JP2009535383A - 強く結合した塩基で修飾されたオリゴヌクレオチドと人工ヌクレアーゼを組み合わせたアンチセンス作用物質 - Google Patents

Abstract

本発明は、キレート部分とオリゴヌクレオチド配列を有し、オリゴヌクレオチドが１つまたは複数の修飾核酸塩基（例えば、ヒドロキシ基で置換された核酸塩基）を含む化合物を提供する。開示された化合物は、アンチセンス療法に適している。キレート部分は、ランタニド金属のイオンと複合体を形成できる。これらの化合物は、核酸の有効な翻訳阻害因子であり、標的核酸に対する増加した結合親和性を有する。本発明は、組成物およびこれらの組成物をアンチセンス療法として使用する方法をさらに含む。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により組み込まれている、２００６年５月３日出願の米国仮出願第６０／７９７，４４８号の利益を主張するものである。

本発明は、特異的に修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡの塩基を含み、高度に選択的な人工ヌクレアーゼ活性を有するランタニドの有機複合体と結合したオリゴヌクレオチド類似体の分野に関する。

オリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチドの使用は、現代の治療において非常に重要であり、多数の文献が存在する（Uhlmann他、「Antisense oligonucleotides: A new therapeutic principle」、Chemical Reviews、1990年、90、543〜584頁；Crooke他、「Antisense Research and Applications」、CRC Press(1993年)；Mesmaekar他、「Antisense oligonucleotides」、Acc. Chem. Res.、1995年、28、366〜374頁；Stein、「The experimental use of antisense oligonucleotides: a guide for the perplexed」、J. Clin. Invest.、2001年、108、641〜644頁）。アンチセンスポリヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡの標的に特異的に結合することにより、核酸の複製、転写または翻訳を不活性化でき、それにより、癌およびウィルス感染などの疾患を抑制する機序がもたらされる。したがって、アンチセンスヌクレオチドの標的への結合は、様々な状況での遺伝子発現の改変に、例えばウィルスのライフサイクルまたは癌細胞の成長への干渉に使用できる。

相補的標的ヌクレオチド配列への特異的結合親和性に加えて、アンチセンスヌクレオチドは、効能、生物学的利用能、低毒性および低コストを含む、治療目的のための必要条件を満たすべきである。天然のリン酸ジエステル骨格を有するオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼに対して不安定であり、細胞膜を容易には貫通できないので、研究者らは、ヌクレアーゼ耐性および細胞内への取り込みを改善する、ポリヌクレオチド骨格の修飾を試みた。したがって、ヌクレアーゼ耐性および細胞内への取り込みが増進され、一方核酸とのそれらの特異的相互作用および／またはそれらの触媒活性を維持した、ポリヌクレオチド類似体を提供することが望ましい。

研究は、ヌクレアーゼ活性に対する高度な耐性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの化学的修飾の開発を対象とした（Mesmaekar、他「Antisense oligonucleotides」、Acc. Chem. Res.、1995年、28、366〜374頁；Crooke ST、「Progress in antisense therapeutics」、Med. Res. Rev.、1996年、16、319〜344頁）。例えば、一研究（Wang他、「Sugar modified nucleosides and oligonucleotides」米国特許第５，６８１，９４０号、1997年10月28日）は、様々な新規の糖により修飾されたヌクレオシド、および対応する糖により修飾された、アンチセンス、診断または他の目的のために使用する場合に、天然のＲＮＡおよびＤＮＡのオリゴヌクレオチドを超える特性を有する、オリゴヌクレオチドを提供する。様々な他の修飾ヌクレオチドが、潜在的アンチセンス薬として提示されている（Iyer、「Reagents and process for synthesis of oligonucleotides containing phosphorodithioate internucleoside linkages」、米国特許第６，１１７，９９２号、2000年9月12日；Meyer他「Oligonucleotides containing pyrazolo[3,4-d]pyrimidines for hybridization and mismatch discrimination" 米国特許第６，１２７，１２１号、2000年10月3日；Froehler他、「Enhanced triple-helix and double-helix formation directed by oligonucleotides containing modified pyrimidines」、米国特許第６，２３５，８８７号、2001年5月22日；Cook他、「Substituted purines and oligonucleotide cross-linking」、米国特許第６，２３２，４６３号、2001年5月15日；Short、「Modified nucleotides and methods useful for nucleic acid sequencing」米国特許第６，５７９，７０４号、2003年6月17日）。

オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ生存能力を減少させるための興味深い研究は、リン酸ジエステル結合を静電的に保護する、双性イオン塩基型の含有による修飾を介するものである（Switzer、「Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides」、米国特許第５，５９６，０９１号、1997年1月21日；Switzer、「Antisense oligonucleotide containing compositions and method of forming duplexes」、米国特許第６，０３１，０８６号、2000年2月29日）。

分子モデリングならびに添付の実験により、特定の修飾されたプリンおよびピリミジン塩基（例えば、１−メチル−５−ヒドロキシシトシンおよびそのアニオン型である１−メチル−５−ブロモウラシルおよび２−アミノ−９−メチルプリン）が、相補的天然核酸塩基と強く結合する双性イオン互変異性体を有することが実証されている（Suen他、「Identification by UV resonance Raman spectroscopy of an imino tautomer of 5-hydroxy-2'-deoxycytidine, a powerful base analog transition mutagen with a much higher unfavored tautomer frequency than that of the natural residue 2'-deoxycytidine.」、Proc. Natl. Acad. Sci. 、USA、1999年、96、4500〜4505頁；Karelson他、「Quantum-Chemical Modeling of the Tautomeric Equilibria of Modified Anionic Nucleic Acid Bases」、ARKIVOC、2001年3月、51〜62頁）。

さらに、核酸を触媒的に加水分解できる有機−金属複合体の設計が非常に注目されている（Morrow、「Artificial Ribonucleases」、Adv. Inorg: Biochem.、1994年、9、41〜74頁；Magda、「Metal Complex Conjugates of Antisense DNA Which Display Ribozyme-Like Activity.」、J. Am. Chem. Soc. 1997年、119、6947〜6948頁；Komiyama、「Progress towards synthetic enzymes for phosphoester hydrolysis」、Current Opinion in Chemical Biology、1998年、2、751〜757頁；Hegg、「Toward the development of metal-based synthetic nucleases and peptidases: a rationale and progress report in applying the principles of coordination chemistry」、Coord. Chem. Revs. 1998年、173、133〜165頁；Trawick他、「Inorganic Mimics of Ribonucleases and Ribozymes: From Random Cleavage to Sequence-Specific Chemistry to Catalytic Antisense Drugs」、 Chem. Rev.、1998年、98、939〜960頁）。特定のランタニド（例えば、ランタン、ユーロピウム、セリウム、ガドリニウム）の複合体は、天然酵素と同程度またはそれより高いホスホジエステラーゼ活性を有する（Bing Zhua他、「Binuclear lanthanide complexes as catalysts for the hydrolysis of double-stranded DNA」、Inorg. Chem. Communs.、1999年、2、351〜353頁；Williams他、「Structure and Nuclease Activity of Simple Dinuclear Metal Complexes: Quantitative Dissection of the Role of Metal Ions」、Acc. Chem. Res.、1999年、32、485〜493頁；Haner他、「Development of Artificial Ribonucleases Using Macrocyclic Lanthanide Complexes」、Chimia 2000年、54、569〜573頁；Kuzuya他、「Conjugation of Various Acridines to DNA for Site-Selective RNA Scission by Lanthanide Ion」、Bioconjugate Chem. 、2002年、13、365〜369頁；Canaple他、「Artificial Ribonucleases: Efficient and Specific in Vitro Cleavage of Human c-raf-1 RNA」、Bioconjugate Chem.、2002年、13、945〜951頁；Shigekawa他、「Extended x-ray absorption fine structure study on the cerium (IV)-induced DNA hydrolysis: Implication to the roles of 4 f orbitals in the catalysis」、Appl. Phys. Lett.、1999年、74、460〜462頁）。

合成ＲＮＡエステル転移反応触媒を提供する、１つの有望な方法は、触媒的切断基の結合を介して有効かつ選択的な変異原性および抗ウィルス性の触媒にした、より強力なアンチセンスオリゴヌクレオチドの作製による方法である（Hall他、「Efficient sequence-specific cleavage of RNA using novel europium complexes conjugated to oligonucleotides」、Chemistry & Biology、1994年、1、185〜190頁；Komiyama、「Sequence-specific and hydrolytic scission of DNA and RNA by lanthanide complex-oligoDNA hybrids」、J. Biochem.、1995年、118、665〜670頁；Hall他、「Towards artificial ribonucleases: The sequence-specific cleavage of RNA in a duplex」、Nucl. Acid Res.、1996年、24、3522〜3526頁；Hall他、「Sequence-specific cleavage of RNA using macrocyclic lanthanide complexes conjugated to oligonucleotides: A structure activity study」、Nucleosides & Nucleotides、1997年、16、1357〜1368；Haner他「The sequence-specific cleavage of RNA by artificial chemical ribonucleases」、Antisense and nucleic acid drug development, 1997年、7、423〜430頁；Baker他、「Oligonucleotide -europium complex conjugate designed to cleave the 5' cap structure of the ICAM-1 transcript potentiates antisense activity in cells」、Nucl. Acid Res., 1999年、17、1547〜1551；Haner他、「Functional terpyridine-metal complexes, a process for the preparation thereof and oligonucleotide conjugates with terpyridine-metal complexes」、米国特許第５，９２５，７４４号、1999年7月20日；Morrow、「Metal complexes for promoting catalytic cleavage of RNA by transesterification」、米国特許第５，６８４，１４９号、1997年11月4日）。１つまたは２つの指定部位におけるＲＮＡの選択的切断のための人工酵素は、ランタニド（ＩＩＩ）イオンを、１つまたは２つのアクリジン基を担持するオリゴヌクレオチドと組み合わせることにより調製されている（Kuzuya他、「Conjugation of Various Acridines to DNA for Site-Selective RNA Scission by Lanthanide Ion」、Bioconjugate Chem、2002年、13、365〜369頁；Kuzuya他、「Selective activation of two sites in RNA by acridine-bearing oligonucleotides for clipping of designated RNA fragments」、J. Am. Chem. Soc.、2004年、126、1430〜1436頁）。
米国仮出願第６０／７９７，４４８号 Uhlmann他、「Antisense oligonucleotides: A new therapeutic principle」、Chemical Reviews、1990年、90、543〜584頁 Crooke他、「Antisense Research and Applications」、CRC Press (1993年) Mesmaekar他、「Antisense oligonucleotides」、Acc. Chem. Res.、1995年、28、366〜374頁 Stein、「The experimental use of antisense oligonucleotides: a guide for the perplexed」、J. Clin. Invest.、2001年、108、641〜644頁） Crooke ST、「Progress in antisense therapeutics」、Med. Res. Rev.、1996年、16、319〜344頁 Wang他、「Sugar modified nucleosides and oligonucleotides」米国特許第５，６８１，９４０号、1997年10月28日 Iyer、「Reagents and process for synthesis of oligonucleotides containing phosphorodithioate internucleoside linkages」、米国特許第６，１１７，９９２号、2000年9月12日 Meyer他「Oligonucleotides containing pyrazolo[3,4-d]pyrimidines for hybridization and mismatch discrimination" 米国特許第６，１２７，１２１号、2000年10月3日 Froehler他、「Enhanced triple-helix and double-helix formation directed by oligonucleotides containing modified pyrimidines」、米国特許第６，２３５，８８７号、2001年5月22日 Cook他、「Substituted purines and oligonucleotide cross-linking」、米国特許第６，２３２，４６３号、2001年5月15日 Short、「Modified nucleotides and methods useful for nucleic acid sequencing」米国特許第６，５７９，７０４号、2003年6月17日） Switzer、「Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides」、米国特許第５，５９６，０９１号、1997年1月21日 Switzer、「Antisense oligonucleotide containing compositions and method of forming duplexes」、米国特許第６，０３１，０８６号、2000年2月29日 Suen他、「Identification by UV resonance Raman spectroscopy of an imino tautomer of 5-hydroxy-2'-deoxycytidine, a powerful base analog transition mutagen with a much higher unfavored tautomer frequency than that of the natural residue 2'-deoxycytidine.」、Proc. Natl. Acad. Sci. 、USA、1999年、96、4500〜4505頁 Karelson他、「Quantum-Chemical Modeling of the Tautomeric Equilibria of Modified Anionic Nucleic Acid Bases」、ARKIVOC、2001年、3、51〜62頁 Morrow、「Artificial Ribonucleases」、Adv. Inorg: Biochem.、1994年、9、41〜74頁 Magda、「Metal Complex Conjugates of Antisense DNA Which Display Ribozyme-Like Activity.」、J. Am. Chem. Soc. 1997年、119、6947〜6948頁 Komiyama、「Progress towards synthetic enzymes for phosphoester hydrolysis」、Current Opinion in Chemical Biology、1998年、2、751〜757頁 Hegg、「Toward the development of metal-based synthetic nucleases and peptidases: a rationale and progress report in applying the principles of coordination chemistry」、Coord. Chem. Revs. 1998年、173、133〜165頁 Trawick他、「Inorganic Mimics of Ribonucleases and Ribozymes: From Random Cleavage to Sequence-Specific Chemistry to Catalytic Antisense Drugs」、 Chem. Rev.、1998年、98、939〜960頁 Bing Zhua他、「Binuclear lanthanide complexes as catalysts for the hydrolysis of double-stranded DNA」、Inorg. Chem. Communs.、1999年、2、351〜353頁 Williams他、「Structure and Nuclease Activity of Simple Dinuclear Metal Complexes: Quantitative Dissection of the Role of Metal Ions」、Ace. Chem. Res.、1999年、32、485〜493頁 Haner他、「Development of Artificial Ribonucleases Using Macrocyclic lanthanide Complexes」、Chimia 2000年、54、569〜573頁 Kuzuya他、「Conjugation of Various Acridines to DNA for Site-Selective RNA Scission by lanthanide Ion」、Bioconjugate Chem. 、2002年、13、365〜369頁 Canaple他、「Artificial Ribonucleases: Efficient and Specific in Vitro Cleavage of Human c-raf-1 RNA」、Bioconjugate Chem.、2002年、13、945〜951頁 Shigekawa他、「Extended x-ray absorption fine structure study on the cerium(IV)-induced DNA hydrolysis: Implication to the roles of 4 f orbitals in the catalysis」、Appl. Phys. Lett.、1999年、74、460〜462頁 Hall他、「Efficient sequence-specific cleavage of RNA using novel europium complexes conjugated to oligonucleotides」、Chemistry & Biology、1994年、1、185〜190頁 Komiyama、「Sequence-specific and hydrolytic scission of DNA and RNA by lanthanide complex-oligoDNA hybrids」、J. Biochem.、1995年、118、665〜670頁 Hall他、「Towards artificial ribonucleases: The sequence-specific cleavage of RNA in a duplex」、Nucl. Acid Res.、1996年、24、3522〜3526頁 Hall他、「Sequence-specific cleavage of RNA using macrocyclic lanthanide complexes conjugated to oligonucleotides: A structure activity study」、Nucleosides & Nucleotides、1997年、16、1357〜1368頁 Haner他「The sequence-specific cleavage of RNA by artificial chemical ribonucleases」、Antisense and nucleic acid drug development, 1997年、7、423〜430頁 Baker他、「Oligonucleotide-europium complex conjugate designed to cleave the 5' cap structure of the ICAM-1 transcript potentiates Antisense activity in cells」、Nucl. 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本発明は、オリゴヌクレオチドを有する化合物に関し、該オリゴヌクレオチドは、相補的核酸に対するそれらの結合能力を増加させ、ホスホジエステラーゼ活性をもたらし得る修飾核酸塩基および／またはキレート部分を含む。開示された化合物のオリゴヌクレオチド部分における修飾核酸塩基の数の特性に応じて、相補的標的核酸に対する該化合物の結合能力は、通常の相補的オリゴヌクレオチドと比較して１０^３〜１０^９倍まで増加させることができる。結合におけるこのような増加は、工業的、予防的、治療的または他の目的において作用物質をより低濃度で用いることが可能である。さらに、またはあるいは、金属イオンと複合体を形成できるキレート基により修飾した本発明の化合物は、相補鎖と複合体を形成し、リン酸ジエステル結合の切断を触媒し、別の相補鎖で反復できるので、その触媒活性により、（従来のアンチセンス治療化合物と比較して）化合物の有効濃度をより低くすることができる。

本発明の材料は、限定するものではないが、宿主または病原体の遺伝子発現の診断、治療および調節を含む、アンチセンス核酸を用いる、またはその後用いることのある、すべての種類の行為において有用である。

本発明の材料はまた、結合力が非常に強いため、標的核酸の検出および／または定量化のための検出プローブとして有用である。

したがって、本発明の一態様は、キレート部分および約５から約１５０個の核酸塩基のオリゴヌクレオチドを有する化合物であり、該オリゴヌクレオチドは双性イオン互変異性体、イオン互変異性体、メルカプト基で置換された核酸塩基またはヒドロキシ基で置換された核酸塩基などの少なくとも１つの修飾核酸塩基をさらに含む。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約１０から約１００個の核酸塩基、より好ましくは約１０から約５０個の核酸塩基、最も好ましくは約２０から約３０個の核酸塩基を有する。ある場合には、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの修飾核酸塩基を有する。好ましい実施形態において、修飾核酸塩基は、メルカプト基で置換された核酸塩基および／またはヒドロキシ基で置換された核酸塩基である。ある実施形態において、ヒトロキシ基で置換された核酸塩基は、化合物の核酸塩基の総数の約１０％から約２０％である。好ましい実施形態において、ヒドロキシ基で置換された核酸塩基は、５−ヒドロキシシトシン、５−ヒドロキシウラシル、８−ヒドロキシアデニンもしくは８−ヒドロキシグアニンであり、一方で、メルカプト基で置換された核酸塩基は、５−メルカプトシトシン、５−メルカプトウラシル、８−メルカプトグアニンもしくは８−メルカプトアデニンである。

本明細書中で使用する場合、キレート部分は、化合物の、金属のイオンと複合体を形成できる部分である。好ましい実施形態において、金属はランタニドであり、より好ましい実施形態において、金属はランタン、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユーロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウムおよびルテチウムからなる群より選択される。特に好ましい金属は、ユーロピウムおよびランタンである。好ましいキレート部分は、以下から選択される式を有するものである。

式中、Ｒは化合物のオリゴヌクレオチド部分である。Ｒ^１およびＲ^３は水素、Ｃ_１〜８のアルカン、Ｃ_２〜８のアルケン、Ｃ_２〜８のアルキン、アシルＣ_１〜８アルカン、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１〜８アルキルアリールまたはＣ_１〜８アルキルヘテロアリールであってよい。Ｒ^２は、Ｃ_１〜８のアルキル、Ｃ_２〜８のアルケン、Ｃ_２〜８のアルキン、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１〜８アルキルアリール、Ｃ_１〜８アルキルヘテロアリールまたはアシルＣ_１〜８アルカンであってよい。具体的な一実施形態において、キレート部分は、
であり、式中、Ｒ^１はいずれも２，２，２−トリフルオロアセチルであり、Ｒはオリゴヌクレオチドである。

本発明の別の態様は、本明細書中に開示した化合物と、薬剤的に許容可能な担体とを含む組成物である。いくつかの実施形態において、組成物は、リポソームなどの送達媒体をさらに含む。

本発明のさらに別の態様は、本明細書中に記載した化合物を用いて、標的核酸の翻訳を阻害する方法である。例えば、このような方法は、標的核酸を本発明の化合物と、化合物と標的核酸とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触させることを含み、ハイブリダイズした化合物が標的核酸の翻訳を阻害する。ある場合には、化合物は標的核酸の結合を切断する。ある実施形態において、標的核酸は、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、標的核酸は生物内にあり、接触させることは、本発明の化合物と薬剤的に許容可能な担体とを含む組成物を生物に投与することを含む。あるいは、他の実施形態において、接触させることは、本発明の化合物と、標的核酸を含む生物由来の生体試料とを混合することを含む。ある場合には、該生物はヒトまたは動物である。具体的な実施形態において、該ヒトまたは動物は、ウィルス感染、細菌感染、微生物感染、真菌感染または癌を患っている。

本発明のさらに別の態様は、生物内で核酸の翻訳を阻害する方法であって、生物内の標的核酸の核酸配列を予測または決定することと、生物に、本発明の化合物と薬剤的に許容可能な担体とを含む組成物を投与することとを含む方法である。ある場合には、組成物はリポソームなどの送達媒体をさらに含む。組成物中の投与化合物は、ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な条件下で、標的核酸のヌクレオチド配列と該生物内でハイブリダイズするのに十分相補的であるヌクレオチド配列を含み、それにより該生物内で核酸の翻訳が阻害される。ある場合には、化合物のヌクレオチド配列は、標的核酸の配列の全部または一部に十分相補的である。

本発明のさらに別の態様は、ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な条件下で、標的核酸の翻訳を阻害する化合物を作製する方法であって、（ａ）標的核酸のヌクレオチド配列を決定することと、（ｂ）標的核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的であるオリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであって、５から１５０個の核酸塩基であり、少なくとも１つの核酸塩基が、５−ヒドロキシシトシン、５−ヒドロキシウラシル、８−ヒドロキシアデニンおよび８−ヒドロキシグアニンから選択されるヒドロキシ基で置換された核酸塩基であるオリゴヌクレオチドに結合したキレート部分を含む化合物を合成することと、（ｃ）化合物を、ランタン、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユーロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウムおよびルテチウムから選択される金属イオンと混合することとを含む方法である。いくつかの実施形態において、キレート部分は式、
を有し、式中、Ｒは化合物のオリゴヌクレオチド部分である。Ｒ^１およびＲ^３は、水素、Ｃ_１〜８のアルカン、Ｃ_２〜８のアルケン、Ｃ_２〜８のアルキン、アシルＣ_１〜８アルカン、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１〜８アルキルアリールまたはＣ_１〜８アルキルヘテロアリールであってよい。Ｒ^２は、Ｃ_１〜８のアルキル、Ｃ_２〜８のアルケン、Ｃ_２〜８のアルキン、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１〜８アルキルアリール、Ｃ_１〜８アルキルヘテロアリールまたはアシルＣ_１〜８アルカンであってよい。具体的な実施形態において、ハイブリダイゼーションを可能にするために十分な条件は、ヒトの生理的条件である。

前述に加えて、本発明は、追加の態様として、上述の具体的な変形より多少なりとも範囲が狭い本発明の全ての実施形態を含む。例えば、本発明の態様は、属または数値範囲を略して参照することにより記載することもあるが、いずれの属および各数値または範囲内の小領域の各要素も本発明の態様として意図されると解釈するべきである。同様に、本発明の様々な態様および特徴を組み合せて、本発明の範囲内であると意図される、ここには記載されない態様および特徴で実施することができる。本出願人（ら）は、添付の特許請求の範囲の全範囲を発明したが、添付の特許請求の範囲はそれらの範囲に他者の先行技術を包含する意図のものではない。したがって、特許庁あるいは他団体または個人により、本出願人（ら）が特許請求の範囲内に法定の先行技術を指摘された場合、適用される特許法の下に補正の権利を行使する権利を保有し、このような特許請求の範囲の主題を再定義し、法定先行技術または明らかな法定先行技術の変形をこのような特許請求の範囲から明確に排除する。このような特許請求の範囲の補正により定義された本発明の変形もまた、本発明の態様として意図される。

本発明は、キレート部分ならびに、アンチセンス、診断およびオリゴヌクレオチドを用いる他の方法における使用のための特性を有するオリゴヌクレオチドを含む、新規な化合物を提供する。本発明の化合物は、（ａ）天然核酸塩基に対して高度な結合効率を有する１つまたは複数の修飾核酸塩基、および（ｂ）１つまたは複数のキレート部分、を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。これらの化合物は、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡのリン酸ジエステル結合を加水分解でき、アンチセンス療法において有用である。

本発明の文脈において、「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）あるいはこれらの模倣体、キメラ、類似体および相同体のオリゴマーまたはポリマーを指す。この用語は、天然発生の核酸塩基、糖およびヌクレオシド（骨格）間の共有結合から成るオリゴヌクレオチド、ならびに例えば標的核酸とハイブリダイズする、または相補的オリゴヌクレオチドと相互作用する場合に、天然発生オリゴヌクレオチドと同じような方法で機能する、非天然発生部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。このような修飾された、または置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば、細胞内への取り込みの増進、標的核酸に関する親和性の増強およびヌクレアーゼの存在下における安定性の向上などの望ましい特性のため、多くの場合天然型より好ましい。

生物学的対応物（例えば、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡまたはＤＮＡ）に対する本発明の化合物の結合効率は、修飾核酸塩基または双性イオン互変異性体またはイオン互変異性体を有する他の類似体を組み込むことを通じて得られる。本発明の化合物は、修飾核酸塩基あるいは双性イオン互変異性体またはイオン互変異性体を有する他の類似体を有する、少なくとも１つの核酸塩基を有する。好ましい実施形態において、修飾核酸は、５−ヒドロキシシトシン、５−ヒドロキシウラシル、８−ヒドロキシアデニンおよび８−ヒドロキシグアニンから選択されたヒドロキシ基で置換された核酸塩基あるいは５−メルカプトシトシン、５−メルカプトウラシル、８−メルカプトグアニンおよび８−メルカプトアデニンから選択されたメルカプト基で置換された核酸塩基である。

一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の、式（スキーム１）を有する５−ヒドロキシウラシルのアニオン（１）の互変異性型を含む。

式中、Ｒは、本発明の残りの化合物に関する。半経験的分子軌道法であるＡＭ１およびＰＭ３ならびに非経験的分子軌道法であるＳＣＦおよびＤＦＴ（ＢＬＹＰ／６−３１＋Ｇ（ｄ））の計算結果により、溶液中における１−メチル−５−ヒドロキシウラシルのアニオンの最も安定な互変異性体が、５位に不活性なＯＨ基を有する型（１ｂ）であることが示唆される。Ｎ３位に水素原子が欠けているため、１−メチル−５−ヒドロキシウラシルのアニオンの互変異性体１ｂとアデニンとの通常のペアリングは機能しない。しかし、１−メチル−５−ヒドロキシウラシルのアニオン１ｂの互変異性型は、非ワトソンクリック塩基対としてグアニンと強く結合した複合体を作製する（スキーム２）。

１−メチル−５−ヒドロキシウラシルのアニオン１ｂのＣ４位のカルボニル（オキシアニオンに近い）の実質的に負の電荷のため、この塩基対は、天然のグアニン−シトシン塩基対より実質的により強く結合するであろう。計算により、グアニンと１−メチル−５−ヒドロキシウラシルのアニオンとの非ワトソンクリック塩基対が、通常のグアニン−シトシン塩基対より２〜４ｋｃａｌ／ｍｏｌ安定であることが明らかである。

別の実施形態において、本発明の化合物は、ヒドロキシ基で置換された塩基である５−ヒドロキシシトシン（２）を含む。５−ヒドロキシシトシン（２）のアニオンの互変異性型をスキーム３に示し、式中、Ｒは先と同様に残りの化合物を意味する。

１−メチル−５−ヒドロキシシトシンのアニオンの場合、構造２ｂが溶液中で最も安定な互変異性型である。アニオンのこのＮ−Ｈ型は、Ｃ２位のカルボニル酸素原子に実質的に負の電荷を有する。結果として、グアニンを有するそれぞれの塩基対（スキーム４）は、通常のグアニン−シトシン塩基対より有意に非常に強く結合している。

ＡＭ１ ＳＣＲＦの計算により、異常なグアニン−互変異性体２ｂ塩基対は、通常のグアニン−シトシンワトソンクリック塩基対より５．４２ｋｃａｌ／ｍｏｌ安定であることが予測される。ＰＭ３パラメーター化を使用して個別に計算した差はより大きく、おおよそ１０．２１ｋｃａｌ／ｍｏｌである。その結果として、このような強い結合は通常のＤＮＡ複製過程に実質的に作用でき、突然変異または細胞の終わりさえももたらし得る。これは、５−ヒドロキシシトシンの実験的観察によるものであり、非常に強い変異原性剤である５−ヒドロキシウラシルと同様である。（Wallace、「Biological consequences of free radical-damaged DNA bases」、Free Radical Biology and Medicine、2002年、33、1〜14頁）。しかし、本実施形態において、この成分は表示した化合物に特異的な強い結合と、生物学的対応物（ＤＮＡ、ＲＮＡ）のランダムな相補的塩基へのごくわずかな非特異的結合とを、非常に低濃度で確実にするにすぎない。

本発明の別の実施形態において、ヒドロキシ基で置換された塩基は、８−ヒドロキシアデニンおよびそのアニオンの互変異性型（３）である。このアニオンのそれぞれの互変異性型をスキーム５に示し、式中Ｒは先と同様に残りの化合物を意味する。

９−メチル−８−ヒドロキシアデニンのアニオンの場合、最も安定な互変異性型はイオン化された８−ヒドロキシ型３ａである。この場合、ウラシルとの通常の結合はほとんど影響されない。しかし、計算により、中性の９−メチル−８−ヒドロキシアデニンの溶液中で最も安定な互変異性体が、スキーム６に提示した双性イオン型４であることが示唆される。

アンモニウム基の正のイオン電荷のため、この互変異性型は、ウラシルと非常に強い水素結合を形成する。９−メチル−８−ヒドロキシアデニン双性イオン互変異性体４とウラシルとの塩基対は、通常のアデニン−ウラシル塩基対より、５．１６ｋｃａｌ／ｍｏｌ（ＡＭ１ ＭＣａ ＳＣＲＦ）から８．４１ｋｃａｌ／ｍｏｌ （ＰＭ３ ＭＣａ ＳＣＲＦ）安定であることが計算された（スキーム７と比較されたい）。

これも先と同様に、８−ヒドロキシアデニンの非常に高い変異原性活性によるものである（Wallace、「Biological consequences of free radical-damaged DNA bases」、Free Radical Biology and Medicine、2002年、33、1〜14頁）。しかし、期待された結合の強化は、本発明の化合物の濃度を、天然の核酸塩基のみを有する化合物と比較して、５桁まで減少可能にする。

本発明の別の実施形態は、８−ヒドロキシグアニンの互変異性型およびそのアニオン（５）により修飾された本発明の化合物を提供する。このアニオンのそれぞれの互変異性型をスキーム８に示し、式中Ｒは、先と同様に残りの化合物を意味する。

９−メチル−８−ヒドロキシグアニンのアニオン場合、最も安定な互変異性型は、イオン化された８−ヒドロキシ型５ａであり、これは通常の塩基対とエネルギー的に同様に結合する。しかし、中性の９−メチル−８−ヒドロキシグアニンの溶液中で最も安定な互変異性体である、スキーム９に提示した双性イオン型６は、シトシンと非常に強い結合を有する。

９−メチル−８−ヒドロキシグアニン双性イオン互変異性体６とシトシンとの塩基対は、通常のグアニン−シトシン塩基対より７．２２ｋｃａｌ／ｍｏｌ（ＡＭ１ ＭＣａ ＳＣＲＦ）から８．１７ｋｃａｌ／ｍｏｌ（ＰＭ３ ＭＣａ ＳＣＲＦ）安定であることが予測された。このような塩基対の構造をスキーム１０に示す。

本明細書中で使用する場合、ヒドロキシ基で置換された核酸塩基はそれぞれ、それが対向する核酸塩基と安定に水素結合する場合、核酸塩基に相補的であると考えられる。したがって、ある場合は、５−ヒドロキシウラシルはアデニンに相補的であり、５−ヒドロキシシトシンはグアニンに相補的であり、８−ヒドロキシアデニンはウラシルおよび／またはチミンに相補的であり、８−ヒドロキシグアニンはシトシンに相補的である。ヒドロキシ基で置換された核酸塩基と標的核酸の核酸塩基との他の安定な水素結合も起こり得、したがってヒドロキシ基で置換された核酸塩基は、安定な水素結合を起こさせる標的核酸の核酸塩基に相補的であると考えられる。

修飾核酸塩基の酸性の互変異性基は、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＳＯ_３Ｈなどの、任意の他の酸性基であってもよい。例示的実施形態において、グアニンとシトシンとの複合体（７ａ）、および８−メルカプトグアニンの双性イオン型とシトシンとの複合体（７ｂ）それぞれの安定化には実質的な差がある。

Ｊａｇｕａｒ（Ｊａｇｕａｒ ６．５，Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００５）を使用し、６−３１Ｇ＊＊＋基底系を用いたＤＦＴ（Ｂ３ＬＹＰ）の計算により、以下の複合体安定化エネルギー値を得た：７ａに関しては−０．０３８３７６ａ．ｕ．、対して７ｂに関しては−０．０７３２５１ａ．ｕ．。したがって、後者に非常に強い結合が存在することを示している。その結果として、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸における８−メルカプトグアニンおよび同等の互変異性体化合物の存在により、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＲＮＡ−タンパク質およびＤＮＡ−タンパク質の水素結合複合体の安定性が増強されるであろう。これらの複合体の安定性は、ＲＮＡ干渉診断、アンチセンスヌクレオチド療法、核酸マイクロアレイ診断ならびにこれらを利用するさまざまな実験室診断および臨床的方法に対する有用性を有する。

表１に、上述の化合物に関する、ＡＭ１ ＳＣＲＦ（ｓ＝８０）により計算した、生成熱：ΔＨ^０ _ｆおよび相対的互変異性の平衡定数：ΔｐＫ_Ｔ、を示した。

本発明の所与の化合物におけるヒドロキシ基で置換された核酸塩基の数は、少なくとも１つであるが、化合物のオリゴヌクレオチド部分の核酸塩基の総数の２０％以下である。ヒドロキシ基で置換された核酸塩基が２０％を超えると、化合物が安定性を失い、標的核酸との結合が減少する。ヒドロキシ基で置換された核酸塩基の好ましい数は、核酸塩基の総数の約１０％から約２０％である。本発明の化合物に複数のヒドロキシ基で置換された核酸塩基が存在する場合、ヒドロキシ基で置換された核酸塩基は同じであっても異なっていてもよい。

本発明による化合物は、約５から約１５０の核酸塩基（すなわち、約５から約１５０の結合したヌクレオシド）を含むことが好ましい。当分野の普通の技術者は、本発明が、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、および１５０の核酸塩基長の化合物を包含することを理解するであろう。

好ましい一実施形態において、本発明の化合物は、１０から１００の核酸塩基長である。当分野の普通の技術者は、これが、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００の核酸塩基長の化合物を包含することを理解するであろう。

別の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、１０から５０の核酸塩基長である。当分野の普通の技術者は、これが、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０の核酸塩基長の化合物を包含することを理解するであろう。

別の好ましい実施形態において、本発明の化合物は、２０から３０の核酸塩基長である。当分野の普通の技術者は、これが、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０の核酸塩基長の化合物を包含することを理解するであろう。

特に好ましい化合物は、約１０から約５０核酸塩基のオリゴヌクレオチドであり、約２０から約３０の核酸塩基を含む化合物がさらにより好ましい。

本発明の化合物は、キレート部分をさらに含む。キレート部分は金属リガンドとして機能する。これらは金属イオンを安定してキレートできる。特定の金属リガンド複合体は、リン酸ジエステル結合の切断に有効であることが示されている。キレート部分をアンチセンス活性を持つオリゴヌクレオチドに組み込むことにより、標的核酸の１つまたは複数のリン酸ジエステル結合を分解または切断できるので、標的核酸を阻害するオリゴヌクレオチドの有効性を向上させることができる。したがって、本発明の化合物は、金属イオンをキレートできるキレート部分をさらに含む。好ましい実施形態において、金属イオンは、ランタン、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユーロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウムおよびルテチウムである。ユーロピウムまたはランタンのイオンが特に好ましい。金属のイオンは、＋１、＋２、＋３、＋４または＋５などの任意の安定なイオンであってよい。好ましいイオンは、Ｌａ（ＩＩＩ）、Ｅｕ（ＩＩＩ）、Ｈｏ（ＩＩＩ）、およびＣｅ（ＩＶ）である。

企図されるキレート部分は、スキーム１２に概説されるような式により表されるものを含む。
式中、Ｒは残りのオリゴヌクレオチドであり、
Ｒ^１は、水素、Ｃ_１〜８のアルカン、Ｃ_２〜８のアルケン、Ｃ_２〜８のアルキン、アシルＣ_１〜８アルカン、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１〜８アルキルアリールおよびＣ_１〜８アルキルヘテロアリールから選択され、
Ｒ^２は、Ｃ_１〜８のアルキル、Ｃ_２〜８のアルケン、Ｃ_２〜８のアルキン、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１〜８アルキルアリール、Ｃ_１〜８アルキルヘテロアリールおよびアシルＣ_１〜８アルカンから独立して選択され、
Ｒ^３は、水素、Ｃ_１〜８のアルカン、Ｃ_２〜８のアルケン、Ｃ_２〜８のアルキン、アシルＣ_１〜８アルカン、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１〜８アルキルアリールおよびＣ_１〜８アルキルヘテロアリールからなる群より独立して選択される。

「アルキル」という用語は、表示の炭素原子数を含む直鎖および分岐型の炭化水素基、通常、メチル、エチルならびに直鎖および分岐型のプロピル、およびブチルの基を含む。炭化水素基は、炭素原子を１６個まで含むことができる。「アルキル」という用語は、「架橋アルキル」、例えばＣ_６〜Ｃ_１６の二環性または多環性の炭化水素基、例えばノルボルニル、アダマンチル、ビシクロ［２．２．２］オクチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［３．２．１］オクチルおよびデカヒドロナフチルを含む。「アルキル」という用語は、場合によっては、例えば１個または複数個のハロゲン原子、１個または複数個のヒドロキシル基あるいは１個または複数個のチオール基で置換されたアルキル基をさらに含む。「シクロアルキル」という用語は、環状のＣ_３〜Ｃ_８の炭化水素基、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロヘキシルおよびシクロペンチルとして定義される。「ヘテロシクロアルキル」は、環状構造の中に少なくとも１つのヘテロ原子が存在することを除いて、シクロアルキルと同様に定義される。適切なヘテロ原子は、Ｎ、ＳおよびＯを含む。

「アルケニル」および「アルキニル」という用語は、それぞれ炭素間二重結合または炭素間三重結合を含むことを除いて、「アルキル」と同じように定義される。「シクロアルケニル」は、環の中に炭素間二重結合が存在することを除いて、シクロアルキルと同様に定義される。

「アルキレン」という用語は、置換基を有するアルキル基を指す。例えば、「Ｃ_１〜３のアルキレンアリール」は、１〜３個の炭素原子を含み、アリール基で置換されたアルキル基を指す。

「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、本明細書中では、フッ素、臭素、塩素およびヨウ素を含むと定義される。

「アリール」という用語は単独または組合せで、本明細書中では単環性または多環性の芳香族基、好ましくは単環性または二環性の芳香族基、例えば、フェニルまたはナフチルとして定義される。特に示さない限り、「アリール」基は、非置換であっても、例えば、１個または複数個の、特に１個から３個のハロ、アルキル、ヒドロキシ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニルおよびアルキルスルホニルで置換されていてもよい。例示的アリール基は、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、２−クロロフェニル、３−クロロフェニル、４−クロロフェニル、２−メチルフェニル、４−メトキシフェニル、３−トリフルオロメチルフェニル、４−ニトロフェニルなどを含む。「アリールＣ_１〜３アルキル」および「ヘテロアリールＣ_１〜３アルキル」という用語は、Ｃ_１〜３アルキル置換基を有するアリールまたはヘテロアリールの基として定義される。

「ヘテロアリール」という用語は、本明細書中では、１個または２個の芳香環を含み、少なくとも１個の窒素、酸素または硫黄原子を芳香環の中に含む、単環性または二環性の環系として定義され、これらは、非置換であっても、例えば、１個または複数個の、特に１個から３個のハロ、アルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニルおよびアルキルスルホニルなどの置換基で置換されていてもよい。ヘテロアリール基の例は、チエニル、フリル、ピリジル、オキサゾリル、キノリル、イソキノリル、インドリル、トリアゾリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、イミジゾリル（ｉｍｉｄｉｚｏｌｙｌ）、ベンゾチアゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、チアゾリルおよびチアジアゾリルを含む。

「Ｈｅｔ」という用語は、酸素、窒素および硫黄からなる群より選択される、１個または複数個のヘテロ原子を含む、単環性、二環性および三環性の基として定義される。「Ｈｅｔ」基は、環に結合したオキソ基（＝Ｏ）もまた含むことができる。Ｈｅｔ基の限定されない例は、１，３−ジオキソラニル、２−ピラゾリニル、ピラゾリジニル、ピロリジニル、ピペラジニル、ピロリニル、２Ｈ−ピラニル、４Ｈ−ピラニル、モルホリニル、チオホリニル、ピペリジニル、１，４−ジチアニルおよび１，４−ジオキサンを含む。

「ヒドロキシ」という用語は、−ＯＨとして定義される。

「アルコキシ」という用語は、−ＯＲとして定義され、式中Ｒはアルキルである。

「アルコキシアルキル」という用語は、水素がアルコキシ基で置換されているアルキル基として定義される。「（アルキルチオ）アルキル」という用語は、酸素原子ではなく硫黄原子が存在する以外はアルコキシアルキルと同様に定義される。

「ヒドロキシアルキル」という用語は、アルキル基に付加したヒドロキシ基として定義される。

「アミノ」という用語は−ＮＨ_２として定義され、「アルキルアミノ」という用語は−ＮＲ_２として定義され、式中、少なくとも１個のＲはアルキルであり、２番目のＲはアルキルまたは水素である。

「アシルアミノ」という用語は、ＲＣ（＝Ｏ）Ｎ−として定義され、式中、Ｒはアルキルまたはアリールである。

「アルキルチオ」という用語は、−ＳＲとして定義され、式中、Ｒはアルキルである。

「アルキルスルフィニル」という用語は、ＲＳＯ_２−として定義され、式中、Ｒはアルキルである。

「アルキルスルホニル」という用語は、ＲＳＯ_３−として定義され、式中、Ｒはアルキルである。

「ニトロ」という用語は、−ＮＯ_２として定義される。

「トリフルオロメチル」という用語は、−ＣＦ_３として定義される。

「トリフルオロメトキシ」という用語は、−ＯＣＦ_３として定義される。

「シアノ」という用語は、−ＣＮとして定義される。

金属イオンと複合体を形成したキレート部分を含む本発明の化合物の計算によるヌクレアーゼ効率は、修飾核酸塩基の数の特性に応じて、天然発生のヌクレアーゼと比較して１０^３〜１０^９倍に上昇し、対応する有効濃度の低減、同時に化合物の高度な特異性の維持が可能となる。

開示されたキレート部分は、周知の技術を使用して調製できる（例えば、Cowan、Curr. Opin. Chem. Biol、5、634〜642頁(2001年)およびFranklin、Curr. Opin. Chem. Biol、5、201〜208頁(2001年)を参照されたし）。これらは、容易に利用できる材料と、例えば、Wuts他、Greene's Protective Groups in Organic Synthesis、第４版（Hoboken、NJ: Wiley-Interscience）2007年に開示されたような周知の保護基化学とを使用して、追加として、また代替として合成できる。

本発明の化合物のさらなる変形
本発明の化合物の他の変形もまた企図される。オリゴヌクレオチドは本発明の化合物の好ましい形態であるが、本発明は、限定するものではないが、本明細書中に記載したようなオリゴヌクレオチド類似体および模倣体を含む、化合物の他のファミリーも同様に包含する。

当分野では周知のように、ヌクレオシドは塩基と糖との結合体である。ヌクレオシドの塩基部分は通常複素環塩基である。このような複素環塩基の最も一般的な２種は、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合で結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドでは、リン酸基は、糖の２’、３’または５’のヒドロキシ部分のいずれかに結合できる。オリゴヌクレオチドの形成において、リン酸基は隣接するヌクレオシドと相互に共有結合で結合し、線状高分子化合物を形成する。その後、この線状高分子化合物のそれぞれの末端はさらに連結でき、環状化合物を形成できるが、線状化合物が一般的に好ましい。さらに線状化合物は、核酸塩基間の相補性を有することができ、したがって全体的なまたは部分的な二本鎖化合物を作製するような方法でフォールディングできる。オリゴヌクレオチド内で、リン酸基は一般的にオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成していると見なされる。通常の結合またはＲＮＡおよびＤＮＡの骨格は、３’から５’へのリン酸ジエステル結合である。

修飾されたヌクレオシド間結合（骨格）
本発明において有用な企図されたアンチセンス化合物の具体例は、修飾骨格または非天然のヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを含む。本明細書において定義したように、修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドは、骨格内にリン原子を保持するものと、骨格内にリン原子を有さないものとを含む。本明細書の目的に関して、および時として当分野において見られるように、ヌクレオシド骨格間にリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドとみなすことができる。

リン原子をその骨格内に含む企図された修飾オリゴヌクレオチド骨格は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ジチオリン酸、リン酸トリエステル、アミノアルキルリン酸トリエステル、メチルおよび３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルリン酸トリエステル、セレノホスフェートおよび通常の３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体ならびに１つまたは複数のヌクレオチド間の結合が３’から３’、５’から５’または２’から２’の結合である、逆の極性を有するものを含む。逆の極性を有する企図されたオリゴヌクレオチドは、３’末端側ヌクレオチド間結合に１つの３’−３’結合、すなわち脱塩基（核酸塩基を失うまたはその位置にヒドロキシ基を含む）できる１つの逆のヌクレオシド残基を含む。様々な塩、混合塩および遊離酸の形態もまた含む。

上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許は、限定するものではないが、第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９６号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３０６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号、第５，１９４，５９９号、第５，５６５，５５５号、第５，５２７，８９９号、第５，７２１，２１８号、第５，６７２，６９７号および第５，６２５，０５０号を含み、これらを、それぞれ参照により本明細書に組み込む。

その中にリン原子を含まない、企図された修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子とアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、あるいは１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子またはヘテロ環状ヌクレオシド間結合により形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から一部形成される）を有するもの；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ_２成分構成物を有する他のものを含む。

上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許は、限定するものではないが、第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，２６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６１０，２８９号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、第５，７９２，６０８号、第５，６４６，２６９号および第５，６７７，４３９号を含み、これらを、それぞれ参照により本明細書に組み込む。

修飾された糖およびヌクレオシド間結合−模倣体
他の企図されたオリゴヌクレオチド模倣体において、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド結合の両方（すなわち骨格）を新規な基で置換する。核酸塩基単位は、適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持する。このような化合物の１つである、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖−骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置換される。核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に、直接または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許は、限定するものではないが、第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号および第５，７１９，２６２号を含み、これらを、それぞれ参照により本明細書に組み込む。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Nielsen他、Science、1991年、254、1497〜1500頁に見出すことができる。

本発明のある実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子骨格、特に上で参照した米国特許第５，４８９，６７７号の−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｏ−ＣＨ_２−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として周知である］、−ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−ＣＨ_２−［天然のリン酸ジエステル骨格は−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ_２−として表される］、および上で参照した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格を有するオリゴヌクレオシドである。また、上で参照した米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドも企図される。

修飾された糖
修飾オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の置換された糖部分を有することができる。企図されるオリゴヌクレオチドは、２’位に以下のうちの１つを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；あるいはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル、式中、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のＣ_１〜Ｃ_１０のアルキルまたはＣ_２〜Ｃ_１０のアルケニルおよびアルキニルであってよい。特に好ましくは、Ｏ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］_ｍＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮＨ_２およびＯ（ＣＨ_２）_ｎＯＮ［（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３）］_２であり、式中、ｎおよびｍは１から約１０である。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下のうちの１つを含む：Ｃ_１〜Ｃ_１０の低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基またはオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善するための基、および同様の特性を有する他の置換基。企図される修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られている）（Martin他、Helv. Chim. Acta、1995年、78、486〜504頁）、すなわちアルコキシアルコキシ基を含む。さらに企図される修飾は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちＯ（ＣＨ_２）_２ＯＮ（ＣＨ_３）_２基（以下の実施例において記載のように２’−ＤＭＡＯＥとしても周知である）および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当分野では２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても周知である）、すなわち以下の実施例においても記載される２’−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）_２を含む。

他の企図される修飾は、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ_３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２）、２’−アリル（２’−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。２’修飾は、アラビノ（上方）位またはリボ（下方）位においてであってよい。好ましい２’アラビノ修飾は、２’−Ｆである。同様の修飾は、オリゴヌクレオチドの他の位置、特に３’末端ヌクレオチドまたは２’−５’結合オリゴヌクレオチドの糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位でなされてもよい。オリゴヌクレオチドは、さらにペントフラノシル糖の代わりのシクロブチル部分の様な、糖模倣体を有することができる。このような修飾された糖構造の調製を教示する代表的な米国特許は、限定するものではないが、第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号、第５，７９２，７４７号および第５，７００，９２０号を含み、これらは、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。

さらに好ましい糖の修飾は、２’−ヒドロキシ基が糖環の３’または４’炭素原子に結合し、その結果二環性の糖部分を形成する、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。結合は、２’酸素原子および４’炭素原子に架橋した、ｎが１または２であるメチレン（−ＣＨ_２−）_ｎ基が好ましい。ＬＮＡおよびこれらの調製は、国際公開番号ＷＯ９８／３９３５２号および国際公開番号第ＷＯ９９／１４２２６号に記載されている。

天然核酸塩基および修飾核酸塩基
オリゴヌクレオチドは、核酸塩基（当分野ではしばしば単に「塩基」と呼ばれる）の修飾または置換をさらに含み得る。本明細書において使用する場合、「未修飾」または「天然」核酸塩基は、プリン塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）ならびにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾核酸塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ_３）ウラシルおよびシトシンならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ（特に５−ブロモ）、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなどの他の合成および天然の核酸塩基を含む。さらなる修飾核酸塩基は、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）などの三環性ピリミジン、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロール［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）などのＧ−クランプを含む。修飾核酸塩基は、プリン塩基またはピリミジン塩基が他の複素環、例えば、７−デアザアデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンで置換されたものを含んでもよい。さらなる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering、858〜859頁、Kroschwitz, ed. John Wiley & Sons, 1990年に開示されているもの、Englisch他、Angewandte Chemie、International Edition、1991年、30、613頁により開示されたものおよびSanghvi、15章、Antisense Research and Applications、289〜302頁、Crooke and Lebleu, ed., CRC Press, 1993年により開示されたものを含む。

特定の上記の修飾核酸塩基ならびに他の修飾核酸塩基の調製を教示する代表的な米国特許は、限定するものではないが、上記の米国特許第３，６８７，８０８号ならびに米国特許第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０２号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、第５，６４５，９８５号、第５，８３０，６５３号、第５，７６３，５８８号、第６，００５，０９６号および第５，６８１，９４１号を含み、これらを、それぞれ参照により本明細書に組み込み、さらに、米国特許第５，７５０，６９２号もまた参照により本明細書に組み込む。

結合
本発明のオリゴヌクレオチドの別の修飾は、オリゴヌクレオチドに化学的に結合された、活性、細胞分布またはオリゴヌクレオチドの細胞への取り込みを強化する、１つまたは複数の部分または結合体を含む。これらの部分または結合体は、第１級または第２級ヒドロキシ基などの官能基に共有結合する結合基を含み得る。本発明の結合基は、キレート部分、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学特性を強化する基、オリゴマーの薬物動態特性を強化する基を含む。

代表的な結合基として、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および染料が含まれる。薬力学特性を強化する基は、本発明の文脈において、取り込みを改善、分解に対する耐性を強化および／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基を含む。薬物動態特性を強化する基は、本発明の文脈において、本発明の化合物の取り込み、分布、代謝または排出を改善する基を含む。代表的な結合基は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号および米国特許第６，２８７，８６０号に開示されており、これらの全開示を参照により本明細書に組み込む。

結合部分は、限定するものではないが、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル（例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール）、チオコレステロール、脂肪族鎖（例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基）、リン脂質（例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート）、ポリアミンまたはポリエチレングリセロール鎖、あるいはアダマンタン酢酸、パルミチル部分またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分などの脂質部分を含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、活性製剤原料、例えば、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５−トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾサイアジアザイド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメタシン、バルビツレート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌剤または抗生物質と結合できる。オリゴヌクレオチド−薬剤結合体およびそれらの調製は、米国特許出願第０９／３３４，１３０号に記載されており、これを参照によりその全体を本明細書に組み込む。

このようなオリゴヌクレオチド結合体の調製を教示する代表的な米国特許は、第４，８２８，９７９号、第４，９４８，８８２号、第５，２１８，１０５号、第５，５２５，４６５号、第５，５４１，３１３号、第５，５４５，７３０号、第５，５５２，５３８号、第５，５７８，７１７号、第５，５８０，７３１号、第５，５８０，７３１号、第５，５９１，５８４号、第５，１０９，１２４号、第５，１１８，８０２号、第５，１３８，０４５号、第５，４１４，０７７号、第５，４８６，６０３号、第５，５１２，４３９号、第５，５７８，７１８号、第５，６０８，０４６号、第４，５８７，０４４号、第４，６０５，７３５号、第４，６６７，０２５号、第４，７６２，７７９号、第４，７８９，７３７号、第４，８２４，９４１号、第４，８３５，２６３号、第４，８７６，３３５号、第４，９０４，５８２号、第４，９５８，０１３号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，２４５，０２２号、第５，２５４，４６９号、第５，２５８，５０６号、第５，２６２，５３６号、第５，２７２，２５０号、第５，２９２，８７３号、第５，３１７，０９８号、第５，３７１，２４１号、第５，３９１，７２３号、第５，４１６，２０３号、第５，４５１，４６３号、第５，５１０，４７５号、第５，５１２，６６７号、第５，５１４，７８５号、第５，５６５，５５２号、第５，５６７，８１０号、第５，５７４，１４２号、第５，５８５，４８１号、第５，５８７，３７１号、第５，５９５，７２６号、第５，５９７，６９６号、第５，５９９，９２３号、第５，５９９，９２８号および、第５，６８８，９４，１号を含み、これらのそれぞれを参照により本明細書に組み込む。

アンチセンス阻害
本発明の化合物と標的核酸とのハイブリダイゼーションは、一般的に「アンチセンス」と称する。このようなハイブリダイゼーションは、標的核酸の翻訳の阻害をもたらし、本明細書中では「アンチセンス阻害」と呼ぶ。このようなアンチセンス阻害は、通常、少なくとも１つの鎖または断片が切断、分解またはさもなければ動作不能であるようなオリゴヌクレオチド鎖または断片の水素結合をベースとするハイブリダイゼーションに基づく。この点において、標的特異核酸分子およびこのようなアンチセンス阻害に関するそれらの機能は現在好ましい。

干渉されるＤＮＡの機能は、複製および転写を含み得る。例えば、複製および転写は、内在性の細胞の鋳型、ベクター、プラスミド構築体などに由来してよい。干渉されるＲＮＡの機能は、ＲＮＡのタンパク翻訳部位への転座、ＲＮＡ合成部位から離れた細胞内の部位へのＲＮＡの転座、ＲＮＡからタンパク質の翻訳、１つまたは複数のＲＮＡ種を生じるＲＮＡのスプライシング、およびＲＮＡにより行われるまたは促進される、ＲＮＡが関与する触媒活性または複合体形成などを含み得る。本発明の文脈において、「調節」または「発現の調節」は、遺伝子をコードする核酸分子、例えばＤＮＡまたはＲＮＡの量または濃度を増加（刺激）または減少（阻害）することのいずれかを意味する。阻害は多くの場合、発現の調節の好ましい形態であり、ｍＲＮＡは多くの場合好ましい標的核酸である。

本発明の文脈において、「ハイブリダイゼーション」はオリゴマー化合物の相補鎖のペアリングを意味する。本発明において、好ましいペアリングの機序は、水素結合を含み、これは、オリゴマー化合物の鎖の相補的なヌクレオシドまたはヌクレオシド塩基（核酸塩基）間の、ワトソンクリック型、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型の水素結合であってよい。例えば、アデニンとチミンとは、水素結合の形成を介してペアリングする相補的核酸塩基である。ハイブリダイゼーションは、さまざまな状況下で起こり得る。

標的核酸への化合物の結合が標的核酸の通常の機能に干渉し、活性の損失をもたらし、特異的結合が望まれる条件下、すなわちインビボアッセイまたは治療的処置の場合等の生理学的条件下、あるいはインビトロアッセイの場合アッセイが実施される条件下で、非標的核酸配列へのアンチセンス化合物の非特異的結合を避けるための十分な相補性が存在する場合に、アンチセンス化合物は、特異的にハイブリダイズ可能である。

本発明において、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」という語句は、本発明の化合物がその標的配列とハイブリダイズするが他の配列とのハイブリダイズは最少数となるであろう条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、状況によって異なり、本発明の文脈において、オリゴマー化合物が標的配列とハイブリダイズする「ストリンジェントな条件」は、オリゴマー化合物の特性および組成ならびに調べているアッセイにより決定される。

本明細書で使用される場合、“相補的”とは、オリゴマー化合物の２つの核酸塩基間の正確なペアリングに関する能力を指す。例えば、オリゴヌクレオチド（オリゴマー化合物）のある位置の核酸塩基が、標的核酸（該標的核酸分子がＤＮＡ、ＲＮＡまたはオリゴヌクレオシド分子である）のある位置の核酸塩基と水素結合可能な場合、そのオリゴヌクレオチドと標的核酸との間の水素結合の位置は、相補的位置であると考えられる。それぞれの分子における相補的位置のうち相当数が、相互に水素結合できる核酸塩基により占められている場合、オリゴヌクレオチドと相手のＤＮＡ、ＲＮＡまたはオリゴヌクレオチド分子は相互に相補的である。したがって、「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的」は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間に安定で特異的な結合が起こるような、十分な数の核酸塩基において、ペアリングが正確であることまたは相補性の程度が十分であることを示すために使用される用語である。

特異的にハイブリダイズ可能であるためには、アンチセンス化合物の配列はその標的核酸の配列と、１００％相補的である必要はないと当分野では理解されている。さらにオリゴヌクレオチドは、介在する、または隣接する断片がハイブリダイゼーション事象に関与しないような、１つまたは複数の断片（例えば、ループ構造またはヘアピン構造）にわたってハイブリダイズできる。本発明の化合物のオリゴヌクレオチド部分は、標的核酸の標的領域に対して少なくとも７０％の配列相補性を含むことが好ましく、より好ましくは８５％または９０％の配列相補性を含み、さらにより好ましくは、標的とする標的核酸配列内の標的領域に対して、９５％の配列相補性を含む。例えば、化合物の２０核酸塩基のうち１８が標的領域に対して相補的であり、したがって特異的にハイブリダイズする本発明の化合物は、９０％の配列相補性を表すであろう。この例において、残りの非相補的核酸塩基は、クラスター化または相補的核酸塩基に組み入れられていてよく、相互にまたは相補的核酸塩基に隣接している必要はない。長さが１８核酸塩基であり、標的核酸に完全に相補的な領域の両側に、非相補的核酸塩基を合わせて４個有する化合物は、標的核酸との全相補性の７７．８％を有し、したがって本発明の範囲内にあるであろう。標的核酸の領域を有する化合物の相補性パーセントは、当分野において周知のＢＬＡＳＴプログラム（basic local alignment search tools）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラムを使用して、ごく普通に決定できる（Altschul他、J. Mol. Biol.、1990年、215、403〜410頁： Zhang他、Genome Res.、1997年、7、649〜656頁）。ヒドロキシ基で置換された核酸塩基および／または合成類似体（他の合成核酸塩基など）を有する本発明の化合物では、相補性は、標的核酸の特定の核酸塩基に関する合成類似体の特異性により評価できる。

アンチセンス化合物の好ましい形態は、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであるのに対して、多くの種において、二本鎖構造（二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子など）を導入することにより、遺伝子の機能またはその付随する遺伝子産物を強力で特異的なアンチセンス仲介により減少させることを示している。この現象は、植物および動物の両方において起こり、ウィルス防御およびトランスポゾンのサイレンシングと進化的な関連を有すると考えられている。

ｄｓＲＮＡが動物において遺伝子サイレンシングをもたらし得る第１の証拠は、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）における研究により１９９５年に現れた（Ｇｕｏ他、Ｃｅｌｌ、１９９５年、８１、６１１〜６２０頁）。Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ他は、ｄｓＲＮＡの主要な干渉効果は転写後に生じるものであることを示している（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ、１９９８年、９５、１５５０２〜１５５０７頁）。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）に曝露することにより得られた、線虫において定義された転写後のアンチセンス機序は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と定められた。この用語は、ｄｓＲＮＡを導入することにより、内在性標的ｍＲＮＡ濃度を配列特異的に減少させることに関与する、アンチセンス仲介遺伝子サイレンシングを意味することが一般化されている（Ｆｉｒｅ他、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８年、３９１、８０６〜８１１頁）。実際には、アンチセンス極性をもつｄｓＲＮＡの一本鎖ＲＮＡオリゴマーがＲＮＡ干渉の強力な誘導因子であることが近年になって判明している（Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２年、２９５、６９４〜６９７頁）。

製剤
本発明の化合物はさらに、取り込み、分布および／または吸収を促進するために、他の分子、分子構造または化合物の混合物、例えば、リポソーム、担体、希釈剤、レセプター標的化分子、経口、直腸、局所または他の製剤と混合、カプセル化、コンジュゲートまたは別の形で結合できる。このような取り込み、分布および／または吸収を促進する製剤の調製を教示する代表的な米国特許は、第５，１０８，９２１号、第５，３５４，８４４号、第５，４１６，０１６号、第５，４５９，１２７号、第５，５２１，２９１号、第５，５４３，１５８号、第５，５４７，９３２号、第５，５８３，０２０号、第５，５９１，７２１号、第４，４２６，３３０号、第４，５３４，８９９号、第５，０１３，５５６号、第５，１０８，９２１号、第５，２１３，８０４号、第５，２２７，１７０号、第５，２６４，２２１号、第５，３５６，６３３号、第５，３９５，６１９号、第５，４１６，０１６号、第５，４１７，９７８号、第５，４６２，８５４号、第５，４６９，８５４号、第５，５１２，２９５号、第５，５２７，５２８号、第５，５３４，２５９号、第５，５４３，１５２号、第５，５５６，９４８号、第５，５８０，５７５号および第５，５９５，７５６号を含み、これらのそれぞれを参照により本明細書に組み込む。

本発明のアンチセンス化合物は、任意の薬剤的に許容可能な塩、エステルまたはこのようなエステルの塩、あるいはヒトを含む動物に投与する生物活性転写産物またはこれらの残基を（直接または間接的に）提供できる、任意の他の化合物を包含する。したがって、例えば、本開示は、本発明の化合物のプロドラッグおよび薬剤的に許容可能な塩、このようなプロドラッグの薬剤的に許容可能な塩ならびに他の生物学的同等物をさらに含む。

「プロドラッグ」という用語は、内在性の酵素の活性あるいは化学物質および／または条件の作用により、体内またはこれらの細胞内において活性型（すなわち薬剤）に転換される、不活性型に調製された治療薬を指す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグ型は、Gosselin他の国際公開番号ＷＯ９３／２４５１０号、１９９３年１２月９日公開またはImbach他の国際公開番号ＷＯ９４／２６７６４号および米国特許第５，７７０，７１３号に開示された方法により、ＳＡＴＥ（（Ｓ アセチル−２−チオエチル）リン酸）誘導体として調製される。

「薬剤的に許容可能な塩」という用語は、本発明の化合物の生理的および薬剤的に許容可能な塩、すなわち親化合物の所望の生物活性を維持し、望ましくない毒性効果を与えない塩を指す。オリゴヌクレオチドに関して、薬剤的に許容可能な塩およびそれらの使用の好ましい例は、米国特許第６，２８７，８６０号にさらに開示され、この全体を本明細書に組み込む。

本発明は、本発明のアンチセンス化合物を含む、薬剤化合物および製剤をさらに含む。本発明の薬剤化合物は、局所または全身治療のいずれが望ましいか、および治療範囲により、多くの方法で投与できる。投与は、局所（眼および膣および直腸送達を含む粘膜を含む）、肺、例えば、噴霧器による；気管内、鼻腔内、表皮、経皮を含む、粉末またはエアロゾルの吸入または吹入、経口または非経口であってよい。非経口投与は、静脈内または動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内の注射または注入、あるいは、頭蓋内例えば髄腔内または脳室内投与を含む。少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有するオリゴヌクレオチドは、経口投与に特に有用と考えられている。局所投与用の医薬化合物および製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体および粉末を含み得る。従来の薬剤担体、水性、粉末または油性の基剤、増粘剤などは、必要または望ましいと思われる。コーティングされたコンドーム、手袋なども、また有用である。

都合よく単位用量形態で存在できる本発明の薬学製剤は、製薬工業において周知の従来技術により調製できる。このような技術は、有効成分と（複数の）薬剤担体または（複数の）賦形剤とを組み合わせるステップを含む。一般的に、製剤は、均一かつ念入りに有効成分と液体担体または細かく分割された固体担体あるいは両方とを組み合わせることにより調製し、その後必要に応じて製品に成形する。

本発明の組成物は、限定するものではないが、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、軟質ゲル、坐薬および浣腸などの任意の多くの可能な剤形に処方できる。本発明の組成物は、水性、非水性または混合媒体の懸濁液としてもまた処方できる。水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む、懸濁液の粘度を増加する物質をさらに含むことができる。懸濁液はさらに安定剤を含み得る。

本発明の薬剤組成物は、限定するものではないが、溶液、乳剤、フォームおよびリポソーム含有製剤を含む。本発明の薬剤組成物および製剤は、１種または複数の浸透促進剤、担体、賦形剤、希釈剤あるいは他の活性または不活性原料を含むことができる。

乳剤は通常、１種の液体が他の液体中に普通直径０．１μｍを超える液滴の形態で分散している、不均一系である。乳剤は、分散相に加えて追加の成分および水相、油相またはそれ自体が分離相のいずれかの溶液として存在し得る活性薬剤を含むことができる。マイクロエマルジョンは、本発明の実施形態として含まれる。乳剤およびそれらの使用は当分野では周知であり、米国特許第６，２８７，８６０号にもまた記載されており、この全体を本明細書に組み込む。

本発明の製剤は、リポソーム製剤を含む。本発明において使用する場合、「リポソーム」という用語は、球状の二分子層あるいは二分子層の重なりによって構成された両親媒性脂質からなる小胞を意味する。リポソームは、親油性材料から形成される膜および送達すべき成分を含む水性内部を有する、単層または多層の小胞である。陽イオン性リポソームは、負に帯電したＤＮＡ分子と相互に作用し、安定な複合体を形成すると考えられている、正に帯電したリポソームである。ｐＨ感受性または負に帯電したリポソームは、ＤＮＡと複合体を形成するよりも、それを封入すると考えられている。陽イオン性および非陽イオン性リポソームの両方は、細胞にＤＮＡを送達するために使用されており、本発明の化合物を送達するために使用できる。

リポソームは、「立体的に安定化された」リポソームをさらに含み、この用語は、本明細書中で使用する場合、１種または複数種の特殊化した脂質を含み、それをリポソームに組み込んだ場合結果、このような特殊化した脂質が欠けているリポソームと比較してライフタイムの循環を増進するリポソームを指す。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が、１種または複数種の糖脂質を含む、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１種または複数種の親水性ポリマーにより誘導体化されたものである。リポソームおよびそれらの使用もまたは、米国特許第６，２８７，８６０号に記載されており、この全体を本明細書に組み込む。

本発明の薬学製剤および薬剤組成物は、界面活性剤をさらに含み得る。薬物製品、製剤および乳剤への界面活性剤の使用は、当分野では周知である。界面活性剤およびそれらの使用もまたは、米国特許第６，２８７，８６０号に記載されており、この全体を本明細書に組み込む。

一実施形態において、核酸、特にオリゴヌクレオチドを効率的に送達するために、本発明はさまざまな浸透促進剤を用いる。非親油性薬剤の細胞膜を通過する拡散の補助に加えて、浸透促進剤は、親油性薬剤の浸透性をさらに促進する。浸透促進剤は、５つの広義のカテゴリー、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤および非キレート性非界面活性剤の１つに属すると分類できる。浸透促進剤およびそれらの使用もまたは、米国特許第６，２８７，８６０号に記載されており、この全体を本明細書に組み込む。

当業者は、製剤がそれらの使用意図、すなわち投与経路により、ごく普通に設計されることを認識するであろう。

局所投与に好ましい製剤は、本発明の化合物が、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性剤などの局所送達剤と混合されたものを含む。好ましい脂質およびリポソームは、中性（例えば、ジオレイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＰＥ、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、負の（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）、および陽イオン性の（例えば、ジオレイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）を含む。

局所および他の投与のために、本発明の化合物は、リポソーム内にカプセル化でき、またはリポソーム、特に陽イオン性リポソームと複合体を形成できる。あるいは、化合物を脂質、特に陽イオン性脂質と複合できる。好ましい脂肪酸およびエステル、それらの薬剤的に許容可能な塩ならびにそれらの使用もまた、米国特許第６，２８７，８６０号に記載されており、この全体を本明細書に組み込む。局所製剤は、１９９９年５月２０日提出の米国特許出願第０９／３１５，２９８号に詳細に記載されており、この全体を参照により本明細書中に組み込む。

経口投与用の組成物および製剤は、粉末または顆粒、ミクロ粒子、ナノ粒子、水または非水溶性媒体の懸濁液または溶液、カプセル、ゲルカプセル、小袋、錠剤またはミニタブレットを含む。増粘剤、香料、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤は望ましいと思われる。好ましい経口製剤は、本発明の化合物が１種または複数種の浸透促進剤、界面活性剤およびキレート剤を結合して投与されるものである。好ましい界面活性剤は、脂肪酸および／またはエステルあるいはこれらの塩、胆汁酸および／またはこれらの塩を含む。好ましい胆汁酸／塩および脂肪酸ならびにそれらの使用もまた、米国特許第６，２８７，８６０号に記載されており、この全体を本明細書に組み込む。浸透促進剤の併用、例えば脂肪酸／塩と胆汁酸／塩との併用もまた好ましい。特に好ましい組合せは、ラウリン酸、カプリン酸およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらなる浸透促進剤は、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルを含む。本発明の化合物は、スプレー乾燥粒子またはミクロまたはナノ粒子の複合形態を含む顆粒形態で、経口的に送達できる。複合剤およびそれらの使用もまた、米国特許第６，２８７，８６０号に記載されており、この全体を本明細書に組み込む。経口製剤およびそれらの調製は、米国特許出願第０９／１０８，６７３号、第０９／３１５，２９８号，および第１０／０７１，８２２号に詳細に記載されており、これらのそれぞれの全体を参照により本明細書中に組み込む。

非経口の、髄腔内または脳室内投与用の組成物および製剤は、バッファー、希釈剤および他の適切な添加物、例えば限定するものではないが、浸透促進剤、担体化合物および他の薬剤的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含み得る、無菌の水溶液を含むことができる。

本発明のある実施形態は、１種または複数種の本発明の化合物および１種または複数種の他の非アンチセンス機序により機能する化学療法剤を含む薬剤組成物を提供する。このような化学療法剤の例は、限定するものではないが、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マホスファミド、イホスファミド、シトシンアラビノシド、ｂｉｓ−クロロエチルニトロソウレア、ブスルファン、ミトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソウレア、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−アザシチジン、ヒドロキシウレア、デオキシコホルマイシン、４−ヒドロキシペルオキシシクロホスホルアミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、タクソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（ＶＰ−１６）、トリメトレキサート、イリノテカン、トポテカン、ゲムシタビン、テニポシド、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）などの癌化学療法薬を含む。本発明の化合物と共に使用する場合、このような化学療法剤は、単独で（例えば、５−ＦＵおよびオリゴヌクレオチド）、連続して（例えば、ある期間は５−ＦＵおよびオリゴヌクレオチド、その後ＭＴＸおよびオリゴヌクレオチド）または１種または複数種のこのような化学療法剤との併用で（例えば、５−ＦＵ、ＭＴＸおよびオリゴヌクレオチドまたは５−ＦＵ、放射線治療およびオリゴヌクレオチド）使用できる。限定するものではないが、非ステロイド系抗炎症薬およびコルチコステロイドを含む抗炎症薬ならびに限定するものではないが、リビビリン、ビダラビン、アシクロビルおよびガンシクロビルを含む抗ウィルス薬もまた本発明の化合物と併用できる。アンチセンス化合物と他の非アンチセンス薬との併用もまた、本発明の範囲内である。複数種の併用化合物は、一緒にまたは連続して使用できる。

別の関連する実施形態において、本発明の組成物は、第１の核酸を標的とする１種または複数種のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチド、および第２の核酸を標的とする１種または複数種の追加のアンチセンス化合物を含み得る。あるいは、本発明の組成物は、同じ標的核酸の異なる領域を標的とする、複数種のアンチセンス化合物を含み得る。アンチセンス化合物の多くの例が、当分野において周知である。複数種の併用化合物は、一緒にまたは連続して使用できる。

投薬
治療組成物の製剤およびそれらのその後の投与（投薬）は、当業者の技術範囲内であると考えられ、用量反応、毒性および薬物動態的研究により決定される。投薬は、治療すべき疾患状態の重篤性および反応性に依存し、治療期間は数日から数カ月あるいは治癒が達成されるまでまたは疾患状態の減退が達成されるまで続く。慢性疾患状態または減退しているが治癒を達成できない病態に関して、投薬は無期限に続くであろう。最適な投薬スケジュールは、患者の体内における薬剤の蓄積の測定から計算できる。当業者は、至適用量、投薬方法および反復率を容易に決定できる。至適用量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的効力に応じて変更でき、一般的にインビトロおよびインビボの動物モデルにおいて有効であると見出されたＥＣ_５０に基づいて予測できる。一般的に、用量は、体重ｋｇ当たり０．０１μｇから１００ｇであり、１日、１週間、１か月または１年に１回または複数回であり、あるいは２〜２０年毎に１回与えられる。当分野の普通の技術者は、投薬の反復率を、体液または組織中の薬剤の滞留時間および濃度の測定に基づいて容易に予測できる。治療が成功した後に、疾患状態の再発を防ぐために、患者に維持治療を行うことが望ましいと思われ、ここでオリゴヌクレオチドは、体重ｋｇ当たり０．０１μｇから１００ｇの範囲で、１日に１回または複数回から２０年毎に１回まで、維持用量で投与される。

本発明の化合物の用途
本発明の化合物は、細胞の表現型の修正あるいはウィルス、細菌、原生生物、マイコプラズマ種、クラミジアなどの病原体の増殖の制限あるいは新生物細胞または正常なまたは疾患の細胞の特定の種類における死亡率の誘導のために、インビトロまたはインビボで使用できる。したがって、化合物を、疾患になりやすい、または疾患状態にある生物に投与できる。生物に投与する場合、化合物はさまざまな病原体、例えば、腸管毒素原性細菌、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）菌、ジルアジア（Ｇｉａｒｄｉａ）菌およびエントアメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａｓ）による感染の治療に使用できる。化合物はさらに、新生物の細胞、例えば癌細胞、肉腫細胞およびリンパ腫細胞用の細胞毒性薬または細胞増殖抑制剤として使用できる。化合物は、免疫系細胞、例えば、特異的Ｂ細胞；ヘルパー細胞、サプレッサー細胞、細胞障害性Ｔ−リンパ細胞（Ｃ）およびナチュラルキラー（ＮＸ）細胞などの特異的Ｔ細胞の機能を調節するために使用できる。本発明の化合物を使用する免疫機能の調節は、癌および免疫系疾患などの様々な疾患の治療に有用であり得る。

化合物は、化合物のオリゴヌクレオチドがその標的配列に結合することに関与する任意の機序により、タンパク質の転写または発現に干渉できるように選択できる。これらの機序は、プロセッシング、核膜を通過する輸送の阻害、エンドヌクレアーゼによる切断などへの干渉を含む。

化合物のオリゴヌクレオチドは、核酸配列、例えば成長因子、リンホカイン、免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体部位、ＭＨＣ抗原、ＤＮＡまたはＲＮＡのポリメラーゼ、抗生物質耐性、多剤耐性（ｍｄｒ）、アミノ酸、核酸などの形成の様な代謝過程に関与する遺伝子などをコードするものに相補的であり得る。オリゴヌクレオチドは、イントロンまたはオープンリーディングフレームに付随する隣接配列を含む核酸配列に相補的であり得る。

本発明の化合物は、感染性疾患、癌、自己免疫疾患および臓器移植に関与する病態の治療に使用できる。感染性疾患の治療において、標的核酸配列は、ＡＩＤＳ、ＣＭＶ、ヘルペス、薬剤耐性プラスミドおよびトリパノソーマに関与する遺伝子を含む。癌の治療において、標的核酸配列は、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子および関連遺伝子に関与するＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。さらに、本発明の化合物はまた、薬剤耐性に関与する遺伝子およびそれらの遺伝子産物を標的にできる。自己免疫疾患の治療に関しては、化合物は、例えば関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデスおよび多発性硬化症に関与する核酸配列を標的にできる。

本明細書中に記載したように、本発明は、標的遺伝子またはヌクレオチド配列のいずれかの型を限定するものではなく、例えば任意の微生物またはウィルスのための任意の遺伝子を適用できる。しかし、考えられる標的遺伝子の以下のクラスを例示の目的で記載する：発生遺伝子（例えば、接着分子、サイクリンキナーゼ阻害因子、Ｗｎｔファミリーのメンバー、Ｐａｘファミリーのメンバー、Ｗｉｎｇｅｄ ｈｅｌｉｘファミリーのメンバー、Ｈｏｘファミリーのメンバー、サイトカイン／リンホカインおよびそれらの受容体、成長／分化因子およびそれらの受容体、神経伝達物質およびそれらの受容体）；癌遺伝子（例えば、ＡＢＬ１−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＢＣ１０７０６９；ＢＣＬ１−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ０５３０５６；ＢＣＬ２−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ１８１５０５；ＢＣＬ６−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ１３８９３１；ＣＢＦＡ２−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ００１００１８９０；ＣＢＬ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ１３８３９２；ＣＳＦ１Ｒ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＣＨ４７１０６２；ＥＲＢＡ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ０２１７２４；ＥＲＢＢ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ１３８５７３；ＥＲＢＢ２−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ１８１５０５；ＥＴＳ１−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ００５２３８；ＥＴＶ６−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ００２３３６；ＦＧＲ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ１５３０４８；ＦＬＴ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ００４１１９；ＦＯＳ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ００１０８０５４７；ＦＹＮ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ０１６３６３；ＨＣＲ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ００３９６５；ＨＲＡＳ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ００７０６９；ＳＯＣＳ６−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ００４２３２；ＫＲＡＳ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ１７６７９５；ＬＣＫ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ；ＬＹＮ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ００１０４２７７１；ＭＥＴ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ０１７９５６；ＭＤＭ２−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ０２２０４５；ＭＬＬ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ０１２０８１；ＭＹＢ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ０１４５２０；ＭＹＣ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ０３２７８９；ＭＹＣＬ１−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ００１０３３０８２；ＭＹＣＮ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ００５３７８；ＮＲＡＳ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ００２５２４；ＰＩＭ１−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ；ＰＭＬ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ００２６４８；ＲＥＴ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ０２０６３０；ＳＲＣ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ０１６８４８；ＴＡＬ１−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ００３１８９；ＴＣＬ１−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ０２１９６６；ＴＬＸ１ −ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ００５５２１；およびＹＥＳ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ００６１０６）；腫瘍抑制遺伝子（例えば、ＡＰＣ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ００００３８；ＢＲＣＡ１−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＧ００５９０５；ＢＲＣＡ２−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ００７３０５；ＭＡＤＨ４−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ００５３５９；ＭＣＣ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ０２２１３２；ＮＦ１−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ０１７９４０；ＮＦ２−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ１８１８３１；ＲＢ１−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ０００３２１；ＴＰ５３−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＥＦ４３２５５０；およびＷＴ１−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＭ０２４４２６）；酵素（例えば、ＡＣＣ合成酵素およびオキシダーゼ、ＡＣＰデサチュラーゼおよびヒドロキシラーゼ、ＡＤＰ−グルコースピロホリラーゼ（ｇｌｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｒｙｌａｓｅｓ）、ＡＴＰアーゼ、アルコール脱水素酵素、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、カルコン合成酵素、キチナーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、ＤＮＡおよびＲＮＡのポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、粒結合型デンプン合成酵素、ＧＴＰアーゼ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、インテグラーゼ、イヌリナーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、ノパリン合成酵素、オクトピン合成酵素、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、フィターゼ、植物成長調節因子合成酵素、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼおよびペプチダーゼ、プルラナーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、ＲＵＢＩＳＣＯ、トポイソメラーゼならびにキシラナーゼ）；病原微生物の遺伝子（例えば、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、プラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）およびクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ））；病原ウィルスの遺伝子（例えば、ＨＩＶ、肝炎、ヘルペス、インフルエンザ、ライノウィルス、アデノウィルス、およびマイナス鎖ＲＮＡウィルス）；市販の関連遺伝子（例えば、抗体の遺伝子、成長因子遺伝子およびホルモン遺伝子）；動物ウィルス（例えば、ＦＭＤＶ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＤＱ９０２６５３およびＦＬＶ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＤＱ５３１５８４）；植物ウィルス（例えば、ＰＶＹ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＥＦ４７０２４１；ＴＭＶ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＡＢ２６４５４７；およびＣＭＶ−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＮＣ００２０３４）。

核酸の結合に加えて、本発明の化合物を、限定するものではないが、リガンド、受容体および／または酵素を含むタンパク質に対する結合のために用いることができ、その結果化合物はタンパク質の活性を阻害する。

本発明の文脈において、アンチセンス化合物が特定の核酸分子を「標的とすること」は、複数ステップの過程であり得る。この過程は、普通は機能を調節するべき標的核酸の特定で始まる。この標的核酸は、例えば、発現が特定の疾患または病状に関与している細胞遺伝子（または遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）あるいは感染因子由来の核酸分子であってよい。

標的化過程は、通常、所望の効果、例えば発現の調節をもたらすようにアンチセンス相互作用が発生するための、標的核酸内の少なくとも１つの標的領域、断片または部位の決定もまた含む。本発明の文脈において、「領域」という用語は、少なくとも１つの特定可能な構造、機能または特徴を有する標的核酸の一部として定義される。標的核酸の領域内には、断片が含まれる。「断片」は、標的核酸内のより小さい領域または領域の一部（ｓｕｂ−ｐｏｒｔｉｏｎｓ）として定義される。本明細書中で使用する場合、「部位」は、標的核酸内の位置として定義される。

当分野において周知のように、翻訳開始コドンは通常５’ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子において、対応するＤＮＡ分子の５’ＡＴＧ）であるので、翻訳開始コドンはまた、「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」または「ＡＵＧ開始コドン」とも称される。少数の遺伝子は、ＲＮＡ配列、５’ＧＵＧ、５’ＵＵＧまたは５’ＣＵＧ、を有する翻訳開始コドンを有し、５’ＡＵＡ、５’ＡＣＧおよび５’ＣＵＧはインビボで機能することが示されている。したがって、いかなる場合にも開始アミノ酸は、通常メチオニン（真核生物において）またはホルミルメチオニン（原核生物において）であるけれども、「翻訳開始コドン」および「開始コドン」という用語は、多くのコドン配列を包含できる。真核細胞遺伝子および原核胞遺伝子は、代わりの開始コドンを複数有し得、これらのいずれか１つが特定の細胞型または組織においてあるいは一連の特定の状況下で、翻訳開始に選択的に利用できることは当分野において周知である。本発明の文脈において、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」は、このようなコドンの（複数の）配列にかかわらず、インターロイキン１８をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳を開始するために、インビボで使用されるコドン（ｃｏｄｏｎまたはｃｏｄｏｎｓ）を、指す。遺伝子の翻訳終止コドン（または「終止コドン」）が、３種の配列、すなわち５’ＵＡＡ、５’ＵＡＧおよび５’ＵＧＡ（対応するＤＮＡ配列は、それぞれ５’ＴＡＡ、５’ＴＡＧおよび５’ＴＧＡ）の１つを有し得ることもまた当分野において周知である。

「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」という用語は、翻訳開始コドンからいずれかの方向（すなわち、５’または３’）に約２５から約５０の連続したヌクレオチドを包含するような、ｍＲＮＡまたは遺伝子の一部を指す。同様に、「終止コドン領域」および「翻訳終止コドン領域」という用語は、翻訳終止コドンからいずれかの方向（すなわち、５’または３’）に約２５から約５０の連続したヌクレオチドを包含するような、ｍＲＮＡまたは遺伝子の一部を指す。その結果として、「開始コドン領域」（または「翻訳開始コドン領域」）および「終止コドン領域」（または「翻訳終止コドン領域」）は、本発明のアンチセンス化合物により効率的に標的とされ得る全領域である。

翻訳開始コドンと翻訳終止コドンの間の領域を指すことが当分野において周知である、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または「コード領域」もまた、効率的に標的とされ得る領域である。本発明の文脈において、好ましい領域は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始または終止コドンを包含する遺伝子内領域である。

他の標的領域は、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）（翻訳開始コドンから５’方向のｍＲＮＡの一部を指し、したがって５’ｃａｐ部位とｍＲＮＡの翻訳開始コドンの間のヌクレオチド（または遺伝子上の対応するヌクレオチド）を含むことが当分野で周知である）および３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）（翻訳終止コドンから３’方向のｍＲＮＡの一部を指し、したがって翻訳終止コドンとｍＲＮＡの３’末端の間のヌクレオチド（または遺伝子上の対応するヌクレオチド）を含むことが当分野で周知である）を含む。ｍＲＮＡの５’ｃａｐ部位は、５’−５’三リン酸結合を介してｍＲＮＡの５’末端残基に結合したＮ７−メチル化グアノシン残基を含む。ｍＲＮＡの５’ｃａｐ領域は、５’ｃａｐ構造それ自体ならびにｃａｐ部位に隣接する最初の５０ヌクレオチドを含むと考えられている。５’ｃａｐ領域を標的とすることもまた好ましい。

いくつかの真核生物ｍＲＮＡ転写産物は直接翻訳されるが、多くは翻訳前に転写産物から切り取られる「イントロン」として周知の１つまたは複数の領域を含む。残りの（したがって翻訳された）領域は、「エクソン」として周知であり、一緒にスプライスされ、連続したｍＲＮＡ配列を形成する。標的となるスプライス部位、すなわちイントロン−エクソン接合部またはエクソン−イントロン接合部はまた、異常なスプライシングが疾患にかかわっている、または特定のスプライス産物の過剰生産が疾患にかかわっている状況において特に有用であり得る。再構成または欠失による異常な融合接合部位もまた、好ましい標的部位である。異なる遺伝子供給源由来の２つ（またはそれ以上）のｍＲＮＡのスプライシング過程を介して作製されたｍＲＮＡ転写産物は、「融合転写産物」として周知である。イントロンが、例えばＤＮＡまたはｍＲＮＡ前駆体を標的とするアンチセンス化合物を使用して有効に標的とされ得ることもまた周知である。

選択的ＲＮＡ転写産物がＤＮＡの同じゲノム領域から作製できることもまた、当分野において周知である。これらの選択的転写産物は、一般的に「変異体」として周知である。より具体的には、「ｍＲＮＡ前駆体変異体」は、それらの開始位置または終止位置のいずれかにある同じゲノムＤＮＡから作製された他の転写産物とは異なる、イントロン配列およびエクソン配列の両方を含む、同じゲノムＤＮＡから作製された転写産物である。

１つまたは複数のエクソンまたはイントロン領域あるいはこれらの一部のスプライシング中の切り取りにおいて、ｍＲＮＡ前駆体変異体はより小型の「ｍＲＮＡ変異体」を作製する。その結果として、ｍＲＮＡ変異体は、プロセッシングされたｍＲＮＡ前駆体変異体であり、異なるｍＲＮＡ前駆体変異体はそれぞれスプライシングの結果として常に独自のｍＲＮＡ変異体を作製しなければならない。これらのｍＲＮＡ変異体はまた、「選択的スプライス変異体」として周知である。ｍＲＮＡ前駆体変異体のスプライシングが起こらない場合、そのｍＲＮＡ前駆体は、ｍＲＮＡ変異体と同一である。

変異体は、転写を開始または終止するための選択的シグナルの使用を介して作製でき、ｍＲＮＡ前駆体およびｍＲＮＡは複数の開始コドンまたは終止コドンを保有できることは、当分野において周知である。選択的開始コドンを使用する、ｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡに由来する変異体は、ｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡの「選択的開始変異体」として周知である。選択的終止コドンを使用するそれらの転写産物は、そのｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡの「選択的終止変異体」として周知である。選択的終止変異体の１つの特定の型は、複数の転写産物が、転写機構による１つの「ｐｏｌｙＡ終止シグナル」の択一的選択に起因し作製され、その結果ひとつのｐｏｌｙＡ部位でのみ終了する転写産物を作製する「ｐｏｌｙＡ変異体」である。本発明の文脈において、本明細書中に記載された変異体の型もまた、好ましい標的核酸である。

好ましいアンチセンス化合物とハイブリダイズする標的核酸上の位置は、本明細書中の以下で「好ましい標的断片」と称される。本明細書中で使用する場合、「好ましい標的断片」という用語は、活性アンチセンス化合物を標的とする標的領域の少なくとも５’−核酸塩基部分として定義される。理論に縛られることを好むものではないが、これらの標的断片は、ハイブリダイゼーションのためにアクセス可能な標的核酸の一部を表すと現在考えられている。

ある好ましい標的断片の特定の配列は、本明細書中に説明されているが、当業者は、これらが本発明の範囲内の特定の実施形態を例示および説明する役目を果たすことを認識するであろう。追加の好ましい標的断片は、普通の技術者により特定できる。

例示的な好ましい標的断片の中から選択される少なくとも５個の連続した核酸塩基のストレッチを含む、核酸塩基長が５から１５０の標的断片は、同様に標的とするに適切であると考えられる。

標的断片は、例示的な好ましい標的断片の１つの５’末端から少なくとも５個連続した核酸塩基を含む、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含み得る（残りの核酸塩基は、標的断片の５’末端のすぐ上流から始まる、同じＤＮＡまたはＲＮＡの連続したストレッチであり、ＤＮＡまたはＲＮＡが約５から約１５０核酸塩基を含むまで続く）。同様に好ましい標的断片は、例示的な好ましい標的断片の１つの３’末端から少なくとも５個連続した核酸塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ配列により表される（残りの核酸塩基は、標的断片の３’末端のすぐ下流から始まる、同じＤＮＡまたはＲＮＡの連続したストレッチであり、ＤＮＡまたはＲＮＡが約５から約１５０核酸塩基を含むまで続く）。本明細書中に例示した好ましい標的断片で武装した当分野の技術者は、必要以上の実験をすることなく、さらに好ましい標的断片を特定できる。

１つまたは複数の標的となる領域、断片または部位がひとたび特定されると、標的に対して十分相補的である、すなわち十分にハイブリダイズされ、十分な特異性を有し、望ましい効果を与えるアンチセンス化合物が合成され、標的となる領域、断片または部位の配列において核酸塩基に対して相補的である少なくとも１つのヒドロキシ基で置換された核酸塩基を組み込み、本明細書中に記載したキレート部分をさらに組み込む。アンチセンス化合物を、その後金属のイオンと接触させ、イオンと化合物との複合体を形成できる。この得られた化合物は、その後アンチセンス療法の機序に使用できる。

キットおよび診断ツール
本発明の化合物は、診断、治療、予防のため、ならびに研究用試薬およびキットとして利用できる。さらに、すぐれた特異性により遺伝子の発現を阻害できるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定の遺伝子の機能を解明、または生物経路の様々なメンバーの機能を識別するために、普通の技術者により頻繁に使用される。

キットおよび診断における使用のために、本発明の化合物は、単独または他の化合物または治療との併用のいずれかで、ディファレンシャル分析および／またはコンビナトリアル分析のツールとして使用でき、細胞および組織内における遺伝子発現の、一部または全部の相補体の発現パターンを解明できる。

１つの限定されない例として、１つまたは複数のアンチセンス化合物により治療された細胞または組織内における発現パターンを、アンチセンス化合物により処理されていない、対照の細胞または組織と比較し、発生したパターンを、例えば、疾患関連性、シグナル経路、細胞局在、発現レベル、サイズ、試験した遺伝子の構造または機能に関係がある遺伝子発現の差のレベルに関して分析する。これらの分析は、刺激された細胞または刺激されなかった細胞において、発現パターンに影響を与える他の化合物が存在するまたは存在しない下で実施できる。

当分野で周知の遺伝子発現分析法の例は、ＤＮＡアレイまたはマイクロアレイ（Brazma. およびVilo、FEBS Lett.、2000年、480、17〜24頁；Celis他、FEBS Lett.、2000年、480、2〜16頁）、SAGE（遺伝子発現の連続分析（serial analysis of gene expression））（Madden他、Drug Discov. Today、2000年、5、415〜425頁）、ＲＥＡＤＳ（消化されたｃＤＮＡの制限酵素 による増幅（restriction enzyme amplification of digested cDNAs））（PrasharおよびWeissman、Methods Enzymol.、1999年、303、258〜72頁）、ＴＯＧＡ（全遺伝子発現分析（total gene expression analysis））（Sutcliffe他、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.、2000年、97、1976〜81頁）、タンパク質アレイおよびプロテオミクス（Celis他、FEBS Lett.、2000年、480、2〜16頁；Jungblut他、Electrophoresis、1999年、20、2100〜10頁）、発現配列タグ（ＥＳＴ）配列決定（Celis他、FEBS Lett.、2000年、480、2〜16頁；Larsson他、J. Biotechnol、2000年、80、143〜57頁）、サブトラクティブRNAフィンガープリンティング（SuRF）（Fuchs他、Anal. Biochem.、2000年、286、91〜98頁；Larson他、Cytometry、2000年、41、203〜208頁）、サブトラクティブクローニング、ディファレンシャルディスプレイ（DD）（Jurecic およびBelmont、Curr. Opin. Microbial.、2000年、3、316〜21頁）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（Carulli他、J. Cell Biochem. Suppl.、1998年、31、286〜96頁）、ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）技術（Going and Gusterson、Eur. J. Cancer、1999年、35、1895〜904頁）および質量分析法（Comb、Chem. High Throughput Screen、2000年、3、235〜41頁）を含む。

アンチセンスの特異性および感受性もまた、治療使用のために当業者により利用される。アンチセンス化合物は、ヒトを含む動物において疾患状態の治療の治療部分として用いられている。リボザイムを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド薬は、安全かつ効果的にヒトに投与されており、多くの臨床検査が現在進行中である。したがって、アンチセンス化合物が、細胞、組織および動物、特にヒトの治療のための治療計画において有用であるように構成できる、有用な治療法であり得ることは確立されている。

治療のためには、標的核酸の発現を調節することにより治療できる疾患または障害を有すると疑われる対象、好ましくはヒトを、本発明によるアンチセンス化合物を投与することにより治療する。例えば、限定されない一実施形態において、本方法は、治療を必要とする対象に、治療有効量のアンチセンス化合物を投与するステップを含む。本発明の化合物は、有効量の化合物に、適切で、薬剤的に許容可能な希釈剤または担体を加えることによる、薬剤組成物で利用できる。該化合物の使用および本発明の方法は、予防的にも有用であり得る。

追加の態様および詳細な開示は、限定ではなく例示を意図するものである、以下の実施例により明らかになるであろう。

修飾ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドの合成
ＧＣＡＧＣＣＡＡＡＡＣＧＴＣＣＮ（配列番号１）またはＣＣＴＴＣＧＮ（Ｎ＝５−ＯＨｄＣ）（配列番号５）の合成

５−ヒドロキシ−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸を、５−ヒドロキシシチジン５’−二リン酸の合成に関して記載されたものと同様の手順を使用して合成した。２５ｍｇ（４５μモル）のｄＣＴＰ（ナトリウム塩として）を２００μｌの水に溶解し、その後４℃に冷却した。臭素を、ｄＣＴＰ溶液に、激しく攪拌しながら黄色を呈するまでゆっくりと加えた。過剰の臭素を取り除くため、７μｌのシクロヘキサン、次いで０，１ｍｌの２，４，６−コリジンを振とうしながら加えた。乳剤を３７℃で約２時間インキュベートし、その後エーテルを用いて抽出した（４×０．５ｍｌ）。水層を真空下で蒸発させ、水に再溶解し、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−２５カラム（約８０ｍｌ、ＨＣＯ_３ ⁻型）に添加した。三リン酸を含む画分を、重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）、ｐＨ７．５〜８（５ｍＭから０．８Ｍ）の直線勾配を用いてカラムから溶出した。ヌクレオシド三リン酸の混合物を含む画分を、プールし、５０％エタノールを用いて数回蒸発させ、ＴＥＡＢを除去した。５−ＯＨｄＣＴＰを、Ｍｏｎｏ Ｑカラム上で、１回目は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．５においてＮａＣｌの５ｍＭから０．７Ｍの直線勾配、最終的にはリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ３．５の５ｍＭから０．７Ｍの直線勾配を使用して、さらに２回精製した。５−ＯＨｄＣＴＰのピークを回収し、水を用いて希釈し、ＤＥＡＥ ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−２５ カラム（２．５ｍｌ、ＨＣＯ^３−型）に再添加した。カラムを０．１Ｍの重炭酸アンモニウムを用いて洗浄し、塩を除去し、その後０．６Ｍの重炭酸アンモニウムを用いて、５−ＯＨｄＣＴＰを溶出した。重炭酸アンモニウムを、５０％エタノールを用いた蒸発を繰り返しすことによって除去した。５−ＯＨｄＣＴＰの回収率は、約２５〜３０％であった。モル吸光係数［ε＝７７００（Ｘ，＝２９２ｎｍ）］（１５）を使用して５−ＯＨｄＣＴＰの量を算出した。

１つの、内部５−ＯＨｄＣを含むオリゴヌクレオチドを、先に記載した方法の変形によって調製した。１〜２．５ｎｍｏｌのＧＣＡＧＣＣＡＡＡＡＣＧＴＣＣ（配列番号２）またはＣＣＴＴＣＧ（配列番号３）を、６５μｌのバッファー（１００ｍＭカコジル酸ナトリウムｐＨ７．０、１ｍＭ ＣｏＣｌ２、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０μｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．１ｍＭ ＤＴＴ、１０ １μＭの５−ＯＨｄＣＴＰおよび１００単位の末端デオキシヌクレオチド転移酵素を含む）中で、３０℃で３０分間インキュベートした。１つの５−ＯＨｄＣＭＰを有する３’末端から伸長したオリゴヌクレオチドを、その後Ｐａｒｔｉｓｐｈｅｒｅ ＳＡＸカラム（０．４×１２．５ｃｍ、Ｗｈａｔｍａｎ）上で、２５％アセトニトリルを含むリン酸ナトリウムバッファーｐＨ６．３の直線勾配（５ｍＭから０．５Ｍ、６０分にわたって）を使用してＨＰＬＣ精製した。精製した伸長オリゴヌクレオチド、ＧＣＡＧＣＣＡＡＡＡＣＧＴＣＣＮ（配列番号４）またはＣＣＴＴＣＧＮ（配列番号５）（Ｎ＝５−ＯＨｄＣまたは５−ＯＨｄＵ）を、ＮＥＰ−５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して脱塩した。

希土類金属複合体の合成およびそれらのオリゴヌクレオチドとの結合
材料
チクロ（Ａｌｄｒｉｃｈ、９８％）、４−クロロメチル安息香酸（Ａｌｄｒｉｃｈ、９５％）、トリフルオロ酢酸エチル（Ａｌｄｒｉｃｈ、９９％）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（Ａｌｄｒｉｃｈ、９７％）、１−（３−ジメチルアミノ）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（Ｓｉｇｍａ、Ｐｒｏｔ．Ｓｅｑ．Ｇｒａｄｅ）、ユーロピウムトリフラート（Ａｌｄｒｉｃｈ、９８％）、ランタントリフラート（Ａｌｄｒｉｃｈ、９９．９９９％）、６０〜２００μｍの粒子径および４ｎｍの細孔径を有するシリカゲル（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、ＵＳＡ）、４０〜１２５μｍの粒子径および３−４ｍｅｑ／ｇの能力を有するＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。

４−（１，４，８，１１−テトラアザチクロテトラデカ−１−イルメチル）安息香酸の合成
エタノール：水（容量で５：１）の混合物（１８ｍｌ）に溶解したチクロの溶液（０．９１３ｇ、４．５ｍｍｏｌ）に、４−クロロメチル安息香酸（０．１５７ｇ、０．９２ｍｍｏｌ）のＬｉＯＨ（４ｍｌの水に５３ｍｇ）水溶液を加えた。この混合物を、その後５時間、攪拌しながら激しく還流した。その後溶媒を、減圧下で除去し、残留物を１３ｍｌの水に溶解した。得られた水溶液を、その後クロロホルムを用いて抽出し、（３ｍｌで１０回）、水層を減圧下で２ｍｌ、まで濃縮した。白い固体の生成物を、濃塩酸およびエタノールの溶液を加えることによって沈殿させ、エタノール／水／ＨＣｌから再結晶させることにより精製し、０．２０５ｇの表示化合物を得た。ＬＣ−ＭＳにより、４−（１，４，８，１１−テトラアザチクロテトラデカ−１−イルメチル）安息香酸塩酸塩の検査は、９５％より大であった。

４−（４，８，１１−Ｔｒｉｓ−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−１，４，８，１１−テトラアゾシクロテトラデカ−１−イルメチル）−安息香酸の合成
アルゴン洗浄した二口丸底フラスコに、引き続いて４−（１，４，８，１１−テトラアザチクロテトラデカ−１−イルメチル）安息香酸（９０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）、乾燥メタノール（１ｍｌ）、乾燥トリエチルアミン（０．５ｍｌ）およびトリフルオロ酢酸エチル（１．７ｍｌ）を加えた。以下の手順は全てアルゴン雰囲気下で実施した。混合物を６０時間攪拌した。その後、減圧下で溶媒を除去し、残留物を乾燥テトラヒドロフラン（５ｍｌ）に取った。減圧下でＴＨＦ溶液を濾過し、溶媒を除去した。残留物を真空中で４時間乾燥させ、０．５４ｇの油性化合物を作製した。ＭＳ ｍ／ｚ ６２３．５Ｍ［Ｃ_２４Ｈ_２７Ｆ_９Ｎ_４Ｏ_５］＋１。

４−（４，８，１１−Ｔｒｉｓ−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカ−１−イルメチル）−安息香酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イルエステルの合成
４−（４，８，１１−Ｔｒｉｓ−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−１，４，８，１１−テトラアゾシクロテトラデカ−１−イルメチル）−安息香酸（０．５４ｇ）を含むフラスコをアルゴン洗浄し、引き続き乾燥ＴＨＦ（１．２ｍｌ）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（２８ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）および１−（３−ジメチルアミノ）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（５１．６ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物をアルゴン下で、室温で６０時間攪拌した。その後、減圧下で溶媒を除去し、残留物を最小量のクロロホルムで溶解し、シリカゲルカラムを通した。生成物を、クロロホルム：メタノール（５０：１）を用いて溶出した。ロータリーエバポレーターを用いて濃縮し、真空中で乾燥させた後で、４−（４，８，１１−Ｔｒｉｓ−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカ−１−イルメチル）−安息香酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イルエステルを、白い固体物質として回収し、回収量は７０ｍｇであった。生成物のＬＣ−ＭＳスペクトルは、主要な画分が７２１［Ｍ（Ｃ_２８Ｈ_３０Ｆ_９Ｎ_５Ｏ_７）＋１］の質量を有し、これは６２３［（Ｍ−Ｃ_２Ｆ_３Ｏ）＋１］の質量を有する断片をもたらすことが確認された。

微量画分（約１％）は、
：ＭＳ ｍ／ｚ８５５．７［Ｍ（Ｃ_３８Ｈ_４０Ｆ_６Ｎ_６Ｏ_１０）＋１］として検出された。

４−（４，８，１１−Ｔｒｉｓ−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカ−１−イルメチル）−安息香酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イルエステルのＬａおよびＥｕ複合体を作製する一般的手順
乾燥エタノール（２ｍｌ）中の、等モル（約２０μモル）の、４−（４，８，１１−Ｔｒｉｓ−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカ−１−イルメチル）−安息香酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イルエステルとランタニドトリフラート、Ｌａ（ＣＦ_３ＳＯ_３）_３またはＥｕ（ＣＦ_３ＳＯ_３）_３との混合物を、アルゴン雰囲気下で、室温で２２時間攪拌した。その後、減圧下で溶媒を除去し、残留物をアセトニトリル（０．５ｍｌ）に取った。エーテル（０．７ｍｌ）を加えた後で、混合物を冷凍庫に４８時間保存し、濾過し、その後真空下で乾燥させ、４−（４，８，１１−Ｔｒｉｓ−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカ−１−イルメチル）−安息香酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イルエステルのＬａおよびＥｕ複合体の淡い黄色の固体を得た。

他のリガンドの合成は、周知の合成技術を使用して実施できる。例えば、米国特許第６，９８４，７３４号、第６，１２７，１２１号および第５，６８４，１４９号を参照されたく、これらのそれぞれの全体を参照により本明細書中に組み込む。

４−（４，８，１１−Ｔｒｉｓ−（２，２，２−トリフルオロアセチル）−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカ−１−イルメチル）−安息香酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イルエステルのＬａおよびＥｕ複合体のオリゴヌクレオチドへの結合
２つの異なった修飾２０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを合成する：５’−ＣＴＴ ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＴＴ ＴＡＣ ＧＴＣ ＧＮ−３’（Ｎ＝５−ＯＨ−ＣまたはＣ）（配列番号６）

約１０ｎｍｏｌの各オリゴヌクレオチドを、２００ｍＭのＮａＨＣＯ_３溶液の３００μＬに溶解する。得られた溶液をその後ジオキサン（２００μＬ）中のテトラアゾ大員環（０．６４ｍｇ）のランタニド複合体の溶液に加える。得られた混合物を室温で３時間激しく攪拌する。その後、混合物をリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．８６）中で詰めたＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（１．５×５．５ｃｍ）に通す。生成物を同じリン酸バッファーを用いて溶出し、全１５ｍｌの溶出液の後の方の１３ｍｌを回収し、室温において真空中で容積０．５ｍｌに減少させた。

インビトロの活性測定
ランタンおよびユーロピウムの複合体化合物の活性を、標的核酸（例えば、５’−ＧＣＧ ＡＣＧ ＴＡＡ ＡＣＧ ＧＣＣ ＡＧＡ ＡＧ−３’（配列番号７））の溶液とそれぞれの複合体化合物とを、ヒトの生理的条件（例えば、温度および塩の条件）を再現した条件下で混合することにより測定する。化合物および標的核酸を混合し、相互作用を可能にする。混合物の一定分量を抜き取り、標的核酸の存在または分解に関して分析する。標的核酸の量を測定する。標的核酸の分解率を、ランタンおよびユーロピウム−複合体化合物のヌクレアーゼ活性と、直接相関させる。

組み込まれたヒドロキシ核酸を有するオリゴヌクレオチドの安定性：５’−ＣＴＴ ＣＴＮ ＮＣＣ ＮＴＴ ＴＡＣ ＮＴＣ ＮＣ−３’（Ｎ＝Ｇまたは８−ＯＨ Ｇ）（配列番号８）
一連のオリゴヌクレオチドを、ポリヌクレオチド鎖の５’末端で、^３５Ｓ−αＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて標識した。標識したオリゴヌクレオチドを精製し、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＰＤ１０ ゲル濾過カラムを使用して、遊離標識の^３５Ｓ−αＡＴＰを外した。オリゴヌクレオチドの特異的活性は、オリゴヌクレオチドの０．０５〜０．２μＣｉ／μｇであった。

標識オリゴヌクレオチド（１〜１０ｎＭ）を、１００ｎＭ ＫＣｌおよび８０％ウシ胎児血清を含む５ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．５中でインキュベートし、表示の時間、３７℃の温度でインキュベートした。表示の時間間隔で、反応混合物の一定分量を抜き取り、０．０５％ブロモフェニルブルー、０．０５％キシレンシアノール、７Ｍ尿素および０．５×ＴＢＥバッファーを含む泳動用色素を用いて５倍に希釈した。分解したオリゴヌクレオチドを２０％のポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して分析した。バンドをゲルから切り取り、放射能を、Ｗａｌｌａｃ Ｍｉｃｒｏ Ｂｅｔａシンチレーションカウンターを使用して計測した。

Maniatis, T., Fritsch、E. F. and Sambrook、J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、N. Y. 1082に記載されているプロトコルを使用した。

結果、ヒドロキシ基で置換された核酸塩基をオリゴヌクレオチドに組み込むことによる、明確な安定化が示された（図１）。図１における表記は、天然オリゴマー（配列番号８、すべてのＮはＧである）およびオリゴマー１（１−ｍｏｄ；５’−ＣＴＴ ＣＴＮ ＧＣＣ ＧＴＴ ＴＡＣ ＧＴＣ ＧＣ−３’；配列番号９；Ｎ＝８−ＯＨ Ｇ）、オリゴマー２（２−ｍｏｄ；５’−ＣＴＴ ＣＴＮ ＧＣＣ ＮＴＴ ＴＡＣ ＧＴＣ ＧＣ−３’；配列番号１０；Ｎ＝８−ＯＨ Ｇ）およびオリゴマー３（３−ｍｏｄ；５’−ＣＴＴ ＣＴＮ ＧＣＣ ＮＴＴ ＴＡＣ ＧＴＣ ＮＣ−３’；配列番号１１；Ｎ＝８−ＯＨ Ｇ）に対応する。

強く結合した互変異性体の存在は、それぞれの二本鎖核酸の融解温度を大きく上昇させる。配列番号８（すべてのＮがＧである）の通常の二本鎖の測定溶解温度は、６７±２℃である。対照的に、２個の８−ヒドロキシグアニンで置換された同じオリゴマー（配列番号１０）の融解温度は、７１±２℃である。

８−ヒドロキシグアニンを組み込んだオリゴヌクレオチドを使用するＲＮＡの分解
強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）をコードする、^３５Ｓ標識および非標識の両方のセンスおよびアンチセンスＲＮＡを、ＲＮＡの分解をインビトロで観察するために調製した。ｅＧＦＰをｐＣＲ３．１発現ベクターに、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの調節下で、二方向（センスおよびアンチセンス方向）に、クローン化した。センスおよびアンチセンスｃＧＰＦ ＲＮＡを、インビトロで、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ^３５Ｓ標識リボヌクレオチド三リン酸を使用して、標準プロトコルを使用して合成した。この分析のために、等量の^３５Ｓ標識ＲＮＡを、異なる濃度のｅＧＦＰに対する相補的オリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。オリゴヌクレオチドは、８−ヒドロキシグアニンを０個（配列番号８）または１個（配列番号９）のいずれかで組み込んであった。天然および修飾オリゴヌクレオチドの両方が、リボヌクレアーゼ活性を有することが周知であるランタニドと複合体を形成した。ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドを、３７℃で１時間インキュベートした。その後、ＲＮＡを１％アガロースゲル電気泳動で分析した。ゲルは、オートラジオグラフィーを用いて視覚化し、ＲＮＡのバンドを切り取り、加水分解し、Ｗａｌｌａｃのシンチレーションカウンターを使用して計測した。定量結果を図２に示し、残存している未分解のＲＮＡの量を表す。図２の第１と第３の縦棒は、ｅＧＦＰ ＲＮＡと８−ヒドロキシグアニンを組み込んだオリゴヌクレオチド−ランタニド複合体（それぞれ１０μＭおよび５μＭ）とのインキュベーション結果を示す。図２の第２と第４の縦棒は、ｅＧＦＰ ＲＮＡと天然グアニンを有するオリゴヌクレオチド−ランタニド複合体（それぞれ１０μＭおよび５μＭ）とのインキュベーション結果を示す。図２の第５と第６の縦棒は、オリゴヌクレオチド−ランタニド複合体を加えていない対照実験を表す。これらの実験結果は、１つの修飾型を有するオリゴヌクレオチドが、標的ｅＧＦＰ ＲＮＡとより安定な複合体を形成し、その分解を強化することを明らかに示す（第１と第２の縦棒および第３と第４の縦棒とを比較されたい）。１つの８−ヒドロキシグアニン修飾を含むオリゴヌクレオチド−ランタニド複合体は、５μＭにおいてヌクレアーゼ活性を示すが、一方、天然のグアニンを含むオリゴヌクレオチド−ランタニド複合体は、ヌクレアーゼ活性をほとんど示さない。

ランタニド−オリゴヌクレオチド複合体によるＲＮＡ分解の分析。ｅＧＦＰ ＲＮＡを、通常のまたは修飾された２０ヌクレオチド長のｅＧＦＰに対して相補的なオリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。インキュベーションは、３７℃で１時間であった。この実験において、非標識ＲＮＡを使用し、結果を、１％アガロースゲルを使用した電気泳動により分析した。ゲル上のＲＮＡを、臭化エチジウム染色により視覚化した。

図３は、この実験の結果を示す。上方のゲルは、未修飾のオリゴヌクレオチド−ランタニド複合体（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデシルユーロピウムと配列番号８との複合体）と、下方のゲルは、修飾オリゴヌクレオチド−ランタニド複合体（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデシルユーロピウムと配列番号９との複合体）（オリゴヌクレオチドはヒドロキシ基で置換された核酸塩基に１つの修飾を有する）とインキュベートした後のｅＧＦＰ ＲＮＡの分解を示す。上方および下方のゲル両方のレーンは、以下の通りである：１．分子量および核酸のサイズマーカー；２．１０μＭのオリゴヌクレオチド−ランタニド複合体；３．１０μＭのオリゴヌクレオチド−ランタニド複合体；４．５μＭのオリゴヌクレオチド−ランタニド複合体；５．５μＭのオリゴヌクレオチド−ランタニド複合体；６．対照（センスＲＮＡ）；７．対照（アンチセンスＲＮＡ）。

図３に示した結果は、修飾を有するオリゴヌクレオチドは、ランタニドとの複合体においてより安定かつ活性であることを示唆する。

引用文献
個々の記載された全文献を、それらが教示する材料、方法および手順に関して、参照により本明細書に組み込む。

０、１、２または３個のヒドロキシグアニン核酸を組み込んでいるオリゴヌクレオチドの３７℃における血清中での安定性を描いたグラフである。 様々な相補的オリゴヌクレオチドと共にインキュベーションを行った後の、残存ＲＮＡ量を描いたグラフである。 本明細書中に開示したランタニド−オリゴヌクレオチド複合体の存在下で、ｅＧＦＰの分解を示した分析ゲルの写真である。上方のゲルは、ランタニドと複合体を形成した未修飾オリゴヌクレオチドとｍＲＮＡとのインキュベーション結果を示し、下方のゲルは、ｍＲＮＡとランタニドと複合体を形成した修飾オリゴヌクレオチドとのインキュベーション結果を示す。レーン１は分子量サイズマーカーであり、レーン２およびレーン３は、１０μＭのオリゴヌクレオチド−ランタニド複合体の存在下での分解を示し、レーン３および４は、５μＭのオリゴヌクレオチド−ランタニド複合体の存在下での分解を示し、レーン６はセンスＲＮＡの対照実験であり、レーン７はアンチセンスＲＮＡの対照実験である。

Claims (37)

1. ５から１５０個の核酸塩基を有するオリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドに結合したキレート部分とを含む化合物であって、前記核酸塩基の少なくとも１つが、５−メルカプトシトシン、５−メルカプトウラシル、８−メルカプトグアニン、８−メルカプトアデニン、５−ヒドロキシシトシン、５−ヒドロキシウラシル、８−ヒドロキシアデニンおよび８−ヒドロキシグアニンからなる群より選択される修飾核酸塩基であるオリゴヌクレオチドを含む化合物。
2. 修飾核酸塩基がヒドロキシ基で置換された核酸塩基であり、５−ヒドロキシシトシン、５−ヒドロキシウラシル、８−ヒドロキシアデニンおよび８−ヒドロキシグアニンからなる群より選択される、請求項１に記載の化合物。
3. １０から１００個の核酸塩基を含む、請求項１に記載の化合物。
4. １０から５０個の核酸塩基を含む、請求項１に記載の化合物。
5. ２０から３０個の核酸塩基を含む、請求項１に記載の化合物。
6. 少なくとも２個の核酸塩基がヒドロキシ基で置換された核酸塩基である。請求項１乃至５のいずれか１項に記載の化合物。
7. 核酸塩基の１０％から２０％がヒドロキシ基で置換された核酸塩基である、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の化合物。
8. キレート部分が式
   を有し、式中、Ｒがオリゴヌクレオチドである、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の化合物。
9. キレート部分が式
   を有し、式中、Ｒがオリゴヌクレオチドであり、
   式中、Ｒ^３は水素、Ｃ_１〜８のアルカン、Ｃ_２〜８のアルケン、Ｃ_２〜８のアルキン、アシルＣ_１〜８アルカン、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１〜８アルキルアリールおよびＣ_１〜８アルキルヘテロアリールからなる群より独立して選択される、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の化合物。
10. キレート部分が式
    を有し、式中、Ｒがオリゴヌクレオチドであり、
    式中、Ｒ^２は、Ｃ_１〜８のアルキル、Ｃ_２〜８のアルケン、Ｃ_２〜８のアルキン、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１〜８アルキルアリール、Ｃ_１〜８アルキルヘテロアリールおよびアシルＣ_１〜８アルカンから選択される、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の化合物。
11. キレート部分が式
    を有し、式中、Ｒがオリゴヌクレオチドであり、
    式中、Ｒ^１は、水素、Ｃ_１〜８のアルカン、Ｃ_２〜８のアルケン、Ｃ_２〜８のアルキン、アシルＣ_１〜８アルカン、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１〜８アルキルアリールおよびＣ_１〜８アルキルヘテロアリールからなる群より独立して選択される、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の化合物。
12. Ｒ^１が、水素、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ_３および−ＣＨ_２フェニルから独立して選択され、フェニルがＨ、ＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｏヘテロシクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｏアルキルまたはアルキルで置換されている、請求項１１に記載の化合物。
13. キレート部分が式
    を有し、式中、Ｒがオリゴヌクレオチドであり、
    式中、Ｒ^１は、水素、Ｃ_１〜８のアルカン、Ｃ_２〜８のアルケン、Ｃ_２〜８のアルキン、アシルＣ_１〜８アルカン、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１〜８アルキルアリールおよびＣ_１〜８アルキルヘテロアリールからなる群より選択される、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の化合物。
14. キレート部分が式
    を有し、式中、Ｒがオリゴヌクレオチドである、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の化合物。
15. キレート部分が式
    を有し、式中、Ｒがオリゴヌクレオチドであり、
    式中、Ｒ^３は、水素、Ｃ_１〜８のアルカン、Ｃ_２〜８のアルケン、Ｃ_２〜８のアルキン、アシルＣ_１〜８アルカン、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１〜８アルキルアリールおよびＣ_１〜８アルキルヘテロアリールからなる群より独立して選択される、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の化合物。
16. キレート部分が式
    を有し、式中Ｒがオリゴヌクレオチドである、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の化合物。
17. 金属のイオンをさらに含み、金属がランタン、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユーロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウムおよびルテチウムからなる群より選択される、請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の化合物。
18. 金属がユーロピウムまたはランタンである、請求項１７に記載の化合物。
19. 請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の化合物と、薬剤的に許容可能な担体とを含む組成物。
20. 送達媒体をさらに含む、請求項１９に記載の組成物。
21. 送達媒体がリポソームを含み、化合物がリポソーム内に包含されている、請求項２０に記載の組成物。
22. 標的核酸の翻訳を阻害する方法であって、標的核酸を、請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の化合物または請求項１９乃至２１のいずれか１項に記載の組成物と、化合物が標的核酸とハイブリダイズできる条件下で接触させることを含み、ハイブリダイズした化合物が標的核酸の翻訳を阻害する方法。
23. 標的核酸が生物内にある、請求項２２に記載の方法。
24. 接触させることが、化合物と薬剤的に許容可能な担体とを含む組成物を生物に投与することを含む、請求項２３に記載の方法。
25. 生物が、ヒトまたは動物である、請求項２３または２４に記載の方法。
26. 接触させることが、化合物と標的核酸を含む生体試料とを混合することを含む、請求項２３に記載の方法。
27. ハイブリダイズすることが、標的核酸の切断を誘導する、請求項２２乃至２６のいずれか１項に記載の方法。
28. ヒトまたは動物の対象において標的核酸の翻訳を阻害するための薬剤を製造するための、請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の化合物の使用。
29. 標的核酸がｍＲＮＡである、請求項２２または２８に記載の方法または使用。
30. 化合物が、標的核酸の結合を切断する、請求項２２乃至２９のいずれか１項に記載の方法。
31. 前記ヒトまたは動物が、ウィルス感染、細菌感染、微生物感染、真菌感染または癌を患っている、請求項２５または２８に記載の方法または使用。
32. 生物内で核酸の翻訳を阻害する方法であって、
    生物内の標的核酸のヌクレオチド配列を予測または決定することと、
    生物に、請求項１９乃至２１のいずれか１項に記載の組成物を投与することとを含み、前記化合物がヌクレオチド配列を含み、該生物の生理的条件下で、前記化合物が、標的核酸のヌクレオチド配列と該生物内でハイブリダイズするのに十分相補的であり、それにより核酸の翻訳が阻害される方法。
33. 化合物のヌクレオチド配列が標的核酸のヌクレオチド配列の全部または一部と完全に相補的である、請求項２８乃至３２のいずれか１項に記載の方法または使用。
34. 生物の生理的条件下で、生物の核酸の翻訳を阻害する化合物を作製する方法であって
    ａ）標的核酸のヌクレオチド配列を決定することと、
    ｂ）標的核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部とハイブリダイゼーションを可能にするのに十分相補的であるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであって、５から１５０個の核酸塩基を含み、オリゴヌクレオチドの少なくとも１個の核酸塩基が、５−メルカプトシトシン、５−メルカプトウラシル、８−メルカプトグアニン、８−メルカプトアデニン、５−ヒドロキシシトシン、５−ヒドロキシウラシル、８−ヒドロキシアデニンおよび８−ヒドロキシグアニンからなる群より選択される修飾核酸塩基であるオリゴヌクレオチドに結合したキレート部分を含む化合物を合成することと、
    ｃ）前記化合物を、ランタン、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユーロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウムおよびルテチウムからなる群より選択される金属のイオンと混合することと、
    を含む方法。
35. 修飾核酸塩基が、ヒドロキシ基で置換された核酸塩基であり、５−ヒドロキシシトシン、５−ヒドロキシウラシル、８−ヒドロキシアデニンおよび８−ヒドロキシグアニンからなる群より選択される請求項３４に記載の方法。
36. キレート部分が、
    からなる群より選択される式を有し、
    式中、Ｒがオリゴヌクレオチドであり、
    Ｒ^１およびＲ^３は、水素、Ｃ_１〜８のアルカン、Ｃ_２〜８のアルケン、Ｃ_２〜８のアルキン、アシルＣ_１〜８アルカン、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１〜８アルキルアリールおよびＣ_１〜８アルキルヘテロアリールからなる群より独立して選択され、
    式中、Ｒ^２は、Ｃ_１〜８のアルキル、Ｃ_２〜８のアルケン、Ｃ_２〜８のアルキン、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_１〜８アルキルアリール、Ｃ_１〜８アルキルヘテロアリールおよびアシルＣ_１〜８アルカンから独立して選択される、請求項３４または３５に記載の方法。
37. 条件がヒトの生理的条件を含む、請求項３４乃至３６のいずれか１項に記載の方法。