ, докато прилсдодХицираш’ адепозируен сгспресията слп-iiv ‘v;.л«здяза { бОТу- Л;-; * · )·
“Л1 — ;,'3 TQ их ,л ..χ,ια. АХ Гсптраксфер с коидаати, прд поите свръзката меаду аде-возмрЕус и нслилазин се остцестзявс през биотиа»стрепто- п-лднноз мост а) Ьиотввазжранс на аденожрус оЦХ2 лзщ 2,4 и» 1ЧлС*ллтр”рац (Оефодеке G—5 РД10, Хрмация) разтвор от аденозирус <№ (около 10частички) в 150 млнатриев хлорид/5 il, Χ*Ρχ > pH 7.9/ 10 5 глицерин, се прибавят10 шл (10 шюла) от 1 ш1 разтвор на МП '* 1C - бяотин (Нирсе2X335)· След ’ чеса при стлйяс тегчерзтура бистин - ?'одаОици-ро1глй вирус се отделя чрез гелно Филтруване (както по-горе)от излишния реактив, фез прибавяне на глицерин разтвора се Дивзадп дс коац&amp;пграциа 70 глицерин (обж обем 2.2 жл) и ос
CiiSpSUiiiM} ПрЛ ' С. a.Γύ*«iiitwiiipiiiiU*u Uu ЗИруСи 2ί0*»§ ДЗ О’ьдаiiu4cc2i*euc доказано чрез како c различни разреждания върхуцелулозна - шгсржа надарена; след нзсудаване зри 60° С вйридааашае as два чене зю закужнз сукллаа камера» брокирааеа В5й» ннк^бнранс аве ог^еноовлдоц - кологпрзиа алкална лсо^esasa (жк*,)* нри^лааие и сдай чао шщуСарзио с проявяващиярозхвер AJ’X / (ндоросйкъо ~ i-k*· .. ->з<2 vOt- J -«Н4“* е рои - ^-xsop-5-.шдолияфОФрат» телумдаозе сол; вьордаер <«аа- όΟί,ια iiCitepe*ад ϋύ»ΐθ<ί·^ί'.;'θ^Λ>.ί·_· цветни 6) 1»е,,учаза.ю с-гредоазидш! - подгшззн - лошегага Свързва iiO'B-V ЗВО А^Ън« V ~»аЧ#мЦ ίΡ'ν дз взрива сдО"“ ЛмВио сдлознид в .',Р~.й ?дч. сл догцер л оааззори, ГНХ), Ϊ-0Α. 72 лаела 0 .7' цр) сзроптовпда s I мл 207 у», ПОРВбрй 7.9 и 300 в2 гшриев ^жорпд е,; ореолрас е .0 . escполов разтвор не ;; Ж? (226 шала). След 1.5 часа пра сгаРях оесшоразура , исда- фицлрзладд арогзпн сс гед;л рддгррза през Сефадакс 6-?5 колона» ярл вао^з so яолучазег 75 нжолв огрвазавадан» ло.ц<хцярзи е лМ плела цлпдзяддлдг.оо л^лкор· . сдкддцлрдпж прогоня ос оо- γχκι до реагира с З-жфкоплолроплтш - ;здтфицирап полялпзин (75 нлзяа» средна ^,жлйидз пз дпригскп 777 ддзпнови ноиоиери» мо- дзржлренл ο 190 а,.ола жфкзкаолрояйошд - лжер) з 2.6 мя хзи м,« ΙΕΡΟ': р2 7.2» 250 л. пдтриез хлорид о хддосОера as ар-н. bju. дошсгстйта се изолират пзсредегвси нагдосбнаниз хромато-графия взрху м-i/iiU .^.-. ** Е ’J i2<B \ 7орлддля). (Едогеиг: 27 - -0 % φρ. ·<α5Ρ .: зо тд 2717,5 pH 7.2; ..ддер .4: буфер 2 р:.лд;-'ягз с лд: ^дтх ояухра при копцеа-:: 1.7 д. След диаднза оре .ду ЕЕ (20 длаа 3 ... дшрпев длшрцд. грация на сол между д.2 r' ЕЖ;;. pH ?.? t 150 κθ натриев хлорид) се лолучево конвгат*оъстояг се от *5 кголо стрсптелк.уи я 5? нисдз поаилязин· с) Трансфекцкя па Hols - клетки Пе1а - клетви се пугтивпрат в f ск културелни блюда» каатое описано в пример I· Трепсфекцията се провежда при плътност от ОСЮ клетки-плота. Ире?;к тренс^екцнята клетките се иикубя-рст с I нл пресна сро съдържащ 2 РСу. 6 от pC'’VL - ΈΕ в J’'-! жвг 235 се смесват е О.Я отстрептевидин - потяизан в .170 :лкя ШЪ. След 20 минути се при-бавят 5 шсл ясяяккнлн р№0 в ,17(5 мкл ΐΒ>, След повя 20 минутисе прябозят 65 шш бяотяиялярек аденозярус яли за контрола саот-зстното количество ауппетпрке όΓ',12 Мо к-с, изхорен вирус прижеукготрапето)· Хллуюкснатг смес (бистип одв/.-свплекс А" съ-ответно "контролен здз% виж фигура 29) co остсзя нови 20 ми-нути да престои· Провежда се ат*торпат*вно по^лекеообрезувшю, като 65 шшбяотяняжрап адоновярус се сяесза пързокпкшшо е О.е от строй-те видян - полилизин в 50 тил цн:,, след 2J минути се прибавят 6ил* pCnVL - ДР-К в ί?υ нкл ПЗ .· · След пози 20 минути се прибавят3 мкл пелилязян п.1390 в 200 мкл Ж, (5cиндексна смес "биотин-адз/конпнекс 4’?). Оеб от pC’-iVi - дж в 6? мкл ЙЙк се смесват с 0,3 мяготрептавядин - полиознн в 33 мкл Н8.$» След 20 минути се прн-бовят 65 от биотяяялиран зденезярус яли като контрола съответ-ното количество от оуснпвтфус ох312 (30 мкл, изходния вирус замодефякецйята). Снссятс от комплексите (^биотинадв/комгаекс А”съответно ,г контролен адв", зиж Фигура 29) се оставят да пре-стоят нови 20 минути и се разреждат след това с НВо до 500 мкл·Алтернативното вонндексообрвзуване се провежда като първона- - 120 - челно 65 ю биотшширеи едопо вирус се снеси о о.З шсг стреа-тьвидип-пслщшзии з 5ϋ LJwi НЗ;, след 2н пии^и сс прибавят 0.6;..кг рС'Ж. - ,Ж в 50 ьет ЙВ . Вогплекспатс снсс (’’Зтотииадв/комплекс ?Л) се оставят де престои Ви минута след това се рав» ώ«.,ί~4<,ί *3 Η. · · 4:*ν „*/·.· Д,и^г> Смет ес ьр-Вж мъм клет&amp;тте. -л^-ткате сс илхубирст дзачеса при 37° С, еле,ч това ос ардбавят 0.5 дз пресно среда е до-ба яке па Ю % PC,. тжгто се глкубярат 24 чеса при ?7° С и следтсяз се събират з ос подлагат на луциферазво изпиташ». баредв- ляието яз луциЖажта лктишост става както в предишните опи-ти. йооочезате зло дш?ура л) стойности представляват цялостнатадуцйдерозна антланаст па трапоЛтдираннтс плетки. Успоредно се ировехда тренсфездя па йеХа · клетки, прикоето з* пуснато лодпопенто не коаюгата о блотинилирап вирус, .който е чнактивиран члоз исорллеп/Уй - третиране, лиаятивира-нет... се изззрлза лаосо следна; По 200 акд бпотпяиднрзн вирусенпрепарат се поставят ззш дзл· адллОнатшш ;ш х.6 такзнна култ^-разна платка. Ж всяка проба сс прибавят но 2 жл (53 пг/пл)8-аетоксиаооралеа (в длмотялсулфоксад), бдодото се поставя зьр-ду лед а в шгад&amp;алецде на U иинути се облъчва е у в - лампа (565цв; · VP Тх-оз лоша), при което разстоянието между пробата и«филтъра възлиза на 4 <ж. След облъчването даете проби се обе-диняват и гелво се (млтруаот (С 5пик-колона, ••армацяя), прикоето колоната е предварително еввилибрнрана с 40 % глицерин вйй · Алшсватня части от по 75 жя се комплекеират с 0.6 актстрептавадин-поамзий и се използват за трансфокция на НеХа -клетки по гореописания начин. Чрез цчтопатичяа опре доления се установява, че вирусния ..·титьр благо дарение на инактиш райето е намалял с фактор повече • · ·»· · · · ··· · · * · · « • - » * * * 6 * • ···· · » * »· · * · ·»* ·»*· • Х2Х — ··· · ·· · ·· · ο·ι 10% до като трансферния капацитет при по-високи концентрации е нашили с ао-шажо от 5а а при ниски кснцектрецаи о фек- Тир Οί.ύΠΟ 5» д} хрьнсфокццй па «562 - клетки i5u. - плетки се куптавйрат в еуепспппя не 2р&amp;1 Ϊ640 - сре-да члоко Жм » шшо а г натриев Озкарбоаат за литър) + 10ГО., χκυ едиалцйДч пехлрипл> цркДи стрептомицин а п ш«слутаиив до платпаст аа клетките 5аО иСа ддетки/ил· хб чеса пре-ди трексфекцията жетките cv поете пат п п^.сги среда сддърпадапи ах., дофереоАС^дйд (Стш). ас сутринта след трапсфепциятаплескате се ^ιρ- .и^исес &amp;.5и иа- о пряспа УрУдЗ у ·*^ v *»'У *йл-д #1 'XV рУУХхриДв**
LcIiU liV ύ· Lui aKtfcjivP «. ,>.д, &amp; а^Уцу »*®-»e***X X <.-/a iXrffilv *ίΙ*ίϋ**· - i 4Ui>C# u Xw 'u jJi,. L»&amp;C^4klL«id 4^~дДи Г4Д*4С *** хтХхм-uiOi-C*^*· ci) £&amp;3ϊ3ύμ Vi V .-·.A"U’ Д/Ч.С «-* V <!y *** -X U VL ilLwl Tin?. / ζΐ,/V «*4.,.
ЦмХ}р;дОд> .-*> .χ·- (XL/yOuSc»-.- C -xid пХ »J? CT lie XУ i· jpАй.-PU cj Ic ^. >,../* J «д1ъ*л L.xC ф XpiLpci "''J ***i»*x XX ilpi*X*iX3ii2 w-j шел адел-вирус Цхс-χί·. — препарат п спаесо се прибави пъп алнше.
б> ХаСхВар IX wuC UP ОТрСЛТаВЛДЦЛ—ЛиДПЛЗЗПП в Хсс жпu > <Jv wtJ-JiJiiu X - . -* «»Д»* w*pUL«/*Lixci<j.piiii ixO-Uilp^’U ф S*Uu faPwiiiiO X ОлЛС&amp;НО # x)t ХЛСД 30 ΧΧΊΰχίΚ SO йрибазл рОХЯЗОр 02 ί- ΠΚΓ iAc-icVij **" νρίΛ X iOL isUXLt ,ΐ.'^ό Ί waiU^ ~1U _j , -·;Χ i»ax- XJ Xal jJ'd 33. XXpKl W'XW^.ww4u U -X. X XUfei? W 4> 4V Ш i-UCi'H*#Xyi<i il X p*U.X X У V 3 X bU tAiXjI ii*cO ф w«iU Д co пдпутм co apnea- S) ,.:ХйсдО;Гх’и 00 - ?„Йн'ХО C OuJCddO 3 £5) $ 0 Td3jf£ рЙоДхХиЗ f ЧХ Ji»-aU*iU х^^-ДДа J ·./*.,'Лп7 Л c# P* pi ^ ·*·) Li *J »1 *.i j t- -- vr * ,V#iu 00 -iija'.U pwwJiC'-Xp УХ «-‘>У „au UU И VP- L - -::v Че*00 -.ο r-·
V <i luJu ч>У w43MiipiiX -Хш в»£у ·4^:·* • - ч Д w*'1' шзхйипя* ,^де* 122 • ·· ните на фигура 30 стойности представляват сбцазалуцжферазнаактивност на треш^ицирените клетка· ЙКШР 20 Гентрансфер в първични клетки от костен мозък а) полиране на клетки от костен мозък Първични клетки от костен мозък се ваша? от шка катокултурата среда (Ж садьравда 10 % ГС »5 хЮ5 й 4-меркавтоетввод, 1 % IX - 3 кондиционирана среда и антибиотик)qq вкарва е аоадта на инжекционна игла (0.4 ша или 0.5 ш ди-аметър)» свързана с 1 мл ампула, в изолирани кости на бедро-то и подбедреийцата и клетките чроз проплакване се извличат·След това клетките се маят 1 х з културелна среда чрез центро-фугиране ари 100 х г 8 кин. След това клетките отновио се сус-пендврат ари концентрация 10 клетки/на н се засяват з кудту-рални шишета. След 4 часа неврйхепвалйте клетки се прехвърлятв ново Т25 * културално шише и се култивират една воц в при-съствие на 50 шш, дефероксамив» б) Образуване на аденсвирус - трансферна - полидизин/ ДйК - коьшлекеи За образуването на комплекси 50 ш биотшдирав аденоза-руд се култивира с 400 пг стреатавида - модифициран полилизиив 20 икл ИВ в продължение на 20 шшути. После сс прибавят 20нкд ИВ : , еъдъркац 6 мкг pCwVI· След инкубиране '20 минути сеприбавят 7 мкг шши тран^ерии-аояижзюмсоотрат ( Т р!) в 160нкл Ж и обаете смес се иикубира нови 20 шнутя. с) Треасфекцня За тренсфекцията клетките от костния мозък се получават откултуралвата среда чрез 8 минутно центрофугиране при 100 х г.Утайката от клетка се лаеш в културална среда, еъдзцжацо 2 >5 • · · FG a 250 ши аденовирус-тран^ерин-нолилизин/Мй - комплекси ав ново Т25 - шаме се култивира? при 37° С 3 часа. След това сеприбавя? 3 ия а след 2 часа нова 6 нл културалва среда* едарже-да 10 % ЯС>. д) Определяне на луциферазната експресия 48 часа след трзисфездятз клетките се събират и вакто пра другите примери се изследва луциферазната ж експресия· Трено-уекцията вода до дуциферазпа активност отговаряща на 310 х Ю5светлинни едипициДОО шгг общ клетъчен протеин. ЖШВР 21 Тренефекция на веурсбластоняа клетка е 48 ко козждв присъствие на свободен аденовирус а на аденовирус-палили зин-кбшш?ати Клетка от клетъчната линия с означение както са описани в пример 16* се трансфацират с 48 кс козмид с посочени-те количества -Д-р!» свободен пслнляаян а ДШ£» Допълнително къминкубационните смеся се прибавят яли 100 мкЬ хлорохин (колонки3 а 4) ала 10 мкл адонсаирус 61312, съдържащ 5 х 10Xi частичкив Ш1 (колонки 5 и б), Последните две проби (колонки 7 и 8* рХ/бистин) получават 15 мкл биотиняларан аденовирус 01312 (1х X0Ai частички) * 30 минути се инкубират с етрептавидян - поля-дизнн (0.8 мкг, подучен както е описано в пример 19) в 150 жлИВ. След това към пробата се прибавят 6 жг ДПХ в 150 мкл ЙВ. *оставя се де престоя 30 минути при стайна температура, след ко-ето се прибавят 150 мкл Ж, съдържащ 6 ьшг х-рХ + 1 мкг свобо-ден рХ. След ново иккубяране в продължение на 30 минута пристайна температура* сместа се прибавя към клетките. След двуча-сово инкубиране пра 37° С, кш всяко блюдо се прибавят по 4 млД» t хб % ГС . 24 часа по-късно клетките се събират и се яз- нерва луциферазната активност. Резултатите се показани на фи-гура 31.flEU.P 22 Гептрзнсфер в първични епителни клетки от дихателнитепътища Презрителни опити е оглед на генетична коректура на дие-тични фиороза показаха, че имортализирапи клетъчни линии, полу-чени от епител не дихателните пътища* са достъпни за гентрзноеСерния метод съгласно изобретението. За д а се изключи възмож-ността, този феномен да се дълги на промени на епитела от да-хз телни те пътища индуцирани от инортализацията, опитите с траи-сфершиаолилизин^оаюгатите ьзе провеждат и с първични епителниклетки от дихателните пътища (1 °Аб). 1°Ащ - клетки се получават от проба на полипи в носа вапациенти* както е описано от хааКваквз et ai·* 1967. Тшани-те се промиват в стерилен разтвор на натриев хлорид» след товапри 4° С в ^iaiaua ^eseatial среда (Жщ) плюе антибиотик (пеницилин 50 КДш, стрептомицин 50 мкг/ул, гента-ницин 4о мкг/мд) се пренасят в лабораторията, пробата се осво-бождава от Кнорпел- и излишната оубникозна тъкан и епителнияслой се иакубира в аротеазен разтвор (Ситна, тип 14, 0.1 мг/да)в йЕИ при 4° С в продължение на 16 до 48 часа. на неутрализи-ране на протеазата се прибавят 10 % Рй (говежда серум от за-родиш) и клетките се освобождават чрез леко движение. Получена-та суспензия ое филтрува през 10 шш найлонова решетка, за дасе отстранят клетъчните остатъци, центрофугират се (150 х г5 минути) и ое мият в Р12 t 10 % РВ . След това клетките се третират с трансферин-полилизин-конюгати ( втгрь) в кодиращ зз луцкферавв плазмид (phsvl) *· Λ*· · ···· · ♦ * · · · · · ♦······ · ·· 0·· · ·· · ·* * кзто репортерен ген· Яри тези изследвания първичните клеткине показват възприемчивост към тези комплекси както това пра-вят съответните жортализарани клетъчна линии (основа « 429светлинни еданци; при прибавки па конюгат : 543 светлинна еди-ници), което вода до извода, че X °Ай клетките са сравнителнобедна на трансферни - рецептори. За да се използва алтернативен рецептор върху клетките,прилагат се биотинилирави адеповируси (сравни пример 19).Клетките третирани с този конюгат, показват значително по-сил-на експресии от базовите стойности (прибавка на конагати2585752 * 453585 светлинна единици). Освен това а други пър-вични епителни клетки от дихателните гвдзде от други видовесе оказаха достави» на този метод на гевтрансфер (мижа « 3250244 + 343X53; маймуна « 53498880 * 869481 светлинни едини-ца). ПРЛ.ЪР 23 Гевтрансфер в хепатоцати и в кръвни клетки При експериментите в тези примери се използват следнитематериали и метода: Трансфекция на тъканта културални клетки: Клетки от клетъч-ната линия BML СХ.2 се култивират, както е описано в пример 6.Hela - клетки и хепатоцати се отглеадат в б см петриеви блюда·Трансфекцията се провежда при клетжна плътност от около 3 ххо5 клетва в пзиичка. Преда трансфекцията стандартната културал-ии среда се сменя a X мл прасна среда съдържаща 2 % PC . · Образуване на бинарни комплекси: ^иотипилирени адеиовиру-си (около ХО9 РГ <, вик пример 19 а) и 19 б)) се оставят да ре-агират с 800 нг стрептавидавклиран полилизин в 50 мкл ilBo · След30 минути при стайна температура се прибавят 6 мвг pC^VX - ДШС - 126 * a 170 ш HB; е иякубира се 30 минути и след това се прибавят3 мкг рХЗОО в 200 икл ИЗ и след пози 30 минути р88творът сеизползва за трансПекциошглте опити. Образуване на терциераи комплекси: Ьиотиниларани аденови-руси (около IQ$ 2Рн )) Об оставят да зааимодействат с 800 нгстрептавинилиран полнлизж в 50 мкл Пй-,. След 30 минути пристайна температура се прибавят б мкг pcnvi - дШС в 170 мкл йВ%30 минути се инкубира и след това се прибавят χϋ мкг Т*р1190Вв 200 шт НЗ и след нови Зо минути разтворът се използва затрансфевдонаате опити. - галактозадазня изпитания: 3HI-CI.2 - клетки се по-сяват върху покривни стъкла и 24 часа клетките се транофациратс репортерния плазнид pCnV - f gal (Lim Η Chae, 1989) След 48часа се провежда - -галактозидазния тест, както е дадено впример 15. а) връзката между да - кандензати и аденоварус усилва всилна степен дуциферазната-репортергенна експресия Резултата от трансфера на ДНК а хепатоцити посредством ба-нерни и терциерни да - комплекси се показан на фигура 32: Рен-трансфералат ефект се усилва в присъствие на свободен аденози-рус. Колонките piAdenov/TfpL показват резултатите от трано-фекции с аденоварус, който е конюгиран чрез траасглутаминаза еполйлйзин и след това е оставен да реагира с да, която неутра-лизира част от негативния товар. По-късно се прибавя трансферин-полилизин, който донуетрализира остатъчния негативен заряд,по този начин се образува терцаерен комплекс аденозирус-подили-зин/трзнсфернн-поднлизйй/ЛПК. лакто се вижда от Фигурата, полу-ча да се изключително висока стойност от 1.5 х 10^ светлинниединици (отговаряш! на около 5000 светлинни единици за клетка). За изобразения в колонка адановирус ♦ рХ + Т^рХ опит, адеаовируссе смесва с полилизин, както при третирането с трансглутаминаза.За да се накаже специфичността на осъществената чрез тронсгяу-тамиааза връзка на полилизин към вируса, изключва се ензима. То-гава вирусният препарат се коаплексира със същото количествоДйК и ТарХ както при рХадено-LpI, 3 този случай трзнефекциятае уаерена както с адеаовирус + TrPI, тъй като и в дата експе-римента съвместното локализиране на вирус и да/трансферин-по-дилизин - комплекс представлява стохастичен (статистически ве-роятностев) процес, за разлика от показания в колонка рХадепо-зйруе/Lpl екаеримент, при който съвместното локализиране чрезсвръзката на вирус и да в ернерния комплекс осигурява високастепен на трансфевдя с трансферни. б) Трзнефекцията ©62 - клетки показва ендезомолятнитесвойства на адевовируса Клетка на човешка еритролевкемична -клетъчна линия ©62съдържат ОКОЛО 150 000 трансферна - рецептори ( Klausner etβΐ·» t983 ь). в присъствие на хяорохин тези клетки могатдори в отсъствие на аденоаирус в силна степен да се трапсфица-рат с Т рХ-репортер-.ЩК - комплекси (фигура 33 Т+рХ), както то-ва е докладвано от (Gotten et al., 199С) Тези сьвдте комплексиобаче в присъствие на свободен еденовирус, но в отсъствие нахяорохин, дават сравнително слаба репортергенна експресия(аденов/Т.рХ), вероято поради това, че ©62 клетки, както идруги кръвни клепки ( Silver et al·, 1988; Horrath efc al» 1988)показват само малък брой аденовирусни рецептори. Ако аденови-руса се свърже към полилизина чрез биотин/етерептавидиков -мост и репортер^да чрез прибавяне на повече полилизин се кон-дензира цялостно, за да се конллетира бинерн я комплекс ( rua®- • 128 · .......... soV/pL) » постига средни стойности пра подпомогнатата от адено-вируса травефекцня» вероятно поради това» че малкото аденовз- рецептори се използват ефицяектно. Ако все пак комплек-сяраната с аденовирус -пояилизин ДПгС е цялостно кондензиранаи чрез прибавка на тр^шеферин-полшшзин при образуване натер-циерен комплекс (рХаденовярус-Т-р!) се неутрализира и много-бройните клетъчни трансферинрецептори влезат в действие» тстогава транефевдионната ефициенция - както благодарение нао,л1циентиото тронсфоринно свързване» така и на евдозомолитни-те свойства на вируса - се повишава най-малко с две допълнител-ни степени (фигура 33)· с) Тройни . UiE - комплекси водят до експресмране на репор-терния ген в почти 100 % от хепатоцитите За да се изпита ефициеицяата на транспортната система вмиши хепатоцити Ш СХ»2» клетките се травсфицират с ' -галак-тозидазен - репортерен ген· Фигура 34 показва - галактозвдаз-ните изпитания след а) трансфекция с трансферни в присъствие нахлорохин» б) трансфекция с трансферни в присъствие на свободенаденовирус (01312) - полилизин - трансферни - ДПК - комплекси· В отсъствие на аденовирус след стандартна трансфекция с транс-ферин само малко клетки експриуирзт репортергеве. Процентнатачаст на траиефекцията с трансферни възлиза на по-малко от О.Х/». iieraio присъства и хлорохин» то процента се покачва на око-ло 0.2 % (фигура 34 А)· Със свободен аденовирус екеарямнратоколо 5 - 10 % на клетките репортерния ген (фигура 34 В)» дока-то тройните кожлекси с трзнсглутаминаза - модифициран вирусводят до експресия в повечето» ако не във всички клетка (фиг· 34 С). Тъй като тройните комплекси могат да ое използват привисоко разреждане» обикновено не се наблюдава токсичния е-^ент * · · • · · · · » ♦ « ?. · · · ···· · · β ···· · ··*···· - 129 - : ·..· : ..· : зьзникващ при високите дози на свободен (инактивиран) адено-зируо. Ясе пак трябва да се вземе под внимание» че пра използ-ване на тройните комплекси зъз висока концентрация, за да сепостигнат 100 % от тъканнитс културални клетки, може да се за-бележи подобен токсичен ефект· Причина за токсичното действиеможе да бъде остатъчната вирусна гевна активност или да седължи на ендозомолитиите свойства на прибавения вирус» или тое просто в резултат на много високата експресия на трансфаци-раная ген. д) ькеперсмята на траисфицирания ренортерен ген етрзнзиентна, може обаче в яе-делящ се хепатодатида се задържи в продължение на седмици Тройни (терциерни) транспортни комплекса (рхадеаовирус/Т*р1) се получават с полилизин-аденовирус а с модафициран ада-новтрус, който © допълнително инактивиран чрез въздействие спооредей· До 2/5 конфяуентна женатоцитна - клетъчна култура»както е посочено в експериментите от фигура 34 В, се трансфи-цира с луцвдераза - репортергенплазмад рСД7Ь и се измерва лу-циферазаета активност през различни интервали от време· Кактосе аетда от фигура 55» луциферазиета активност е най-висока след3 дни, тогава когато хепатоцитната клетъчна култура става ксн-флуентна а клетките престават да се делят, .кепрескрането нарепортерния ген се запазва в поделящата се клетъчна култура,без да се прилага селекция за задържането на гена и продължаваконе 6 седмици» особено когато се използва псорален - инакти-виран аденовирус за образуване на тройните комплекса.йР;О;Р 24 използване на пилешки-аденовирус Сж за усилванене Ж - транспорта в човешки клетка - Χ3ϋ - .......... β този пример се изпитва пилешкия - аденовирус СЕЮ по стисшениз способността да усилва ДНК-тронефера в човешкиБеда - клетка, аналогично as предишните хярндари, пра които gqизпитва човешки адевовирус тип 5. Използва се пилешка - аденавирус CJW (зад Делпс, серотипГАУ-Х,?, пилешки бъбречни клетъчни пасажи). ирусът (2 мя) сенанася върху РД-Ю гея филтрираме колона, еквалибрирава с 20мХ lUPESpII 7.3, Χ5ϋ ад натриев хлорид (НЗа ) * 10 % глицерини 2 ил от елуата се оставят да взаимодействат с 20 гжя I мБННо -IC-биотин (иирсе) в продължение на 3 часа пра стайна тем-пература. Биотййшшрапйят вирус след това се диализира срещу3 х 300 ал НВ$ * 46 % глицерин при 4° С и в аликвотни частисе съхранява при -70° С. Бела - клетки (5 х ХО5 клетки за 6 см блюдо) се ивкубиратв 2 мл ЖЖ + 2 Д РС</ с 6 мкг от пяазмидв рСУУХ, комвяексиране полилазин (|Ху.~)- ида траисфершмояияизив(Т-рР )-смеси в500 мкл ВЗь Спредварително комплексите се ивкубират 30 минутакри стайна температура). След това пробите сс прибавят към клет-ките в посочените на фигура 36 вирусни количества. При пробите,които съдържат биоташширан G&amp;XG - вирус, посоченото количествовирус заедно с посоченото количество стрептавидин-полилизинbtrpX) се предварително инкубират з продължение на 30 минутипри стайна температура в 200 мкя ШИ, преди към тях да се приба-вят 6 миг от пдазмада pCXVL в Х00 гакя ЙВ * След ивкубиране 30минути пра стайна температура към клетките се прибавя посоченияТ,рХ -материал пра 37° С. Два часа по-късно към клетките се при-бавят 5 вл + ХО % РС>, След 24 часа клетките се събирати се подготвят за луциферазннте изпитания. дакто се вижда от фигура 36, СБХО - вируса в свободна фор- - 131 • · » · · · ··*·«·« • β * • · · · не усилва W - транспорта в Hela - клетки (колонки Ι-б). Акообаче СЕЮ - вируса е модифициран с бяотян и е получен в кои-плекс със стрептавидин, че вижда, че вирус® както с, така и бездопълнителен троасферин-полкяизин» усилва ДНК - трансфера зсравнително еднакъв порядък с този постигнат чрез човешки аде-новирус <312. Специалната линия от Не3,а * клетки показва висок1гз л8цитет на свързване за полилизин/ДНК - комплекси в отсъствиена трансферни (сравни луциферазната активност на пробите 1 и 4във фигура 36)· От тук,включването на СЕ1О - злруса в полюгазиа-да-кеиплексите е достатшно, за да се осъществи приемането накомплекса. ЖЬЕР 25 Трансфекция на миобласти а) Трансфекция на жобласти и миотуби с ДНК-тр8нсферип-полилизин - комплекси в присъствие на свободен адево-вирус и в присъствие на баотня/стрептевидин-евъзенаденовирус С2С12 миоблестн ( ВЬ« el nl.. 1985? ЖС И СК1 1772)и G8 - миебласти (АТСС й: CEI R56) се тронсфицярат във "висо-ко глжозеи ДЙВ?й” + 10 % PC миобластни култури при субконфлу-ентност с около 5 х култури за б cs* блюдо, миокубни култу-ри се получават като жобласти се нанасят з б ск блюда (около5 X ХО5 клетки за блюдо) ж средата се подменя с ’’високо глю-козна ДШ’· + 2 % конски серум, след като клетките станат ко»·..'•луентня (Ban· и Leiden, 1991; Lhnmn el el·, 1991). ТранефОК-цията на клетките (миотубяте) се провежда 5 до 7 дни по-късно.Трансфекцяопните комплекси се получават кзкто е описано в при-мер 19, при което се неполззат посочените количества от TfpI’·sirpb и биотинилиран аденовирус di3i^ Плетките се събират - хзг - 20 часа след тренсфекцията и се измерва луцжеразката активност.Посочената не фигура 3? луциферазна активност се отнася ва ця-лата клетъчна проба· йижда се» че кгкто биобластяга, така имиотубаите култури могат да се трпнсфкцират с висока ефвдент-ноет. След диференциране на миотубите транефвкциенветз ефици-еация спадан с по-йялко от X loo (С2СХ8) или не показва знз-чттелно намаление (G8). Образуването на итотуби се осъществя-ва при G8 - клетъчната линия с по-малка йреквенция, коетс час-тично шже де е отговорно за липсата на доказуемо намаляванена производителността в диференцираната култура. Ролята насбмеино^ействие между трансфери» и транед-еринния рецептор праДШХ - транспорта не е съществена при този клетъчен тип* Привсичките четири клетъчни препарата се реализира само слабда - транспорт пра използването на Tf pi/Ж - комплекси в вдо»еъстзие на свободен адековирус 01312 (колонки J, ?, XQ).ири използването на свързан вирус се усилва производителносттана трянсфетсциятз (колено 2, 3, 5, 6, 8, 9, ϋ, 12). При срав-няване с комбинирани - комплекси, съдържащи само вирус и яоля-лйзйи/ rpl, постигнатия геитрансфер с резулатите получени скомплекси, които включват трансферин-полилнзин, се получаваприръст на производителността с по-малко от X Хо^ (сравни на-пример колонка 2, без трансферни, е колонка 3, (с трансферни)·«©яката трзнефекц^я със свободен вирус и силната трансфекциясъс свързани вирускомплекси, както в присъствие така и в от-съствие на трансферни - полнлизжн дават възможност да се на-прота предположението, че аденовируса при тези клетки служ ка-то лнгавд и че без свързване свободния вирус може да проникнев клетките, но КрХ./,Ж - комплекса не прешнава в продуктивноколичество (използвания в този пример р&amp;ЛЬ-да е означен във 133 фигурата с рСХс). б) Хистохиничен анализ на трансфвкцпоннате честата вшютуби №£12 миотубни култури (кскто жтобдаетите в б ом блюда за-садена» 5 х 105 клетки» диференцирани в аиотуби) се получаваткакто е описано за). Пра пробите със свободен зирус рС,ДР -гал ДЙК (6 акт) се комплексирет е 8 одн» Т+рЬв присъствие на500 жл НВр и се прибавят към клетките з присъствие на 18 мкладеновирус 013X2 (I х 10^ вирусни частички в ж) в 2 ж ЖЕй/ 2 % РС_. Пробите със свързан вирус се получават с рС.’ДгХ8е.-. ДЦК(6 нкг)» комплексирани с 7 «кг TtpL и 800 нг itrpl. t жл био-тинилирав аденовирус 01312 (I х Ю^2 вируси в ж) в 500 мклйВз » и се прибавят към клетките в 2 ж % PC След ин- «3баране в продължение на 24 часа» клетките се оцветяват» кактое описано в пример 15» за определяне .-а А-га лактози да знатаактивност. -Галактазидазните - цветни проби съвпадат с резултати-те от трансфекцията, при които се използва яуцифераза катореаортерен генен продукт (виж а)). При шготубнкте култури сеполучава много ниска генекспресия, когато сс използва свободенвирус» докато свързването на вирус и ДШ1 дево еисоко ниво нагенекспресиране. Присъствието но синьооцветени многоядрени ту-буля показва успешния транеоер на даден ген в тези диференци-рани клетки в присъствие на свободен аденозирус. е) Трансфер на ДНК в първични мини-бисбластии- иийшй-мйотубни култури Голямите скелетни мускули от двата задни крака на 4 сед-мична мъжка мишка С573Х/6 мишка се изолират стерилно в Рй иG&amp; надробяват на парчета от около 5 мм. Тъканта се суспендира - IM - — ; ...... a 20 ο PB1 » зетззя ce~ де престоя около 2 минути и да се утаяа горния слой се изсмуква. Toss промиване co повтаря 5 пъти.Тъкавятс след то за се емесвпт е 3.5 мл X % (т/о) колагеназа»тип 2 Сят и 0.5 на I % (йрокция V а 4 да калциев двухло-рид) я при 57° С в продължение аз 30 шнути при често вшшатаа-но бъркане се оставят да се инкубзрат. ?> края па 30 мицутнатаиакубацня остатъчната тъкан цфставя да ос утаи, горния слой сеотстранява и се омесва с 5 ш» ДЖ; * 20 Д ИЖ Хнкубирозето апротеаза се повтаря 3-4 пвтн, дояете тъканта канално се дас-яоргира. Клетъчната суспензия след това се прекарва през кле-тъчно сято (Фалхон), за да се отстранят агрегатите а клетъчнитеФрагменти и се центрофугира при 500 х р з преджение па 15 ми-нути. Утайната от клетките се отново суспендира з 10 о ДК> ♦20 % PC 2 и фиброплаотите се отстраняват» като клетките се пла-тарат в непокрито такенно кудтураляо блюдо е диаметър 15 смв продължение as 60 минути. Кеприкрепеките клетки знглзтедносе отделят и се плат врат върху пет дтлшин-по крити ХО см тъ-ка шш културелнк блюда с 15 нл Ж + 20 Д ±’0.зе блюдо. Следпостигане на канфауензая (около една оедаца по-късно) клеткитесе трапаинирет и отново се реялатирет по около 1 х 10° клетказа блюдо върху лажниа-покрити 6 ок блюда. "s да се образуватшотубн» култури» около 5 дни по-късно (когато клетките са пос-тегнала конфлуентност) средата се подакя с + 2 % конскисерум и след една седмица се провежда трансфекцията. Тренедек-цията ка маоблестлите култури се предприеме е € ом блюда приоколо 80 % конфлуентвост. Хамяшга-покритите клетъчни култура®-нн платки се получават както следва: Кдетъчш* културадаа блюдасе покриват с 0. .25 яр/ъ®. яолилазнн (Ж 30 ж? - 70 ооо Сигма)в сторшша вода в продъкленио на 30 мацути ара стайна теапера- - 135 - ·:· : ...... тура. Платките се преплакзат 3 х със стерилна зода з се оставя®да изсъхнат ва въздуха· Слот тсво плетките ос покриват е 8 нкг/та ламииян (SHs, Сирма) въз вода през now при стайна темпера-тура· Преда засаждане па клетките платките се мият три пъти· Използваните за траксфекцията ДН’С - комплекси се получа-ват, като даденото количество пссралепА’=· -ипактияиран биетгаи-лиран аденовирус 01312 (получен съгласно пример 19) се разреждав 150 акл НВл , прибавя се 1 мкг ^rpl, в 150 мкл И8у и следтова се игасубира 30 минати кри стайна температура. После на вся-ка нробс НВр (100 мкл), съдържаща 6 ша» pCOVL (във фигуратаозначено рСХцс), и се инкубира нови 30 минути при стайна тешю-ротура. Накрая къй всяка проба се прибавят ? мкг Tipi в 100 желНз,.. и след това се прибавя т, към ««областната- или къи мио·тубната култура з 6 см блюдо, съдържащо 2 ма Дл/. + 2 % ГСс.След един час инкубиранс средата се подменя с 5 мл ЖЕй * 20 %PCS (киобластж) · съответно с ♦ 2 % конски серум (маотуби)и след <8 часа клетките се събират за да се проведа луцифераз-ния анализ. Луциферазн8Т8 активност за ушшто -:петъчна проба едадена на фигура 38. ПРЛзЕР 26 Подобряване на трансфера чрез СБЮ - вирус в маоблаети при използването на лектин - лигекд а) Сравнителни анализи на аденовирус 6-1312 и GSIO - злрус в НеХа - клетки и С2С12 - миобдасти Проби яли от ПеЬа-клеткя таи от С2С1.2-ш*обл8СТи (5 х 10^клетка за 6 см блюдо) се трансфицират с 6 мяг pCflVl, (зъз Фигура-та означено с рСХда), комплекенрая с 1 икг ,..лгрЬ/7 мкг IV рХ-плюс 5 мкл биоташаифан аденовирус 613X2 (виж пример 1.9, 1 хI0*2 частичка в та), или с It мкд биотаииларан СЕЮ-зарус (ва, пр*аер ?Af 0.3 x частични з ил). След 20 часово вняубира-че клетките се събират и се поететаят за определяне на дуцнДе-разиата активност. Па фигура 39 е показана получавате яуцифв-разаа активност от всяка цялостна клетъчна проба. Тренсфекцаята в ПеХе - клетки се проведа сас сразаяеиасфицивнция при използваното на човешки аденозирус 06312/^, ц>Х/Т.„.рЬ/ЦЯХ - ксмпелкси, които могат да наалеаат □ клетк^с илипрез оденовзрус-рецеятора или чрез траксферня-роцептора идипри нзпелявзие чз CXW -жрусДадХД-рХ/ХПХ - коапяекеи» кояхомогат да навяезат чрез трансфер^й-рецептора. ’.окото зее пактрансферс на ЛИК в С?С1?~ияобдястито с s ^новирус <Ц312 чояе;;s се проведе еФициентио» то комплексите е CSW - вируси фуиа—ционире.т лоаю в ?с г клетки. Предишни опити показват» ч© трояо-берив-рецеиторе играе сено iwai® роля при троиспортирене ноконбиниреяи комплекси з тези клетки; предполага се, че адонова-русяая-рецептор е главното нясто за неалдзеке. Слабата £истдв-ност на СХХО - вируса з жоблести мю :я се дш cw наслаба връзка ггзг-το на CEXD - вируса» така п мв трансферни жС2С1Я - ниобяаетите. б) Подобряване на трепсфевдята на С2С12-шобясетп сСЕ10 - вирус при използване не аглутиаин от пшокзче-и ’ кълнове като яягант Въз основе по слабия транспорт получен з а)» избран бе новлиганд като зокестптел но тренсфержн» а иаспно бистинизшракаглутинйя от псепжпй кълнове (? - 4 колз бгатин за «ох про-теин; Гьорингер 5'.oHXs3ii). оиотияшшран С.,30 - вирус се асяуча-38 както вече беше описано. Комплекси, садьрпаж 6 йкг pCXVX.плюе даденото количество мгр!» TfpL» бяствизлирен зглутяннн отпшеничени кълнове (WCA-3) и СВД - вирус се получават канто • · - £3? следа: вируса и И0Л зеедяс се разреждат в 150 акя НВ,> p-r.rpl, също така се разрежда з 150 шсл НЗ^, ;вата разтвор® сесмесват и се кнкубирз? 30 ииаутп при стайно температура. Ж, разредена л 100 шсд изу, се прибавя пък л-грХ/взрус/ WGA - раотвора и отново се иикубира 30 мкаути пра стайна те»· пиратура. Накрая къ;~ раатзора сс постезп L р! з 100 нкл Ей а пробата отново се инкубнра 30 при стайна температура. 5 /.емпдексите се прибавят кък С2С,х2.-ниобластнсе <5 х Ю клетки зе 6 си блюдо) вките се прибавятсе препарират га 2 мл ДУЕУ * 2 % PC - · Слс,.;, едип чес към оет-5 ;;л f 10 % PC и след 20 чеса клеткитеопределяне па пуцифехегшзх активност· Актив- ността (светлинни едавд) ос всяко сбда клетъчна проба е даде-на но u-iwypa 50 (използваната в този нрямер ДПК е pCHVXw въвФигурата озаачепа с рС1«с). β отсъствие па вирус се получава uuoro слаб ,Ж - трансфер» както с» така и без WC-Δ (коленни X» €). Умерен трансфер се по-лучава със езърааи СлХО-вирус (колонна 2), по са получава 16-кратно увеличение, ковете WC-A-x сс съ^ърха в комплекс. Увели-чаване съдържанието не 7VCA в комплекса (от I жг ас 5 шег) во- ди до леко понижаване ка трансфера (сравни колонкикого увеличаване еъдърженпето но rpl в комплексапа 2 пер) леко позньшза трзкорерз. Тоги ресултстивот, че VWA-- китс ллганд увеличава транспорта паклетките посредством СШ0 - вируси. 3 й4), до- (ст X ΜΚΓясно показ- УИУ в C2CI2 д) жшрееиреае на фактор VIII в СУС~л - клеблзотни и мистубнх култури а:сбластпнте- и киотубяя култури са получават конто е спа-сено ао-горе. Трпксдекцйятз сс ярсвекда кри изаолзвепе на £жт от шзшзд» садьрт full lengu Фактор VIII едпк • · - 158 • · (Wood et al.e 1984{ Baton at al.t 1986) и КОМПЛСКСиран СЪГЛЗСВОобичайното предписание за комплекеиране с 5 шш Х5 мкл Окотиаи-лиран адановируо (както е посочено) плюс и.5 или X шсг 5trpL и7 ИЛИ 6 MKT tfpX. ДНХДирусните комплекси се прибавят към клетките в 2 %ГС^/ДОм. След четири часово инкубиране при 57° С се прибавят3 мл пресна Дмьь ♦ 10 % PC5 към всяко блюдо. След ХЬ часа среда-та се събира и при използване на Хоатест (лоби, Фармация) систе-ма за тестуване с интернационален стандарт като референтеп, сеизследва за наличието на фактор VXXX. Количествата фактор иХХсе нанасят като ножници, образувани за 24 часа за X х Х0ь клет-ки (фигура 4Х). ЙЬШЬР 27 Използване на адевовирус - протеин за цпК -транспорт Адановируо (дан тип 500) се отглежда в пода - клетки, пре-чиства се и се биотинилира, както е описано за адепевирус 0X5X2.г.2 мл от вируса се даализира в продължение па часа срещу5 х 500 мл 5 мм (2-(Х'Х-морфОлино)етансулфонова киселина), X ша Ж1'А ρϋ 6.25, 4° С, След това материала се центрофу-гира 30 минути при 27 X в $Т760-ротор. Горният слой внимател-но се отстранява, утайката (пелета) се суспендира отново вйвб/40 % глицерин. ПьХАЗ', рй 7.4 и натриев хлорид се прибавяткъм горния слой в количества 20 мм и х5и мм и както палета (съ-държащ вирусните Core - протеини и главното количество от хак-еонкапсида; вав фигура 42 ”согеп), така и горната фракция (съ-държаща вертиците; във фигура 42 R се изследват за тяхната ДЙХ - транепорТ1|^^ активност в мишл фиб- робласти ( Jtrauss й <Jaeni£schfOM в аера _ оетки. - 139 ···· · Комплескообразувенето с /ШК сс извърщва κεκτο следва: по-сочените количества от всяка Фракция, нарувев вирус преда цен-трофугирането или интактен вирус (явразен като hex* протеин,ввредава е тоста на ьрадфорд) се разреждат в ЗСО мкв SBt .Прибавя се стрептавида - полияизин (3 мкг в 50 m НЗ'?) и 30яикути се ннкубире при стайне теиперзтуре. б икг pCLVl, , въвфигурата оанечено ”рС1.-:.с;·, се расрекдет з 200 шш EBs в сеприбавяй към първия разтвор за 30 минутно инкубяраие. Закреясе прибавят 3 ?жг Т|р1 в 100 жкл 113-з > последвано от ново 30уипутно внкубираце. 3 пробите» есптс cs подучени само с 7-ρΙ»се смесват Е икг lEpl. в 170 ккл Ей Е с € йкг рСШП, в 330 мкдЦ3530 минути при стайна температура. Посочените количествавирусен протеин се разреждат а 300 шш BBS а след това се при-бавят квд Т,р1/Ж - компвекскте. йсички проби след това сеприбавят за ода час към 5 я 10$ клетки в б см блюдо, съдържа-но 2 и Λ.Χ..-Ι0 % РСб (ели йеХа - клетки яли l.oVX3 - фиброблао-тн). След теза се прибавят 5 ш: прясне среда, съдържаща 10 % *Сj и след 7б часа клетките се препарират за определяне на лу-циферазната активност. Получената луциферезна активност (всветлинни единици) е дадено не фигура 42» накто за HeJUa - клет-ки (таблица А), таке и за 1 оПЗ-^иброблестк (таблица в)* при дата типа клетки *л«в зезисецо от дозата увеличава- не яа Ж - трансферната активност зъл зръака е вертекс фрак-цията (преби 4 - 6 в двете таблици). .:нс се садърдат същите ко- личества биатиапдирзи вирусен протеин ъ Х~рх/да - комплекситебез стрептавидян - полилкзяа, наблюдава се диК-трененорт бдизъсдс базовите стойности (проба 3 на всяка от таблиците). ъгЕ.Ь? 22 /силен геатраасфер при използване на тройни ДШС-шзшщек- • · · - »0 • * * си, съдържащи гадшстозен-ятжданкотгорат а) Тройни комплекси, съдържащи инслуенцапептиден-котгагат Примерите 13 и 14 показаха, че полилизин-конюрани пепти- ди съдържат последователности, получени от М-края на ивфлуеа-цавярус-хемаглутинин НММюдедиянца, увеличават гентраноферав /ШКДрбнсферин-полнлизда-компяексите посредством трансферин-ПОЛИЛИЗЙН» Получават се подобни .’’НК-койбдаацйоняй-комплекси, еъдържа-дя тетра-ентеиереп галактоза-лотанд-полилизин-конЕрат (полученкекто е описано в пример б, съответно в пример 13), като лдааа-ден-полилизин-конасат се прибави към плазмяд-да рСЖ, за дасе неутрализира половината от ДМК - заряда, н остатъка от за-рпде се използва за да се заредят комплексите с инйлуенцапеп-тид-аолилизля-конугати· Транспорта аа тези ДИК - комплекси, ко-йто садъряат синтетичния яиганд (раХ)4, към ЗШ, СХ»2 хепетоци- . .а- тя (трансфекцияте ое провеждат, както е описано в пример бр)при което се получава луцяйеразно генпа експресия (фиг. 43), ко-ито е значително по-висока от експресията получена с трансфе-рна като яигаид. Експресията е повече от 500 пъти по-висока оттази която се получава в контролните експерименти с ДНК - ком-плекси без ^тафлуенцзпептиди, но със същото количество попили-зйн (фигура 43)· Получената с ДНК-комботационии комплекси ак-тивност е съда така около 30 пъти по-висока отколкото с ДНЯ/(оаХ)4рХ- комплексите, с които клетките са инкубирани в при-съствие на хлорооп. б) Тройни комплекси, съдържащи еденовирус - конвгат Комплексите се получават по следния начин:ьиотияизиран здаковяруе 61312 (получен както в пример Х9; 2 мкл, 6 мо или ХБ мкл5 Ю^частички в мл) в 50 мкл Нй$ се 4 -Τ’ " д,. ·» й-χ «· ί ·.»' . ·· » смесве esc стрептсандяя-тюлдазпи (.100 яз?, Ю нг или 420 нг)в 100 ше BBS След 30 г<яутко иняубирене с? прлбазя рпзтзооот 6 met рС.МП, в 300 мкл ЯЗ- и след нови 30 мянутп сс поставяразтвор на З.Е чк? (ое!)4рХ (получел >ло ?то з пряяер 0) или ?шгг Tpi в 150 ьшд П?й. да-н^ллекснчте разтзоря се отглеждаПО 300 000 клетка (VTO ΤΙ.·:?3, <700 71'М, МСС Т1.й?5, МССТ1Ж) з 6 <п блюда в "високо глжозна МйМ + 2 % РС^, По-нататъшното отглеждано на клстжнатз култура з зуцафорззнятеизпитания се превеждат кшето о описано з преданите опита катополучените стойности за гонка експресия след часа са доденана пигура 44. ПРГЕЕР 29 Гбйтрапсфер а ^ш^обгвстоидаВ-кдетки СовбЖй-lQ- я знтмсвепжи-ло-лслпляаиннсошзгатя се полу- чават какте следва, при което свързването се провежда анало-гично на познати от литературата методи чрез зъзедаве яз дя-сулфида мостове esc сукаднитдал-о фкдчлдятяо-пропиопат /s?dp,7«пл et si., 19S1). β) Получаване на знти-човеоки-Хо-подялизин 300-коикгат Кж разтвор но 2 мг нози-аити-човешкя-Хе ( solthem З1о- / techoolosy Associates. Inc.. Birmingham, ЛЬ, US/) 3(150 ί-J натриев хлорид, 20 ml НСР-М, ρίί 7.0) се прибавя 14 жл5 мм етаволов растзор не РДР (Мриация). След 10 часа пристайна температура се филтрува през гелкоясна СоНадекс 0 25(одуеит 100 мГ; HLPIn-буфер рП 7.3), при което се получават Ι·3 мг анти-човешки-1о, модифициран с 30 няола пиржотдятио- 0 пропиоватта остатъци. Яоли(Х)лизин 500 (среден градус за пода-мервзацвя от 300 лазинези остатъка (Стщ)), се кодифицира аав* логично esc ЯД» и чера третиране е датветревтод а последващоредно филтруване минава във $одвфицирава форма esc свободнимеркаптогрупм. Разтвор на 12 нмола полилизин 500, модифициранс 29 анода иеркаатогрупи9 в 0.3 мл йВ , се смесва в отсъствиена кислород с по-горе получения модифициран аита-човешки-юв се остава едва нощ при стайно температура. Реакционната снесчрез прибавяне на 5 » натриев хлорид се довежда до съдържаниена 0.6 &amp; натриев хлорид, йодирането на кошзгатвте се изаьривачрез йовеобменна хроматография (^араация9 ионо r Н1 9/5); следдиализе срещу 25 ш* ЙШ- Рй 7.3 се получават съответните кон-югатже състонщн се от 0,33 мг анти-човешки-Хс, кодифицирай с 4анода подшшзяв 300 (модно съотношение 1 ; 2). б) Получаване нз човеаки-loC - полилизин 300 - конагатлъа разтвор на 19,5 мг (122 анода) антитела (Сита 1-4506) в 2 вл НЗ се прибавят 39 мкл етааодов разтвор на сукцин- иадид-пирвдилдптио-пропаонат С.РДР» Фармация), След 2.5 часапри стайна температура се фвдтрува през гелколона Сефадекс G25 (елуент 100 пс iffiPB - - буфехо рй 7,9) > зри което се получа-ват 19 мг (119 анода) човевкя-1о09 модифициран с 252 ннелапиридадитвопропвонатни остатъци. Дсяи(1)яизив 300 (средна сте-нен на нодимеризация от 300 лизинови остатъка; Ситна) пс анало-гичен начин се модифицира е /ЯдР в чрез третиране с дитиотре-атол в последващо тилно филтруване се довежда до модифициранаформа със свободни неркаптогрупв. Разтвор на 119 нмола полшш-зин 300 v шздвфицвран с 262 наела меркаптогрупи, в 1 ад НВ , сесмесва при отсъствие на кислород с гореспоменатия модифициранчовеаки-ΐοβ в се оставя де престои една № ара стайна темпе-ратура, Към реакционната смес се прибавя 5 М натриев хлорид зада се получи 0.6 с съдържание на натриев хлорид, Изолирането на - 143 - « *' *> » a I · · ······« коняратите се извършва «раз йовообневва хроматография (шоно ь9Сараация) 50 ми ПЕРЕ;- pH 7.3, солеаи градиент 0.6 &amp; до 3 й нат-риев хлорид); след диаяиза срещу йВз pH 7.3 се получават съот- модш:впдираии с ветаите конвгати състояли се crtv^O виола полйлйзин 300 9 ар (57ниола) антитела (волно съотношение I : 1.6).с ) Образуване на комплекси и трансфекцияitoиндексите се нолучават както следва $ Виотинилираи аденовирус 61312 (30 ш; Ю^частичкя в us)в 50 мкл НЗ- се смесва със стрептавидин - подидизин (800 нг) в100 мвд йВ; ; еаед 30 минутно инкубиране се прибавя разтвор на3 pCbVl в 200 шся Й86. След нови 30 минути се прибавя раз-твор на 5.1 мкг полилизин (ply 450), 10.2 акр Т р! , 12 шер чо-веши-ХрСнюлйлазии - конюгат или 10 мкг знти-човежн-1о-поли-лизин - конюгат в 150 но ИВ . ДШ£- комплексите се прибавяткъм всеки Ю6 В-лин^ластоидаи клетки (клетките се получаватот човешки периферни мононуклеарни кръзни клетки чрез амортала-зираве с Епцайн Вар вирус както е описано от walls и Crawford,1989 и се култивират в платки с 24 вдлъбнатини в 1 о Ш11640 + 2 5 ГО ); По нататъшното разработване на клетъчната кул-тура и луцжеразните налитания се проведат както беше вече□писано в предишните опити. Получените стойности за ревна екс-пресия (луциферазна активност в светлинни единици) е даденана фигура 45« ПРЛЛЕР 30 дНК -транспорт е транефервн-подилизяв в присъствие насвободен и кошогиран риновируса) Риновярус Ж - 2 препарати Риновирус K2V-2 се получава в пречиства както е описано от SMern et el., 1984. - хи 400 мкл разтвор на рипоаарус (около 30 мкг) в йВ. (150мМ натриев хлоридД мм Ж?£ pH 7.9)/10 % глицерин се третирас 10 нмола lift -ХС-баотин (Пире 2X335). След три часа ишсубира-не при стайна температура вируса се отделя от вевррвдевия био-тин чрез удължена даализа срещу 113 40% глицерин при 4° С. СвеТЬчувствитвлен риновирус, получен чрез култивиране навируса в присъствието на акрлданово оранжево, се инактиаира,както е опасано от Meashus et cl., 1984. б) Получаване на да - комплекси а трапофешаш X) Трансферин-полилизж/Жй комплекси се получават каторазтвор на 6 мкг паазмид-Ж рОЖ в 330 мкл ИЗо (Х50 мм нат-риев хлорид, 20 ЙШ» рй ?·3) се смесва с разтвор на 8 мкг1^р1290 в 170 мо ИВ... ДИК - комплексите се смесват с 1.5 млсреда (ДМ2М t 2 % ГС ) и е 0.14 жг до 3.5 мкг риноварус 1Ю-2(или ипактиадран 1Ш7-2). Сместа се разпределя като ШН ЗТЗ»клетки 300 000 плетки се поставят в 6 см блюдо. Четири часа по-късно траксфекциоквата среда се заменя с 4 мг пряспа среда (Ш£« t 10 % ГС). Клетките се събират след 24 часа и се изслед-ват за луциферазна активност, както по-рано беше те описано(фигура 46А). XI) да - ксмбижцдовнн-кошшекеи, съдържащи транеферин-аолилизми- и риновирус-подилизип-кошагати се получават кактоследва: 100 мкл разтвор от биотинилмран рановирус UIV-2 (3.5жг) в йВ се смесва с X мкг гр! в Х00 мкл НЗ ( другитевирусни концентрации се смесват със съответните части). След30 минути ар I стайна температура разтворът се смесва с 6 мкгвяазмйд-да в 150 мкл 0¾ инкуоира се поза 30 минута при стай-на температура и се смесва с € жг Тгр1290 в 15о мкл 1IB-.да- комплексите се смесват с 1.5 мл ореде (дай 4 2 % fC) и се прибавя към ΙΧϋΐ ЗТЗ - клетките (500 000 клетки за 6 мабледо)· Но нататъшното обработване на културите в луциферазнитеизпитания qq провеждат както е описано в X) (Фигура 468). UFOMSP ЗХ Трансфекцая на НеХа - клетви о комбинационни-комплекси,съдържащи йонно свързан аденовируе Образуване не комплекси А): ДНК - комплексите се получаваткато първоначално 30 мкл аденовируе 0X3X2 (около 10^ РГ д< ) сесмесят с I мкг полилизин piy;450 (средна дължина на веригата450 иокоаера) в Х70 мвл НВ> и след това към него се прибавяслед престояване 30 минути при стайна температура 6 миг pC&amp;iVl -л11ПС в 170 мвл Н8-. След ново инкубиране с продължителност 30минути комплексите се смесват с 9 акт Т.,;рХХ20 в X7D ПВ5 ·Аликвотна част от комплексната смес (10 % « 50 мвл разтвор, 600нг ДНК» или 1 % « 5 мкл разтвор, 60 нг ДПС) се разрежда в 1.5мл ДшУб * 2 ГС ? и се прибввят 300 000 ИеХа - клетки. След 4часа се прибавят 2 мл ДУЖ + 20 % ГС> Събирането на клеткитеи луциферазните изпитания се провеждат както обикновено. Дуця-феразната активност отговаряща на цялия екстракт възлиза на29.ХХ5.000 светлинни единици ( в случая на 600 нг ДНК) вх.090.000 светлинни единици (при 60 нг ДШ0. Образуване на комплекси В) (контролен опит): ДйК -комплек-сите се получават като първоначално 6 шя рС,Ж-ДНК в Х70 мклпВее смеси е X мкг делили зин рХу-АБО в 170 мкл ЯВ и след30 минути при стайна температура се прибавят 9 мкг LplX90 вХ70 мвл ИВ . След инкубиране в продължение на нови 30 минути,към комплексите се прибавят 30 мкл аденовируе 0X3X2 (околоХО9 РГ ). Аликвотна част от комплексната смес (10 % « 50 мклразтвор, 600 нг ,Ш; или X % « 5 мкл разтвор, 60 нг ДНК) се - 146 - ·:· · ’·· · - * разрежда в 1.5 ма ДиЬк t 2 % PC и се прибавят 500 000 йеХа -клетки* След 4 часа се прибавят 2 ма Д« ♦ 20 % PC.. Прибира·пето па клетките и луциферазните определения се извършват как·то обикновено. Луциферазната активност отговаряща за цялостнияекстракт възлиза па 405 000 светлинни едаияци ( при 600 нг ДНЛ)и 200 светлинни единици (при 60 нг ДВК). НВШР ж Локално поставяне но ДШС/адено вирус/тронсферин-полилизин-комплекси в черен дроб на плъх а) директно инжектиране Ж - комплексите се получават както е слисано в пример19. Те съдържат 200 мкл аде но вирус 015X2« 6.4 миг стрептавидин-НОЛИЛИЗИН, 48 MKT pCx^Vb И 48 МКГ Т- Р1290 в общ обем ОТ 2 000мкл ИВ . иЖй aprague-Dewley плъх (телсно тегло 240 г) ©еанестезира с авертин и се прави 4 сантиметрова лапаротоняя.Инжектирането на комплекса се извършва в продължение на 2 ми·нути в левия страничен чернодробен дял. След това раната отлапоротомията се затваря пластове. Плъхът, в състояние на нар·коза, се убива 48 часа след инжектирането на комплексите и сеизмерва луциреразната експресия в различни проби от черния дроб.Показа се луциферазна активност от 5.615 светлинна единици/мгпротеиново съдържание в хоногената от чер дроб в областта намястото на инжектиране; Общата активност възлиза на 570 600светлинни единици. Па места от черния дроб» отдалечени от мяс-тото на приложение на инжекцията, не се измерва никакзо луди»,херазна активност. б) приложение на комплексите чрез жлъчната система в чер·ния дроб Комплексите се получават по следния начин: 200 мкл биоти-
нилиран аденовирус 0X312* разреден е 200 мкл НВ5 се квкубжратпри стайна температура в продължение на 30 минути с 6.4 мкгстерпетавидин-модиЧициран полилизин в 400 ш НВ5. След товасе прибавят 48 мкг рСЖ в 900 мкл ΗΒ;» За приложението накомплексите се използват мъжки плъхове от горния зид (телеснотегло 250 г), анестезирани с аверитев и корава им се отваря смедиален разрез» Червата се изместват в лявата страна на теле-то и в жлъчния път се въвежда 2? 0 игла, свързана с маркуч испринцовка от I мя. Лнжектирането на комплексите продължава 4минути» След това иглата се изтегля от жлъчния път и мястото наинжектиране се затваря с фибрш-iosa лепенка (Лнуно). Коремниятразрез ©е затваря със шевове и метални аграфй. След 30 часа плъ-хът се убива и се изследват проба от различни места на черниядроб за луциферезна активност» Най-високите стойности за луди-ферезвз активност възлизат на 19 000 светлинни единици за атпротеин; пресметнатата обща емсресия не цялия черен дроб е отпорядъка на 2.7 х 10б светлинни единаци» пряавв зз приложение на Д1Ш/адеповйрус/Гр1-комплекси в запушвавена нз опашката на миши Комплексите се образуват, кзкто е описано в пример 19. Тесе състоят от 45 мкл аденоаирус 61312, 0.8 миг стрептавижн -полялизжн, 6 мкг рСЖ и 24 мкг мТ.р1290 в общ обем от 150 милИВс. Комплексите се инжектират в опашката във вената на мъжкаСЗН/Йе мишка (възраст: 2 месеца) под наркоза с авертин. Непос-редствено в края на инжектирането вената на (шашката в прокса-малния в дистиваяния си край се компримира, тава че комплекснияразтвор, през времето на компримиране (25 минути) да се задър-жи в отрязъка от вената на опашката и да ас може да се отмие с - 148 кръвта. 48 «аса след пнаектирансто юшката се убива чрез церви-кална дислокация и инзектираната вена на опашката се препарира.Експресията от яуцифераза се измерва в хомогеаат от отрязъкана вената на опашата. Получава се дуциферазна активност от2 600 светлинни еданици/5 см вена от опашата. ДРЛЖР 34 Трансфекциа от пързични човешки меланомша клетки а) Трансферния с аденовирус - лояшшзик/трваеферан -полклизии - комОлнзцйоннй комплекси Първична меленоини клетка се изолират от хирургически от-странен медаиом от пациент. За целта, туморът механично се раз-дробява в Kill 1640 клетъчна културална среда с 5 % РС - 2мМгдутамин и добавка на антибиотик и частичките от тъканта се пре-карват през метално сито. След това туаорнате клетки се промив-ат няколкократно чрез центрофугиране и наново суспендиране исе засяват в Т25 клетъчна културалне стъкла. 24 чеса след изо-лирането на туморните клетки следва тронсфекция с тройни ком-плекси състоящи се от: 3 ши, 3 мкд или 2? мкл биотиниаирвиаденоварус 01512 (1 х Ю^/мл), 0.5 акт стрептавида-полилизин, 6 мнг pCUVL и 7 жг Tfр!290 (» добавка на 2? ши аденовирус: I лкг стрентавидан - полилизин и б миг Т|рХ230) в общ обем от500 жл НЗ . 56 часа след трансфекцията клетките се събирати луциферазната активност (светлинни единици) се измерва (ж.Фигура 47; горната графа показва резултатите с клетки в суспен-зия, долната с прикрепените клетки). б) Трансфекцзя с аденовирус - подаяжзжДяска плътностлипопротеин - полилизин - комбинационни комплекси1) йоиучаваае на 1Д1 - полилизин - ковюгатн • 149 - • · · Разтвор от 10 № (14.3 нмола) 1Д1 (липоаротеян с нискаплътност) Сирма» Ь - 2139» молекулно тегло 3 500 000» диаметърна частичките около 26 им) в 2 ьш НЗ.- се спесва е 143 жа 10 мМетанолов разтвор на 1 ?ДР (1.43 мямода; ^армация) и се оставятда реагират з продължение за два часа при стайна температура· След гелно филтруване през Сефадеке G25 колона (14 х 140 мм) сИЗ- се получават 3.2 мл разтвор па около ±j мг 1Д1, модифициранс и.70 шшола пиридилдатиопропионатни остатъци. Разтвора се смес-ва с 1.2 мл 5 М натриев хлорид за да може при следващото приба-вяне на полализин да не се получи утаяване, както з противенслучай де настъпи. Поли(Ь)лйзйн със средна дължана на веригатаЗОО мономера» се модифицира капто е описано е сРДР, третира сес датиотронтоя и гелно се филтрузз при което се довежда до лоди-фицираяа с меркаптогрупа форма. Гореописаният модифициран Ш-разтвор се смесза е разтвор от 0.33 мкмола нолилизин 300» мо-дифициран с 0.76 шплола меркаптогруяа» в4 ms2 о натриев хло-рид, 0.5 &amp; НЖг> , pH 7.9» в атмосфера на аргон и се оставя прастайна температура да престои 4£ часа. Реакционният разтвор серазрежда със стерилна вода до 32 ил {концентрация на натриевияхлорид около 0.5 2) и се разделя чрез йонообмзниа хроматография(Оаорад йакропреп ;» 10 х 100 мм» 20 ил рП 7.3» градаент от 0.7 - 3 М натриев хлорид). Орокцияте от продукта елуират приконцентрация на сол от 1.5 п - 2.2 л и се събират. След диали-за срещу НВс се получават кошогатк състоящи се от 2.35 мг (3.4нпола) 1Д1 модифициран с 190 ннола полшшзин (отговарящ на 7.5иг на свободната форма полализкн - база). Това отговаря насредно модифициране на 1-Д1 - частичките с около 55 полилазано-ви вериги. 11) Образуване на комплекси и трансфекция: — 150 — ··· · ·· · 18 мкл Виотинилиран аденовирусев 01312 препарат се разреж-дат с ЯВ до 100 мкл обем· 1.2 мкг етрепзтавидин - пояияизки седопълват до 100 мкл с И8_ и се смесват с 100 - те мкл аденови-русен препарат. След 30 минути се прибавят 150 мкл ИВ с 6 шгрСЖ. След пови 30 минути се добавят 500 мкл Ж е 4 миг 1Д1р1(полйлизйново съдържание 20 мкг). Така полученият разтвор сесмесва с 1.5 мл ДЛ (10 % PC) и се прибавя към 5 х 105 трито-ни мелановни клетки Сполучени както е описано в а) и означение и fc»), които се намират в клетъчно културелио бледо с6 см диаметър. По-нататъшния ход на работа и дуциферазиате из-мерва ние се провеждат, кокто е описано под а). Генната експре-сия е дадена във фигура 48. Λ) показва резултатите с меяавомвиклетки ittai, всички опити са преведени с АорЬ-конигати, коитоне^означеня специално на фигурата. В) показва опитите с меяа-номните клетки всички опити са проведени е АорХ - конвга-ти, тезй са отделно показани в последната колонка (означениетоо I3I2/I6 се отнася за специалния вирусен препарат). В дадени-те в колонка 2 опити, 1Д1 е приложен в 25 кратен излишък, в ре-зултат на което, при съревнованието зе ХД1 - рецептора,води донамаляване на гентрансферната ефициекция. ПРШ 35 Трансфекция на първични човешки фибробласти Бяопсии от кова на хора се поставят в 6 см петриево блюдосъдържащо ДМЕМ, 2 ш! глутамин, 20 % PC и антибиотик. След то-ва биопсиите с помощта на хирургически нож се много надробявати се култивират в присъствие на 3 мл среда в продължение на 5дни. След това клетките се промиват с прясна среда (вил по-го-ре) и отново се отглеждат ? дни. След този период от време клет-ките се трйномвизират и се субкултивират в ново петриево бледо. 151 - • · · · •· · Хогато клетките станат почти коифлуентни, те отново се трипси-нязирет и до трансфекцията се замразяват. За трансфекзнята клет-ките се размразяват» засаждат се в € см петриеви блюда и се от-глеждат в ДМЕМ» садъриаме 2 Mi глутамин, 10 % PC и антибиотик.Хоивгатите за трансфекцията се получават по следния начин: 3 шш,10 мкл, 20 мил и 30 мкл биотииилиран аденовирус 0X3X2 се инку-б.-рат с О.Х мкг, 0.3 мкг, 0.5 мкг и 0.8 шо? пояилизин - модифи-циран етрептавидот в 150 мкл НВ 30 минути при стайна темпера-тура. След това се прибавят 6 мкг от пяазжда pCMV -гал в 170жл НВ. и сместа се инкубира нови ЗО минути. В последния етапсе прибавят 7.8 мкг Т-рХ за конюгатите с 3 мкя ох3X2» 7 мкгТ.рХ за 10 мкл 0X3X2 и 6 жг Трх за конюгатите с 20 мкл и с30 мкл 0X3X2 в 170 жг НВ . След иякубиране з продължение на30 минути, конюгатите се поставят в-ьрху клетките в 2 мл ДШЬ»съдържаме 2 ж; глутзмин, 2 % ГС и антибиотик и клетките се ан-кубирзт 4 часа при 37° С. След това средата се отстранява и кул-терате се разреботаа при 37° С с ДШ«» съдържам 2 мМ гяутамин» Ю % ГС и пнт-лбйотж. След 48 часа се определя експресията на' -галактозидазата» кекто беше описано в предишните опити. Дри траасфекция с 3 мкл 013X2» 14 % от клетките показват-гвлактозйдаяиа продукция, при 10 жл 01312 се получават 32 % позитивни 1£летки, с 20 шсл 01312 39 % и с 30 мкл 01312 64 %от клетките са позитивни. ΠΡΛ1Р 36 Гентрансфер з епителна клетки от дихателни пътища наплъхове на жизо с помощта на комбииационни - комплексие) Получаване на ΊΧρί/ΑορΙ - комбинйциоинп комплексиЧовешки трансферни - полилизин - ДйД - комплекси (ηΧ-ρΙ) се получават чрез комбинация аа 8 акт трансферни - полоизин • · · - 152 - •AC » » * a * « -* * « «····· *»*·« (Серва Ьисхешпгъл) в 150 ика ΗΒ (150 шл натриев хлорид/20 мйОРЕ pH 7.3) е 6 мяг рСЖ. - ДНК в 550 uks НВ , и се ивдуб»»рат 50 И1:иута при стайна темперзтуре. Лдеиовирус - иолилизин -какатетите се получават конто е описано з пример 19 е) като ссизползва псораденДЗ-инектйВйрен аденовирус. Еомбинацаонните-конплекси Т ρΙ/ΛορΧ се получават съгласно арепясанието в при-бор 25 с). б) прилагане не комплексите vm вяао през интретрзхиалпияпът 2з тези опити се използват плъхове л , за t lgrnodoQ hispid us които се е оказало» че представляват подходящ модел ва животназа човешки аденозирусни белодробни зеболявания (ρεβ1β1 εΐ1984). дивотиите се анестезират с ?летоксжлуран. След верти-:: лок отвор на ввйтрвлната страна на врата се препарира въздуш-ната тръба. комплексите (250 до 500 мкл; 3 мкг пяазмяд-ДЖ) се•шло.гткра? директно въз въздушната тръба под ъгъл 45° на лежащи-те под наклон дазотж. Въз времената посочени във фигура 49 следашдектлроието» ^нотните се убиват с С0? и въздушната тръба» за-едно с белия дроб веднага се проплакват със студен буфериранразтвор но натриев хлорид (Рй ?) и се заделят. 2а луцаферазнаятест, белодробното тъкан се хомогенизира в екстрокционеа буфер»лизатито се стендартизират по отношение на обцо протеиново съ-държаиаа и се измерва по описания вече начин луцаферазната екс-пресия. Посочените светлинни единици се отнасят за 1.250 мкгобщ протеин» получен от белодробните яизата. Опитите се провеж-дат в 5 и &amp; - кратни повторения» резултатите co посочени катосреда стойности * й?’й? 3? Гентрансфер при използване не ве-вяруени ендозомолатна - 153 • · · · · · средства а) Сяатез на разпукваща мембраната пеатида I) Синтез на лептида: Псптидите се синтезират върху азтоизтичен синтезатор (A3IASIA) посредством твърда фазова метода при използване на р-ел-кокеибенвяаякеходйа свода (0.9? цаояа/г) като твърда фаза иГйос-защитени аминокиселини· Карбокси-треминалиата аминокиселааос свързва към смолата чрез симетричния анхидрид. Следните ами-нокиселини се свързват посредством 1-хи,:,роксябензотриазол-да-щншохексяякарбодаймад-яия метод. Използват се следните защитнигрупи за страничните вериги: (Trt)aεη, (Trt)Cye /<t~Bu)cye " слу-чай ив eala и ада, (t-Bu)aiu, (тп)?ь, (t-3u>s©r. Пелтндите инат снедните последователности: wALA: (XL AC} 5)
Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu AU Leu Slu Ala Leu CLP (SE'4 ID KO:6) Ala Leu Ala Glu /la Leu Ala Hu Ala Leu Hu A la
Trp Glu Ala Ala Leu Ala Hu AleHu Kls Leu Ala Hu Ala Leu AlaAla Ala Sly Gly Ler Cye
Hy Leu Phe Hy Ala Leu Ala Hu
Ala Hu His Leu Ala Hu Ala LeuLeu Ala Ala Hy Hy Oer Cys GLP-II (SEQ ID N0:7) Hy Leu Phe Hy Ala Leu Ala HuAla Leu Ala 51h Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu AlaLeu Ala Slu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cye GLP - delta (3SQ ID SO*8) HyLeu Ala Hu Ala Leu Ala Hu AlaGlu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala
Leu Phe Hu Leu Ala Glu AlaLeu Ala Glu Ala Leu AlaHy Gly Ser Cys SALA - Inf (SEQ ID L0s3) Gly Leu Ph® Gly Ala lie Ala Gly - 154
Ph© II© Glu Asn Sly Trp Glu Sly Leu Ale Slu Ale Leu AlaGlu Ala Leu Slu Ala Leu Ala Ala Sly Sly $er Cys SALA-P50 (SBQ ID KOt 10) Sly Leu Ph© Glu Ala 11© Slu SlyPh© 11© 011 abb Sly Trp Glu Sly Leu Ala Glu Ala Leu AlaSlu Ala Leu Slu Ala Leu Ala Ala Sly Sly ser Cys P50 (S£Q ID LOt 11) Sly Leu Ph© Slu Ala II© Glu Gly
Ph© II© Slu Аав Sly Тгр Slu Sly M©t II© Asp Sly Gly GlyCya Пептазате co отцепват os сшолате и заданите групи на стра-ничните ВСрИГй» о изключение US (тарц.~бутш1)Суо» co отстраняват«ре5 третиране не 100 мг от пептзд-ватезареиата твърда фаза с3 шт оиос от фенсп/етспдйТйОдДп-оенйзкй/воде/трйфлуорсцетва ки-селина в съотношение 0.75:0.2520.5:0.52x0 в иродъкжекяе на 1.5часа прп стайна температура. Суровите пептиди се утаяват еетер и се иият 2 пъти. ... -тсрц.-бутсл заситените пептлди 2А1Аи СХР се разтварят в малък обею 1 трпетшшмецзев бикарбонат(Ϊ2ΑΒ) рЕ 0. ра&amp;ревдт се до 100 m2 ЕлЛВ в ло-нетатък се пре-чистват чрез реверсивна фазезе писокоеХектмзка течно хроа&amp;тс-графая върху нуклеезал 500 - 5С4 колена (о.Х % Ж/ацетснатрид-градаент), като з двата пептада елуарат при около 50 % ацетонит-рил. Свободната Су< -.Ή - форма на яептадите се получава» катоот Ш-Суь-псптъдлте се отстранят зацатните групи по точно о»щие начин на описания по-горе. Суровите пептад (5 мг) се разт-варят з 100 мая ХОО Wt ри Ь» съдървд 1 шел л-меркзпто-етенол и чрез гелно филтруване (Сефадеке δ-25» 100 м« ΤΕΛ3» 0.5ж* дДХА) а сушене чрез замразяване или всиеобюенна^роматографйя » V · * ” * * «···· · ··«···· « 155 - · *··* : ··* : (Моно 0, Фармация, 20 Ш; НШЬ, ри 7.3, градавнт 0 да 3 й нат-риев хбсрид; петтада еяуира пр» 1.5 U натриев хлорид) става пре-чистването. II) Модифициране е и-(х’1дроксиетил)иалеимид С - крайната ,ύ-група на пелтидае GIF - делта, GIF -II,ΕΛΙΑ - инф, ША-Р50, Р 50, след геОно филтруване (Сефадеке 5-25, 20 нМ ЙЖ.:-·, рй 7.3, 0.5 м«. ЗДТА) зе освобождаване от сво-бодната зй-форм8, се блокира чрез взаимодействие е 1.3 до 10-крзтен излишък от И-(хидр<жсиетил)адяеишд (1час при стайнотемпература). Излишният нажеикид се отстранява чрез гелно фил-труване (Сефадеке 5-25, 100 ми TEAS, pii В) и пептидите (GIF -делта-пая, CIT-II-иал, йА1А-Лиф-йал, ША-Р50-мая, Р50-мал) се ·получават след сушене чрез замразяване като триетилакониевисоли. III) кодифициране с ?,2Мятиобиопирйдин Свободните ..-пептиди се оставят де взаимодействат с 10еквивалента 2,2Мттиобиспиридян (20 мг.: НЕРйь, pH 7.9, 0.5 иИЕДТА) една нощ прл стайна температура. Излишният реактив сеотстранява чрез делне филтруване (Сефадеке 6-25, 100 me. TEAS,pii 8) или чрез йонообменна хрометограмя (echo Q Сермация, 20Mw НЖ>, pH 7.3, градиент 0 до 3 мело натриев хлорид; пептида елуира при 1.5 натриев хлорид) при което се получават (2-пи-ридвнтио)* оуи -пентйдите (-ai-Meijfce-sspy, sip-i^-sspy,..··. ..SAlA-Iaf-SSPy, ULA-PSO-SSry, Г50-ПЗРу). IV) Дпмерззпране на пептидите Хомодаерът по P5Q (Ρ5ϋ дим) се получава като се оставятда реагират в продължение на 3 дни при стайна температура екви-моларни количества от Р50-Су.-(2-плридатно) и Р50-Суз~ М в 2Gид НЖь, pii 7.3. Реакционната смес се разделя върху Еоно 0 но- - 156 - ЛО«0 (Η1-5/5 Фармация, 20 мй НХРЕс, рй 7.3, гр.· дивят 0.09 ;.·>до 3 й натриев хлорид; Р59-димерй елуира при i.J, натриев хло-рид). Хетеродамера GIF- -Р50 се получава аналогично чрез вза-идсдействие на пептида Р50 (свобода мврваято форма) о пиридия-тиомодифициран пептид GIF. б) Изпитания за нропусклизостто на липозомитеСпособността не синтетичните пеотида да разпукват липозо- ните се измерва втз основе на излизането на флуоресцентно баг-рило от лйпозомите» които се натоварени е намаляваща концентра-ция от калцеин. грозените се получават чрез Ш-метода C«r0V« егае phase evaporation") (Szoka w Papahadjopouloo, 1978)c водна фаза от 103 калцеин, 375 ад Na*, 50 Mi натриев хло-рид, ρΠ 7.3 и се екструдират през 100 та поликарбонатен филтърUacixmaia 0t aiM 1991) за 48 се получи еднакво разпределениепо големина на частичките. Идазомите се отделят от не-свързан-зя материал чрез гелно Филтруване върху Сефадекс 0-25 с изо-оо-мотячен буфер (200 мд натриев хлорид» 2.5 ibi?rb, рй 7.3). Приизпитанията за пропуекливост (ликах) изходният разтвор се раз-реда при разлаяни рй стойности (6 мкл/мл) в 2 х изпитателен бу-фер (400 мй натриев хлорид» 40 иь натриев цптоат). Алнквотвачаст от ±00 мкл се поставя към 80 мкл от сертаня разреждалия наясптнда във вода в тякоотитеона платна с 96 вдлъбнатини (край-на концентрация на липида: 25 мкк) и след 30 минутно инкубира-ас пря стайна температура и при 600 та ( възбуждане при 4см ам)се поставя върху ч ’кротитъраи платки - флуоресцентен фотометърза изследване на калцеин флуоресценцията. Стойностите за 100 %ликак се получава чрез прибавяне на I мкл от 10 %-ен разтвор натритон Х-100. Ляхаянйте единици се пресмятат като реципрочнастойност на аептидната концентрация, при която се наблюдава - 15? 50 % siiaasi (2.е. обемът в мкл лкаовопен разтвор, коите се ла-зарет 50 % от акт пектид). Стойностите под 2υ единици се екстра-псяират. Хозудтствте от дляозошите даказзи азшиювая са дедевина фигура 50· СХГ a ЙАХА показват псй-вксопв рН-еяецвфзквв ак- тивност. е) ^рптрощ.Аца - лиани * изпитания йрссаи човешки еритроцити се промиват няколкократно с ИВ? и откове се суспендират з 2 х изпитателен буфер с подхода® ристойност (300 «у натриев хлорид» 30 мо натриев нитрат) ара кон-цеитрацяя от 6.6 х itr йяякзотпа част от 75 пкд се прибавя квд 75 нкл ссрзапо разреждано пептида вя в веда в нлкротлтер- на платка е Об вдаъбкагикк (конусен тип) ι в проуклхоияе на едначас -при постоянна ражперно клатене аа алкубкра. СлсА отстра-няване за не-диазраштте еритроцити чрез датрофугирсне (ЮООсб/шш, 5 азн) Ιυϋ укл от горния слой се лрс-зкзърдят в поза ш«- ротптврзе платка з се определя хологлемлзпатз абсорбция при 750пу (основен коректор нрз 750 пн). 150 ’0-по визиране се опреде-ля чрез прибавяне на X мкл ХО уФ-ен разтвор на тритон X-iOo пре-ди центрофугирането. &amp;шодзтичш1те едакщп се пресмятат каторедарочна стайноот на аептздзата концентрация» при която сенаблюдава 50 /J-еп ликаа (т.е. обемът в акд па ератроцитния разтвор, които се дизпрат 50 % от жг аептпд). Стойностите под3 хоаолятичня единаци се екстраполират. Стойностите се посоченина фигура 51. От тая е видно, че 150 дан и ΠΛΧΛ-Р50 показватнай-високата специфична ос pH активност но отношение лнзлра- аетс но клетки и/али по отношението на освобождаването на по-годяни молекули, пате хемоглобин. i50-w номерите Ρ5ύ π Р50 ;>.· -Ру апат по-ниска активност, йюштин показва най-висока ак-тивност, която обаче ас е специфична зз кисели рй-стойвости. - 158 • · · · д) Получавано аа ДНК - комбинзцаонни комплекси ДЧК- комплексите ес получават като първоначално се смеся® G ШЯР рСгЩ-ДШС в 150 мкл НЗ , 0 4 ют ?др1290 в 150 жл НЗ 'и след 30 минута при стайна температура се смесва с до 20ша» Ро1у(Цлизин25О в 100 шсл НВ.> След нови 30 минути ипкуб»-рапе при стайна температура ос прибавят 0.3 до 30 икг пептидв 100 ?жл ДВО я отзове се ипкубират 30 минути. Оптималното ко-личество еядозскояитно средство се определя з предварителни опити, при което се измерва получената производителност на ген-тракспер (виж таблица 3: гектряиефер з .Ш1 01.2 - клетки).Оказа се, че едновременното прибавяне на яолилйзяй и ендозоаю-тптяо средство, коктс и използването не пе-?олпми обеми за получазакето но кешгекеи (1.5 крайеи »,бек.) дозг срсзшша ялипо-добре тренсфекцяонна ефициенцин. йр^ тев г опити се устапозвсъре тока, че и не-лептчдни о<№тжи?еведеств«? дезоксяхоло-&amp; киселина и одекнова кисел™ усилват трансфера но ДНК. е) ТрвнсФекция на клетки Адзеронтни клетъчни линия (ЖЬСЬ.2 хепатоцати, съответноШй ЗТЗ-клетки) се култивират I до 2 да преда тронсфекцаятав б ек блкда (Дййй среда е 10 % РО ·. ; 300 000 клетки/блюдо).Средата се отстранява и се прибавят 1.5 мл Д1Ж * 2 % PC- и500 ш ДКД - комплекса. Алтернативно се използват 0.5 шг Д!Ж+ б % ГС\ и 1.5 гд ДПС - комплекси. След 4 часово инкубиранесе прибавят 2 икл Д1/Е0.. ('№ % ГС ..), (Установено бе, че алтерна-тивно средата моно се замени е 4 ?ля йдй’й с 10 % PC ). Съба-рянето да клетките и дуцяФеревните пепитения се провеждат кай-те вече беше описано 24 часа след тренефекцията. Показанитестойности яа светлинните единици представляват цялостната луци-феразна активност на трансфицарсняте клетка. Траасфекцаята на - 155 - .:. : ’··’ : ·· ’ 31X1 GI.2 хааажоцнжи o доказана из фигура 52» Хнгура 52Л: ДПК - кодадоксиге се получават каже парзона-иалне се сассваж С акт рО.ЛТ- ДЦК в 250 дкл 135 с 4 нкг 2-pl230 в 250 пкл iui-и след жоза, олод л-шути ара стайнатояноражура, co ирибааяж 20 ш аодн(1)лпзаа2о0 а 750 шсд 13.^След дози 30 шшужа аакусираие при сталаа таннеражура се ара-баааж посочената ксличесжаа попгидл з 250 шл НВ4> След нозе яа-кубйраае ог 30 минута се нряиаапт ш асьаискслже и.5 ллплюс 6 % ГС.> я се арлбаааг 450 000 клетки. сиуура 52 в; ^вйкошлекелта се получават ката пврвона-челас се снесааг 0 лкг ро;?‘х^о;к в 500 пил хШ:> с 4 акт xOpit.Suв 250 ккл 1Шо а се оотаалг да ареежойж 30 шиуга ара стайнатаялерагура. 500 якл розгвор па 20 щц* аолй<1)лйзиа29и в ЮЬсе ежеза с посочените количества пепжлдл л 250 жгг 1ШЗ и зад-ните се прибави ш i.pi/ДДп * сместа· След кози 30 минута иа-луОпрвкс при сталпа температури кв кскцдексиже се првбавйж0.5 мл ДШ. + 0 Д ГО; к се прибавя кал 450 сой клетка. Клетки-те so сабирсж след 24 «асе след жрецефавдяже и онредаянеже надуциферазпага адживноеж се извършва но оплеения ао-раао почин. Преведената е ЩЕ ЗТЗ - плетки шшжл са отразена sa фигу-ра 53. Получаването ле кеяслсксиге 2} и .>} с овцата» кикго притрецсфскщжк? на viXI- С1.2 - клежкя. 1рк тези експеримента с кяожьчки култури» песжядае Р50 ддий и '0ΛΙΑ-Ρ50 показват най-висока активност» «Ш и Gif инатсредна активност» даежо Р5о-яонояерижв и надигна нмаж нискаекжонссж. ВШ 38 Гекграясфер при използване на синтетичен но-вярусен пептад с олитслизян-удмжсняс в С~краа ttt · · · · - ua c. iioimu 02 поездоатдяаомас^ч id lo:4) yet Ala Gin AspIla lie ,>θγ Ito He 31^ nep Leu 7aI Lys Hp He lie AspIto УаХ деп Lye Phe Ito Lye Lye Lys Dye lye Dye Dye LyeLye Lys Lye Dya ce синтезара по нтоде онисан в пре- дания прпкор й aw така се пречиства· Този пеатвд е отведен02 jtiiiJhylococcue ашмпе ) - toxin Ceq IL DCs 3) ίιΧΕ Sin лср He He Ler Ito He Gly AspLeu VaX Dye Trp He Ilo Asp Hu* Val Aon Dye Phe Ito Dye Dyeea койтс e asaeciao, че е специфичен π прншазне apes мембра-ни spr нйсеае рО-стойиостt като юаи певшд е удааев с 10 до-пълнятехни лязкиз· ;ХЕК - кодадшакто се получават като парвоначалнс се саесватС ШСР рСс. Ή — L*iA i A f’O ΑαΑ 23 г И 4 а.Ш? ХтplaCU В 170 МНД КЬ,~>в след 30 штнутя ара стайна хедаература се арлдабят оаоао 3акг зептяд з 170 дал Н3..>, След дава К плаута адаубираае пристайна тадааротуро, дааледсите се саесан с н5 да ДПд + 2 % ГС; и се зрлбазат 453 303 ЛХД 0Х.2 дедатоцатм· Одед 2 часа оепрнЗззят Ζ »4»! (Ι^,Μ.4,·., у ί~0 /i> ГЗл. След 2ч часа след тронвфвнциятасс сабярат даогаатс и са измерва луциферозаот* активност но не-чии опзсав з яредаилте примери· Дуч&amp;^редаота активност се от-нася вя цялостния екстракт и възлага иа лП.иис езотяиннж единици. ЙР5СТ 39 Траасфенцая as хепвтощиа в присъствие да мшштап-поа-тпди с озагодазаиова опаша a G - кран Пептади от пссдедоватедноститв (посока: Н- квд С-крвМ) (3u4 ID РС« 12) Sly He Sly Ala Vai Deu Dye VaX Lett Ito Ito
Sly Leu ?ro Де Leu lie Der Irp lie Lye ияеп ala Dye Dye Dye Dye Dye Dye Dyu Lys Lys Dye - in asl 1) w (Γ.;ς ID roi 13) Sly Π
Sly ,’U να L£U Sltt 7a 1 Lea ilu Thr 31y Leu fro ’.In Leu He Ser Irp He Lye Лг,з Lys
Ar.3 31s Sis Lyc Lye Lye Lye Lyn Lyn Lye Lys Lys Lys (кисели ‘.’утпнти, означени като KCj 2) се СЙН5еЗЙР8Т« както еописано з npw.ep 32. дгйС - комплексите се подуча ват > като първоначално се сме-сят 6 мкг pCbVI. - ДМ з 170 мкл ШК с Л шег Т^р1290 в 170 мкл НЖ и след 30 минути при стайна температура се прибавят около3 мир пептид мед1шш 5 вкр m2 в 170 мкл Ш5>. След ново ин-кубиране в продължение на 30 минути компелксите се смесват с1.5 мл Дмйй ♦ 2 Я РС> и 450 000 BMI CI.2 клетки, която сакултивирани, както е описано в пример 36, се прибавят кш гор-ното. 24 часа след транофекодята клетките се събират и се под-лагат на луцийеразен тест, както вече беше описано. Луцнфораз*вата активност, отнасяща се за цялкя екстракт, възлиза на 9 200светлинни единици (в случая на мел!) и 9 4о0 светлинни единици(а случай на мел 2), 1Ш :.^Р 40 йкспресиране на интерферон алфа в НеХа - клетки Неха - клетки (5 х 10^ клетки за 6 см брпдо) се трансфици- рат е плазмида рА -С Vi-ITH, който кодира за човешки интерфе-йси алфа2с нод контрола на CLV енханеер/промотор - последова-телността (плазмдът е описан в ДВ 40 21 917 А. рАд-СШ-ХГХХсе получава като се реклонира Hisdiii-xbsi iph- > 2с -ивсерат в рАД-СШ). Вън проби от 6 мкг ./UIK в 330 мкл ййО се прибавят 8 мкг Т. ρΐ в 330 мкл НЗ . и се оставят да престоят 30минути при стайно температура. Пробите 6 - хо получават само4 мкг I· рх и след първите 30 минути инаубиране aw пробите 6 - iC> - • · · • · ♦ • · « * »···· « · « й 7 се прибави пс аликзптнг част Р1бр1, (20 ;.агг) з 1С0 жс ш пробите 5, 2 и 10 по ялипасянз част от yly^ 210 (20 кт).глсд пози 20 иипуз·’ нпкубиряне, ос пр”Осзип аликзстнй части от100 мкд НЗ , съдърдзщч 10 r.:o (проби П OJO: 50 пкл (преби 9 н,Ιϋ) свобода ΡΙ0, (зо счнтезета ие ?>б и РЗГрх. ж*к прякор ТЗ).След 30 минутно йпкубпрзив пробите се наносят върху Hole - клет-ки з 2 кл Д020/2 5 РСл в присъствие че сладките допълнителнишаштсненти: Гребне 2, 7 r· ТС лз-рчелат ТОС ид. лгтсрсхия, про-бзте ? и * получават 5 и 15 ?л*л е де но вирус 61312 (I л: 10АС час-дкчки/9л), пробг 5 пелучезз 1г ?л:л от с&amp;тя пссрелен-жктизи-ъстт ълрус. (бате ясптрслс гг стимулирането по екдаенпа иптер-Оерюй-йредкцйл чрез ядекдзарус, дробете П, 12 и И се третя-рет с илшезотг·' -поети от ткруое кекте з 3, б и 5). Дое часе след тдъл:едекцляте се прибавят 5 з;~. приспа среда ".Ш·ддяс 10 1' ?Со къе плетките. 00 часа сте : тренсрекц”ята средатасе стстрепж. л се зеленя е 2 лл пряспа ..... + 10 Д PCs β Тазисреда се събира ?2 чгеа. след '‘•рпчсХекцллтд и се презеяда ДЛоА-тест за определяте ял 1ΓΝ - \ , петте е слжяе з 10’ "Ό 21 917Д. ,*а:ячостсатд ,ОО.л - х (я нг/чл) се посочени пъз 2ттуре г1‘. -> съгласие с пс-рено попрозеп’*тс геблюдения, при използва- не на луцирерозе- или 2-гадатозидаа- penopsepmr гени, Т рХХуакцйошдрс слабо прл траксеер пс Iff 11 - reus в тези клетки.Присъствието на ядерохян де as дсказувг сигнг-л (около 7 игД?з)йребо 2, одсжовирус 61312 етхуяяра 192 - трансфера не начинзависещ от дозировката (проби 3 и 4). Третирането на тези клет-ки със сравнителни золичоотзс зпрус в отсъствие κε 1ГН-Л5К -ясяпдсксл не дава докезуея 1Г2Х - с:тпал (проби II и 12). Траясфбкцпята със синтетичния, от жлденцепептид отведен ен-доаомолитез пептид РХб (вж нриаер 13) като кошогат (проби б и • · Sr • 163 ·" 7) или като йонно на повърхността на TjPI/ДйК - комплекситесвързан пептид (проби 8, 9 и 10, за свързването на пептвда вилпример 37) дава доказуема интерфаронова продукция, която сеусилва с пептидния конюгат в присъствие на хлорохин (проба 7)· - 164 -Таблица ΙΑ Трансфекционни метода
Клетъчен тж Т,р1 Т4р1 + хлорохта комплекс : (А.) (А») хепатоцити йер02 - */- - +А първични - - ниоблаети/ннотуби C2CI2 +/- G8 +А фибробласти зтз + ±йО —13 ♦/- +/- миши Ь-клетки +/- първичниепдотелии клетки свинска аорта +/- Човешка неуробластошю клетъчна линия
Gi-O-H +/- +/- Йе1е клетки + + ~ X6S - .:· · ···' Таблица ΪΑ (яродъослив)Транофекциоани метода Клетъчен тяг. Т р! + свобо- Т pi + свър- £pl + ден аденовирус аан аденовирус инфлу- Piy йошхлекс (8.) сг.) хепатсцити ilopG2 +++ 1П.С12 ++ + + +++++ +++ първични - ++ шобдастя/шштубй С2С12 V- +++++ С8 +/- ++++♦ първични +++ фйбробласта 5Ϊ3 +++ +++++ ++ . о —15 +++++ + миви Ь-клетки + +++++ ++ първични ++++ ендотелни клетки свинска аорта + +++ +/- човешка неуробластоииа клетъчна линия ei-MMi +++ ++++ iiexa клетки +++++ +++++ +++ • · - 166 ~ 1абвде 13
Мави ьз клеткиOGM ьг «е 4 +/- ©ршроадш клето птичи адз ++ кестен возьк мйака пиле +/- Ь37 - трансформирани човешки ь-клетки
йиаа-идазивй© клетъч-на линия (aPCXi.3i2/U ++++ ++++ - 16? -хаблаца χώ (продалеиие) МЙЮ Ь ;> ΚΜΪΚΗ ССД + ++ Ш?чСб ++ +++ ермтреадоа плетем Д562 + +++++ пилешки ад&amp; +++ +++++ постен иеззд мижа - ++ пиле + +++ пп»-2ренсформирапи чсвешса маеш - +++ «шша-шшамбна клетъчнаДИВИЯ Сгй1»Сх1»ОхД/и ++ +++ +/- яуцаферазна активност χύυϋ-ίΟ 000 светлинни единици за 10клетки 6 10 OOG~i0Q св..2.тлцай едниаця1-5 х 10 светлинна единици5-50 2 Кг свс2лгншй единици г.., ·* iv X хи ех-тдгнли едаици + ++ Н+ + , + 1- +++++ иозече от Ки х KiW езстд-ннз единицаТ| pi транеферзн-яейшшзии.адевовируе репжпсацяокнс дефектен адеаовирус CI3I25вфлу-р1у> инфлуенца ПА«с ii-краен аеавд-полализав -» 166 · ··. Таблица 2 Λ ембрананзизни протеинийируеии фузионни протеиниН-крайна фузиокиа лоспедозателност Вируси с обвивно
In* 1 uenas, vir us Hyxeviridae Ш*2 pH 5 Ϊ0Υ ^Ihaacoviridae pM Vaccinievirue 14 kha pH 5 Oeadeivirub Ba ra inf1uenscv .01 pH 7 морбили ЗВДС oarainflueasav, pH 7 81У hetroviridae SP41 рн 7 SI У vGtroviridaQ &amp;p41 pH 7 вируси без сбаивка iolievirae ^nteiOViridae vp1 pH 5 Goxackie virus anteroviriaaa vp1 pii 5 Hhlnovirus vp1 PH 5 white,1990; Taicaha- slii, 1990
Hoekctra, 1390Goag al·» 1390Hoekstre 1990;
Getting ct al., 1978lok&amp;hashl, 1930 tlepushsin et al,, 1992 auysschaert u. yandon-Hranden, 1991;?ranchini, 1989 ^rieke u Hogle, 1990Oethlag et al.,1978 Утрешни фузиониа последователностВируси с обвивка
Oealiki ?aa?est V· lo^aviridae «1 pii 5
Jindbisvirus вируси бев обвивка vp5 white, 1990white, 1990
Hheeue Hotavirus
Hackow et al,, 1986 - 109 - ТабЛлЦВ 2 В Токсини и микроорганизми
Streptolysin о Oti^eptococcueсуяфхядал-акз иаиуая сзързво co с холестеринпори 20-80 mer, 15 am. foren • * >* · » * * • » · · · № кШ pH 7 Kehoe et al.t 1987
Liateriolysin 0 L.aonocytogenes 60kDa pH 5 Geoffrey et al.t 1 сулфвдрия-а u s s опрансаъпззз co o нслоотеризсроден o С9 л jsysiiTOoaffi a” ТОКСИН staphylococcus поз-ьркдост b -sheet Οί,,ζ'ίί'ί/ρδ « хекоажига ьзнзки 2 са йФ Хемолизин соц 34 kDa pH 7 8 exaphip. Helixes -ЛНШЛЙЗИН i’l’ypenosona cruzi8Я8Д0ГИЯ С порВсринисроден с С9 Лнутга система не гршгачни
Perforin I, ’ СТОКСИЧЙЙ Т-КЛСТКИСа^-зсвясеци licnbrun insert ion
Complement 03 (.. ..е C5be 31-4) кух протеинов цллиадзр 10 II’i Гл18Д зиеоко-регузгараиа активност 1987 416 дд pH 7 Gropeaa-Werfcerle et al<, 1992 75 кое pH 5 Andrews et ai.t1990
Ohakdi u iranua-Jecsec» 1991Kaser,1391 - 170 Таблица 2 В (продължение) spenaiua “"Я^вв-Фузиокен протеин№50 > -пододиница на рй 7 31оЬ«1 et el·» повърхностния протеин,вътрешно Фузионнапоследователност 1992 ***-
- 171 -Таблица 2 C ^омбранактивни пеатвди Защитни токсини
Melittin 26аа amph· χ -Nelix Blondelle u« Hou- пчелна отрова Boabolitin Гго_ усукан 17АА aaph. х -Helix ghten, 1991t Demp-sey et el.t 1991? Dctsra u. Inegaki 1991 Argiolse u Pisano· отрова на sausa пчела 1985 Hastoperan 14АА amph· х -Helix Argiolae u Pisano, отрова не оса 1985 Crabrolin 13АА amph. 4ielix Argiolas u Pisano, отрова на старея 1985 Pardaxin ЗЗАА amph. \ -Helix Shai et si·, 1990 реполевт за авузяАвтибактераални аептида
Sarcotoxin ΙΑпасва куха (в хевояшхИ)
Ceeropins 37 АА aaph. ^ -Helix Esaer, 1991 жнеекти ρρθ.. усукан (хуморалнл ицуаяа сиотеив» копринен молец)
Maganin 23АА asaph· ·*-Helix Marion et al·, K°aeBXeaopue leeirle 1988
Alanetioin 15-24AA aaph* Л -Helix Baser, 1991
Fungus (Trichoderme viride)бактериални токсиаа лева киселина
IV - Toxin 2бАА amph. .-x-Helix Thiaudiere et al.,1991 { • « · · · · ··· · - 172 · Геилица 2 С (продължение)
Staphylococcus auress киселинно вдцарен Alouf et alef19*9 АдоеЬарог 25АА aaph. > -Helix Lelppa at al., 1991
Sntaooebe histolytica киселинно ивдциран Дмуина систена на гръбначни
Defeoeine 29-ЗШ -sheet Lehrer at al·» авомядреаа веугро$или (SS. иос«) 1991 • · - 173 179
Tab. 3 Таблица 3
Трансфекция наTransrektion von(б pg pCMV-L DNA BNL CL.2 w, 4 pg TfpL290) pLys o pg 0.3 pg 1 pg 3 pg 10 pg 20 pg 30 pg o pg P50cfim GLF Mefittin 160 330 490 0 540 290 0 300 340 0 70 425 4 pg PSOdim GLF EALA 3100 670 3 140 200 600 150 430 170 560 180 410 10 P9 P50dm GLF EALA 5 700 1 950 2120 16 600 16 600 217 000 179 300 760 215 000 181 700 1 330 1 980 76 360 3 424 800 20 pg P50dim GLF EALA Melfttin 3 200 23 300 418 400 191 000 6 545 185 100 320 600 181 000 7 054 800 294 200 273 600 9 344 000 \ Desoxy- choBcadd 6 730 34 700 16 000 • Oleic acid 12 200 11 900 4 100 • · • · ··· ··· ··· ··· · ··· · ··· _ _ · ······ ······ ······· 180 ..... . .***** ··· · ·· · ·· · - 174 - ЛИТЕРАТУРА
Literatur:
Abrahamson, D.R. et al., 1981, J. Cell Biol., 91, 270-280.
Akopian, T.A. et al., 1991, Nucl. Acids Res. 19, 424.Alouf, J.E., Dufourcq J., Siffert 0., Thiaudiere E. und
Geoffroy Ch., 1989, Eur. J. Biochem. 183, 381-390.
Anderson, P. et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 11301-11304.
Andrews, N.W., Abrams C.K., Slatin S.L. und GriffithsG., 1990, Cell 61, 1277-87.
Ansardi, D.C. et al., 1991, J. Virology 65, 2088-2092.Argiolas, A. und Pisano J.J., 1985, J. Biol. Chem. 260, 1437-1444.
Armentano, D., Yu, S., Kantoff, P., von Ruden, T.,
Anderson, W.F. und Gilboa, E., 1987, J. Virol. 61,1647-1650.
Armentano, D. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87, 6141-6145.
Asada-Kubota, M. et al., 1983, Exp. Pathol., 23, 95-101.
Ascoli, M. et al., 1978, J. Biol. Chem., 253, 7832-7838.
Ashwell, G. et al., 1982, Annu. Rev. Biochem.·, 51, 531-554.
Atherton, E., Gait, M.J., Sheppard, R.C. und Williams,B.J., 1979, Bioorg. Chem. 8, 351.
Barr, E. und Leiden, J., 1991, Science 254, 1507-1509.Bartlett, G.R., 1959, J. Biol. Chem. 234, 466.
Berkner, K.L., 1988, BioTechniques 6, 616-629.
Berns, K.I., 1990, Virology, 2nd Edition, Ed. by
Fields, B.N., Knipe, D.M. et al., Raven PressLtd., New York, 1743-1759.
Bhakdi, S. und Tranum-Jensen J., 1991, Immunology today12, 318-320.
Blau, H. et al., 1985, Science 230, 758-766. - 175 -
Blobel, C.P., Wolfsberg T.G., Turuck C.W., Myles D.G.,Primakoff P. und White J.M., 1992, Nature 356,248-252.
Blondelle, S.E. und Houghten R.A., 1991, Biochemistry30, 4671-4678.
Bondeson, J., Wijkander, J. und Sundler, R., 1984,Biochim. Biophys. Acta 777, 21-27.
Boulanger, P.A. und Puvion, F., 1973, Eur. J. Biochem.39, 37-42.
Bragg, R.R. et al., 1991, Onderstepoort J. Vet. Res. 58, 309-310.
Carpenter, G., 1984, Cell, 37, 357-358.
Chardonnet, Y. und Dales, S., 1970, Viology 40, 462-477.
Cheng, S-Y. et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77, 3425-3429.
Ciliberto, G., Dente, L., Cortese, R., 1985, Cell 41,531-540.
Clarke, D.D., Mycek, M.J., Neidle, A. und Waelsch, H.,1959, Arch. Biochem. Biophys. 79, 338-354.
Collis, P., Antoniou, M. und Grosveld, F., 1990, EMBOJ. 9, 233-240.
Cotten, M., Laengle-Rouault, F., Kirlappos., H.,
Wagner, E., Mechtler, K., Zenke, M., Beug, H., undBirnstiel, M.L., 1990, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87,4033-4037.
Davidson, D. und Hassell, J.A., 1987, J. Virol. 61,1226-1239.
Davis, B.D. und Dulbecco, R., 1980, Microbiology, 3rdEdition, Ed. by Davis, B.D. et al., Harper &amp; Row,Sterilization and Disinfection, 1263-1274.
Defer, C., Belin, M., Caillet-Boudin, M. und Boulanger,P., 1990, J. Virol. 64, 3661-3673.
Dempsey, C.E., Bazzo R., Harvey T.S., Syperek I.,
Boheim G. und Campbell I.D., 1991, FEBS Lett. 281,240-244. - 176 -182 • · · · * · · ·· · · · · » ··· ···· · · ····· · ······· • · · · · · • · · · · · ·
De Wet, J., Wood, K., DeLuca, M., Helinski, D. und
Subramani, S., 1987, Mol. Cell. Biol. 7, 725-737.
Dhawan, J. et al., 1991, Science 254, 1509-1512.
Donti, E. et al., 1988, Cancer Genet. Cytogenet. 30, 225-231.
Dulbecco, R., 1980, Microbiology, 3rd Edition, Ed. byDavis, B.D. et al.. Harper &amp; Row, The Nature ofViruses, 853-884.
Eaton, D.L. et al., 1986, Biochemistry 25, 8343-8347.Esser, A.F., 1991, Immunology today 12, 316-318.
Fields, B.N. und Knipe, D.M., 1990, Virology, 2nd edition, Raven Press, Ltd., New York.
FitzGerald, D., Padmanabhan, R., Pastan, I. undWillingham, M., 1983, Cell 32, 607-617.
Folk, J.E., 1985, Methods Enzymol. 113, 358-375.Franchini, G., 1989, Science 244, 694-697.
Fricks, C.E. und Hogle J.M., 1990, J. Virol. 64, 1934- 1945.
Fujiwara, et al., 1981, J. Immunol. Meth. 45, 195.Geoffroy, C., Gaillard J.-L., Alouf J.E. und Berche P., 1987, Infection and Immunity 55, 1641-1646.
Gething, M.J., White J.M. und Waterfield M.D., 1978,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 2737-2740.
Ginsberg, H.S., 1980, Microbiology, 3rd Edition, Ed. byDavis, B.D. et al., Harper &amp; Row, Picornaviruses,1095-1117.
Goldmacher, V.S., Biattler, W.A., Lambert, J.M.,
McIntyre, G. und Steward, J., 1989, MolecularPharmacology 36, 818-822.
Goldstein, J.L. et al., 1982, Clin. Res., 30, 417-426.Goldstein, J.L. et al., 1979, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 76, 333-337.
Goldstein, L.J. et al., 1980, Nature 285, 66
Gong, S., Lai C. und Esteban M., 1990, Virology 178,81-91.
Green, M. et al., 1989, Cell 58, 215-223. • · - 177 - 1 QO · · · · · · · хоо ··· · ·· · ·· ·
Hearst, J. E. und Thiry, L., 1977, Nucl. Acids Res. 4,1339-1347.
Heldin, C-H. et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 4216-4221.
Helene, C. und Toulme J.-J., 1990, Biochem. Biophys.Acta 1049, 99-125.
Herskowitz, I., 1987, Nature 329, 219.
Hizuka, N. et al., 1981, J. Biol. Chem., 256, 4591-4597.
Hoekstra, D., 1990, J. Bioenerg. Biomembr. 22, 121-155Holland, J.J., 1990, Virology,2nd Edition, Ed. by
Fields, B.N., Knipe, D.M. et al., Raven PressLtd., New York, Defective Viral Genomes, 151-165.
Horvath, J. et al., 1988, J. Virol. 62, 341-345.Horwitz, M.S., 1990, Virology, 2nd Edition, Ed. by
Fields, B.N., Knipe, D.M. et al., Raven PressLtd., New York, Adenoviridae and theirreplication, 1679-1721.
Hosang, M. et al., 1987, ΕΜΒ0 J., 6, 1197-1202.
Huang, A.S., 1987, The Molecular Basis of Viral
Replication, Ed. by Bercoff, R.P., Plenum PressNew York and London, The Role of DefectiveInterfering (DI) Particles in Viral Infection,191-194.
Ikura, T., Go N. und Inagaki F., 1991, Proteins 9, 81-89.
Imamura, K. et al., 1987, J. Immunol., 139, 2989-2992.Iwanij, V., 1977, Eur. J. Biochem. 80, 359-368.
Jones, N. und Shenk, T., 1979, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 76, 3665-3669.
Jung, et al., 1981, Biochem. Res. Commun. 101, 599.Kaplan, J. et al., 1979, J. Biol. Chem., 254, 7323- 7328.
Kasid, A., Morecki, S., Aebersold, P., Cometta, K.,Culver, K., Freeman, S., Director, E., Lotze,M.T., Blaese, R.M., Anderson, W.F. und Rosenberg, • · · 184 - 178 - S.A., 1990, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87, 473-477.
Kehoe, M.A., Miller L., Walker J.A. und Boulnois G.J.,1987, Infect. Iirnnun. 55, 3228-3232.
Keller, G., Paige, C., Gilboa, E. und Wagner, E.F., 1985, Nature 318, 149-154.
Khang, C. und Nagaraji. K.V., 1989, Am. J. Vet. Res. 50, 1466-1470.
Klausner, R.D. et al., 1983, J. Biol. Chem., 258, 4715-4724.
Klausner, R.D. et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA80, 2263-2266.
Kuhn, L.C. et al., 1982, Trends Biochem. Sci., 7, 299-302.
Kurachi, K., Davie, E.W., 1982, Proc. Natl. Acad. SciUSA 79, 6461-6464.
Laver, W.G. et al., 1971, Virology 45, 598-614.
Lehrer, R.I., Ganz T. und Selsted M.E., 1991, Cell 64, 229-230.
Leippe, M., Ebel S., Schoenberger O.L., Horstmann R.D.und Miiller-Eberhard H.J., 1991, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 88, 7659-7663.
Lim, K. und Chae, C.B., 1989, BioTechniques 7, 576-579.Luthmann, H. und Magnusson, G., 1983, Nucl. Acids Res. 11, 1295-1308.
MacDonald, R.C. et al., 1991, Biochim. Biophys. Acta1061, 297-303.
Macgregor, G. und Caskey, C.T., 1989, Nucl. Acids Res.17, 2365.
Mackow, E.R., Shaw R.D., Matsui S.M., Vo P.T., Dang M.N. und Greenberg H.B., 1988, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 85, 645-649.
Madshus, I.H., Olsnes, S. und Sandvig, K., 1984,Virology 139, 346-357.
Malim, M. et al., 1989, Cell 58, 205-214.
Maniatis, T., Fritsch, E.F. und Sambrook, J. (1982)
Molecular Cloning A Laboratory Manual. Cold Spring • ·
Harbor Laboratory, 474.
Marion, D., Zasloff M. und Bax A., 1988, FEB 227, 21.Marshall, S., 1985, J Biol. Chem., 250, 4133-4144.Massague, J. et al., 1986, J. Cell. Physiol., 128, 216· 222.
McClure, M.O., Sommerfelt, M.A., Marsh, M. und Weiss,R.A., 1990, J. General Virol. 71, 767-773.
Mellman, I.S. et al., 1984, J. Cell Biol., 98, 1170-1177.
Mizel, S.B. et al., 1987, 1987, J. Immunol., 138, 29062912.
Ojcius, D.M. und Young J.D., 1991, TIBS 16, 225-229.Oropeza-Werkerle, R.L., Muller S., Briand J.P., Benz R., Schmid A. und Goebel W., 1992, Mol. Microbiol6, 115-121.
Otero, M.J. und Carrasco, L., 1987, Virology 160, 75-80.
Pacini, D.L. et al., 1984, J. Infect. Dis. 150, 92-97.Parente, R.A. et al., 1990, Biochemistry 29, 8720-8728Patek, P.Q., Collins, J.L. und Cohn, M. 1978, Nature 276, 510-511.
Ponder, J.P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991,88, 1217-1221.
Posner, B.I. et al., 1982, J. Cell Biol., 93,. 560-567.Precious, B. und Russell, W.C., 1985, Virology, ed.
Mahy, B.W.J., IRL Press, Oxford, Washington, DC,193-205.
Rafalski, M., Lear, J.D. und DeGrado, W.F., 1990,Biochemistry 29, 7917-7922.
Reece, R.L. et al, 1987, Aust. Vet. J. 64, 365-367.Riordan, J.R. et al., 1989, Science, 245, 1066-1073.Rosenberg, St.A. et al., 1992, Human Gene Therapy 3, 75-90.
Ruysschaert, J.-M. und Vandenbranden M., 1991, BiochemBiophys. Res. Commun. 175, 872-879.
Sambrook, J. et al. (Eds.), 1989, Molecular Cloning, • · - 180 186 • · · · · · · • · · ··· · ♦ · · ···· · · · ···· · ··* ···· • · · · · · • · ·· · ·· · 2nd Edition, Vol. 3, 16.39-16.40.
Schalch, D.S. et al., 1986, Endocrinology, 118, 1590-1597.
Sennett, C. et al., 1981, Annu. Rev. Biochem., 50,1053-1086.
Seth, P., FitzGerald, D., Ginsberg, H., Willingham, M.und Pastan, I., 1984, Mol. Cell. Biol. 4, 1528-1533.
Severne, Y., Wieland, S., Schaffner, W. und Rusconi, S., 1988, ΕΜΒ0 J. 7, 2503-2508.
Shai, Y., Bach D. und Yanovsky A., 1990, JBS 265,20202-20209.
Sharon, N., 1987, Cell Separation: Methods and SelectedApplications, Vol. 5, Academic Press Inc., pp.13-44.
Silver, L. et al., 1988, Virology 165, 377-387.
Sipe, D.M. et al., 1991, J. Biol. Chem. 256, 3469-3474.Skern, T. et al., 1984, Virology 136, 125-132.Slepushkin, V.A., Andreev S.M., Siderova M.V., Melikyan G.B., Grigoriev V.B., Chumakov V.M., GrinfeldtA.E., Manukyan R.A. und Karamov E.V., 1992, AIDS 4Res. Human Retroviruses 8, 9-18.
Sly, W. et al., 1982 , J. Cell Biochem ., 18, 67-85 Smith, K.A. et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 864-867. Stahl, P.D. et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. 75, 1399-1403.
Straubinger, R.M. und Papahadjopoulos, D., 1983, Meth.Enzymol. 101, 512-527.
Strauss, W. und Jaenisch, R., 1992, EMBO J. 11, 417-422.
Subbarao, N.K. et al., 1987, Biochemistry 26, 2964-2972.
Sullenger, B.A. et al., 1990, Cell 63, 601-608.Svensson, U., 1985, J.Virol., 55, 442-449.
Szoka, F. und Papahadjopoulos, D., 1978, • · - 181 - 137 * · · • · · · • · · · · · • · · · · • · · · · · ·
Proc.Natl.Acad.Sci. USA 75, 4194-4198.
Takahashi, S., 1990, Biochemistry 29, 6257-6264.Takayama, K.M. und Inouye, M., 1990, Critical reviews in Biochem. and Mol.Biol. 25, 155-184.
Takese, K. et al., 1990, Nippon Juigaki Zasshi 52, 207-215.
Thiaudiere, E., Siffert 0., Talbot J.-C., Bolard J.,
Alouf J.E. und Dufourcq J., 1991, Eur. J. Biochem.195, 203-213.
Trono, D. et al., 1989, Cell 59, 113-120.
Uchida, Y., Tsukada, U. und Sugimori, T., 1977, J.Biochem. 82, 1425-1433.
Urakawa, T., et al., 1989, J. Gen. Virol. 70, 1453-1463.
Valerio, D., Mclvor, R.S., Williams, S.R., Duyvesteyn,M.G.C., Van Ormondt, H., Van der Eb, A.J., Martin,D.W. Jr, 1984, Gene, 31, 147-153. van Oostrum, J. und Burnett, R.M., 1985, J. Virol. 56,439-448.
Wagner, E., Zenke, M., Cotten, M., Beug, H. und
Birnstiel, M.L., 1990, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87,3410-3414.
Wagner, E., Cotten, M., Foisner, R. und Birnstiel, M.L., 1991a, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88,· 4255-4259.
Wagner, E., Cotten, M., Mechtler, K., Kirlappos, H. undBirnstiel, M.L., 1991b, Bioconjugate Chemistry 2,226-231.
Walker, F. et al., 1987, J. Cell Physiol., 130, 255-261.
Walker, R.D. et al., 1989, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86,9514-9518.
Walls, E.V. und Crawford, D.H., 1989, Lymphocytes, apractical approach, G.G.B. Klaus, Ed., IRL pressOxford, 149-162
Watson, J.D., et al., 1987, Mol. Biol, of the Gene, 188
• · ··· · ·· · ·· ·
Benjamin/Cummings Publ. Company Inc., 676-677.
Wharton, S.A., Martin, S.R., Ruigrok, R.W.H., Skehel, J.J. und Wiley, D.C., 1988, J. Gen. Virol. 69,1847-1857.
White, J.M., 1990, Annu. Rev. Physiol 52, 675-697Wilchek, M. et al., 1988, Anal. Biochem. 171, 1.
Wilson, J.M., Danos, 0., Grossman, M., Raulet, D.H. und
Mulligan, R.C., 1990, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87,439-443.
Willumsen, N.J., Davis, C.W. und Boucher, R.C., 1989,
Am. J. Physiol. 256 (Cell Physiol. 25), 1033-1044.
Wood, W.I., Capon, D.J., Simonsen, C.C., Eaton, D.L.,Gitschier, J., Keyt, B., Seeburg, P.H., Smith,D.H., Hollinshead, P., Wion, K.L., Delwart, E.,Tuddenham, E.G.D., Vehar, G.A., Lawn, R.M., 1984,Nature, 312, 330-337.
Wu, R., Yankaskas, J.R., Cheng, E., Knowles, M.R. undBoucher, R., 1985, Am.Rev.Respir.Dis. 132, 311-320.
Wu, G.Y. und Wu, C.H., 1987, J. Biol. Chem. 262, 4429- 4432. Wu, G.Y. und Wu, C.H., 1988, J. Biol. Chem. 263, 14621 14624. Yankaskas, J.R., Stutts, M.J. , Cotton, C.U. , Knowles, M.R., Gatzy, J.T. und Boucher, R.C., 1987,
Genetics and Epithelial Cell Dysfunction in CysticFibrosis, Alan R. Liss, Inc., pp. 139-149.
Yankaskas, J.R., Haizlip, J.E., Conrad, M., Koval, D.,Schlegel, R. und Boucher, R.C., 1991, Am. Rev.Respir. Dis. 143, A139.
Zamecnik, P.C., Goodchild, J., Taguchi, Y. und Sarin, P.S., 1986, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83, 4143-4146.
Zatloukal, K., Denk, H., Lackinger, E. und Rainer, I.,1989, Lab. Invest. 61, 603-608.
Zenke, M., Steinlein, P., Wagner, E., Cotten, M., Beug,H. und Birnstiel, M.L., 1990, Proc.Natl.Acad.Sci. -183 189 ·· · • · · • * е · • · · · · • · · ·· · USA 87, 3655-3659.
Zon, G., 1988, Pharmaceut. Research 5, No.9, 539-549.Remington’s Pharmaceutical Sciences, 1980, Mack Publ.
Co., Easton, PA, Osol (ed.).
Trends Pharmacol. Sci. 10, 1989, 458-462. • · · » * · к · · · • а · а · · « мяйнг на поснвдомдааостта (II) Заглавие изобретението: Състав за навеждане на комплек- си аа нуклеинови клссяини в по-васш! еукараотняклетки (III) ЬроМ аз последователностите: 13 (IV) Компютърна форма на четене: (А) медиум тайп: Флопи да С(В) кошизтьр: IBM PC съвместим (С) опериране еавмш: pc-dos/ib-dos (Д) софтуер: patentls 5|1им 1.0, Version - 1.25 (оо)
(2) Лнфориация за последователност 1 I (I) Характеристика не последователността: (А) Дзднинах 23 аминокиселини (В) Тип: аминокиселина (С) форма на вернгата: единична верига (Д) топология: двете С (II) Вид на молекулата: пептид (XI) описание на последователността: m ко»ъ
Olj Lea Ню Slu Ala He Ala Sly phe lie 31a Asa Gly Xz> 1 5 10 31a Gly Met He Asp Gly Sly Sly Cye 15 20 (2) Знформация за последователност й 2s (I) Характеристика на последователността: (А) дължина: 23 аминокиселини (В) тип: Ашнюкаселивв * β* -185- ....... (С) форми на веригата: едлшяно веригаСД) топология: двета (II) вид на молекулата: пептад (XI) описание аа последователността: skq id boi2«
Gly Deti Phe GXy Ale lie Ala GXy Phe Ila Slu Asa Gly Trp1 5 10
Olu Gly Hat Xie Asp Gly Gly Gly Cye 15 20 (2) лкформация за последователност 3 (1) Характеризиране на последователността: (А) ддаагаа: 26 аминокиселини (3) тип: аминокиселини (С) форма на веригата: единична верига СД) топология: двете (11) Вид на молекулата: пептад (XI) описание на последователността: да id во»з«
Mat Ala Gia Asp lie lie Ser Tfar He Gly Asp lieu Vfcl Dye15 10
Trp Xie Xie Asp Thr Tai Aao Dye Phe Thr Dye Dye15 20 25 (2) Днфоривцвя за последователността L* 4: (I) Характеризиране на последователността: (A) дълзшна: 36 аминокиселини (B) тип: аминокиселина (C) фор^ла па веригата: единична аерагаСД) топология: двета (II) Естество на молекулата: пептад (XI) описание на последователността: id во«4* 186
Met Ala Gio Asp lie lie Ser Thr lie Gly Aap Leu Val lys 1 5 10 Tpr lie He Asp Phr Val Asn Lyo The Thr Lys Lya Lye lya 15 20 25 Lys lya lys lye Lys Lys Lya Lya 35 35 (2) информация за последователността В 5: (1) Характеризиране на последователността: (А) двойна: 34 аминокиселини 'Ш· (з) тип: аминокиселина (С) форма на веригата: единична верига (Д) топология: двете (II) Зотество на молекулата: пептид (XI) описание иа последователността: ж Ιβ ко,5»
Trp Glu Ale Ala Leo Ala Glu Ale Leu Ala Glu Ala Leu Ala 1 5 Ю
Glu Hie Leo Ala Glu Ala Leu Ala Gio Ala Leo Gio Ala Leu 15 20 25
Ala Ala Gly Gly Ser Cye 30 (2) Информация за последователност te 6: (I) Характеризиране на последователността: (А) дъяаина: 35 аминокиселини (3) тип: аминокиселина(С) форма на веригата: единична верига(Д) топология: двете (II) Зид нз молекулата: пептид(XI) Описание на последователността: SMQ ID B0s6s - 18? - .:. - .- . .,· .
Gly leu Fbe Gly Ale Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu 15 10
Ala Glu His Leu Ala Git Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala 15 20 25
Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cya 30 35 (2) Информация за последователност fe ? (1) Характеристика на последователността: (A) дължина: 35 аминокиселини (B) тип: аминокиселина (C) форма на веригата: единична верига (4) топология: двете (11) Естество не молекулата: пептид СИ) Описание на последователността: ssq id no«?t
Gly Leu the Gly Ala Leu Ala Glu Ale Leu Ala Glu Ala Leu1 5 10
Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala15 20 25
Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cya 30 35 (2) Днуормация за последователност № 6 (X) Характеристика на последователността: (A) дължина: 34 аминокиселини (B) тип: аминокиселина (C) Форма нп веригата: единична верига (4) топология: двете (XX) Естество на молекулата: пептид (XX) Описание на последователността: seq id κοιβι • · 188
Sly Leu Phe Olu Leu Ala Glu Ala Leu Ala Slu Ale Leu Ala1 5
Slu Ala Leu Ala Slu Ale Leu Ala Glu Ala Leu Slu Ala Leu15 20 25
Ale Ala Sly Sly Ser Cye 30 (2) Днформация за последователност 9 (1) Характеризиране на последователността: (А) дьдмииа: 54 аминокиселини (з) тип: аминокиселина (С) шорна на веригата: единична верига (Д) топология: двете (11) Вотеетно на молекулата: пептид (XI) Описание на последователността: ssq id soi9i
Gly Leu Phe Sly Ale He Ale Sly Ph® lie Slu Asa Sly Trp1 5 Ю
Slu Gly Leu Ale Slu Ala Leu Ale Slu Ala Leu Slu Ala Leu15 20 25
Ala Ala Sly Sly Ser Qye 30 (2) Информация за последователност &amp; ΙΟ (I) Характеризиране на последователността: (А) дължина: 34 аминокиселини (3) тип: аминокиселина (С) форма на веригата: единична верига (Д) топология: двете (II) ьстество на молекулата: пептид (XI) Описание на последователността: ID ΚΟί ι0# • · - 189 - • · • · · · · * • <l· * « • · • · · · • • · « e • · Gly Leu Pile Glu Ala lie Glu Gly ?he lie Glu Aon Gly Trp 1 5 10 Glu Gly Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu 15 20 25 Ala Ala Gly Gly Ser Cye 30 (2) Информация за последователност ΰ IX: G) Характеризиране не последователността: (А) дьзшша: 23 аминокиселини (β) тип: аминокиселина (С) форма па веригата: единична верига (Д) топология: двете (XX) Естество на молекулата: пептид (XX) Описание на последователността: s&amp;a ΐΰ но»lit
Gly Leu Pba Glu AX© He Glu Gly ?he lie GXu Aen Gly Trp1 5 10
Glu Gly Met lie Aep Gly Gly Gly Cye 15 20 (2) Лвформацин за последователност te 12: (X) Характеризиране на последователността: (А) долина: 36 аминокиселини (β) тип: аминокиселина (С) ферма па веригата: единична верига (Д) топология: двете (XX) Естество на молекулата: пептид (XX) Описание на последователността: ю по»12»
Gly He Gly Ala Val Leu Lye Val Leu № Thr Gly Leu Pro 10 25 - 190 -
Ala bail XI© Ser Trp lie bye Arg bye Arg Gin Gin Lye bye15 20 bye bye bye bye bye Iy)s bye bye30 35 (2) лвформация за последователност 13(1) Характеризиране на последователността: (А) докиаа: 36 аминокиселини(в) тип: аминокиселина(С) форма на веригата: единична верите(Д) топология: двете (XX) Естество на молекулата: пептид (XX) Описание на последователността: seq id kq»13iGly Xie Gly Ala Val Leu ftlu Val Leu Glu Thr Gly Leu Pro 10
Ala Leu He Ser Trp llle Lys Arg bye Arg Gin Gin lye lye 15 25
Lye lys bye bye bye lys Lys bye 30 35

Claims (66)

  1. X Патентни претенции 7 X» Състав за трансфекция не αο-внсвн еукариотнм клетки скомплекс от нуклеинова киселина и вещество с афинитет към нук-леивоза киселина, което е евентуално конюгирано с интерналиаи-ращ фактор за този клетки, характеризиращ се с това· не садър- Гг^Л-С pS? ί&amp;- да средство, което притежава способиостта,4й2е по-наншкгоикато съставка на нуклеинова киселина - комплекса, да се приема t li т\ . Π ·· ί от клетките които ще се траноф!щирет и садърлоиието на ендзво-митс» в конто комплекса след навлизането в клетките се локали»зир^, де се освободи в цитопдазната» 2· Състав съгласно претенция 1, характеризираш се с това»че ендозошшат^Йтесредство е вирус или вирусна компонента» кол-то съответно по начало е интернализирац факторна клетвите» \! 3. Състав съгласно претенция X» характеризиращ се с това,че еадозомолитното средство яма нуклеинова киселина'«свърсващдомен или е свързано вън вещество с афинитет към нуклеиновакиселина и проявява способността като съставка на коиюгат/ну-кяенвава киселина - комплекса да се приема от клетките» прикоето комплекса съдъряа езееделно допълнителен интернализиращфактор за клетките*
  2. 4. Състав съгласно претенция 3» характеризиращ се с това» ΤΛ. че ендозомолитното средство е свързано ковалентно кш веществос афинитет към нуклеинова киселина» , / 5» Състав съгласно претенция 3» характеризиращ се с това» v пг че ендозомолитното средство е свързано не-ковалентно към ве-ществото с афинитет кш нуклеинова киселина.
  3. 6. Състав съгласно претенция 5» характеризиращ се е това» • · • · че връзката се осъществява през бистин - стрептавадинов мост.
  4. 7. Състав съгласно претенция 5« характеризиращ се с това» [/ че свързването е йонно· 8« Състав съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че ендозомслитното средство е свързано към веществото с зфинн- £ \ -Сч. тет към нуклеинова киселина директно през(нуклеиж)ва киселина-езързвеж домен.
  5. 9. Състав съгласно претенция 3, характеризиращ се с това. че ендозсмслитното средство е вирус или вирусна компонента.10· Състав съгласно претенции 2 или 9, характеризиращ се е това, че ендозомслитното средство е адекозирус.
  6. 11. Състав съгласно претенция 10, характеризиращ се с това,че аденовируоа е мутант· 12· Състав съгласно претенция 11, характеризиращ се с то-ва, че аденовируоа е репликациоино янкомпетентек мутант. 13· Състав съгласно претенция 12, характеризиращ се с това,че аденовируоа има ежа яли повече мутации и/или деле4вцни ве!а - региона·
  7. 14. Състав съгласно претенция 10, характеризиращ се с то-ва, че адено вируса е инактивирея· 15· Състав съгласно претенция 14, характеризиращ се с то-ва, че аденовируса е инактивиран чрезкъсйълновнда.
  8. 16. Състав * се с то-
    ва, че аденоваруса е инактивиран чрез Ж^псорален. 17» Състав съгласно претенция 14, характеризиращ се с то-ва, че аденовируса е инактивиран чрез форюлдехид. 18· Състав съгласно претенция 5, характеризиращ се с то-ва, че вирусната компонента се състои от един или повече аде- новирусни протеини· • · - 3 -
  9. 19. Състав cwnecHO претенция 2 или 9, характеризиращ сес това» че чевируса е пжорнавирус.
  10. 20. Състав съгласно претенция 19» характеризиращ се с то-ва» че аикорнавируса е Овеятуалае инаятизиран риновирус.
  11. 21. Състав съгласно претенция 3» характеризиращ се с to- ut за, че ендозонолитното средство не е по начало интераадизаращке/ о — Hh-uAi ь/актор/зПглетките и че нуклеиевг киселина * комплекси седър-38 освен това инторнализиращ Фактор за таза клетка» който есвързан кш вещество с афинитет къп нуклеинова киселина.
  12. 22. Състав съгласно претенция 21» характеризиращ се с то-ва» че ендозоколитното средство е вирус или вирусна компонента»които съответно но са интернализиращ фактор за човешка клетва.
  13. 23. Състав съгласно претенция 22» характеризиращ се с то-ва» че ендозонолитното средство е вирус» които е инфекциозенза зид,различен от човека.
  14. 24. Състав съгласно претенция 23» характеризиращ се с то-ва» че вируса е аденозирус.
  15. 25. Състав съгласно претенция 24» характеризиращ се с то-ва» че аденовируса е птичи аденовирус.
  16. 26. Състав съгласно претенция 25, характеризиращ се е то-ва» че зденовируса е сьше^ийнрув"ietM. огрЬаа, r < jLu-C |2г_еГТ4- , 2?« Състав съгласно претенция 21, характеризиращ ое с то-ва» че ендозополитното средство е евентуално кодифициран, ен- иЖ ύ дозомолитв®] вирусен пиптид.
  17. 28. Състав съгласно претенция 27, характеризиращ се с то- 1 ε-ΑΛ'Υχίί-Η- ва, че ендозомолатния1 пептвд е инфяуенца^хеуаглутинии НА2 мпептид.
  18. 29. Състав съгласно претенция 28» характеризиращ се с то-ва» че пептида има последователността sly-Leu-fhe-Giu-Ala-iie- Ala-Gly-Phe-Ile-Glu-Aen-Gly-Trp-Glu-Gly-4iet-Ile-Aep-Gly-Gly" Gly-Cys. 30· Състав съгласно претенция 28» характеризиращ се с το-за, че пептида има последователността oiy-b©a±?be-Giy-Aia-Xle-Ala-Gly-rbe-lle-Glu-Aaa-Gly-Txp-Gla-GlyMylet-Xle-Asp-Gly-Gly-Gly-Cye. 31· Състав съгласно претенции 21» характеризиращ се е то- \л и 0 V^tt0fcAUU<r^4H? па» че евдозомоявтното средство е не-вирусно/^евентуално коди-фициран природен или синтетичен пептвд.
  19. 32. Състав съгласно претенция 31» характеризиращ се с то-ва че пептяда притежава последователността Giy-Leu-Pbe-Glu-Aia- Ile-Glu-Gly-Phe-Ile-Glu-Aen-Gly-Tpp-Glu-aly-aet-Ile-Asp-Gly- Gly-Gly-Cya.
  20. 33. Състав съгласно претенция 31, характеризиращ се с то-ва» че пептида представлява хомо- яли хетеродимер на определе-ния в претенция 32 пептид.
  21. 34. Състав съгласно претенция 33, характеризиращ се с то-ва, че пептида е хомодимор.
  22. 35. Състав съгласно претенция 33, характеризиращ се с то-ва, че пептида е хетеродимер с последователността aiy Leu рьеGlu Ala lie Ли Gly Ph® 11« Glu Ааи Gly Xrp Glu Gly Leu AlaGlu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ale Ala Gly Gly Ser Gye
  23. 36. Състав съгласно претенция 31, характеризиращ се с то-ва» че пептида притежава последователността тгр Glu Ala Ala LeuAle Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Hla Leu Ala Glu Ala GluAla Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Sea? Cye.
  24. 37. Състав съгласно претенция 31, характеризиращ се е то-ва че пептида притежава последователността ®1у Leu ?he Gly Ala Leu Ala Gia Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His Leu Ala GluAla Glu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Gly Gly Ser Cye. 38· Съотв съгласно претенция 27 или 31» характеризиращ сес това, на пептида притеетвв нуклеинова киселина - свързващ домен·
  25. 39. Състав съгласно претенция 38, характеризиращ се с тоза, че пептида има одиголизиново удължение.
  26. 40. Състав съгласно претенция 3 или 21, характеризиращ сес това, че интернализиращият фактор е трансферен. 41· Сьетаз съгласно претенция 3 или 21, характеризиращ сес това, че интернализиращият фактор е лагавд за Т - клетки. 42· Състав съгласно претенция 3 или 21, характеризиращ сес това, че интерналазиращия фактор е лигавд за В - клетки·
  27. 43. Състав съгласно претенция 42, характеризиращ се с това,че иитернализирещая фактор е инунглобулин.
  28. 44. Състав съгласно претенция 42, характеризиращ се стеза, че лагавда е знти-инунглобулин. 45· Състав съгласие претенция 3 или 21, характеризиращ сес това, че интернализиращият фактор е лкганд за хепатити.
  29. 46. Състав съгласно претенция 45, характеризиращ се стова, че интернализиращия фактор е лаганд за азиалогдикопротеи-новия рецептор. 4?· Състав съгласно претенция 46, хароктерязиращ се с тоза, че ивтернадизаращвя фактор е тетрагадактоза-полилизин.
  30. 48. Състав съгласно претенция 3 или 21, характеризиращ сес това, че интернализарещжя фактор е лектив. 49» Състав съгласно претенция 3 или 21, характеризиращ сес това, че иитернализирещая фактор а лжвсвротевв с ниска плът-ност. • · — 6 —
  31. 50. Комплекс коте съставки па състав съгласно една отпретенциите 3 до 49, характеризиращ се с това, на съдържа една или повече за експониране в клетката нуклеинова киселини,ендозомолинно средство, което само по себе си яма нуклеиновакиседива-свързващ домен или е свързано кш вещество с афинитеткъм нуклеинова киселина и евентуално освен това интернализиращфактор, който е свързан към вещество с афинитет към нухяеино-ва киселина.
  32. 51. Комплекс съгласно претенция 50, характеризиращ се стова, че съдържа лечебноактивна нуклеинова киселина.
  33. 52. Комплекс съгласно претенция 51, характеризиращ се стова, че нуклеиновата киселина се състои от едаа или повечегентерапевтично действащи ДЙК - молекули.
  34. 53. Комплекс съгласно претенция 52, характеризиращ се стова, че ДНК - молекулите кодират зеГцитокиаи.
  35. 54. Комплекс съгласно претенция 51, характеризиращ се с то-ва, че нуклеиновата киселина съдържа нуклеотидо последовател-ност, от която се транскрибират РШС - молекули, които специфич-но инхибират клетъчни Функции.
  36. 55. Комплекс съгласно претенция 50, характеризиращ се с това, че веществото с афинитет към нуклеинова киселина е орга- U ничев поликатйон. 56« Комплекс съгласно претенция 55, характеризиращ се с •IV това, че поликаИопа е полилизин.
  37. 57. Комплекс съгласно претенция 50, характеризиращ се стова, че еидозомолизното средство а интерпалавиращият Факторса свързани и двата са свързани към една и ежа субстанция сафинитет към нуклеинова киселина. 56« Комплекс съгласно претенция 57, характеризиращ се е I/' • · ··· · «е» · » β . * . · · · · · «···· · .··.·.· ж, · · · · · · · m 7 ··· · ·· · ·· · \л2 това, ме евдозомолитното средство а интернализйращнят факторса свързани към полализиа.
  38. 59. Комплекс съгласно претенция 58» характеризиращ се с то»за» че съдърка и не-ковалентно свързан ползлззин.
  39. 60. Конюгат като съставка на комплекс съгласно една отпретенциите 50 до 59, характеризиращ се с това» че копитата се \)·~ΊτΟ състои от ендозонолитно средство и от вещество с афинитет къмнуклеинова киселина·
  40. 61. Конигат съгласно претенция 60, характеризиращ се с ML това, че ендозомолитното средство е свързано ковалентао къмвещество с афинитет към нуклеинова киселина.
  41. 62. Конюгат съгласно претенция 60, характеризиращ се с \Jтова, че ендозомолктнОто средство е свързано не-ковалентно към вещество с афинитет към нуклеинова киселина·
  42. 63. Коаюгат съгласно претенция 62, характеризиращ се стова, че свързването се осъществява през биотин-стрептавидан-ов мост. 6¼. Конвгат съгласно претенция б£» характеризиращ се с то» |/ва, че свързването е йонно.
  43. 65. Конигат съгласно претенция 60, характеризиращ се с |/това, че ендозоиолатното средство е вирус или вирусна компо-нента.
  44. 66. Конвгат съгласно претенции 65, характеризиращ се стова, че евдозомолитното средство е а дене вирус. 67« Конигат съгласно претенция 66» характеризиращ се става, че аденовируса е мутант.
  45. 68. Конигат съгласно претенция 67, характеризиращ се стова, че аденовируса е репликационно инкоажетевтеи мутант.
  46. 69. Конигат съгласно претенция 68, характеризиращ се с • ·
    • · · * · · * » ,, · « « « · • * · » · · · ···».»·* · « · · това, че аденовируса ншз една или повече мутации и/или делециив е!а - региона» 70» Конюгат съгласно претенция 66, характеризиращ се стова, че аденовируса е инактижран. 71» Ковюгат съгласно претенция 70, характеризираш ее етова, че аденовируса е инактетираи чрез късовълнова Ш
  47. 72. Хонвгат съгласно претенция 70, .сарзктеризирац се с 7"' GKtjr· това, че аденовируса е инактиаиран чрез/В/псералев· 73. йонвгат съгласно претенция 70, характеризиращ се стеза, че аденовируса е ивактивиран чрез иориалдехвд. 7¾. Конвгот съгласно претенция 65, характеризираш се стова, че вирусната компонента се състои ст един или повечеадевовирусни протеини. 75. йонюгат съгласно претенция 65, характеризираш се стова, че вируса е ликорназирус.
  48. 76. Конюгат съгласно претенция 75, характеризираш се стова, че вируса е евентуално инактивиран риковирус.
  49. 77. Конюгат съгласно претенция 60, характеризиращ се с 1*2 това, че ендоземолитното средство не е по начало ивтернаяизи-раш фактор за подяезащзте за траисфш^ране клетка.
  50. 78. Конюгат съгласно претенция 77, характеризиращ се стова, че ендозонолитното средство е вирус или зирусне компо-нента, който съответно не е интернализирац (ректор за човешка оетка. 79. хСонюгат съгласно претенция 78, хероктеризяраш се стеза, че ендозонолитиото средство е вирус, който е инфекциозенза зид, различен от човек.
  51. 80. Конюгат съгласно претенция 79, характеризиращ се стова, че вируса е аденозирус.
  52. 81. Конюгат съгласно претенция 80« характеризиращ се стова, че аденовируса е птичи адоновирус.
  53. 82. Конюгат съгласно претенция 81, характеризиращ се с а е та л Мг с това, че аденовируса е Gi^efc-sabrye Lethal orphan 83» Конюгат съгласно претенция 77, характеризиращ се стова, че ендозомолитното средство е евентуално модифициранендрзомолитен вирусен пептид.
  54. 84. Конюгат съгласно претенция 83, характеризиращ се стова, че ендозомолитнкят пептид е инфлуенца-хеиаИцутининИА2-пептид.
  55. 85. Конюгат съгласно претенция 84, характеризиращ се стова, че пептида има последователността Gly Leu Phe Glu AlaHe Ala Gly The lie Glu Asn Gly ‘Σνρ Glu Gly Met lie Asp Gly Gly Gly Cys. 86« Конюгат съгласно претенция 84, характеризиращ се стова, че пептида има последователността Gly Leu Phe Gly AlaHe Ala Gly Phe He Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met lie Asp GlyGly Gly Cys.
  56. 87. Конюгат съгласно претенция 77, характеризиращ се с w това, че ендозомолитното средство е не-зирусев, евентуалномодифициран природен или синтетичен пептид»
  57. 88. Конюгат съгласно претенция 87, характеризиращ се етова, че пептида притежава последователността Gly Leu phe GluAle lie Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met lie Asp Gly Gly Gly Cys.
  58. 89. Конюгат съгласно претенция 87, характеризиращ се стова, че пептида е хомо- или хетеродимер на дефинирания в пре-тенция 38 пептид.
  59. 90. Конюгат съгласно претенция 89, характеризиращ се с • ΙΟ Kia, че авптяде е хоаадаер. 91. lemem етеяаеао пречевади 89, жаравчериеврац ое ечева, че ветзде е хегереяююр и че пржчежава яовяедееечете*»«е 02? lea the 02а Ala 22· 02а 02? Ww XX· 02а Ат 02? trp02а 02? Х*а Ala 02а Ala Lea Ala Ola Ala lea Ola Ala lea Ala Ala01? 02? Se? o?a· П* Комитет owoae претевцжя 8?, жвреюержекж oe cY038, че жвд кае штедешеежвете eXtt Ala Ala UttAla Ola Ala Ua Ala Ola Ala I*a Ala Ola KAa Xaa Ala Ola AlaZaa Ala Ola Ala lea Ola Ala X*a Ala Ala 02? 01? S·» 0?·.
  60. 95, Bmet склаам вречемцкя 87, хвракчерпзиращ oe οтова, %е пеявдв ш йооледозачвдвосчча т 31у АХа laa Ala Ola Ala lea Ala Ola Ala laa Ala Ola Ms iau Ala OlaAla zaa Ala Ola Ala Lea Ola Ala Leu Ala Ala 01? 01? Sex Cye.
    94, Кеят ежхееве првтвюмя 87, хврекчервмфвч ое οчете, че пеете вае в?веевяоее киселина - окрамч дояем.
    95. Кояит свгяесво вречевцхв 94, харветервзярац ое е
    *ове« че пепчжда прячежазе96, оючав етееве пречевцкя 58, жввеквевввшв ое е гевв« че вред- L· жммм, Чв ugihiw ДГОЗажВ 98. мечед ва веадчевеяе ве яевят едааево пречевдвв 01« хврехчервзмрев ое о чом« че wpyo пя (воиОвеачидве еяят» кг аожичке оредетво ж
  61. 99. Метод за «· χερβκτορκ - Π - οβ ο това, че вирус жш (аади)пшпиде видово·в вожнакин се свързват »жес®иIGQ. Пет за получавана па кеягт езавспе претевцхя 62«тервеврвц ее е това» че жруо яли вирушв шш®&amp;т е®о бю?я I вб еиодюе ход <я?«шот бжьрт / вб завеждаме «е кражхвмъа теляк а вхеодк« харвжрвезраг; се с тово, че бае eaeraai сарлесвю арегоицин X яв 49. 102.това, че ΙΟ X, одракодрввнрех бб е Х05. Метод еатехе Х02« одрбкоддевирбж бб в 104. метод вадвехе претенция 102, характеризира ее е « че клетките са ияобластж.
  62. 105. Метод бзгаеяе претенция 102, хврактешзчрец ее е>» «е жзвчхнод са фабробааста. X0U *жод сагдвсао претенция 102, характеризирай се обб« че кяводхче е© хмебоцитх.
  63. 107. Метод съгласно нретеяодя 102, хврехтбряодрбб бб ебб8б « че клетките са ewtexxx клети. 108. метод сьгдввао протекция Х©7» харвктертаиреч се с«овб« че ямйие са от дихателните яодявв. Х09. Метод съгласно едва от претенциите ©т 101 да 108,характеризирай бб е това, че нуклеиновата гасеше» вб гввтервяевтодию-бзтжвга. 110. йод бододеяе претенции 105 и 109, хаз аз © това, че туморите клета и че ДХК веджра as едиа у** иб! - 12 - субстанции» предимно цикотиии. 111. .етод за получаване пе хвтероложеи протеин в по-висшаеукариотна клетка, характеризираш се е това, че клетката сетретира със състав съгласно претенция I» при което нуклеинова·»та киселина съдържа ФНК - последователност, която кодира за же-лания протеин, клетките се култивират при условия аодадящи за.експреспрането не протеина и протеина се изолира.
  64. 112. Уарнацеятичен препарат, съдържай състав съгласно ед-на от претенциите I до 49, съдържащ торапезтичноактявна нукле-инова киселина и дармацевтичпс правило носител.
  65. 115. ТрзнсДекцивиен1комплект, съдържащ носещо устойство в което се намират два таи повече съда, прн което в единия садсе намира зе^стзо с афинитет към нуклеинова киселина, коетоевентуално е свързано към интерн8лизирац фактор за ло-висааефкариотва клетка и втори съд, в който има средство поетопритежава способността лс начало да прониква в по-зисши еука-рлотни клетки и да оезебождаза съдържоинето нз ендозоште вцитоплазмата. _ i Мр&amp;сщ
    114. Тронсфокцйвнвй комплект, съдържащ носещо устройство,в което се намират две или повече сада, пра което в първия садсе съдържа вещество с афинитет към нуклеинова киселина, коетое евентуално свързано към интернализирад фактор за пс-висваеукариотна клетка и втори съд, който с^дър^а вещество с афини-тет къс нуклеинова киселина, което е свързано към средство при-тежаващо способността, като съставка на комплекс не нуклеиновакиселина, да прониква в по-висви ефкариотни клетки и де осво-бождава съдържанието на ендозомите а цитоплазмата.
    115. Трансфекцийй комплект, съгласно претенция 114, ха-рактеризираш се с това, че в първия сад се садържа транс- ·· * * * * « • · · · · · · «.»··>· » 13 глутажааза-свързан аденоваде-полидизав - ксшвгат. 116· Траасфеквдю&amp;ов5 комплект, съдържащ носещо устройствов което се навират два или яоасче съда, при .;оето в първия садсе съдържа бйстпи-уодлфйцирано евдозополитно средство и дворасъд в който co навира вещество о адшитет дъи стредтавидшкада-^яцкрана нуклеинова киселина.
  66. 117. ТрансфекцаОней коадлект съгласно претенция 116, ха-рактеризиращ се е това, че в първия сцц се съдържа биотинклиранаденсвирус, а във втори сад се намира строптавдан-аолилазо·
BG98718A 1991-09-30 1994-04-14 Състав за въвеждане на комплекси на нуклеинови киселини в по-висши еукариотни клетки BG62740B1 (bg)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US76778891A 1991-09-30 1991-09-30
US76803991A 1991-09-30 1991-09-30
US82710292A 1992-01-30 1992-01-30
US82710392A 1992-01-30 1992-01-30
US86475992A 1992-04-07 1992-04-07
US93778892A 1992-09-02 1992-09-02
PCT/EP1992/002234 WO1993007283A1 (de) 1991-09-30 1992-09-28 Zusammensetzung für das einbringen von nukleinsäure-komplexen in höhere eukaryotische zellen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG98718A true BG98718A (bg) 1995-02-28
BG62740B1 BG62740B1 (bg) 2000-06-30

Family

ID=27560281

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG98718A BG62740B1 (bg) 1991-09-30 1994-04-14 Състав за въвеждане на комплекси на нуклеинови киселини в по-висши еукариотни клетки

Country Status (28)

Country Link
US (4) US5547932A (bg)
EP (2) EP0545016A1 (bg)
JP (1) JPH10506001A (bg)
CN (1) CN1059705C (bg)
AT (1) ATE215990T1 (bg)
AU (1) AU671084B2 (bg)
BG (1) BG62740B1 (bg)
BR (1) BR9206559A (bg)
CA (1) CA2118816C (bg)
CZ (1) CZ293141B6 (bg)
DE (1) DE59209951D1 (bg)
DK (1) DK0607206T3 (bg)
EE (1) EE03195B1 (bg)
ES (1) ES2173083T3 (bg)
FI (1) FI941474A0 (bg)
HK (1) HK1013104A1 (bg)
HU (2) HU218846B (bg)
IL (1) IL103171A (bg)
MX (1) MX9205543A (bg)
NO (1) NO316744B1 (bg)
NZ (1) NZ244306A (bg)
PL (1) PL180304B1 (bg)
PT (1) PT607206E (bg)
RO (1) RO117861B1 (bg)
SG (1) SG44680A1 (bg)
SI (1) SI9200236B (bg)
SK (1) SK281682B6 (bg)
WO (1) WO1993007283A1 (bg)

Families Citing this family (416)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5354844A (en) * 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US5981273A (en) * 1991-09-30 1999-11-09 Boehringer Ingelheim Int'l. Gmbh Composition comprising an endosomolytic agent for introducing nucleic acid complexes into higher eucaryotic cells
NZ244306A (en) * 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
CA2131620A1 (en) * 1992-03-20 1993-09-30 Louis C. Smith A dna transporter system and method of use
ES2221920T3 (es) * 1992-04-03 2005-01-16 The Regents Of The University Of California Sistema de liberacion de polinucleotidos de autoensamblaje que comprende un peptido cationico anfipatico.
WO1994006923A1 (en) * 1992-09-24 1994-03-31 The University Of Connecticut Modification of a virus to redirect infectivity and enhance targeted delivery of polynucleotides to cells
HUT73383A (en) * 1993-03-19 1996-07-29 Boehringer Sohn Ingelheim Process for preparing cancer vaccines
DE4311651A1 (de) * 1993-04-08 1994-10-13 Boehringer Ingelheim Int Virus für den Transport von Fremd-DNA in höhere eukaryotische Zellen
WO1995002698A1 (en) * 1993-07-12 1995-01-26 Life Technologies, Inc. Composition and methods for transfecting eukaryotic cells
DE4335025A1 (de) * 1993-10-14 1995-04-20 Boehringer Ingelheim Int Endosomolytisch wirksame Partikel
EP0648493A1 (en) * 1993-10-19 1995-04-19 Tadatsugu Prof. Dr. Taniguchi A method to reverse the phenotype of transformed cells by the transcription factor IRF-1
US5928944A (en) * 1994-02-04 1999-07-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of adenoviral-medicated cell transfection
MX9603866A (es) * 1994-03-18 1997-03-29 Boehringer Ingelheim Int Procedimiento para el tratamiento de celulas eucarioticas.
AU2194895A (en) * 1994-03-25 1995-10-17 Uab Research Foundation, The Composition and methods for creating syngeneic recombinant virus-producing cells
US5670347A (en) 1994-05-11 1997-09-23 Amba Biosciences Llc Peptide-mediated gene transfer
US6284880B1 (en) 1994-05-30 2001-09-04 Boehringer Ingelheim International Gmbh Chicken embryo lethal orphan (CELO) virus GAM-1
DE4418965A1 (de) * 1994-05-31 1995-12-07 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäure in höhere eukaryotische Zellen
DE4426429A1 (de) * 1994-07-26 1996-02-01 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zum Einführen von DNA in höhere eukaryotische Zellen
US6468981B1 (en) 1994-07-29 2002-10-22 Emory University Compositions and methods for targeting pharmaceutically active materials to cells containing androgen receptors
US5525606A (en) 1994-08-01 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Substituted 06-benzylguanines and 6(4)-benzyloxypyrimidines
US5965541A (en) * 1995-11-28 1999-10-12 Genvec, Inc. Vectors and methods for gene transfer to cells
US5962311A (en) * 1994-09-08 1999-10-05 Genvec, Inc. Short-shafted adenoviral fiber and its use
US5846782A (en) 1995-11-28 1998-12-08 Genvec, Inc. Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs
US6465253B1 (en) 1994-09-08 2002-10-15 Genvec, Inc. Vectors and methods for gene transfer to cells
US5559099A (en) * 1994-09-08 1996-09-24 Genvec, Inc. Penton base protein and methods of using same
US5837533A (en) * 1994-09-28 1998-11-17 American Home Products Corporation Complexes comprising a nucleic acid bound to a cationic polyamine having an endosome disruption agent
EP0785276A4 (en) * 1994-09-29 2002-01-09 Ajinomoto Kk MODIFICATION OF A PEPTIDE AND A PROTEIN
US6221959B1 (en) 1994-11-18 2001-04-24 Supratek Pharma, Inc. Polynucleotide compositions
US6359054B1 (en) 1994-11-18 2002-03-19 Supratek Pharma Inc. Polynucleotide compositions for intramuscular administration
US6008202A (en) * 1995-01-23 1999-12-28 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US5795587A (en) * 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US6127525A (en) * 1995-02-21 2000-10-03 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral coat protein and methods of using same
US5770442A (en) 1995-02-21 1998-06-23 Cornell Research Foundation, Inc. Chimeric adenoviral fiber protein and methods of using same
AU5103996A (en) * 1995-03-09 1996-10-02 Bavarian Nordic Research Institute A/S Vectors carrying therapeutic genes encoding antimicrobial peptides for gene therapy
WO1996029423A1 (en) * 1995-03-20 1996-09-26 Baylor College Of Medicine Compositions and methods for inducing infection by retroviral vectors outside of their host range
DE19510344C1 (de) * 1995-03-22 1996-11-07 Boehringer Ingelheim Int Verwendung einer Tumorvakzine
US6420549B1 (en) 1995-06-06 2002-07-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide analogs having modified dimers
AU705035B2 (en) * 1995-06-07 1999-05-13 Baylor College Of Medicine Nucleic acid transporters for delivery of nucleic acids into a cell
US6051429A (en) * 1995-06-07 2000-04-18 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced cationic lipid transfections
US20030069173A1 (en) * 1998-03-16 2003-04-10 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced transfections
AU5979296A (en) * 1995-06-07 1996-12-30 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced cationic lipid transfections
US6783980B2 (en) * 1995-06-15 2004-08-31 Crucell Holland B.V. Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
ATE278794T1 (de) * 1995-06-15 2004-10-15 Crucell Holland Bv Verpackungssysteme für humane, menschliche adenoviren, zur verwendung in die gentherapie
US5908777A (en) * 1995-06-23 1999-06-01 University Of Pittsburgh Lipidic vector for nucleic acid delivery
GB9515356D0 (en) * 1995-07-26 1995-09-20 Medical Res Council Improvements in or relating to delivery of nucleic acid
US5770720A (en) * 1995-08-30 1998-06-23 Barnes-Jewish Hospital Ubiquitin conjugating enzymes having transcriptional repressor activity
IL115199A (en) 1995-09-07 2005-05-17 Opperbas Holding Bv Composition comprising a polynucleic acid molecule in a liposome and method using said composition
CA2190304A1 (en) * 1995-12-15 1997-06-16 Elazar Rabbani Property effecting and/or property exhibiting compositions for therapeutic and diagnostic uses
AU2112697A (en) * 1996-02-09 1997-08-28 Pi-Wan Cheng Receptor ligand-facilitated delivery of biologically active molecules
DE19605548A1 (de) * 1996-02-15 1997-09-04 Boehringer Ingelheim Int Zusammensetzung für die Transfektion höherer eukaryotischer Zellen
CA2248538A1 (en) 1996-03-14 1997-09-18 The Immune Response Corporation Targeted delivery of genes encoding interferon
DE19615803A1 (de) 1996-04-20 1997-10-23 Boehringer Ingelheim Int CELO-Virus
US7812149B2 (en) 1996-06-06 2010-10-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
US9096636B2 (en) 1996-06-06 2015-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
US5898031A (en) 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
DE69725878T2 (de) 1996-08-13 2004-07-29 Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville Zusammensetzungen zur polynukleotidabgabe
DE19632532A1 (de) * 1996-08-13 1998-02-19 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zur Herstellung von Säugetieren mit definierten genetischen Eigenschaften
US5948681A (en) * 1996-08-14 1999-09-07 Children's Hospital Of Philadelphia Non-viral vehicles for use in gene transfer
CN1181422A (zh) * 1996-10-31 1998-05-13 上海市肿瘤研究所 与生长因子受体结合的多肽所构建的基因转移载体
US6544523B1 (en) 1996-11-13 2003-04-08 Chiron Corporation Mutant forms of Fas ligand and uses thereof
US5965441A (en) * 1996-11-13 1999-10-12 The General Hospital Coporation HSV/AAV hybrid amplicon vectors
US20060002949A1 (en) 1996-11-14 2006-01-05 Army Govt. Of The Usa, As Rep. By Secretary Of The Office Of The Command Judge Advocate, Hq Usamrmc. Transcutaneous immunization without heterologous adjuvant
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
US6797276B1 (en) 1996-11-14 2004-09-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Use of penetration enhancers and barrier disruption agents to enhance the transcutaneous immune response
US6153596A (en) * 1996-12-18 2000-11-28 Emory University Polycationic oligomers
JP4289687B2 (ja) * 1997-03-14 2009-07-01 ザ チルドレンズ ホスピタル オブ フィラデルフィア 血友病の治療のための遺伝子治療で使用する方法と組成物
US20040009166A1 (en) * 1997-04-30 2004-01-15 Filpula David R. Single chain antigen-binding polypeptides for polymer conjugation
CA2288992C (en) * 1997-04-30 2012-06-12 Enzon, Inc. Single-chain antigen-binding proteins capable of glycosylation, production and uses thereof
US6635623B1 (en) 1997-06-13 2003-10-21 Baylor College Of Medicine Lipoproteins as nucleic acid vectors
US20050096288A1 (en) * 1997-06-13 2005-05-05 Aragene, Inc. Lipoproteins as nucleic acid vectors
DE19726186A1 (de) * 1997-06-20 1998-12-24 Boehringer Ingelheim Int Komplexe für den Transport von Nukleinsäure in höhere eukaryotische Zellen
US6172211B1 (en) 1997-07-11 2001-01-09 Boehringer Ingelheim International Gmbh Nucleic acid encoding tag7 polypeptide
EP1007099A4 (en) * 1997-07-11 2004-11-24 Univ Brandeis METHOD FOR INDUCING APOPTOSE BY LOWERING THE THIAMINE MIRROR
US7923250B2 (en) 1997-07-30 2011-04-12 Warsaw Orthopedic, Inc. Methods of expressing LIM mineralization protein in non-osseous cells
DE69840361D1 (de) 1997-07-30 2009-01-29 Univ Emory Neue knochenmineralisierungsproteine, dna, vektoren, expressionssysteme
WO1999007723A1 (en) * 1997-08-07 1999-02-18 University Of Maryland, Baltimore Nucleic acid uptake and release vehicle
US20030125278A1 (en) * 1997-08-13 2003-07-03 Tang De-Chu C. Immunization of animals by topical applications of a salmonella-based vector
US6706693B1 (en) 1997-08-13 2004-03-16 The Uab Research Foundation Vaccination by topical application of genetic vectors
US6197332B1 (en) 1997-08-13 2001-03-06 Chiron Corporation Lipid-conjugated polyamide compounds and related compositions and methods thereof
US20030045492A1 (en) * 1997-08-13 2003-03-06 Tang De-Chu C. Vaccination by topical application of recombinant vectors
US6716823B1 (en) 1997-08-13 2004-04-06 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom, and uses thereof
US6348450B1 (en) 1997-08-13 2002-02-19 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom and uses thereof
US5998386A (en) 1997-09-19 1999-12-07 Feldman; Arthur M. Pharmaceutical compositions and method of using same for the treatment of failing myocardial tissue
WO1999019500A1 (en) * 1997-10-10 1999-04-22 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Healt H And Human Services Complex of biotinylated viral vector and ligand for targeted gene delivery
US6914131B1 (en) 1998-10-09 2005-07-05 Chiron S.R.L. Neisserial antigens
CA2671261A1 (en) 1997-11-06 1999-05-20 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Neisserial antigens
US6734338B1 (en) 1997-11-14 2004-05-11 Cedars-Sinai Medical Center Transfection, storage and transfer of male germ cells for generation of transgenic species and genetic therapies
US7294755B1 (en) 1997-11-14 2007-11-13 Cedars-Sinai Medical Center Genetic modification of male germ cells for generation of transgenic species and genetic therapies
JP2001523468A (ja) * 1997-11-14 2001-11-27 セダーシナイ メディカル センター トランスジェニック種の産生のための雄性生殖細胞のトランスフェクションおよび移入
EP0945138A1 (en) * 1997-12-04 1999-09-29 Université Louis Pasteur de Strasbourg Transfection particles
CA2317549C (en) * 1998-01-05 2006-04-11 University Of Washington Composition for enhancing transport through lipid-containing membranes, and uses thereof
BR9906927A (pt) 1998-01-14 2001-11-20 Chiron Spa Proteìnas de neisseria meningitidis
AU4070499A (en) 1998-04-30 1999-11-16 Cornell Research Foundation Inc. Adenoviral vectors with tandem fiber proteins
NZ541361A (en) 1998-05-01 2008-04-30 Inst Genomic Research Neisseria meningitidis antigens and compositions relating to SEQ ID Nos:2916, 2918 and 2920
US7244714B1 (en) * 1998-06-12 2007-07-17 Aradigm Corporation Methods of delivering aerosolized polynucleotides to the respiratory tract
US6509323B1 (en) 1998-07-01 2003-01-21 California Institute Of Technology Linear cyclodextrin copolymers
US7091192B1 (en) 1998-07-01 2006-08-15 California Institute Of Technology Linear cyclodextrin copolymers
US6245427B1 (en) 1998-07-06 2001-06-12 DüZGüNES NEJAT Non-ligand polypeptide and liposome complexes as intracellular delivery vehicles
US20040043489A1 (en) * 1998-07-08 2004-03-04 Menzo Havenga Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for dendritic cells and methods of use
US20030017138A1 (en) * 1998-07-08 2003-01-23 Menzo Havenga Chimeric adenoviruses
US7396919B1 (en) * 1998-07-17 2008-07-08 Mirus Bio Corporation Charge reversal of polyion complexes
WO2000011019A1 (en) * 1998-08-21 2000-03-02 Felix Frey Conjugates of dna interacting groups with steroid hormones for use as nucleic acid transfection agent
US6455314B1 (en) 1998-09-11 2002-09-24 Genvec, Inc. Alternatively targeted adenovirus
US6077709A (en) 1998-09-29 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of Survivin expression
EP1953229A3 (en) 1998-10-15 2008-12-24 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Metastatic breast and colon cancer regulated genes
US6333396B1 (en) 1998-10-20 2001-12-25 Enzon, Inc. Method for targeted delivery of nucleic acids
US7166745B1 (en) 1998-11-12 2007-01-23 Invitrogen Corporation Transfection reagents
US20050063950A1 (en) * 1998-11-19 2005-03-24 Georgetown University Systemic viral/ligand gene delivery system and gene therapy
DE69942837D1 (de) 1998-11-19 2010-11-18 Univ Georgetown Systemisches virus/ligand genabgabemittel und gentherapie
US6929946B1 (en) * 1998-11-20 2005-08-16 Crucell Holland B.V. Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for smooth muscle cells, and/or endothelial cells
DK1141331T3 (da) 1998-12-16 2009-01-05 Novartis Vaccines & Diagnostic Human cyclinafhængig kinase (hPNQALRE)
US7098192B2 (en) 1999-04-08 2006-08-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of STAT3 expression
GB9908195D0 (en) 1999-04-09 1999-06-02 Microbiological Res Authority Treatment of intracellular infection
US6514762B1 (en) 1999-04-23 2003-02-04 New Mexico State University Technology Transfer Corporation Delivery of nucleotides by electrochemical release
DE19918446A1 (de) * 1999-04-23 2000-11-23 Univ Eberhard Karls Verwendung von Coxsackievirus B3 zur Verbesserung der Transfektion von Zellen
MXPA01010924A (es) 1999-04-30 2002-05-06 Chiron Spa Antigenos de neisseria conservados.
US20040009936A1 (en) * 1999-05-03 2004-01-15 Tang De-Chu C. Vaccine and drug delivery by topical application of vectors and vector extracts
US6913922B1 (en) 1999-05-18 2005-07-05 Crucell Holland B.V. Serotype of adenovirus and uses thereof
US6492169B1 (en) 1999-05-18 2002-12-10 Crucell Holland, B.V. Complementing cell lines
US20050232900A1 (en) * 1999-05-18 2005-10-20 Crucell Holland B.V. Serotype of adenovirus and uses thereof
GB9911683D0 (en) 1999-05-19 1999-07-21 Chiron Spa Antigenic peptides
US6696272B1 (en) 1999-06-02 2004-02-24 Hsc Research & Development Limited Partnership Products and methods for gaucher disease therapy
DK1102785T3 (da) * 1999-06-07 2013-05-13 Arrowhead Res Corp Sammensætninger til lægemiddeltilførsel ved anvendelse af pH-følsomme molekyler
US20080281041A1 (en) * 1999-06-07 2008-11-13 Rozema David B Reversibly Masked Polymers
US8541548B2 (en) * 1999-06-07 2013-09-24 Arrowhead Madison Inc. Compounds and methods for reversible modification of biologically active molecules
GB9916529D0 (en) 1999-07-14 1999-09-15 Chiron Spa Antigenic peptides
ES2183752T3 (es) * 1999-09-17 2005-07-16 Tgt Laboratories, S.A. De C.V. Vectores adenovirales recombinantes y su utilizacion en el tratamiento de la cirrosis de higado.
EP2275553B1 (en) 1999-10-29 2015-05-13 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Neisserial antigenic peptides
CA2395636A1 (en) * 1999-12-30 2001-07-12 Novartis Ag Novel colloid synthetic vectors for gene therapy
AU2764801A (en) 2000-01-07 2001-07-24 University Of Washington Enhanced transport of agents using membrane disruptive agents
ES2507100T3 (es) 2000-01-17 2014-10-14 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Vacuna OMV suplementada contra meningococo
US6261840B1 (en) 2000-01-18 2001-07-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of PTP1B expression
US20020055479A1 (en) 2000-01-18 2002-05-09 Cowsert Lex M. Antisense modulation of PTP1B expression
BR0108711A (pt) 2000-02-28 2004-06-22 Chiron Spa Expressão heteróloga de proteìnas de neisseria
US6680172B1 (en) 2000-05-16 2004-01-20 Regents Of The University Of Michigan Treatments and markers for cancers of the central nervous system
EP1157999A1 (en) * 2000-05-24 2001-11-28 Introgene B.V. Methods and means for enhancing skin transplantation using gene delivery vehicles having tropism for primary fibroblasts, as well as other uses thereof
JP2003534806A (ja) * 2000-05-31 2003-11-25 ジェンベク、インコーポレイティッド アデノウイルスベクターのターゲティングの方法および組成物
EP1950297A2 (en) 2000-05-31 2008-07-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Compositions and methods for treating neoplastic disease using chemotherapy and radiation sensitizers
JP2004501657A (ja) 2000-06-28 2004-01-22 マックス−デルブルック−セントラム　フュール　モレクラーレ　メディツィン トランスフェクション効率の改良方法
US20040058856A1 (en) * 2000-07-26 2004-03-25 Soo-Young Choi Oligolysine transducing domain, oligolysine-cargo molecule complex and uses thereof
US7198924B2 (en) 2000-12-11 2007-04-03 Invitrogen Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
US20040033605A1 (en) * 2000-09-20 2004-02-19 Menzo Havenga Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for dendritic cells
US7235233B2 (en) * 2000-09-26 2007-06-26 Crucell Holland B.V. Serotype 5 adenoviral vectors with chimeric fibers for gene delivery in skeletal muscle cells or myoblasts
EP1191104A1 (en) * 2000-09-26 2002-03-27 Introgene B.V. Gene delivery vehicles and use thereof in the preparation of a medicament and/or vaccine
DE10049010A1 (de) * 2000-10-04 2002-04-18 Boehringer Ingelheim Int Transferrin-Polykation/DNS-Komplexe für die systemische Therapie von Tumorerkrankungen mit zytotoxischen Proteinen
NZ560966A (en) 2000-10-27 2010-06-25 Novartis Vaccines & Diagnostic Nucleic acids and proteins from streptococcus groups A & B
US20020086849A1 (en) * 2000-10-27 2002-07-04 Gulilat Gebeyehu Method for introducing antisense oligonucleotides into eucaryotic cells
US6892140B1 (en) 2000-11-27 2005-05-10 Enteron, Inc. Immunogenic cancer peptides and uses thereof
MXPA00011713A (es) * 2000-11-28 2002-05-31 Tgt Lab S A De C V Vectores recombinantes virales y no virales conteniendo el gen humano del activador de plasminogeno derivado de urocinasa y su utilidad en el tratamiento de diversos tipos de fibrosis hepatica, renal, pulmonar, pancreatica, cardiaca y cicatrices hipe
US7635571B2 (en) * 2000-12-07 2009-12-22 Siemens Healthcare Diagnostics Products Gmbh Amplified signal in binding assays
US6635466B2 (en) * 2001-01-09 2003-10-21 University Of Iowa Research Foundation Adenovirus serotype 30 (Ad30)
US20030170826A1 (en) * 2001-02-02 2003-09-11 Peter Rabinovich Peptides for facilitating composite receptor expression and translocation of macromolecules
ES2310201T3 (es) 2001-02-13 2009-01-01 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Army Vacuna para inmunizacion transcutanea contra la diarrea de los viajeros.
US20020150566A1 (en) * 2001-03-23 2002-10-17 Kun-Liang Guan Method of inhibiting cancerous cell proliferation using Ras mutants of GDP-bound conformation
GB0107658D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Streptococcus pneumoniae
GB0107661D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Staphylococcus aureus
US20020193295A1 (en) * 2001-05-04 2002-12-19 Emanuel Calenoff Immunogenic peptides and uses thereof
EP1383480A4 (en) * 2001-04-30 2006-05-24 Targeted Genetics Corp Lipid-Containing Drug Delivery Complexes and Method of Producing the Same
WO2002089586A1 (en) * 2001-05-10 2002-11-14 St. Jude Children's Research Hospital Lung epithelial cell line for propagating viruses
US20060159657A1 (en) * 2001-06-14 2006-07-20 Macromed, Incorporated Formulations of lymphokines and method of use thereof for local or both local and systemic control of proliferative cell disorders
US20030003074A1 (en) * 2001-06-14 2003-01-02 Macromed, Inc. Formulations of lymphokines and method of use thereof for local or both local and systemic control of proliferative cell disorders
US7803915B2 (en) 2001-06-20 2010-09-28 Genentech, Inc. Antibody compositions for the diagnosis and treatment of tumor
WO2003000113A2 (en) 2001-06-20 2003-01-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
EP2270024B1 (en) 2001-06-21 2018-10-24 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of superoxide dismutase 1, soluble expression
US7425545B2 (en) 2001-07-25 2008-09-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of C-reactive protein expression
US6964950B2 (en) 2001-07-25 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of C-reactive protein expression
US20030096772A1 (en) 2001-07-30 2003-05-22 Crooke Rosanne M. Antisense modulation of acyl CoA cholesterol acyltransferase-2 expression
US7407943B2 (en) 2001-08-01 2008-08-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein B expression
US7227014B2 (en) 2001-08-07 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein (a) expression
GB0120022D0 (en) 2001-08-16 2001-10-10 Photobiotics Ltd Conjugate
JP2005536439A (ja) 2001-09-18 2005-12-02 ジェネンテック・インコーポレーテッド 腫瘍の診断及び治療のための組成物と方法
WO2003052117A2 (en) * 2001-09-19 2003-06-26 Massachusetts Institute Of Technology Methods and products related to non-viral transfection
US6750019B2 (en) 2001-10-09 2004-06-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of insulin-like growth factor binding protein 5 expression
NZ577565A (en) 2001-10-09 2010-10-29 Isis Pharmaceuticals Inc Antisense modulation of insulin-like growth factor binding protein 5 expressions
US7745418B2 (en) * 2001-10-12 2010-06-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting viral replication
WO2003088808A2 (en) 2002-04-16 2003-10-30 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
JP2005527639A (ja) 2001-11-02 2005-09-15 インサート セラピューティクス インコーポレイテッド Ｒｎａ干渉の治療的利用のための方法及び組成物
US20030138407A1 (en) * 2001-11-02 2003-07-24 Patrick Lu Therapeutic methods for nucleic acid delivery vehicles
US6965025B2 (en) 2001-12-10 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of connective tissue growth factor expression
KR100982204B1 (ko) 2001-12-12 2010-09-14 노바티스 백신즈 앤드 다이아그노스틱스 에스.알.엘. 클라미디아 트라코마티스에 대한 면역화
NZ556415A (en) 2002-01-02 2009-02-28 Genentech Inc Compositions and methods for the diagnosis and treatment of glioma tumor
US8138383B2 (en) * 2002-03-11 2012-03-20 Arrowhead Madison Inc. Membrane active heteropolymers
US8008355B2 (en) * 2002-03-11 2011-08-30 Roche Madison Inc. Endosomolytic poly(vinyl ether) polymers
US20030186916A1 (en) * 2002-03-12 2003-10-02 Lei Yu Vector for transfection of eukaryotic cells
AU2003225793A1 (en) * 2002-03-15 2003-09-29 Baxter Healthcare S.A. Methods and compositions for directing cells to target organs
US20030180712A1 (en) 2002-03-20 2003-09-25 Biostratum Ab Inhibition of the beta3 subunit of L-type Ca2+ channels
ATE447037T1 (de) * 2002-04-25 2009-11-15 Crucell Holland Bv Mittel und verfahren zur herstellung von adenovirusvektoren
US20040142450A1 (en) * 2002-05-10 2004-07-22 Seo Sang Heui Lung epithelial cell line for propagating viruses
US7199107B2 (en) 2002-05-23 2007-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of kinesin-like 1 expression
US20050233993A1 (en) * 2002-06-05 2005-10-20 Kadonaga James T Methods for promoting homologous recombination
PT2332582E (pt) 2002-06-19 2014-01-28 Apeiron Biologics Ag Activação de ace2 para o tratamento de doença cardíaca, pulmonar e renal e de hipertensão
US20060003316A1 (en) * 2002-07-15 2006-01-05 John Simard Immunogenic compositions derived from poxviruses and methods of using same
PT1534340E (pt) 2002-09-06 2012-03-13 Cerulean Pharma Inc Polímeros à base de ciclodextrina para a administração de medicamentos ligados por ligação covalente
CN1820078A (zh) * 2002-09-09 2006-08-16 田纳西大学研究基金会 弹状病毒的重组突变体及其应用方法
MXPA05002791A (es) 2002-09-13 2005-12-05 Replicor Inc Oligonucleotidos antivirales complementarios sin secuencia.
AU2003278957A1 (en) 2002-09-26 2004-04-23 Amgen, Inc. Modulation of forkhead box o1a expression
MXPA05003843A (es) * 2002-10-10 2006-02-17 Us Dept Veterans Affairs Deteccion, localizacion y determicnacion de fases de tumores usando linfocitos activados rotulados dirigidos a un epitope especifico.
AU2003295387A1 (en) 2002-11-05 2004-06-03 Isis Parmaceuticals, Inc. Modified oligonucleotides for use in rna interference
EP1560839A4 (en) 2002-11-05 2008-04-23 Isis Pharmaceuticals Inc CHIMERIC OLIGOMER COMPOUNDS AND THEIR USE IN GENE MODULATION
US20080026077A1 (en) * 2002-11-12 2008-01-31 John Hilfinger Methods and compositions of gene delivery agents for systemic and local therapy
US20050026859A1 (en) * 2002-11-12 2005-02-03 John Hilfinger Methods and compositions of gene delivery agents for systemic and local therapy
ES2420914T3 (es) 2002-11-13 2013-08-27 Genzyme Corporation Modulación antisentido de la expresión de la apolipoproteína B
CA2505801A1 (en) 2002-11-13 2004-05-27 Rosanne Crooke Antisense modulation of apolipoprotein b expression
US7144999B2 (en) 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
US7468356B2 (en) 2003-02-11 2008-12-23 Antisense Therapeutics Ltd. Modulation of insulin like growth factor I receptor expression
US7803781B2 (en) 2003-02-28 2010-09-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of growth hormone receptor expression and insulin-like growth factor expression
US20040185559A1 (en) 2003-03-21 2004-09-23 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 1 expression
US7217566B2 (en) * 2003-03-24 2007-05-15 Invitrogen Corporation Attached cell lines
GB0308198D0 (en) 2003-04-09 2003-05-14 Chiron Srl ADP-ribosylating bacterial toxin
US7598227B2 (en) 2003-04-16 2009-10-06 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of apolipoprotein C-III expression
EP1620112A4 (en) * 2003-04-17 2007-04-25 Univ Columbia DESMOGLEIN 4 IS A NEW GENUS INVOLVED IN HAIR GROWTH
US7399853B2 (en) 2003-04-28 2008-07-15 Isis Pharmaceuticals Modulation of glucagon receptor expression
US20040220085A1 (en) * 2003-05-02 2004-11-04 Jasbir Sandhu Compositions for nucleic acid delivery
US20040220084A1 (en) * 2003-05-02 2004-11-04 Jasbir Sandhu Methods for nucleic acid delivery
BRPI0410886A (pt) 2003-06-03 2006-07-04 Isis Pharmaceuticals Inc composto de filamento duplo, composição farmacêutica, sal farmaceuticamente aceitável, métodos de modificação do ácido nucleico que codifica a survivina humana, de inibição da expressão da suvivina em células ou tecidos, e de tratamento de uma condição associada com a expressão ou superexpressão da suvivina, e, oligonucleotìdeo de rnai de filamento único
CA2528094A1 (en) * 2003-06-09 2005-01-13 Corixa Corporation Expression vectors for stimulating an immune response to cancer antigens
US7883720B2 (en) * 2003-07-09 2011-02-08 Wisconsin Alumni Research Foundation Charge-dynamic polymers and delivery of anionic compounds
WO2005013901A2 (en) 2003-07-31 2005-02-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding rnas
US7825235B2 (en) 2003-08-18 2010-11-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 2 expression
NZ576775A (en) 2003-09-18 2010-12-24 Isis Pharmaceuticals Inc Modulation of eIF4E expression
NZ546272A (en) 2003-10-10 2009-05-31 Alchemia Oncology Pty Ltd The modulation of hyaluronan synthesis and degradation in the treatment of disease
KR20060116825A (ko) * 2003-10-23 2006-11-15 일루미겐 바이오사이언시스, 인코포레이티드 바이러스 감염에 대한 저항성과 관련된 유전자인ｏａｓ1에서의 돌연변이의 검출
US8062891B2 (en) 2003-10-24 2011-11-22 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides to plants
US8507277B2 (en) 2003-10-24 2013-08-13 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides
US20090123468A1 (en) 2003-10-24 2009-05-14 Gencia Corporation Transducible polypeptides for modifying metabolism
US20090208478A1 (en) * 2003-10-24 2009-08-20 Gencia Corporation Transducible polypeptides for modifying metabolism
US8133733B2 (en) 2003-10-24 2012-03-13 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides to target tissues
EP2418281B1 (en) 2003-10-24 2016-06-01 Gencia Corporation Methods and compositions for delivering polynucleotides
US20050191653A1 (en) 2003-11-03 2005-09-01 Freier Susan M. Modulation of SGLT2 expression
CA2747871C (en) 2003-11-17 2018-04-10 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of tumor of hematopoietic origin
WO2005054438A2 (en) 2003-12-01 2005-06-16 Invitrogen Corporation Nucleic acid molecules containing recombination sites and methods of using the same
US20050265956A1 (en) * 2004-01-12 2005-12-01 Ye Liu Polyalkyleneimine-graft-biodegradable polymers for delivery of bioactive agents
US20050164271A1 (en) 2004-01-20 2005-07-28 Sanjay Bhanot Modulation of glucocorticoid receptor expression
US7468431B2 (en) 2004-01-22 2008-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of eIF4E-BP2 expression
WO2005069987A2 (en) * 2004-01-23 2005-08-04 City Of Hope Amplifying interfering rna (rnai) expression and effects
US8569474B2 (en) 2004-03-09 2013-10-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand
US20050203047A1 (en) * 2004-03-10 2005-09-15 Ulrich Thomann Delivery vectors for short interfering RNA, micro-RNA and antisense RNA
EP2700720A3 (en) 2004-03-15 2015-01-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for optimizing cleavage of RNA by RNASE H
WO2005097207A2 (en) * 2004-03-26 2005-10-20 Curis, Inc. Rna interference modulators of hedgehog signaling and uses thereof
DK1736541T3 (da) 2004-03-29 2013-05-06 Galpharma Co Ltd Nyt modificeret galectin 9-protein og anvendelse heraf
US20050244869A1 (en) 2004-04-05 2005-11-03 Brown-Driver Vickie L Modulation of transthyretin expression
US8394947B2 (en) 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
US7884086B2 (en) 2004-09-08 2011-02-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays
US8697139B2 (en) 2004-09-21 2014-04-15 Frank M. Phillips Method of intervertebral disc treatment using articular chondrocyte cells
US9315862B2 (en) 2004-10-05 2016-04-19 California Institute Of Technology Aptamer regulated nucleic acids and uses thereof
CA2582353A1 (en) 2004-10-06 2006-04-20 University Of Rochester Treatment of pulmonary hypertension using an agent that inhibits a tissue factor pathway
US7833513B2 (en) 2004-12-03 2010-11-16 Rhode Island Hospital Treatment of Alzheimer's Disease
EP2110667A1 (en) 2005-01-20 2009-10-21 University Of Rochester Thoredoxin interacting protein (TXNIP) as regulator of vascular function
ES2852549T3 (es) 2005-02-09 2021-09-13 Sarepta Therapeutics Inc Composición antisentido para tratamiento de la atrofia muscular
JP2008531581A (ja) * 2005-02-23 2008-08-14 ユーエービー リサーチ ファウンデーション アルキル−グリコシドで増強されたワクチン接種
CN101175769A (zh) 2005-03-10 2008-05-07 健泰科生物技术公司 用于调控血管完整性的方法和组合物
AU2006230436B2 (en) 2005-03-31 2011-11-24 Calando Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of ribonucleotide reductase subunit 2 and uses thereof
US8734851B2 (en) * 2005-04-29 2014-05-27 Wisconsin Alumni Research Foundation Localized delivery of nucleic acid by polyelectrolyte assemblies
UA95446C2 (ru) 2005-05-04 2011-08-10 Іллюміджен Байосайєнсіз, Інк. Мутаци в генах oas1
DE102005023993A1 (de) * 2005-05-20 2006-11-23 TransMIT Gesellschaft für Technologietransfer mbH Nicht virales Vektorsystem zum Transport von Nukleinsäure in die Lunge
AU2006318194B2 (en) 2005-11-21 2012-08-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of eiF4E-BP2 expression
US20090317802A1 (en) * 2005-12-09 2009-12-24 Bhatia Sangeeta N Compositions and Methods to Monitor RNA Delivery to Cells
CA2566267A1 (en) * 2005-12-09 2007-06-09 University Health Network Thymidylate kinase mutants and uses thereof
US20090068158A1 (en) * 2005-12-09 2009-03-12 Medin Jeffrey A Thymidylate kinase mutants and uses thereof
WO2007089584A2 (en) 2006-01-26 2007-08-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and their uses directed to huntingtin
CA2638915A1 (en) * 2006-02-10 2007-08-23 The Regents Of The University Of California Transducible delivery of sirna by dsrna binding domain fusions to ptd/cpps
EP2502999A3 (en) 2006-03-03 2013-01-23 Amorfix Life Sciences Ltd. Methods and compositions to treat and detect misfolded-SOD1 mediated diseases
US7718193B2 (en) * 2006-03-16 2010-05-18 University Of Washington Temperature- and pH-responsive polymer compositions
EP2614839A3 (en) 2006-04-05 2015-01-28 Genentech, Inc. Method for using BOC/CDO to modulate hedgehog signaling
MX2008014005A (es) 2006-05-03 2009-01-27 Baltic Technology Dev Ltd Agentes antisentido que combinan un oligonucleotido modificado con base fuertemente unida y nucleasa artificial.
EP2035035A2 (en) 2006-06-09 2009-03-18 Novartis AG Immunogenic compositions for streptococcus agalactiae
JP6125741B2 (ja) * 2006-07-12 2017-05-17 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 可逆的なホスホトリエステル電荷中和保護基による核酸の形質導入可能な送達
WO2008011473A2 (en) 2006-07-19 2008-01-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and their uses directed to hbxip
CN102614528B (zh) * 2006-08-18 2014-02-26 箭头研究公司 用于体内递送多核苷酸的多缀合物
US8017109B2 (en) * 2006-08-18 2011-09-13 Roche Madison Inc. Endosomolytic poly(acrylate) polymers
KR20090066289A (ko) 2006-09-08 2009-06-23 로드아일랜드하스피틀 알코올 유발성 뇌 질환의 치료, 예방 및 역행
EP2061484B1 (en) 2006-09-08 2012-11-07 Rhode Island Hospital Treatment, prevention, and reversal of alcohol-induced liver disease
WO2008058291A2 (en) 2006-11-09 2008-05-15 California Institute Of Technology Modular aptamer-regulated ribozymes
AU2007333225B2 (en) * 2006-12-08 2014-06-12 Massachusetts Institute Of Technology Delivery of nanoparticles and/or agents to cells
US8048998B2 (en) * 2007-01-19 2011-11-01 Exiqon A/S Mediated cellular delivery of LNA oligonucleotides
US8834918B2 (en) * 2007-01-22 2014-09-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Modified multilayered film
JP2010516625A (ja) 2007-01-24 2010-05-20 インサート セラピューティクス， インコーポレイテッド 制御された薬物送達のためのテザー基を有するポリマー−薬物コンジュゲート
EP2114981B1 (en) 2007-01-29 2013-05-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating protein expression
JP5761915B2 (ja) 2007-02-22 2015-08-12 ジェネンテック， インコーポレイテッド 炎症性腸疾患の検出方法
US7981688B2 (en) 2007-03-08 2011-07-19 University Of Washington Stimuli-responsive magnetic nanoparticles and related methods
EP2139447A2 (en) 2007-03-20 2010-01-06 Harold Brem Gm-csf cosmeceutical compositions and methods of use thereof
CA2584494A1 (en) * 2007-03-27 2008-09-27 Jeffrey A. Medin Vector encoding therapeutic polypeptide and safety elements to clear transduced cells
ES2654303T3 (es) 2007-05-04 2018-02-13 University Health Network Inmunoterapia de IL-12 contra el cáncer
US20090082217A1 (en) * 2007-07-16 2009-03-26 California Institute Of Technology Selection of nucleic acid-based sensor domains within nucleic acid switch platform
US20120165387A1 (en) 2007-08-28 2012-06-28 Smolke Christina D General composition framework for ligand-controlled RNA regulatory systems
US8367815B2 (en) * 2007-08-28 2013-02-05 California Institute Of Technology Modular polynucleotides for ligand-controlled regulatory systems
US8865667B2 (en) * 2007-09-12 2014-10-21 California Institute Of Technology Higher-order cellular information processing devices
AU2008307482B2 (en) 2007-10-02 2012-07-12 Amgen Inc. Increasing erythropoietin using nucleic acids hybridizable to micro-RNA and precursors thereof
US20090105375A1 (en) * 2007-10-09 2009-04-23 Lynn David M Ultrathin Multilayered Films for Controlled Release of Anionic Reagents
US9029524B2 (en) * 2007-12-10 2015-05-12 California Institute Of Technology Signal activated RNA interference
EP2077119A1 (de) * 2007-12-21 2009-07-08 Apeiron Biologics Forschungs- und Entwicklungsgesellschaft M.B.H. Behandlung von Fibrosen und Lebererkrankungen
US8344116B2 (en) * 2008-03-17 2013-01-01 Case Western Reserve University Polymers and complexes for delivery of nucleic acids to intracellular targets
US8568709B2 (en) 2008-03-20 2013-10-29 University Health Network Thymidylate kinase fusions and uses thereof
CN102037123A (zh) 2008-04-04 2011-04-27 卡兰多制药股份有限公司 Epas1抑制剂的组合物和用途
GB2459436A (en) * 2008-04-08 2009-10-28 Henderson Morley Plc Vaccine adjuvant
US8324333B2 (en) 2008-06-05 2012-12-04 Wisconsin Alumni Research Foundation Anionic charge-dynamic polymers for release of cationic agents
US8815818B2 (en) 2008-07-18 2014-08-26 Rxi Pharmaceuticals Corporation Phagocytic cell delivery of RNAI
CN103429270B (zh) 2008-08-25 2016-11-23 埃克斯雷德制药有限公司 阻止结缔组织生长因子的反义核苷酸及其用途
CA2746527A1 (en) 2008-09-22 2010-03-25 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rna interference in skin indications
CA2745811C (en) 2008-12-04 2021-07-13 Joseph Collard Treatment of tumor suppressor gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to the gene
JP6091752B2 (ja) 2008-12-04 2017-03-08 クルナ・インコーポレーテッド Ｅｐｏに対する天然アンチセンス転写物の抑制によるエリスロポエチン（ｅｐｏ）関連疾患の治療
MX366774B (es) 2008-12-04 2019-07-24 Curna Inc Uso de oligonucleótidos antisentido en la inhibición de transcrito antisentido natural para sirtuina 1.
US9493774B2 (en) 2009-01-05 2016-11-15 Rxi Pharmaceuticals Corporation Inhibition of PCSK9 through RNAi
JP6066035B2 (ja) 2009-02-12 2017-01-25 クルナ・インコーポレーテッド グリア細胞由来神経栄養因子（ｇｄｎｆ）関連疾病の、ｇｄｎｆに対する天然アンチセンス転写物の抑制による治療
US9074210B2 (en) 2009-02-12 2015-07-07 Curna, Inc. Treatment of brain derived neurotrophic factor (BDNF) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to BDNF
US8329882B2 (en) 2009-02-18 2012-12-11 California Institute Of Technology Genetic control of mammalian cells with synthetic RNA regulatory systems
EP2963116B1 (en) 2009-03-04 2020-11-11 CuRNA, Inc. Treatment of sirtuin 1 (sirt1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to sirt 1
US9464287B2 (en) 2009-03-16 2016-10-11 Curna, Inc. Treatment of nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (NRF2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to NRF2
MX2011009752A (es) 2009-03-17 2011-09-29 Opko Curna Llc Tratamiento de enfermedades relacionadas a homologo tipo delta 1(dlk1) por inhibicion de transcrito antisentido natural a homologo tipo delta (dlk1).
US8772238B2 (en) 2009-03-18 2014-07-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of ixolaris, a tissue factor inhibitor, for the treatment of cancer
US9145555B2 (en) 2009-04-02 2015-09-29 California Institute Of Technology Integrated—ligand-responsive microRNAs
EP3248618A1 (en) 2009-04-22 2017-11-29 Massachusetts Institute Of Technology Innate immune suppression enables repeated delivery of long rna molecules
CN102639151B (zh) 2009-05-01 2017-03-22 库尔纳公司 通过针对hbf/hbg的天然反义转录物的抑制治疗血红蛋白（hbf/hbg）相关疾病
WO2010129746A2 (en) 2009-05-06 2010-11-11 Curna, Inc. Treatment of tristetraproline (ttp) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ttp
JP5883782B2 (ja) 2009-05-06 2016-03-15 クルナ・インコーポレーテッド 脂質輸送代謝遺伝子に対する天然アンチセンス転写物の抑制による脂質輸送代謝遺伝子関連疾患の治療
CA2762369C (en) 2009-05-18 2021-12-28 Joseph Collard Treatment of reprogramming factor related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a reprogramming factor
EP2432882B1 (en) 2009-05-22 2019-12-25 CuRNA, Inc. TREATMENT OF TRANSCRIPTION FACTOR E3 (TFE3) and INSULIN RECEPTOR SUBSTRATE 2 (IRS2) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT TO TFE3
CN103221541B (zh) 2009-05-28 2017-03-01 库尔纳公司 通过抑制抗病毒基因的天然反义转录物来治疗抗病毒基因相关疾病
EP2440234A4 (en) 2009-06-10 2013-11-06 Univ New York IMMUNOLOGICAL TARGETING OF PATHOLOGICAL TAU PROTEINS
US8426214B2 (en) * 2009-06-12 2013-04-23 University Of Washington System and method for magnetically concentrating and detecting biomarkers
CA2765700C (en) 2009-06-16 2021-01-05 Opko Curna, Llc Treatment of collagen gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a collagen gene
ES2629339T3 (es) 2009-06-16 2017-08-08 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con la paraoxonasa 1 (pon1) por inhibición de transcrito antisentido natural a pon1
US8859515B2 (en) 2009-06-24 2014-10-14 Curna, Inc. Treatment of tumor necrosis factor receptor 2 (TNFR2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to TNFR2
CN102482672B (zh) 2009-06-26 2016-11-09 库尔纳公司 通过抑制唐氏综合征基因的天然反义转录物治疗唐氏综合征基因相关疾病
US9234199B2 (en) 2009-08-05 2016-01-12 Curna, Inc. Treatment of insulin gene (INS) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an insulin gene (INS)
CA2771172C (en) 2009-08-25 2021-11-30 Opko Curna, Llc Treatment of 'iq motif containing gtpase activating protein' (iqgap) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to iqgap
JP5887270B2 (ja) 2009-09-02 2016-03-16 ジェネンテック， インコーポレイテッド 突然変異体ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄおよびその使用方法
US20130079382A1 (en) 2009-10-12 2013-03-28 Larry J. Smith Methods and Compositions for Modulating Gene Expression Using Oligonucleotide Based Drugs Administered in vivo or in vitro
WO2011050194A1 (en) 2009-10-22 2011-04-28 Genentech, Inc. Methods and compositions for modulating hepsin activation of macrophage-stimulating protein
WO2011052804A1 (en) * 2009-10-30 2011-05-05 Tokyo University Of Science Educational Foundation Administrative Organization Method of delivering agent into target cell
US20120244169A1 (en) 2009-11-06 2012-09-27 Fibrogen, Inc. Treatment for Radiation-Induced Disorders
US9080933B2 (en) 2009-11-09 2015-07-14 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Stimuli-responsive polymer diagnostic assay comprising magnetic nanoparticles and capture conjugates
US20110117668A1 (en) * 2009-11-09 2011-05-19 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Self-powered smart diagnostic devices
JP6220126B2 (ja) * 2009-11-23 2017-10-25 セルリアン・ファーマ・インコーポレイテッド 治療的送達のためのシクロデキストリンに基づく重合体
MX2012006072A (es) 2009-11-30 2012-07-23 Genentech Inc Composiciones y metodos para el diagnostico y el tratamiento de tumores.
AU2010329847A1 (en) 2009-12-11 2012-07-26 Genecode As Methods of facilitating neural cell survival using GDNF family ligand (GFL) mimetics or RET signaling pathway activators
JP6025567B2 (ja) 2009-12-16 2016-11-16 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド 膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位１（ｍｂｔｐｓ１）に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるｍｂｔｐｓ１関連性疾患の治療
WO2011079263A2 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Curna, Inc. Treatment of uncoupling protein 2 (ucp2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ucp2
US8940708B2 (en) 2009-12-23 2015-01-27 Curna, Inc. Treatment of hepatocyte growth factor (HGF) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to HGF
RU2611186C2 (ru) 2009-12-29 2017-02-21 Курна, Инк. ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С ОПУХОЛЕВЫМ БЕЛКОМ 63 (р63), ПУТЕМ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРИРОДНОГО АНТИСМЫСЛОВОГО ТРАНСКРИПТА К р63
RU2615450C2 (ru) 2009-12-29 2017-04-04 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с ядерным респираторным фактором 1(nrf1), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к nrf1
US8946181B2 (en) 2010-01-04 2015-02-03 Curna, Inc. Treatment of interferon regulatory factor 8 (IRF8) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to IRF8
WO2011085066A2 (en) 2010-01-06 2011-07-14 Curna, Inc. Treatment of pancreatic developmental gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a pancreatic developmental gene
CA2786535C (en) 2010-01-11 2019-03-26 Curna, Inc. Treatment of sex hormone binding globulin (shbg) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to shbg
WO2011090971A2 (en) 2010-01-19 2011-07-28 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Osteocalcin as a treatment for male reproductive disorders
RU2611192C2 (ru) 2010-01-25 2017-02-21 Курна, Инк. ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С РНКазой Н1, ПУТЕМ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРИРОДНОГО АНТИСМЫСЛОВОГО ТРАНСКРИПТА К РНКазе Н1
EP2539452B1 (en) 2010-02-22 2016-07-27 CuRNA, Inc. Treatment of pyrroline-5-carboxylate reductase 1 (pycr1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to pycr1
KR20130004579A (ko) 2010-02-23 2013-01-11 제넨테크, 인크. 종양의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 방법
SI2539451T1 (sl) 2010-02-24 2016-04-29 Arrowhead Research Corporation Sestavki za ciljano dostavo sirna
EP2556160A4 (en) 2010-04-09 2013-08-21 Curna Inc TREATMENT OF ILLNESSES ASSOCIATED WITH FIBROBLASTIC GROWTH FACTOR 21 (FGF21) BY INHIBITION OF THE NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT AGAINST FGF21
US8362207B2 (en) 2010-04-16 2013-01-29 Wake Forest University Health Sciences Multi-level specific targeting of cancer cells with IL-13
DK2563920T3 (en) 2010-04-29 2017-05-22 Ionis Pharmaceuticals Inc Modulation of transthyretin expression
BR112012028010A2 (pt) 2010-05-03 2017-09-26 Genentech Inc anticorpo isolado, célula, ácido nucleíco isolado, método de identificação de um primeiro anticorpo que se liga a um epítopo antigênico tat425 ligado or um anticorpo, métodos de inibir o crescimento de uma célula, de tratamento terapêutico de determinação da presença de uma proteína de tat425 e de diagnóstico da presença de um tumor em um mamífero
RU2018110642A (ru) 2010-05-03 2019-02-27 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с сиртуином (sirt), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к сиртуину (sirt)
EP2569430B1 (en) 2010-05-12 2018-10-17 The Trustees of Columbia University in the City of New York Methods for producing enteroendocrine cells that make and secrete insulin
TWI531370B (zh) 2010-05-14 2016-05-01 可娜公司 藉由抑制ｐａｒ４天然反股轉錄本治療ｐａｒ４相關疾病
EP3299464B1 (en) 2010-05-26 2019-10-02 CuRNA, Inc. Treatment of atonal homolog 1 (atoh1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to atoh1
US9057067B2 (en) 2010-07-10 2015-06-16 Kinki University Method for transfecting nucleic acid to cell and nucleic acid complex
NO2593547T3 (bg) 2010-07-14 2018-04-14
DK2625197T3 (en) 2010-10-05 2016-10-03 Genentech Inc Smoothened MUTANT AND METHODS OF USING THE SAME
CA2813901C (en) 2010-10-06 2019-11-12 Curna, Inc. Treatment of sialidase 4 (neu4) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to neu4
US9222088B2 (en) 2010-10-22 2015-12-29 Curna, Inc. Treatment of alpha-L-iduronidase (IDUA) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to IDUA
DK2633052T3 (en) 2010-10-27 2018-07-16 Curna Inc TREATMENT OF INTERFERON-RELATED DEVELOPMENT REGULATOR 1 (IFRD1) -RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENCE TRANSCRIPT TO IFRD1
WO2012061811A2 (en) 2010-11-05 2012-05-10 Fibrogen, Inc. Treatment method for lung remodeling diseases
WO2012065067A2 (en) 2010-11-12 2012-05-18 Georgetown University Immortalization of epithelial cells and methods of use
CN103459599B (zh) 2010-11-23 2017-06-16 库尔纳公司 通过抑制nanog的天然反义转录物而治疗nanog相关疾病
WO2012092341A1 (en) 2010-12-28 2012-07-05 University Of Rochester Methods of modifying insulin signaling using biliverdin reductase (bvr) and bvr derived peptides
SI2670411T1 (sl) 2011-02-02 2019-06-28 Excaliard Pharmaceuticals, Inc. Protismiselne spojine, ki so usmerjene na rastni faktor veznega tkiva (CTGF), za uporabo v postopku zdravljenja keloidov ali hipertrofnih brazgotin
WO2012109495A1 (en) 2011-02-09 2012-08-16 Metabolic Solutions Development Company, Llc Cellular targets of thiazolidinediones
WO2012124688A1 (ja) 2011-03-14 2012-09-20 国立大学法人北海道大学 肺送達のためのベクター、導入剤及び使用
US8658783B2 (en) 2011-04-13 2014-02-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of PTP1B expression
RU2620980C2 (ru) 2011-06-09 2017-05-30 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с фратаксином (fxn), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта fxn
AU2012271357A1 (en) 2011-06-16 2013-05-02 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of fibroblast growth factor receptor 4 expression
EP2753346B1 (en) 2011-09-07 2020-04-22 Mount Sinai School Of Medicine Ceramidase and cell differentiation
AU2012312433B2 (en) 2011-09-20 2017-07-06 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of GCGR expression
US20130085139A1 (en) 2011-10-04 2013-04-04 Royal Holloway And Bedford New College Oligomers
EP2771463A4 (en) 2011-10-25 2015-09-09 Isis Pharmaceuticals Inc ANTISENSE MODULATION OF GCCR EXPRESSION
JP2015511494A (ja) 2012-03-15 2015-04-20 キュアナ，インク． 脳由来神経栄養因子（ｂｄｎｆ）に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるｂｄｎｆ関連の疾患の処置
US9950001B2 (en) 2012-08-20 2018-04-24 The Regents Of The University Of California Polynucleotides having bioreversible groups
EP2943194A1 (en) 2012-09-17 2015-11-18 Chemedest Ltd. Treatment of peripheral neuropathy using gfr(alpha)3 type receptor agonists
WO2014055493A1 (en) 2012-10-02 2014-04-10 Cerulean Pharma Inc. Methods and systems for polymer precipitation and generation of particles
US9694050B2 (en) 2012-10-21 2017-07-04 University Of Rochester THY1 (CD90) as a novel therapy to control adipose tissue accumulation
US10415024B2 (en) 2012-11-16 2019-09-17 Poseida Therapeutics, Inc. Site-specific enzymes and methods of use
US10052364B2 (en) 2013-03-15 2018-08-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Osteocalcin as a treatment for cognitive disorders
US9822418B2 (en) 2013-04-22 2017-11-21 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Mutations in PDGFRB and NOTCH3 as causes of autosomal dominant infantile myofibromatosis
WO2014197938A1 (en) 2013-06-13 2014-12-18 Antisense Therapeutics Ltd Combination therapy
AU2014317961B2 (en) 2013-09-05 2020-07-30 Murdoch University Antisense-induced exon2 inclusion in acid alpha-glucosidase
EP3047023B1 (en) 2013-09-19 2019-09-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Compositions and methods for inhibiting jc virus (jcv)
US9975942B2 (en) 2013-11-11 2018-05-22 Wake Forest University Health Services EPHA3 And multi-valent targeting of tumors
WO2015116902A1 (en) 2014-01-31 2015-08-06 Genentech, Inc. G-protein coupled receptors in hedgehog signaling
WO2015120075A2 (en) 2014-02-04 2015-08-13 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
WO2015171918A2 (en) 2014-05-07 2015-11-12 Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Compositions and uses for treatment thereof
KR102589295B1 (ko) 2014-05-14 2023-10-13 타르그이뮨 테라퓨틱스 아게 개선된 폴리에틸렌이민 폴리에틸렌글리콜 벡터
EP3145550B1 (en) * 2014-05-19 2019-03-27 BioNTech AG Particles comprising protamine and rna in combination with endosome destabilizing agents
US10487314B2 (en) 2014-06-26 2019-11-26 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Inhibition of serotonin expression in gut enteroendocrine cells results in conversion to insulin-positive cells
CN106572974B (zh) 2014-07-15 2021-04-23 生命技术公司 用于将分子有效递送到细胞的具有脂质聚集体的组合物和方法
WO2016033424A1 (en) 2014-08-29 2016-03-03 Genzyme Corporation Methods for the prevention and treatment of major adverse cardiovascular events using compounds that modulate apolipoprotein b
EP3226889A4 (en) 2014-11-19 2018-11-21 The Trustees of Columbia University in the City of New York Osteocalcin as a treatment for frailty associated with aging
JP2018504380A (ja) 2014-12-18 2018-02-15 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｒｅｖｅｒｓｉｒ（商標）化合物
MA41795A (fr) 2015-03-18 2018-01-23 Sarepta Therapeutics Inc Exclusion d'un exon induite par des composés antisens dans la myostatine
EP3302497A4 (en) 2015-06-01 2019-01-16 Sarepta Therapeutics, Inc. EXCLUSION OF EXON INDUCED PAT TECHNOLOGY ANTISENSE IN COLLAGEN TYPE VII
DK3310909T3 (da) 2015-06-17 2021-09-13 Poseida Therapeutics Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til at føre proteiner til specifikke loci i genomet
US10954300B2 (en) 2015-09-28 2021-03-23 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Use of pentoxifylline with immune checkpoint-blockade therapies for the treatment of melanoma
EP3359668A4 (en) 2015-10-09 2019-06-05 Sarepta Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATING DUCHENNE MUSCLE DYSTROPHY AND ASSOCIATED ILLNESSES THEREOF
US11273151B2 (en) 2015-11-04 2022-03-15 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Methods of treating tumors and cancer, and identifying candidate subjects for such treatment
EP3370734B1 (en) 2015-11-05 2023-01-04 Children's Hospital Los Angeles Antisense oligo for use in treating acute myeloid leukemia
EP3411396A1 (en) 2016-02-04 2018-12-12 Curis, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
EP3445405A4 (en) 2016-04-18 2019-12-18 Sarepta Therapeutics, Inc. ANTISENSE OLIGOMERS AND METHOD FOR USE THEREOF TO TREAT DISEASES RELATING TO THE ACID ALPHA GLUCOSIDASE GENE
WO2017189730A1 (en) 2016-04-26 2017-11-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Treatment of hippo pathway mutant tumors and methods of identifying subjects as candidates for treatment
JP2019532027A (ja) 2016-08-17 2019-11-07 ソルスティス バイオロジクス，リミティッド ポリヌクレオチド構築物
US10994025B2 (en) 2017-05-12 2021-05-04 Massachusetts Institute Of Technology Argonaute protein-double stranded RNA complexes and uses related thereto
WO2019006455A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Solstice Biologics, Ltd. AUXILIARIES OF CHIRAL PHOSPHORAMIDITIS AND METHODS OF USE THEREOF
US11555189B2 (en) 2017-10-18 2023-01-17 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense oligomer compounds
WO2019126578A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for directing proteins to specific loci in the genome
AU2019247490A1 (en) 2018-04-06 2020-10-22 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for somatic cell reprogramming and modulating imprinting
JP2024516168A (ja) 2021-04-22 2024-04-12 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド がんを治療するための組成物および方法

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IN165717B (bg) * 1986-08-07 1989-12-23 Battelle Memorial Institute
US5166320A (en) * 1987-04-22 1992-11-24 University Of Connecticut Carrier system and method for the introduction of genes into mammalian cells
US5428132A (en) * 1987-10-11 1995-06-27 United States Of America Conjugate and method for integration of foreign DNA into cells
US5192553A (en) * 1987-11-12 1993-03-09 Biocyte Corporation Isolation and preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood and methods of therapeutic use
US5149782A (en) * 1988-08-19 1992-09-22 Tanox Biosystems, Inc. Molecular conjugates containing cell membrane-blending agents
US5354844A (en) * 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US5108921A (en) * 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5240846A (en) * 1989-08-22 1993-08-31 The Regents Of The University Of Michigan Gene therapy vector for cystic fibrosis
JPH03127622A (ja) * 1989-10-09 1991-05-30 Green Cross Corp:The ｐＨ感受性リポソーム
ES2078521T3 (es) * 1990-05-18 1995-12-16 Boehringer Ingelheim Int Nuevos conjugados de proteina-polication.
AU660629B2 (en) * 1990-10-01 1995-07-06 University Of Connecticut, The Targeting viruses and cells for selective internalization by cells
WO1992019749A1 (en) * 1991-05-03 1992-11-12 The Board Of Regents Acting For And On Behalf Of The University Of Michigan Targeted delivery of genes encoding cell surface receptors
JPH06510524A (ja) * 1991-05-14 1994-11-24 ユニバーシティ オブ コネチカット 免疫原性タンパク質をコードする遺伝子の標的への配達
DE69231385T2 (de) * 1991-06-05 2001-04-12 Univ Connecticut Storrs Zielgerichtete freisetzung von genen, die sekretorische proteine kodieren
EP0666923A1 (en) * 1991-09-05 1995-08-16 The University Of Connecticut Targeted delivery of poly- or oligonucleotides to cells
NZ244306A (en) 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
US5521291A (en) * 1991-09-30 1996-05-28 Boehringer Ingelheim International, Gmbh Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
US5981273A (en) 1991-09-30 1999-11-09 Boehringer Ingelheim Int'l. Gmbh Composition comprising an endosomolytic agent for introducing nucleic acid complexes into higher eucaryotic cells
US5225182A (en) * 1991-10-31 1993-07-06 Sharma Yash P Vectored drug delivery system using a cephaloplastin linking agent and a methed of using the system
US5922859A (en) 1992-02-01 1999-07-13 Boehringer Ingelheim International Gmbh Complexes containing nucleic acid which can be taken-up by endocytosis into higher eukaryotic cells
US5583020A (en) * 1992-11-24 1996-12-10 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Permeability enhancers for negatively charged polynucleotides
WO1994017832A1 (en) 1993-02-09 1994-08-18 The Scripps Research Institute Targeting and delivery of genes and antiviral agents into cells by the adenovirus penton
DE4311651A1 (de) 1993-04-08 1994-10-13 Boehringer Ingelheim Int Virus für den Transport von Fremd-DNA in höhere eukaryotische Zellen
DE4335025A1 (de) 1993-10-14 1995-04-20 Boehringer Ingelheim Int Endosomolytisch wirksame Partikel
US5928944A (en) 1994-02-04 1999-07-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of adenoviral-medicated cell transfection

Also Published As

Publication number Publication date
HU211925A9 (en) 1996-01-29
IL103171A (en) 2003-04-10
ES2173083T3 (es) 2002-10-16
MX9205543A (es) 1993-05-01
EE03195B1 (bg) 1999-06-15
CZ293141B6 (cs) 2004-02-18
FI941474A (fi) 1994-03-30
BR9206559A (pt) 1994-11-08
NO316744B1 (no) 2004-04-26
HU9400898D0 (en) 1994-06-28
PL180304B1 (pl) 2001-01-31
NO941154L (no) 1994-03-29
HK1013104A1 (en) 1999-08-13
CZ74694A3 (en) 1995-05-17
ATE215990T1 (de) 2002-04-15
HU218846B (hu) 2000-12-28
CN1059705C (zh) 2000-12-20
NO941154D0 (no) 1994-03-29
SG44680A1 (en) 1997-12-19
US5547932A (en) 1996-08-20
AU671084B2 (en) 1996-08-15
HUT71312A (en) 1995-11-28
US6274322B1 (en) 2001-08-14
BG62740B1 (bg) 2000-06-30
US6022735A (en) 2000-02-08
CA2118816A1 (en) 1993-03-31
SK36894A3 (en) 1994-08-10
NZ244306A (en) 1995-07-26
DK0607206T3 (da) 2002-08-05
IL103171A0 (en) 1993-02-21
RO117861B1 (ro) 2002-08-30
WO1993007283A1 (de) 1993-04-15
AU2652692A (en) 1993-05-03
CN1070946A (zh) 1993-04-14
SK281682B6 (sk) 2001-06-11
US6077663A (en) 2000-06-20
SI9200236B (sl) 2002-10-31
CA2118816C (en) 2003-06-17
EP0607206A1 (de) 1994-07-27
DE59209951D1 (de) 2002-05-16
EP0545016A1 (de) 1993-06-09
FI941474A0 (fi) 1994-03-30
JPH10506001A (ja) 1998-06-16
PT607206E (pt) 2002-07-31
EP0607206B1 (de) 2002-04-10
SI9200236A (en) 1993-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BG98718A (bg) Състав за въвеждане на комплекси на нуклеинови киселини в по-висши еукариотни клетки
Lubin et al. Engraftment and development of human T and B cells in mice after bone marrow transplantation
HU230488B1 (hu) Simian adenovírus nukleinsav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására
US5981273A (en) Composition comprising an endosomolytic agent for introducing nucleic acid complexes into higher eucaryotic cells
CA2114800A1 (en) New conjugates for the introduction of nucleic acid into higher eukaryotic cells
HU228121B1 (en) Corona-virus-like particles comprising functionally deleted genomes
JPH05505306A (ja) 組換えアデノウイルス
JP2703538B2 (ja) 偽狂犬病ウイルス突然変異体、それを含有するワクチン、その生産法およびその使用法
CN109678965A (zh) 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、cd22-cd19双靶向性的t细胞及其应用
BG61080B1 (bg) Модифициран биологичен материал
US11851671B2 (en) Programmable assembly of virus composites for receptor-targeted gene delivery
JPH04500312A (ja) 自己アセンブルド欠損非自己増殖性ウイルス粒子
CN110157676A (zh) 一种靶向性t淋巴细胞及其制备方法和应用
JPH05505944A (ja) 修飾肝細胞およびその用途
JP4014628B2 (ja) 後天性疾患治療用の新規移植組織片および新規ベクター
HU227667B1 (en) Novel expression vectors and uses thereof
KR100241685B1 (ko) 핵산 복합체를 고등 진핵세포내로 도입시키기 위한 조성물
CN110526990A (zh) 靶向cd30的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
AU708073B2 (en) Improvements in or relating to protection against intracellular infection
KR20190103792A (ko) Il-7을 포함하는 돼지열병바이러스의 치료 및 예방용 조성물
CN110526986A (zh) 靶向cd30的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
HRP920602A2 (hr) Sastav za uvođenje kompleksa nukleinskih kiselina u više eukariotične stanice