JPH03127622A - ｐＨ感受性リポソーム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、酸性側で融合率が増大するｐＨ感受性リポソ
ームに関する。

〔従来技術〕

昨今、リポソームが周囲のｐｌ＋の変動により封入物を
放出するｐｎ感受性リポソームの検討がなされている。

これらｐＨ感受性リポソームは、正常＆ＩＩｗｉよりや
やｐＨの低いＩｌｌ瘍、炎症、感染部位で薬物を有効に
放出するターゲ、ティング製剤や従来の融合能を有する
ウィルス等を用いずに、遺伝子を細胞質内に有効に導入
するツールなどへの利用が考えられている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、ｐｉ感受性であるホスファチジルエタノ
−ルア稟ン、オレイン酸、コレステロールのＡｌ１戒か
らなるリポソームでは、血中で粒子径の増大、封入物の
漏出を生じ、安定性が低いとの報告がある（Ｈｕａｎｇ
　ｅｔ　ａＬ、ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＬ　Ｊ、、父＋Ｉ
Ｑ６ａ（１９８９））　、また、１個又はそれ以上の弱
酸性官能基を有する両親媒性分子を少なくとも２０モル
％含むリポソームがｐｎ感受性を有することも見い出さ
れているが（特表昭６１−５０１８９７号公報）、オレ
イン酸が含有されているため、上記と同様に安定性が低
いという欠点があ；った。

〔問題点を解決するための手段） そこで発明者らは鋭意研究を重ねた結果、ホスファチジ
ルエタノ−ルアもンと、ホスフアチジン酸及び／又はホ
スファチジルセリンとを膜構ｔｃ脂質成分とするリポソ
ームが、特定の＆ｔｌ戒を選択することにより、ｐＨ感
受性を有することを見い出し本発明を完成した。

本発明で用いられるホスファチジルエタノールアミンは
卵黄など天然由来のものや、合成品、半合成品が用いら
れる。

ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンも卵黄など天
然由来のものや合成品、半合成品が用いられる。ホスフ
ァチジン酸及び／又はホスファチジルセリンの総含有率
は２０モル％以下とするのが望ましい。

膜構成脂質成分のＭ威として、ホスファチジルエタノー
ルアミン：ホスファチジン酸及び／又はホスファチジル
セリンのモル比は３２：１〜１６である。また、コレス
テロールを膜構成脂質成分として含有させてもよく、ホ
スファチジルエタノールアミンの５０％までを置き換え
ることが可能である。ホスファチジルエタノールアミン
；コレステロール：ホスファチジン酸及び／又はホスフ
ァチジルセリンの好ましいモル比は、４，２〜４：３．
８〜１０．５〜ｌ程度である。

リポソームの封入物としては、薬剤、ＤＮＡ。

ＲＮＡ等の核酸及びその類縁体、天然物又は遺伝子組み
換え由来の蛋白質、プロスタグランジン、ベンゾイルウ
レア系制癌剤やシスプラチン、アドリアマイシン等の低
分子化合物、蛍光物質等が挙げられる。蛋白には、ＵＫ
（ウロキナーゼ）、組織ブラスミノーゲンアクチベーク
ー、コロニー形成刺激因子、血液凝固因子（例えば■、
■等）、インターフェロン、インターロイキン等が挙げ
られる。

本発明のｐＨ感受性リポソームは次のような工程で作ら
れる。

脂質成分は、有機成分、例えば、クロロホルム、エタノ
ール等に溶解して十分に混合し、容器を減圧乾燥して溶
媒を留去し、容器の内面に脂質成分を薄く付着させて脂
質成分のフィルムを形成させる。

形成された脂質’１ｊｌｌｌ＊に封入物質をｐ１１４〜
１１、好ましくはｐＨ７〜９に調整したｕｋ街液（例え
ば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、生理
食塩溶液等）に加えて溶解した溶液と接触させ、素早く
振とう又は攪拌する。

好ましくは、次いで超音波処理を施し、粒子径を３μ以
下にｍ節する。超音波処理の条件としては０°Ｃ〜７０
°Ｃ１好ましくは３５°Ｃ〜４５°Ｃ，１〜６０分間程
度である。

以上の如くして、ｐＨ感受性リポソームが形成される０
粒子径は約０．０２〜３μｍ、好ましくは約０、０２５
〜０．１μｍとなる。

勿論、リポソームは、逆相蒸発法（Ｓｚｏｋａ　ｅｔ　
ａｔ。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、７Ｊ、’４
１９４（Ｌ９”１８）　）やカルシウム−ＢＤＴＡキレ
ート法（ＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕＬｏｓ　ｅｔａＬ　
、　、　Ｂｉｏｃｈｉ員、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔ
ａ、　、３！４Ｌ、　４８Ｌ　（１９７５）　）等目的
に応じ、種々の方法で調製すればよい、更に、抗体やり
ガント等を、必要に応じてリポソーム表面に組み込めば
より一層好ましい。

リポソームの単離、精製は遠心分離、ゲル濾過等自体既
知の手段にて行うことができる。

リポソームは、次いで要すれば生理的に許容される水溶
液で洗浄し、除菌濾過、分注を行い、液状製剤、ペレッ
ト状、！Ｑ濁状状製剤してｙＪ製する。

製剤化は医薬品の製法において広く公知の方法に準する
。また、本製剤は、液状製剤を凍結させた後、減圧下で
乾燥させ、凍結乾燥製剤としても提供される。

〔実施例〕

本発明をより詳細に説明するために、以下に実施例を挙
げるが本発明はこれらによって何ら服定されるものでは
ない。

実施例１ ホスファチジルエタノールアミン：コレステロール：ホ
スファチジン酸のモル比を８：８：１として混合し、そ
の４０ｍｇをフラスコにとり、５−のクロロホルムに溶
解させた０次いでクロロホルムを揮発させ、フラスコの
壁に薄いフィルムを形成させた。このフィルムと人尿由
来のウロキナーゼ（以下、ＵＫという）を４０ｍｇ含有
する５−のリン酸緩衝液（ｐＨ７，２，０，００５Ｍ）
とを混合し、分散液を調整した後、超音波処理を行なっ
た。超音波処理後、約１時間放置、１１０．０００　Ｘ
ｇで３時間遠心し、前記緩衝液で２回洗浄した。得られ
た洗液を回収し、０．５　ｍの生理食塩水に悲濁させ除
菌処理を行なった後、総括性３５万単位のＵＫを含有す
るＵＫ含有リポソーム製剤を製造した。このリポソーム
製剤は、約１〜１０°Ｃで保存し、要時希釈して医薬と
して供与させることができる。

実施例２ ホスファチジルエタノールアミン１００μｓｏｌ、ホス
ファチジルセリン２０μｍｏｌを１００−のエタノール
に溶解した後に、減圧乾燥させ容器中にフィルムを形成
した０次いで遺伝子工学の手法によって得たコロニー形
成刺激因子（以下、Ｃ３Ｆという）（１０’単位／ｄ）
０．２ｄを容器中に混合し振とうした。

この懸濁液を２７，０００Ｘｇ　、３０分間の遠心処理
にかけ、Ｃ３Ｆをとりこんだ脂肪小体画分を回収した６
次いで同し緩衝液を用いて１１０．０００　ｇ、１０分
間の遠心処理によって数回洗浄後、沈澱物を２−の生理
食塩水に恕濁させ除菌処理後、Ｃ３Ｆを含有するリポソ
ーム製剤を得た。

このリポソーム製剤は、約１〜ｌＯ°Ｃで保存し、要時
希釈して医薬として（Ｊｊ与させることができる。

実施例３ 実施例１において、ウロキナーゼの代わりに、プロスタ
グランジンを３０■添加する以外は、実施例１と同様の
操作を行い、同様のリポソーム製剤を得た。

実施例４ クロラムフ区ニコールアセチルトランスフエラーゼをコ
ードする遺伝子を含むプラスミドを、逆相蒸発法でリポ
ソームに封入した。

ホスファチジルエタノ−ルア逅ン１０ｙｍｏｌ、コレス
テロール１０μ１ＩＩｏ１、ホスファチジン酸２μｍｏ
１をジエチルエーテル に１００μｇの上記プラスミドを溶かしたＴＢＳ緩衝液
０．３３ｄを加え、低出力の超音波発生器で１５秒間処
理を行なった．生成したエマルシヨンを最初３５０ｍｍ
Ｈｇで減圧蒸留し、試料がゲル状になるまで行い、いっ
たん軽く撹拌してから、再度’７００ａＨｇで減圧蒸留
を２０分間行なった。

このものをＦｉｃｏｌｌの密度勾配遠心によって処理し
てリポソーム画分を回収し、除菌処理をなした後、プラ
スミド含有リポソーム製剤を得た。

実験例１　（ｐＦｌ応答性） 各種負荷電脂質含有リポソームのｐＨ応答性を、融合率
をもって比較した．評価は、別途調製した蛍光脂質含有
リポソームを用いて、エネルギー移動法により行なった
（最終的な蛍光１識リボソームの脂質濃度５０ｍＭ、非
蛍光標識リポソームの脂質濃度１５０ｍＭ）、その結果
、負荷電脂質がホスファチジルセリンまたはホスファチ
ジン酸の場合、ｐＨ応答性をある程度有することが分か
った（第１図参照）。

尚、融合率とは、リポソームがｐＨ感受性かどうかを調
べるために用いた指標であり、ＮＢＤ−ＰＥ〔ジオレオ
イルＮ−（７−ニトロ−２−１．３−ベンゾキサジアゾ
ール−４−イル）ホスファチジルエタノールアミン〕及
びＲｈ−ＰＥ　（ジアシルＮ−（リサミン・ロータコン
Ｂ・スルフォニル）ホスファチジルエタノールアミン〕
をそれぞれ１モル％含有する蛍光ｔｍｌ！にリポソーム
と非標識リポソームとを混合、種々のｐｌ＋で２分間反
応させ、反応前後の蛍光値より、以下の式を用いて算出
したものである。

π （但し、式中Ｒは５３０ｎｍでのＮＢＤ−ＰＥ蛍光体５
８０ｎｍでのＲｈ−ＰＥ蛍光の比を意味し、Ｒｉは融合
反応前のＲ値、Ｆ？ｆは融合反応後のＲ値、ｎは混合物
中の非標識リポソーム対ｔ！ｍリボソームの濃度比であ
る．） 実験例２（負荷電脂質含有の影響） リポソーム中の負荷電脂質をホスファチジルセリンまた
はホスファチジン酸として、ホスファチジルエタノ−ル
ア珈ン：コレステロール；ホスファチジルセリン又はホ
スファチジン酸のモル比を、８：８；１．８：８：２．
８８８：４とした際のｐｌ＋応答性を、実験例１と同様
に融合率により比較した。

〔発明の効果〕

本発明のリポソームは、ホスファデジルエタノールアミ
ンと、ホスファチジン酸及び／又はホスファデジルセリ
ン２０モル％以下とからなるリポソームであって、ホス
ファチジルエタノ−ルア句ン：ホスファチジン酸及び／
又はホスファチジルセリンのモル比が３２＝１〜１６で
あることを特徴とするｐＨ感受性リポソームであるから
、酸性側で融合率が増大するｐｉｔ感受性（応答性）を
有する。

【図面の簡単な説明】

第１図は各種負荷電脂質を含有するリポソームのｐＨ応
答性を示すグラフであり、図中ＣＬはカルシオリビン、
ＤＣＰはジセチルリン酸塩、ＰＡはホスファチジン酸、
ＰＣはホスファチジルグリセロール、ＰＩはホスファチ
ジルイノシトール、ＰＳはホスファチジルセリンを表す
（以下同じ）。 第２図（ａ）は負荷電脂質ＰＳ含有リポソームのｐＨ応
答性を示すグラフ、第２図（ｂ）は負荷電脂質ＰＡ含有
リポソームのｐｉ応答性を示すグラフである。 第２図 （ａｌ Ｈ 口 ’ｌ／９／１ Δ ８７Ｂ／２ 第２図 （ｂ） Ｈ ○ ８７８／４ 手Ｊｖεネ［ｉｉ正書（自発）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ホスファチジルエタノールアミンと、ホスファチ
   ジン酸及び／又はホスファチジルセリン２０モル％以下
   とからなるリポソームであって、ホスファチジルエタノ
   ールアミン：ホスファチジン酸及び／又はホスファチジ
   ルセリンのモル比が３２：１〜１６であることを特徴と
   するｐＨ感受性リポソーム。
2. （２）ホスファチジルエタノールアミンの一部がコレス
   テロールに置換されてなることを特徴とする特許請求の
   範囲第（１）項記載のｐＨ感受性リポソーム。