KR19980077401A - 와일드타입 p53 유전자벡터와 양이온성 리포솜을 함유하는 암의 유전자 치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 종양 억제 유전자로서 인체 암의 발생과 진행 및 전이를 차단하는데 핵심적인 역할을 수행하는 와일드타입 p53 유전자를 함유하는 신규 재조합 플라스미드 pCMV-p53을 양이온성 리포솜(cationic liposome)과 결합시킨 새로운 형태의 암치료제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 암치료제는 유전자 치료제의 일종으로서 간암, 위암, 폐암, 대장암, 췌장암, 신암, 방광암 및 전립선 암을 포함하여 p53 유전자에 이상이 있는 각종 인체 암세포를 효율적으로 살생할 뿐 아니라 생체에 유의한 부작용을 일으키지 않음으로써 뛰어난 항암치료율을 나타내며, 특히 기존의 항암제와 병용하여 투여하는 경우 항암제의 내성을 극복할 수 있도록 작용함으로써 상승적 항암효과를 나타내는 특성을 갖는다.

Description

와일드타입 p53 유전자벡터와 양이온성 리포솜을 함유하는 암의 유전자 치료제

본 발명의 목적은 종양억제유전자인 p53을 이용하여 기존의 치료법으로는 실패하였거나 치료가능성이 적은 각종 인체암에 대해 단독투여, 혹은 기존 항암제와의 병용투여에 의해 암을 유의하게 경감 내지 치유시키며, 심각한 부작용이 없는 새로운 유전자 치료제를 개발하려는데 있다.

좀더 구체적으로, 본 발명은 종양 억제 유전자로서 인체 암의 발생과 진행 및 전이를 차단하는데 있어서 핵심적인 역할을 수행하는 와일드타입 p53 유전자를 함유하는 신규 재조합 플라스미드 pCMV-p53을 양이온성 리포솜(cationic liposome)과 결합시킨 새로운 형태의 암치료제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 암치료제는 유전자 치료제의 일종으로서 간암, 위암, 폐암, 대장암, 췌장암, 신암, 방광암 및 전립선암을 포함하여 p53 유전자에 이상이 있는 각종 인체 암세포를 효율적으로 살생할 뿐아니라 생체에 유의한 부작용을 일으키지 않으므로써 뛰어난 항암치료율을 나타내며, 특히 기존의 항암제와 병용하여 투여하는 경우 항암제의 내성을 극복할 수 있도록 작용함으로써 상승적 항암효과를 나타내는 특성을 갖는다.

오늘날 암은 국내외에서 병으로 인한 사망원인의 첫째 내지 두번째로 손꼽히고 있으며, 이에 따라 국민보건 뿐아니라 국가경제에 직간접적으로 미치는 영향은 엄청나다. 조기 암의 치료는 수술요법에 의해 비교적 높은 완치율을 보이고 있으나, 진행된 말기 암에 대해서는 유의하게 효과적인 치료법이 아직까지 개발되지 못한 실정이며, 조기 암으로 진단하여 수술을 한 후에도 재발 및 전이로 인해 실패하는 경우가 빈번하다.

국내에서 가장 빈번하게 발생하는 3 대암인 위암, 폐암 및 간암은 상당수가 수술로서 근치가 불가능한 정도로 진행된 상태에서 발견되고 있으며, 그외에 대장암, 췌장암, 자궁암, 난소암, 두경부암의 경우에도 이러한 실정은 마찬가지이다. 이들 암에 대해서는 각종 항암제와 방사선치료, 면역요법, 동맥색전술 등의 여러 가지 치료법이 동원되고 있으나 그 반응율은 대체로 20% 미만이며, 생존기간에도 별다른 영향을 미치지 못한다.

한편, 국내에서 특히 문제가 되는 것은 간암이다. 간암에는 원발 간암과 전이 간암이 있으며, 폐암과 대장암, 위암 등에 속발되는 전이 간암의 유병율도 높다. 대부분의 간암은 진행된 III기 및 IV기에 상태에서 발견되며, 이 경우 간동맥색전술이나 항암화학요법등이 시도되고 있으나, 치료 후 평균 생존기간이 3 내지 6개월에 지나지 않고 대부분 1년 이내에 사망한다. 여기에 상기한 치료법들이 오히려 간기능의 악화등 부작용을 야기시켜 이로 인해 생명이 단축될 수 있다. 따라서, 진행된 인체암, 특히 원발 및 전이 간암의 치료성적을 개선하기 위해서는 기존 치료법의 문제점을 극복하여 정상세포에는 손상을 주지 않으면서 암세포를 효과적으로 제거할 수 있는 새로운 치료법의 개발이 시급하다.

최근의 구미의학계에서는 암을 유전학적 관점에서 해석하고 치료하려는 노력이 활발하게 이루어지고 있다. 즉, 암은 점진적인 유전자의 변화와 변이된 세포의 과잉증식, 그리고 클론의 확장 등 다단계적 변화가 겹쳐서 발생하는데 여기에 암유전자(oncogene)와 종양 억제 유전자(tumor suppressor gene)가 핵심적 역할을 수행하며, 따라서 원인이 되는 유전자를 효과적으로 없애거나 고치거나 대체할 수 있다면 암의 치유도 가능하다는 것이다. 그러나, 현재까지 모든 종양에서 일률적으로 돌연변이를 나타내는 유전자는 알려져 있지 않다.

대표적인 종양 억제 유전자로 p53을 들 수 있다. 전체 인체 종양세포의 절반가량에서 p53 유전자의 돌연변이가 관찰되며, 빈도의 차이만 있을 뿐 거의 모든 종류의 종양에서 p53 유전자의 돌연변이가 발견된다.

예컨데 국내 3대암인 위암과 폐암 및 간암의 경우 각각 평균 40 내지 60%에서 p53 유전자의 이상이 발견된다. 그외에도 항암화학요법이나 방사선요법에 저항하는 대표적 난치성암인 대장암, 췌장암, 두경부암, 식도암, 자궁암, 난소암, 방광암, 전립선암의 경우에도 절반가량에서 p53 유전자의 이상이 발견된다(참조 : Database of p53 gene somatic mutations n human tumors and cell line : updated compilation and future prospects, Hainaut P., et al., Nucleic Acids Research, 25, 151-157 (1997)). p53 유전자는 종양 억제 유전자의 정의에 부합되게 종양의 발생과 성장 및 진행을 억제하는 기능이 있다고 알려져 있다. 예컨데, 인체의 여러 조직에서 발생할 수 있으며 p53 유전자의 이상이 있는, 즉 와일드타입(wild-type) p53 유전자가 결핍된, 암세포에 정상의 와일드타입 p53 유전자를 투여할 경우 bax 유전자 등의 발현을 촉진하여 암세포의 고사(apoptosis ; 일종의 유전적 지령에 의한 자살)를 유발하며, p21/Wafl/CDKI 등을 발현시켜 증식정지를 유발시킴으로써 암을 치료할 수 있다고 알려져 있다(참조 : Genetic mechanisms of tumor suppression by the human p53 gene, Chen P. L., et al., Science, 250, 1576-80 (1990); Wild-type but not mutant p53 suppresses the growth of human lung cancer cells bearing moltiple genetic lesions, Takahashi T., et al., Cancer Research, 52, 2340-43 (1992); Growth suppression of human head and neck cancercellls by the introduction of a wild-type p53 gene via a recombinant adenovirus, Liu T-J., et al., Cancer Research, 54, 3662-67 (1994)). 또한, 최근 진행된 폐암환자 9명에 p53 유전자를 레트로바이러스에 결합시켜 암종내 국소주사한 결과, 그 중 3명에 있어서 암이 경감되었다는 임상시험 보고도 있다(참조 : Retrovirus-mediatied wild-type p53 gene transfer to tumors of patients with lung cancer, Roth J, A., et al., Nature Medicine, 2, 985-990 (1996)).

따라서 와일드타입 p53 유전자의 투여는 각종의 진행된 인체 암에 대한 유력한 치료법이 될 수 있다. 특히, 국내에서 가장 기대되는 분야는 발병빈도가 높으며, p53의 이상빈도가 높고, 진행된 암에 대해 지금까지 별다른 치료법을 갖고 있지 못하였던 간암과 위암, 대장직장암 등의 분야라 할 수 있다. 국내 간암의 대다수는 B형 바이러스(HBV) 간염에 속발되어 오는데, 이러한 현상은 HBV의 유전자산물인 HBX 단백질이 대표적 항암유전자인 p53의 단백질 산물과 결합하여 이의 정상기능을 차단하기 때문이라고 최근 해석되고 있다. 또한, 간세포내의 HBX 단백질의 양과 와일드타입 p53 단백질 양의 균형여부가 간암발생에 중요한 역할을 한다고도 보고되었다(참조 : Hepatitis BX antigen and p53 are associated in vitro and in liver tissues from patients with primary hepatocellular carcinoma, Feitelsen M. A., et al., Oncogene, 8, 1109-1117(1993) ; Functional inactivation buy not structural mutation of p53 causes liver cancer, Ueda H., et al., Nature Genetics, 9, 41-47 (1995)). 아울러 국내를 포함한 아시아 지역에서 간암의 주요 발생원인은 aflatoxin B인데, 이 aflatoxin은 특징적으로 p53 유전자의 249번째 코돈에 돌연변이를 일으켜 간암을 유발시키는 것으로 보고되고 있다(참조 : Geographical variation of p53 mut-ational profile in nonmalignant human liver, Aguilar F., et al., Science, 264, 1317-9 (1994)).

문제는 어떤 방법으로 와일드타입 p53 유전자를 암환자에게 투여함으로써 부작용없이 효과적으로 암세포만을 살생하여 암을 치료할 수 있느냐 하는 것이다. 정상형 p53 유전자를 이용하는 유전자 요법으로서 인체의 암을 치료하기 위하여 지금까지 개발되어온 방법으로는 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus) 또는 아데노결합된 바이러스(adenoassociated virus)에 p53 유전자를 삽입하여 재조합 바이러스를 제조한 후 이를 인체에 투여하는 방법을 언급할 수 있다(참조 : Retrovirus-mediated wild-type p53 gene transfer to tumors of patients with lung cancer, Roth J. A., et al., Nature Medicine, 2, 985-990 (1996) ; Development and characterization of recombinant adenovirus encoding human p53 for gene therapy of cancer, Willis K.N., et al., Human Gene therapy, 5, 1079-1088 (1994)). 이와 같이 유전자 전달 매개체로서 바이러스를 사용하는 경우에는 유전자 전달 및 발현 효율이 높다는 장점이 있다(참조 : High-efficiency gene transfer and high-level expression of wild-type p53 in human lung cancer cells mediated by recombinant adenovirus, Zhang W. W., et al., Cancer Gene Therapy, 1, 1-10 (1994) ; Development and characterization of recombinant adenovirus encoding human p53 for gene therapy of cancer, Willis K. N., et al., Human Gene therapy, 5, 1079-1088 (1994)).

그러나, 바이러스벡타 이용법은 하기 언급하는 바와 같이 많은 단점들을 가지고 있어서 실제로 인체에 적용하는 경우 문제가 많다. 첫째, 바이러스를 이용한 유전자치료에서는 그 치료제를 얻기위한 정제과정에 문제가 있어서 복제 가능형 바이러스나 바이러스 단백질을 완전히 제거하기 어렵고; 둘째, 제거되지 않은 바이러스가 인체내에서 복제, 전파되어 바이러스성 염증을 일으킬 수 있으며; 셋째, 레트로바이러스의 경우 인체의 염색체내로 들어가서 돌연변이와 암을 유발할 수 있고; 넷째, 특히 아데노바이러스의 경우 반복투여시 면역촉진 때문에 발현되지 않고 파괴되면서 중한 염증반응을 일으킬 수 있는 것이다(참조 : Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenovirus for gene therapy, Yang Y., et al., Proceedings National Academy of Science. U.S.A. 91, 4407-4411 (1994) ; Gene transfer and therapy with adenoviral vector in rats with diethylnitrosamine-induced hepatocellular carcinoma, Qian C., et al., Human Gene Therapy, 8, 349-358 (1997)).

또한, 와일드타입 p53 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드 벡터의 구조도 본 발명에 따른 유전자 치료법에서 매우 중요한 의미를 갖는다. 즉 와일드 타입 p53 유전자가 세포중에 높은 효율로 발현됨으로써 소기의 기능을 원활하게 수행할 수 있도록 하기 위한 효율적인 벡터시스템이 갖추어져야 하는 것이다.

이에 본 발명자들은 유전자요법으로 p53 유전자의 돌연변이 또는 결실로 인하여 발생한 암을 치료하는데 있어서, p53 유전자를 세포내에서 고 효율로 발현시킬 수 있는 새로운 구조의 재조합 플라스미드에 대해 연구하는 한편, 이 유전자의 전달 매개체로서 어떤 것을 사용하면 효과적으로 p53 유전자를 암세포에 전달하고 이를 발현시켜 암 치료효과를 얻을 수 있는지에 대해 집중적인 연구를 수행하였다. 그 결과, p53 유전자를 함유하는 효과적인 재조합 플라스미드를 새로이 작제하고 이를 유전자 전달 매개체로서 선택된 양이온성 리포솜(cationic liposome)과 결합시켜 암치료제로 사용하면 소기의 목적을 달성할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다. 이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.

도 1 은 인체 와일드타입(wild type) p53 유전자를 함유하는 플라스미드 벡터 pCMV-p53의 유전자 지도를 나타낸 것이다.

도 2 는 인체 와일드타입 p53유전자를 함유하는 플라스미드벡터 pCMV-p53의 작제과정을 도식화하여 나타낸 것이다.

도 3 은 대량생산된 pCMV-p53을 HPLC로 분석함으로써 순수한 pCMV-p53 플라스미드 DNA만 따로 분리됨을 확인한 결과도이다.

도 4 는 3-β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(이하, 'DC-CHOL'이라 한다)의 합성과정 및 화학구조를 나타낸 것이다.

도 5 는 디올레일포스페티딜에탄올아민(이하, 'DOPE'라 한다)의 화학구조를 나타낸 것이다.

도 6 은 본 발명에 따른 암치료제 약물의 일종인 헤파토벡틴(HEPATOVECTIN)-1을 구성하는 pCMV-p53 플라스미드 DNA와 DC-CHOL:DOPE 리포솜의 결합을 확인한 전기영동 결과도이다.

도 7 은 본 발명에 따른 암치료제 약물의 일종인 헤파토벡틴-1의 시험관내 유전자발현 효과를 X-Gal 염색에 의해 확인한 현미경 사진으로서, 유전자가 유입된 세포들은 청색으로 염색되어 나타난다.

도 8 은 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N, N, N-트리메틸암모늄 클로라이드(이하, 'DOTMA'라 한다)의 합성과정 및 화학구조를 나타낸 것이다.

도 9 는 본 발명에 따른 암치료제 약물의 일종인 헤파토벡틴-2를 구성하는 pCMV-p53 플라스미드 DNA와 DOTMA:DOPE 리포솜의 결합을 확인한 전기영동 결과도이다.

도 10 은 본 발명에 따른 암치료제 약물의 일종인 헤파토벡틴-2의 시험관내 유전자발현 효과를 X-Gal 염색에 의해 확인한 현미경 사진으로서, 유전자가 유입된 세폭들은 청색으로 염색되어 나타난다.

도 11 은 본 발명에 따른 암치료제 약물의 일종인 헤파토벡틴-3을 구성하는 pCMV-p53 플라스미드 DNA와 poly-L-lysine : DOTMA:DOPE 리포솜의 결합을 확인한 전기영동 결과도이다.

도 12 는 본 발명에 따른 암치료제 약물의 일종인 헤파토벡틴-3의 시험관내 유전자발현 효과를 X-Gal 염색에 의해 확인한 현미경 사진으로서, 유전자가 유입된 세포들은 청색으로 염색되어 나타난다.

도 13 은 헤파토벡틴을 시험관내에서 암세포에 투여했을 때 생존 암세포수가 현저하게 감소됨을 보여주는 현미경사진이다.

도 14 는 헤파토벡틴을 투여한 후 암세포에 고사가 발생하여 그 DNA가 분절되는 것을 확인한 전기영동 사진을 나타낸 것이다.

도 15 는 시험관내에서 p53 유전자가 결실된 암세포에 헤파토벡틴을 투여한 후 암세포내에 인체 와일드타입 p53 유전자 유입되어 발현됨을 RT(역전사)-PCR-서던블롯팅으로 확인한 결과도이다.

도 16 은 인체 위암의 누드마우스 피하이식모델에서 헤파토벡틴 투여 후 암의 성장이 현저하게 억제됨을 보여주는 육안소견 결과이다.

도 17 은 인체 위암의 누드마우스 피하이식모델에서 헤파토벡틴 투여 후 암세포에 고사가 발생하여 그 DNA가 분절되는 것을 확인한 전기영동사진이다.

도 18 은 p53 유전자가 결실된 인체 위암세포의 누드마우스 피하이식모델에서 헤파토벡틴을 국소 투여한 후 암세포내에 인체 와일드타입 p53 유전자가 유입되어 발현됨을 역전사-PCR-서던블롯팅으로 확인한 결과도이다.

도 19 는 인체 간암의 누드마우스 복강내 이식모델에서 헤파토벡틴을 복강내에 투여한 후 암의 성장이 현저하게 억제됨을 보여주는 현미경소견 결과이다.

도 20 은 인체 간암의 누드마우스 복강내 이식모델에서 헤파토벡티의 투여 후 암세포에 고사가 발생하여 그 DNA가 분절되는 것을 확인한 전기영동사진이다.

도 21 은 p53의 돌연변이가 있는 인체 위암세포의 누드마우스 복강내 이식모델에서 헤파토벡틴을 복강내 투여한 후 암세포내에 인체의 와일드타입 p53 유전자가 유입되어 발현됨을 RT-PCR-서던블롯팅으로 확인한 결과도이다.

도 22 는 인체 신압의 누드마우스 신장 이식모델에서 헤파토벡틴의 혈관내 투여 후 암의 증식이 현저하게 억제됨을 보여주는 1 : 1 현미경소견 결과이다.

도 23 은 인체 신암의 누드마우스 신장 이식모델에서 헤파토벡틴의 혈관내 투여 후 암세포에 고사가 발생하여 그 DNA가 분절되는 것을 확인한 전기영동사진이다.

도 24 는 p53의 돌연변이가 있는 인체 신암세포의 누드마우스 신장 이식 모델에서 헤파토벡틴을 혈간내 투여한 후 암세포내에 인체 와일드타입 p53 유전자가 유입되어 그 결과 p21/Waf1이 발현됨을 RT-PCR-서던블롯팅으로 확인한 결과를 나타낸다.

도 25 는 누드마우스 피하 암이식모델에서 헤파토벡틴을 시스플라틴과 함께 투여하여 암의 성장이 더 현저하게 억제됨을 보여주는 육안소견 결과이다.

본 발명은 와이드타입 p53 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드를 양이온성 리포솜(cationic liposome)과 결합시킨 복합체로서 p53 유전자의 돌연변이(mutated) 또는 결실(deletion)로 인하여 발생한 인체 암을 치료하기 위한 약물에 관한 것이다.

유전자요법에 의하여 암을 효과적으로 치료하기 위한 목적으로 선택된 p53 유전자는 와일드타입으로 존재하는 경우 종양 억제 활성을 갖는다. 이 유전자의 산물인 p53 단백질은 핵내에 존재하는 분자량 53Kd의 인산화 단백질(nuclear phosphoprotein)이고 게놈(genome)의 안정성을 유지하는데 필수적인 역할을 수행한다. 즉, 세포 게놈 DNA에 손상이 가해지면 p53 단백질이 발현되는데, 이렇게 발현된 p53 단백질은 G1과 S기 사이(check point)에서 세포주기의 진행을 차단하는 작용을 하며, 이렇게 시간을 번 후 그 사이에 손상된 DNA가 재건(repair)되게 하고, 만약 그 손상정도가 복구불가능할 때에는 해당 세포가 고사(apoptosis)에 빠지도록 유도함으로써 게놈의 안정성을 유지하는 것이다. 따라서, 유전자의 돌연변이나 결실, 또는 암유전자와의 결합등으로 인하여 p53이 그 기능을 상실하는 경우에 표적세포는 게놈의 안정성이 무너지면서 암세포화되며 자율적으로 과잉증식을 하고 돌연변이가 쉽게 추가되어 더 악성의 암으로 진행하게 된다. 한편, p53은 세포증식의 신호전달이나 종양혈관형성, 암세포의 침윤 및 항암제에 대한 다중내성에도 관여하며, 특히 p53 유전자를 암환자에게 투여하는 경우 암의 증식과 전이에 필요한 암혈관의 형성을 차단함으로써 암을 파괴하는 효과도 있는 것으로 보고된 바 있다(참조 : p53 : puzzle and paradigm, Ko L., et al., Genes and Development, 10, 1054-72 (1996) ; p53, the cellular gatekeeper for growth and division, Levine A.J., Cell. 88, 323-331 (1997) ; p53 : from inductive signal to cellular effect, Hansen R., et al., Current Qpinions in Genes and Development. 7, 46-51 (1997)).

p53 cDNA는 12개의 exon으로 이루어져 있으며 exon 2에서 11까지의 부분이 393개의 아미노산으로 이루어진 p53 단백질로 번역된다. p53 단백질은 중심부 표적유전자와의 결합부위(central DNA binding domain), 아미노말단의 전사 활성화부위(N-terminal transcriptional activation domain) 및 카르복시 말단 부위로 이루어져 있다. p53 유전자의 돌연변이는 대부분 exon 5 내지 9 사이의 중심부 DNA 결합부위에서 집중적으로 발견된다(참조 : Sequence-specific transcriptional activation is essential for growth suppression by p53, Pietenpol J.A., et al., Proceedings National Academy of Science, U.S.A, 6, 1998-2002 (1994); Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations, Cho Y., et al., Science 265, 346-355 (1994); Database of p53 gene somatic mutations in human tumors and cell line: updated compilation and future prospects, Hainaut P., et al., Nucleic Acids Research, 25, 151-157 (1997)). 돌연변이된 (mutant type) p53 단백질은 와일드타입에 비해 반감기가 현저히 증가되어 핵내에 장기간 머무르면서 정상적인 p53 유전자의 기능을 억제하고 발암을 유도하게 된다.

본 발명에서는 와일드타입 p53 유전자로서 그 서열 및 물리화학적 성질이 문헌에 공지된 cDNA를 암치료제의 유효성분으로 사용한다(참조 : Isolation and characterization of a human p53 cDNA clone: expression of the human p53 gene, Matlashewski G., et al., EMBO Journal, 3, 3257-62 (1984); Characterization of the human p53 gene, Lamb P., et al., Molecular Cell Biology, 6, 1375-82 (1986)).

또한, 본 발명자는 이 유전자를 세포내에서 고 효율로 발현시킬 수 있는 새로운 구조의 재조합 플라스미드에 대해 연구하던 중에, 도 2 에 도식화하여 나타낸 과정에 따라 작제한 새로운 재조합 플라스미드 pCMV-p53을 사용하면 목적하는 p53 유전자를 매우 효과적으로 발현시킬 수 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 효과를 갖는 재조합 플라스미드 pCMV-p53은 포유류세포 발현플라스미드로서 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)의 어얼리프로모터/인핸서와 인체의 와일드타입 p53 유전자의 cDNA, 폴리아데닐화(polyadenylation)서열 및 전사종결신호(transcription termination signal), 대장균내 복제를 위한 Ori 등으로 구성되어 있으며, 그 유전자 map은 도 1 에 나타낸 바와 같다.

재조합 플라스미드 pCMV-p53 은 세균배양, 세균용해 및 플라스미드의 분리, 플라스미드 DNA 정제, 플라스미드 DNA 멸균으로 구성된 4단계 과정을 통해 대량으로 생산하고 정제하여 사용할 수 있으며, 그 과정 및 제조된 플라스미드의 특성에 대해서는 하기 실시예 1에서 구체적으로 설명한다.

한편, 유효성분인 p53 유전자를 세포내로 전달하여 그 기능을 발휘할 수 있도록 하는 매개체로서 본 발명에서 선택하여 사용한 양이온성 리포솜은 생체외 뿐아니라 생체내로 유전자를 전달하는 수단으로서 유력시되는 것으로, 실제 미국에서는 낭종성 섬유증(cystic fibrosis) 치료유전자, HLA-B7 또는 인터루킨(interleukin)-2 유전자를 전달매체로서 양이온성 리포솜과 결합시켜 인체 유전자치료에 사용하려는 시도가 있었다(참조 : Clinical protocols of immunother-apy of malignancy by in vivo gene transfer into tumors, Nabel E.G., et al., Human Gene Therapy, 3, 399-410 (1992) ; Direct gene transfer with DNA-liposome complexes in melanoma : Expression biologic activity and lack of toxicity in humans, Nabel G.J., et al., Proceedings National Academy of Science U.S.A. 90. 11301-11311 (1993) ; Gene therapy for cystic fibrosis in human by liposome-mediated DNA transfer : The production of resources and the regulatory process, Caplen N.J., et al., Human Gene Therapy, 1, 139-147 (1994)).

이와 같은 양이온성 리포솜을 유전자 전달 매개체로 사용함에 따라, 본 발명에 따른 암료제는 유전자 전달 매개체로서 레트로바이러스, 아데노바이러스 등을 이용하는 지금까지의 p53 유전자 치료방법에 비해 많은 장점을 나타내고 있다. 첫째, 본 발명의 암치료제는 생체 정상세포에 대해 유의한 손상을 일으키지 않으며 염색체내로 들어가지 않으므로 정상세포에 돌연변이나 발암을 야기시키고 않고, 숙주에 면역반응이나 염증을 유발시키지 않으며, 바이러스나 세균오염, 내독소(endotoxin) 등에 의한 오염의 위험이 없는 등 안전성이 아주 뛰어나다. 이러한 성질로 인하여 생체내에 안전하게 직접투여할 수 있으며, 면역촉진이나 심각한 염증에 대한 염려없이 반복투여할 수 있다. 둘째, 순도높게 대량으로 생산하는 것이 용이하며, 이 때문에 매우 경제적이다. 셋째, 기존의 바이러스벡터에 결코 뒤지지 않을 만큼 유전자 전달 효율이 높으며, 따라서 간암과 위암, 폐암을 포함하여 p53 유전자의 이상으로 인하여 발생한 각종 인체 암세포를 효율적으로 살생할 수 있다.

유전자 전달 매개체로서 양이온성 리포솜을 사용하는 본 발명과 아데노 바이러스를 사용하는 기존의 방법에 대하여 항암효과, 유전자 발현효율 및 독성을 각각 평가한 결과는 하기 표 1 에 나타낸 바와 같다.

[표 1]

상기 표 1 의 비교결과로부터 알 수 있듯이, 리포솜과 아데노바이러스를 각각 유전자 전달 매개체로서 사용하는 경우에 시험관내 및 생체내 항암효과에는 유의한 차이가 없으며, 유전자 발현효율 역시 동등한 것으로 나타났다. 그러나, 안전성면에서는 본 발명에서 선택하여 사용한 양이온성 리포솜이 훨씬 뛰어남을 확인할 수 있다.

이에 따라, 본 발명자들은 여러 종류의 양이온성 리포솜을 제조하여 이를 p53 유전자에 결합시키고 그 효능을 확인함으로써 다양한 인체암을 치료하기에 가장 효과적인 치료제를 개발하고자 노력하였으며, 이에 따라 현재까지 본 발명자들에 의해 효과가 뛰어난 것으로 확인된 양이온성 리포솜의 종류를 나타내면 하기 표 2 과 같다.

[표 2]

* DC-CHOL : 3-β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤

* DOPE : 디올레일포스페티딜에탄올아민

* DOTMA : N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드

상기 표 2 에 기재된 바와 같은 양이온성 리포솜을 p53 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드와 결합시킨 복합체를 형성하기 위해서는 플라스미드와 리포솜을 각각 칼슘 및 마그네슘이 결여되어 있는 HBSS 용액에 가하고 실온에 방치한 다음 양 물질을 혼합함으로써 하전에 의해 단단한 결합을 형성하도록 하여야 한다. 이때 양이온성 리포좀의 종류에 따라 바람직한 결합몰비가 상이할 수 있으므로 실험에 의하여 최적의 결합을 이루는 반응몰비를 결정하는 것이 중요하다.

예를 들어, 표 2 기재의 양이온성 리포좀 중 DC-CHOL:DOPE 리포솜과 플라스미드 DNA는 4.5: 1 몰비 이상으로 혼합하는 경우 서로 완벽하게 결합하는 것으로 확인되었고; DOTMA:DOPE 리포솜과 플라스미드 DNA는 4:1 몰비 이상으로 혼합하는 경우 완벽하게 결합하는 것으로 확인되었으며; DC-CHOL:DOPE 리포솜, 플라스미드 DNA 및 폴리-L-리신의 경우에는 4:1:0.375 몰비로 혼합하였을 때 가장 바람직하게 결합하였다.

이렇게하여 형성된 본 발명의 양이온성 리포솜과 플라스미드 DNA의 복합체는 실험결과 모두 90% 이상의 유전자 전달효율을 나타내는 것으로 평가되었다(실시예 3 참조).

한편, 본 발명에 따른 암치료제는 단독으로 투여함으로써도 진행된 암을 효과적으로 치료하는데 기여할 수 있지만, 기존의 항암제와 병용투여하면 항암제의 내성을 극복하여 항암효과가 상승적으로 발휘되는 결과를 보여줄 수 있으므로 이러한 항암제와의 병용투여가 바람직할 수 있다.

암환자에 대한 항암제 투여나 방사선 치료시 실패하는 가장 중요한 원인은 항암제와 방사선에 대한 암세포의 내성이다. 다수의 항암제나 방사선은 세포의 DNA에 손상을 미치고 정상 p53 유전자를 활성화시키며, 이는 bax유전자나 WaF1/p21 유전자를 활성화시키고, 이들은 DNA에 치명적인 손상을 받은 세포를 고사(apoptosis)시키는 기전에 의해 세포를 살생한다. 만약 표적 암세포의 p53 유전자에 고장이 있을 때는 이러한 암세포를 가진 환자에게 다량의 항암제나 방사선을 투여해도 정상 p53 유전자가 활성화되지 않으므로 암세포에는 고사가 일어나지 않으며, 대신 정상 p53 유전자를 가진 정상세포들만 고사에 빠지게 된다. 즉, 항암화학제나 방사선치료에 대한 암의 내성의 중요 원인중 하나는 암세포내 p53 유전자의 이상 때문으로 해석할 수 있는바, 이 경우 항암제를 투여해도 암세포는 저항하며, 그 결과 치료는 실패하고 정상세포에 대한 부작용만 후유증으로 남게되는 것이다. 이것이 오늘날 상당수의 인체암에서 항암제나 방사선의 치료효과가 제한적이고 부작용으로 고생만 하며, 종국에는 거의 대부분의 환자가 암의 진행으로 사망하는 현실을 낳는 주요 원인중 하나로 지적되고 있다 (참조 : Cancer therapy and p53, Lowe S.W., Current opinions in Oncology, 7(6), 547-553 (1995); Apoptosis, cancer and the p53 tumor suppressor gene, Lee J. M., et al., Cancer Metastasis Review, 14(2), 149-61 (1995); Specific p53 mutations are associated with de nevo resistance to doxorubincin in breast cancer patients, Aas T., et al., Nature Medicine, 2(7), 811-814 (1996); p53 and induction of apoptosis as a target for anticancer therapy, Neubauer A., et al., Leukemia, 10, S2-S4 (1996)).

이러한 점을 고려할 때, 정상 p53 유전자를 발동시켜 세포를 고사시키는 기전에 의해 세포를 살생하는 항암제나 방사선의 투여 전에 와일드 타입 p53 유전자를 암세포에 미리 투여한다면 항암제에 의해 암세포의 고사가 일어날 수 있게 하고, 내성을 차단함으로써 항암제의 치료 효과를 극대화시키며, 아울러 항암제의 투여 용량과 부작용도 격감시킬 수 있다. 즉, p53 유전자를 투여함으로써 정상 p53 유전자를 발동시켜 세포를 고사시키는 기전에 의해 세포를 살생하는 항암제 또는 방사선의 치료 효과가 상승적으로 개선될 수 있는 것이다. 이러한 점에 착안하여 본 발명자는 p53 유전자와 항암제의 병용투여를 시도하였으며 그 기대에 부응하는 결과를 확인할 수 있었다(실시예 6 및 7 참조).

본 발명에 따른 약물과 병용투여하여 상승적 항암효과를 얻기에 바람직한 항암제로는 시스플라틴(cisplatin), 아드리아마이신(adriamycin) 및 에톱사이드(etoposide) 중에서 선택된 1 종을 언급할 수 있으며, 이중에서도 시스플라틴이 가장 바람직하게 사용될 수 있다.

한편, 인체에서 발생하는 각종 암을 치료함에 있어서, 본 발명에 따른 암치료제는 치료제에 함유되어 있는 재조합 플라스미드 pCMV-p53 DNA를 기준으로 할 때 10일 내지 4주간격으로 성인 체표면적(㎡) 당 7 내지 70mg 의 범위로 투여하는 것이 바람직하다. 투약 기간은 특기할 부작용이 나타나지 않는 한 암이 최대한 경감될 때, 혹은 검사상 소멸될 때까지로 한다. 그러나, 투약량과 투여간격등 용법은 암의 종류, 진행단계, 치료되어야할 환자의 상태, 연령, 성별, 사용된 치료제의 종류 등에 따라 변할 수 있으며, 특정한 상태에서의 바람직한 투약용법은 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가에 의하여 결정될 수 있다.

암환자에서 약제를 효과적으로 암세포에 전달하는 대표적인 방법은 암이 위치하는 장기의 동맥을 통해 주입하는 것이며, 간암의 경우에도 간동맥을 통한 항암화학요법이 널리 시도되어 오고 있다. p53 유전자의 경우에도 예외는 아니어서 간동맥을 통해 투여하는 경우 다량의 유전자를 간암세포로 전달할 수 있을 뿐 아니라 전신 부작용도 최소화시킬 수 있다. 아울러 위암이나 폐암등 기타 여러 인체암의 경우에도 암을 혈류공급하는 동맥을 통해 p53 유전자를 투여하는 방법이 효과적일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 암치료 약물은 암부위의 혈류공급동맥이나 말초정맥을 통하여 투여될 수도 있고, 복강(peritoneal cavity)내, 흉강(pleural cavity)내, 방광내, 또는 암종내 직접주사 형태로도 투여될 수 있다. 이와 관련하여 최근 미국에서도 원발 및 전이간암환자에서 아데노바이러스를 이용하여 p53 유전자를 간동맥에 투여하는 형태의 인체대상 유전자요법이 FDA의 심사를 기다리고 있는 것으로 보고되었다. 그러나 이 방법은 전술한 바와 같이 아데노바이러스 투여시 거의 예외 없이 끼여 드는 바이러스성 단백질 때문에 특히 반복투여할 때 심각한 면역 및 염증반응을 야기시키며, 이는 현재까지 해결되지 않은 아데노바이러스벡타의 문제점으로서 다수의 문헌에 보고되고 있다(참조 : Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenovirus for gene therapy, Yang Y., et al., Proceedings National Academy of Science, U.S.A., 91, 4407-4411 (1994); Upregulation of class I major histocompatibility complex antigens by interferon is necessary for T-cell-mediated elimination of recombinant adenovirus-infected hepatocytes in vivo, Yang Y., et al., Proceedings National Academy of Science, U.S.A., 92, 7257-7261 (1995); Gene transfer and therapy with adenoviral vector in rats with diethylnitrosamine-induced hepatocellular carcinoma, Qian C., et al., Human Gene Therapy, 8, 349-358 (1997)). 따라서 아데노바이러스를 이용한 생체내 간의 유전자요법은 간전체에 대한 심한 염증을 일으킬 위험이 커서 인체에 적용하기에 적합치 못한 것으로 판단된다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

p53 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드의 작제, 대량생산 및 정제

A. p53 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드의 작제

인체 와일드타입 p53 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드 pCMV-p53을 작제하였다. pCMV-p53은 포유류세포 발현 플라스미드로서 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)의 어얼리프로모터/인핸서와 인체 와일드타입 p53 유전자의 cDNA, 폴리아데닐화(polyadenylation) 서열 및 전사종결신호(transcription termination signal), 대장균내 복제를 위한 Ori 등으로 구성되어 있다. 그 유전자 map은 도 1 에 나타내었고, 작제과정은 도 2 에 도식화하여 나타내었다.

단계 1 : P1 플라스미드 벡터의 작제

먼저, 공지 플라스미드인 pBR322를 골격으로하여 여기에 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)의 어얼리프로모터/인핸서(early promotor/enhancer), SV40 폴리 A 시그날 및 암피실린 내성 유전자가 삽입된 P1 플라스미드 벡터를 작제하였다.

단계 2 : P1 플라스미드에 인체 와일드타입 p53 유전자의 cDNA가 삽입된 P2 플라스미드 벡터의 작제

P1 플라스미드에 인체 와일드 타입 p53 유전자의 cDNA를 삽입시키기 위하여, 먼저 P1 플라스미드 DNA 1㎍과 제한효소 BamHI 1unit, 10X의 완충액(Tris-Cl 10mM, MgCl₂5mM, NaCl 100mM, 2-머캅토에탄올 1mM)을 혼합하여 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 제한효소 처리가 완료된 후 그 산물을 1% 아가로오스(Sigma, USA)에서 100V 조건하에 전기영동하였으며, 완전히 절단된 적정 DNA 밴드를 gel extraction kit(Genomed, Germany)를 사용하여 겔상에서 분리하였다.

P1 플라스미드 DNA의 자가결찰(self ligation)을 방지하기 위해 calf intestinal alkaline phosphatase(CIAP)로 처리하였다. 즉, 플라스미드 DNA (10pmol of 5' 말단) 40㎕, CIAP의 10X 완충액(0.5M Tris-Cl, pH 9.3, 10mM MgCl₂, 1mM ZnCl₂, 10mM Spermidine) 5㎕ 및 CIAP(0.01 unit/㎕) 5㎕를 혼합한 반응액을 37℃에서 30분간 반응시켰다. 이후 페놀/클로로포름(1/1, v/v)을 동부피배 첨가하여 원심분리한 후 상층액에 0.5 volume의 7.5M 암모늄 아세테이트(pH 5.5) 및 2 volume의 100% 에탄올을 가하여 침전시켰다. 침전시킨 용액을 12,000rpm에서 원심분리한 후 침전물을 취하여 건조시켰다. 이후 증류수로 녹인 다음 하기 기술하는 바와 같이 p53 cDNA를 삽입시켰다.

인체 와일드타입 p53 유전자의 cDNA는 미 Johns Hopkins 대 유전학교실로 부터 얻었으며, 이는 1.8 kb 크기로서 pUC13 플라스미드의 Bam H1 제한효소 절단부위에 삽입되어 있는 상태였다. 이것이 정확한 인체 와일드타입 p53의 cDNA인지 여부를 확인하기 위해 미리 제한효소분석 및 DNA 염기서열분석을 이용하였다. 인체 와일드타입 p53 cDNA를 함유한 pUC13 플라스미드를 앞에서와 동일한 반응조건하에 BamH I 으로 절단하였다. 이후 그 산물을 1% 아가로스겔에 전기영동하여 1.8kb 크기의 DNA 밴드를 확인하고 이를 gel extraction kit로 분리한 후 앞에서 미리 준비된 P1 플라스미드벡터에 삽입(ligation)시켰다. 결찰시 반응액의 조성은 P1 플라스미드 DNA 150ng(2㎕), 인체 와일드타입 p53의 cDNA 50ng(2㎕), 효소(T4 DNA 리가아제 ; 2 units/㎕) 1㎕, 10X의 완충액(300mM Tris-HCl, pH 7.8 ; 100mM MgCl₂, 100mM DTT, 5mM APT) 2㎕, 증류수 13㎕ 이었으며, 16℃에서 16시간동안 반응시켰다. 이후 감응(competent) 박테리아인 DH5 α에 통상적인 방법으로 형질전환(transfomation)시켜 클로닝하였다. 이에 따라 P1 플라스미드에 인체 와일드타입 p53의 cDNA가 삽입된 P2 플라스미드를 작제하였다.

P1 플라스미드벡터에 인체 와일드타입 p53 cDNA가 정확히 삽입되었는지를 제한효소 지도 및 염기서열분석법을 통해 확인하였다.

단계 3 : 재조합 발현 플라스미드 pCMV-p53의 작제

p53 유전자의 발현효율을 높이기 위해 단계 2 에서 작재된 P2 플라스미드에 p53의 자연 프로모터(natural promotor)를 다음과 같이 삽입하였다. SalI 링커와 BamHI 링커가 포함된 프라이머를 사용하여 정상 태반조직 DNA로 부터 p53의 인트론(intron) 1 에 위치하는 자연 프로모터를 PCR로 증폭하였다. 그 결과 증폭된 640bp 크기의 인트론 1 밴드를 1% 아가로스 전기영동으로 확인하였고, 이를 gel extraction kit를 사용하여 정제하였다.

P2 플라스미드 DNA에 포함된 SalI Site와 BamHI Site를 제한효소 SalI과 BamHI으로 이중절단하여 전기영동을 수행한 후 정제하였다. P2 플라스미드 DNA에 와일드타입 p53 인트론 1의 자연 프로모터 부위 DNA를 단계 2에서와 동일한 방법으로 삽입시켰다. 이에 따라 사이토메갈로바이러스의 어얼리프로모터/인핸서, 인체 와일드타입 p53 유전자의 cDNA, 자연 프로모터, 폴리아데닐화(polyadenylation)서열 및 전산종결신호(transcription termination signal)를 모두 포함하는 신규한 재조합 플라스미드벡터인 pCMV-p53을 작제하였다.

이후, E. Coli. 균주 DH5 α에 앞에서 제조된 플라스미드 벡터 pCMV-p53을 형질전환시키고 선별된 pCMV-p53 유전자를 클로닝하였으며, 이를 제한효소지도 및 염기서열 분석법을 통해 확인하였다.

B. 재조합 플라스미드 pCMV-p53의 대량생산 및 정제

p53 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드 pCMV-p53의 대량생산 및 정제는 미국 FDA 공인하에 인체 임상실험에 사용되었던 HLA-B7 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드의 합성, 정제 및 멸균방법을 응용하여 수행하였다(참조 : Points to consider in human somatic cell therapy and gene therapy (1991), Congressional, Consumer, and International Affairs Staff(HBF-142), Rockville, MD, USA; Points to consider in ther production and testing of new drugs and biologicals produced by recombinant DNA technology (1995), Congressional, Consumer, and International Affairs Staff (HBF-142), Rockville, MD, USA ; Clinical protocols of immunotherapy of malignancy by in vivo gene transfer into tumors, Nabel E.G., et al., Human Gene Therapy, 3, 399-410 (1992); Direct gene transfer with DNA-liposome complexes in melanoma: Expression, biologic activity, and lack of toxicity in humans, Nabel G. J., et al., Proceedings, National Academy of Science U.S.A. 90, 11301-11311 (1993); Making clinical grade gene therapy vectors, Anderson W. F., Human Gene Therapy, 5, 925-926 (1994); Gene therapy for cystic fibrosis in human by liposome-mediated DNA transfer : The production of resources and the regulatory process, Caplen N. J., et al., Human Gene Therapy, 1, 139-147 (1994); Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formulations, Felgner J. H., et al., Journal of Biological Chemistry, 269, 2550-2661 (1994); Cancer gene therapy using plasmid DNA : Purification of DNA for human clinical trials, Horn N. A., et al., Human Gene Therapy, 6, 565-573 (1995)).

그 상세한 내역은 다음과 같다.

단계 1 : 세균 배양

pCMV-p53에 의해 형질전환된 E. coli DH5 α 300㎖를 100㎍/㎖의 암피실린(ampicillin)을 첨가한 LB 배지 10ℓ에 첨가한 다음, 10ℓ에 첨가한 다음, 10ℓ-용량의 Braun Biostat ED fermenter를 사용하여 배양하였다. 배양은 37℃, 600rpm 의 조건에서 16내지 18시간동안 수행하였으며, 그 결과 최정 O.D.600이 4인 세균배양액을 수득하였다. 이를 3,000 × g 로 30분간 원심분리하여 침전시켰다.

단계 2 : 세균용해 및 플라스미드의 분리

알칼리법(alkaline method ; 참조 : A rapid alkaline extraction method for the isolation of plasmid DNA, Birnboim H.C., Methods in Enzymology, 100, 243-255 (1983))을 개량한 하기 방법에 따라, 단계 1 에서 수득한 세균으로 부터 플라스미드 DNA를 분리하였다.

1) 약 180g의 균체를 완충액(61mM 글로코오스, 10mM Tris, 50mM EDTA, pH8.0, 4℃) 1.4ℓ에 현탁시킨후 용해완충액(0.2N NaOH, 1% SDS, 4℃) 2.8ℓ를 가하고 10분간 냉각하여 균체를 용해시켰다.

2) 3M 아세트산칼륨 용액(pH 5.0) 2.1ℓ를 사용하여 균체 불순물을 침전시킨 후, Miracloth(Calbiochem, San Diego. CA)를 이용하여 2회 여과시킨 용액에 0.6 용적비(volume ratio)로 냉각된(-20℃) 2-프로판올을 첨가하였다. 실온에서 1시간동안 방치한 후, 250㎖ 용량의 원심분리 용기에 분주하여 30분간 10,000 × g 로 원심분리(GSA rota, Sorvall RC5B)하였다.

3) 침전시킨 플라스미드 DNA를 TE 완충액(10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8.0) 200㎖에 녹인 후 암모늄 아세테이트 용액을 최종농도 2.5M이 되게 첨가하여 빙욕하에 15분간 반응시켰다. 반응액을 10,000 × g 로 20분간 원심분리하고 상층액을 0.8μm 니트로셀룰로오스 막 필터(Nalge company ; Rochester, NY)를 통과시킨 여액에 1.6M NaCl이 함유된 30% PEG-8000를 최종농도 10%가 되도록 첨가하였다. 12시간동안 4℃에서 반응시킨후 10,000 × g 로 원심분리하여 펠렛만 수거하였다.

칼럼 완충액(10mM Tris, 1mM EDTA, 150mM NaCl, pH 8.0) 10㎖로 재현탁시킨 후, 하기 단계 3에서와 같이 정제하였다.

단계 3 : 플라스미드 DNA의 정제

플라스미드 DNA를 정제함에 있어서, 본 발명에서는 Clean banch 내에서 Pharmacia FPLC system을 사용하여 2개의 pharmacia XK26/100 칼럼에 Phamacia 세파크릴 S-1000 수퍼파인(superfine) 겔을 충진하여 사용하였다. 이때 칼럼의 길이는 85cm, 전체용적은 900㎖이었으며, Running buffer(10mM Tris, 1mM EDTA, 150mM NaCl pH 8.0)를 사용하여 다음과 같이 수퍼파인 겔 필트레이션 크로마토그래피를 수행하였다.

PEG-8000으로 1차 정제한 플라스미드 DNA를 0.1-0.22μm 셀룰로오스 아세테이트 아크로디스크 주사기필터(cellulose acetate Acrodisc syringe filter ; Gelman, Ann Arbor, MI)를 통과시킨 후 자동화된 Pharmacia FPLC system의 칼럼에 적하(loading)하여 용출시키면서 5㎖씩 분획을 수거하였다. 수거된 각각의 분획을 0.8%의 아가로오스겔 전기영동으로 분석함으로서 초나선형(supercoiled) 플라스미드 DNA로만 이루어진 분획을 따로 모아서 멸균병에 넣은 후 2 부피배의 냉각된 에탄올에 침전시켰다.

단계 4 : 플라스미드 DNA의 멸균

에탄올 침전된 플라스미드 DNA를 10,000 × g 에서 30분간 원심분리하여 플라스미드 펠렛을 분리하고 무균작업대에서 건조시킨 다음, Lactated Ringer's 용액에 용해시켰다. 이 용액을 무균상태의 0.2-micron 에어로디스크(Aerodisc) 필터(Gelman, Ann Arbor, MI, USA)를 통해 여과하여 무균상태로 제조하였으며, -70℃에 보관하였다.

[실시예 2]

pCMV-p53 재조합 플라스미드의 특성조사

미국에서 플라스미드 DNA를 이용한 인체 유전자치료 임상실험시에 FDA가 승인의 조건을 위해 적용하였던 기준에 따라, p53 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드 pCMV-p53의 특성을 조사하였다(참조 : Clinical protocols of immunotherapy of malignancy by in vivo gene transfer into tumors, Nabel E. G., et al., Human Gene Therapy, 3, 399-410 (1992); Direct gene

transfer with DNA-liposome complexes in melanoma : Expression, biologic activity, and lack of toxicity in humans, Nabel G.J., et al., Proceedings National Academy of Science U.S.A. 90, 11301-11311 (1993); Making clinical grade gene therapy vectors, Anderson W. F., Human Gene Therapy, 5, 925-926 (1994); Gene therapy for cystic fibrosis in human by liposome-mediated DNA transfer: The production of resources and the regulatory process, Caplen N. J., et al., Human Gene Therapy, 1, 139-147 (1994); Cancer gene therapy using plasmid DNA: Purification of DNA for human clinical trials, Horn N. A., et al., Human Gene Therapy, 6, 565-573 (1995)).

각 특성에 대한 검사방법 및 결과는 다음과 같다.

1) E coli DNA의 오염여부 분석

실시예 1에 따라 대량 합성한 pCMV-p53 플라스미드 DNA 가 E. coli DNA에 의해 오염되었는지 여부를 서던블롯팅으로 분석하였다. DNA의 농도를 분광광도계(260nm)로 측정한후 pCMV-p53 플라스미드 DNA 500ng을 아가로오스겔에 전기 영동하였으며, 이와 함께 참고치로 5ng의 DH5α 대장균 DNA, 그리고 음성대조군으로 연어정자(salmon sperm) DNA 500ng을 함께 전기 영동하였다. E. coli DH5α DNA를 제한효소 HaeIII로 절단하여 수득한 DNA 단편을 random primer labelling method에 따라³²P로 표지한 다음, 이를 서던블롯팅의 탐침으로 사용하였다. 서던블롯팅을 수행한 결과, 전체 플라스미드중에 함유된 E. coli DNA 는 1% 미만인 것으로 나타났다.

2) 단백질 오염상황의 분석

E. coli 단백질에 의한 오염정도는 micro-BCA assay kit(Pierce사, Rockford, IL, USA)를 사용하여 Smith 등의 방법에 따라(참조 : Measurement of protein using BCA, Smith P. K., et al., Analytical Biochemistry, 150, 76-185 (1985)) 분석하였다. 그 결과, 세균성 단백질은 전혀 검출되지 않았다.

3) 내독소(Endotoxin)와 발열물질(pyrogen)의 분석

내독소의 존재는 표준검색법인 LAL kit(참조 : Cape Cod, Inc, Woods Hole, MA, USA. Bacterial Endotoxin Test, USP, 1990)를 가지고 Lindsay 등의 방법(참조 : single step, chromogenic Limulus Amebocyte Lysate assay for endotoxin, Lindsay G. K., et al., Journal of Clinical Microbiology, 27 (5), 947-951 (1990))에 따라 분석하였다. 이때 검색의 최소한도는 검체 ㎖당 0.03EU, 0.0001 EU/㎍ DNA로 하였다. LAL test 결과 DNA 1㎍당 내독소의 수치는 0.1EU 미만이었고, 그 범위는 0.001 내지 0.025 EU인 것으로 나타났다.

한편, pCMV-p53과 양이온성 리포솜 1, 2 및 3의 결합에 의해 각각 수득된 최종산물 헤파토벡틴-1, 2 및 3(하기 실시예 3 참조)에 대해 European pharamcopeial prescriptions 의 지침에 따라(참조 : European Pharamacopoeia (1971), Test for pyrogens, European Pharamcopoeia, vol. 2, Maisonnevue, Saint Ruffine, France, pp58-60) 발열물질(pyrogen)의 존재여부를 검사하였다. 가토(Newzealand white rabbit) 18마리에 체표면적(m²)당 pCMV-p53 플라스미드 DNA를 기준으로 하여 1mg, 3mg, 10mg, 30mg, 100mg의 용량(각 용량별 3마리)으로 헤파토벡틴을 꼬리정맥을 통해 주사하였다. 각 용량별로 3마리씩에 투여하였으며, 각각 3마리씩의 대조군을 두어 생리식염수를 투여하였다. 이후, 각 군에서 투여 전과 투여 후 3시간동안은 15분간격으로, 그리고 이 후 6시간, 12시간, 24시간에 각각 직장 온도를 측정하였다. 각군별로 합해서 상승된 체온의 합이 2.65℃ 이상일 때 양성으로 1.15℃ 미만일 때 음성으로 판독하였다. 그 결과, 각 헤파토벡틴은 검사한 용량에서 모두 발열검사상 음성으로 나타났다.

4) 고압 액체크로마토그래피(HPLC)

정제 및 멸균 후 플라스미드 DNA의 순도를 음이온교환 HPLC로 분석하였으며, 이 목적으로 Hewlett Packard 1051 Ti quatenary HPLC system과 5mm×50mm LiChrosopher 4000 A pore, 5㎛ 입자크기의 DMAE 칼럼을 사용하였다. 전개완충액(Running buffer)으로는 A(0.02 M monobasic sodium phosphate, 0.03M dibasic sodium phosphate)와 B(0.02M monobasic sodium phosphate, 0.03 M dibasic sodium phosphate, 2M sodium chloride)를 사용하였으며, Flow의 속도는 분당 0.5㎖로 하여 260nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, RNA나 E coli의 DNA와 분리된 뚜렷한 환상 플라스미드 DNA의 피크만을 볼 수 있었으며(도 3 참조), 균체 180g으로부터 수득된 순수한 플라스미드 DNA의 양은 245.2mg으로 계산되었다.

5) 유전자발현의 분석

본 발명에 따른 재조합 프라스미드 pCMV-p53 및 E. coli 의 lac Z 유전자(beta-galactosidase gene)을 삽입한 플라스미드 pCMV-beta-Gal을 각각 표 2 기재의 양이온성 리포솜 1, 2, 3과 하전(charge)을 이용하여 결합시켜 복합체를 형성하였다(하기 실시예 3 참조). 이 후 각 플라스미드와 양이온성 리포솜의 결합체를 DMEM 배지에 배지 1㎖당 각 플라스미드 DNA 1㎍ 의 농도로 혼합하였다. 이 혼합액을 돌연변이형 p53 유전자를 함유하는 인체 신암세포주 CURC-2에 세포 20만개당 pCMV-p53 DNA 1㎍의 투여량으로 4시간동안 투여한 후 와일드타입 p53에 대한 RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)-서던블롯팅 및 X-Gal 염색법을 사용하여 인체 와일드타입 p53 유전자와 베타-갈라토시다아제 유전자의 발현을 각각 조사하였다. 그 결과 양 유전자 모두 높게 발현됨을 확인하였다. 특히, X-Gal 염색법에 의거할 때, 유전자 전달효율은 모두 90%이상으로 계산되었다.

이상의 결과로부터, 본 발명에 따른 pCMV-p53은 미합중국 FDA가 플라스미드 DNA를 이용한 인체의 유전자치료 임상시험에 적용하였던 기준에 잘 부합되는, 효율적이면서도 안전한 재조합 플라스미드임을 확인할 수 있었다. 이하, 재조합 플라스미드 pCMV-p53의 특성을 조사한 결과를 표 3에 종합하여 나타내었다.

[표 3]

재조합 플라스미드 pCMV-p53 의 특성

[실시예 3] 양이온성 리포솜의 제조 및 플라스미드 DNA와 리포솜과의 복합체 형성

A. 양이온성 리포솜 DC-CHOL : DOPE의 제조

양이온성 리포솜 DC-CHOL : DOPE은 DC-CHOL(도 4 참조)과 DOPE(도 5 참조)를 적정비율로 혼합하여 제조하였으며, 이중 DOPE는 시그마사로부터 구입하여 사용하였고, DC-CHOL은 하기 1)의 방법에 따라 제조하여 사용하였다.

1) DC-CHOL의 제조

DC-CHOL은 콜레스테릴 클로로포르메이트와 N, N-디메틸에틸렌디아민을 반응시켜 제조하였다. 먼저, 콜레스테릴 클로로포르메이트 4.5g(10mmol)을 무수클로로포름 5㎖에 용해시켜 플라스크에 넣고, 무수 클로로포름에 녹인 과량의 N, N-디메틸에틸렌디아민 4㎖(36.4mmol)를 0℃에서 적가하였다. 반응 용매를 증발시킨 후, 잔류물을 4℃에서 무수에탄올로 두번 재결정하였다. 수득된 결정은 진공건조시켰으며, 이에 따라 흰색 고체상의 DC-CHOL 1.09g(수율 : 21.8%)을 수득하였다.

mp : 108℃

TLC : Single spot, Rf=0.57(클로로포름 : 메탄올=65 : 35, v/v)

¹H NMR(ppm, CDCl₃) : 2.18(singlet, 6H, (CH₃)₂NCH₂CH₂), 2.36(triplet, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂NH), 3.21(quartet, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂NH), 5.18(triplet, broad, 1H, (CH₃)₂NCH₂CH₂NHCO).

2) DC-CHOL과 DOPE을 혼합한 양이온성 리포솜의 제조

DC-CHOL(1.2μmol)과 DOPE(0.8μmol)를 3 : 2 몰비로 클로로포름에 용해시킨 후, 질소가스를 이용하여 혼합물을 진공건조시켜 건조필름을 형성하였다. 그후, 필름을 멸균된 HEPES 완충용액(20mM, pH 7.8) 1㎖에 현탁시키고, 현탁액을 4℃에서 24시간 동안 수화시킨 후, 5 내지 10분간 bath type sonicator 로 분산시켜, 평균 직경 150nm의 리포솜을 제조하였다. 제조된 리포솜을 오토클레이브 및 0.2micron 필터로 멸균하여 4℃에 보관하며 사용하였다.

3) DC-CHOL : DOPE 리포솜과 재조합 플라스미드 pCMV-p53의 복합체 형성

재조합 플라스미드와 DC-CHOL : DOPE 리포솜을 Ca 및 Mg 이 결여되어 있는 HBSS 1㎖에 각각 가하고 15분간 실온에서 방치하였다. 플라스미드 DNA 용액을 DC-CHOL : DOPE 리포솜 용액에 가하고 약하게 흔들어 주고나서 다시 30분간 실온에서 방치하면 플라스미드 DNA와 DC-CHOL : DOPE 리포솜은 하전(charge)에 이해 단단하게 결합을 형성하며 그 결과 DNA와 리포솜간의 복합체(헤파토벡틴-1)가 형성된다. 형성된 복합체 헤파토벡틴-1을 0.8% 아가로오스겔에서 전기영동한 후 UV 조사하여 플라스미드 DNA와 DC-CHOL : DOPE 리포솜간의 완전결합여부를 확인하였다(도 6 참조).

그 결과, DC-CHOL : DOPE 리포솜과 프라스미드 DNA는 4.5 : 1 몰비 이상으로 혼합하였을 때 서로 완벽하게 결합하는 것으로 확인되었으며, 이에 따라 헤파토벡틴-1는 재조합 플라스미드 pCMV-p53와 DC-CHOL : DOPE(3 : 2 몰비) 리포솜을 1 : 4.5 몰비로 혼합하여 결합시킴으로써 제조하는 것이 바람직함을 알 수 있었다.

4) DC-CHOL : DOPE 리포솜과 플라스미드 DNA 복합체(헤파토벡틴-1)의 유전자 발현효율의 검사

와일드타입 P53 유전자 대신에 E.coli의 lac Z 유전자(베타-갈락토시다아제 유전자)를 삽입한 pCMV-beta-Gal 플라스미드를 헤파토벡틴-1의 제조에 사용한 DC-CHOL : DOPE 양이온성 리포솜과 1 : 4.5 몰비로 결합시킨 다음, 형성된 복합체를 HBSS 배지에 배지 ㎖당 플라스미드 DNA 1μg의 농도로 첨가하였다. 이 혼합액을 p53 유전자의 돌연변이가 있는 인체 신암세포주 CURC-2에 암세포 20만개당 1㎖의 투여량으로 4시간 동안 투여한 후 X-Gal 염색정도에 의거하여 베타-갈락토시다아제 유전자의 발현을 조사하였으며, 그 결과 유전자전달효율은 90%이상으로 평가되었다(도 7 참조).

B. 양이온성 리포솜 DOTMA : DOPE 의 제조

양이온성 리포솜 DOTMA : DOPE는 DOTMA(도 8 참조)와 DOPE를 적정비율로 혼합하여 제조하였으며, 이중 DOPE는 시그마사로부터 구입하여 사용하였고, DOTMA는 하기 1)의 방법에 따라 제조하여 사용하였다.

1) DOTMA의 제조

DOTMA는 먼저 올레일 p-톨루엔설포네이트를 제조한 후, N-[2, 3-디-(9-(Z)-옥타데세닐옥시)]프로프-1-일-N, N-디메틸아민을 제조하고, 이로부터 N-[1-(2, 3-디올레일옥시)프로필]-N, N, N-트리메틸암모늄 클로라이드를 제조하는 3 단계를 거쳐 제조되며, 그 과정을 요약하여 나타내면 도 8과 같다.

a) 올레일 p-톨루엔설포네이트의 제조

1ℓ 용량의 3구 플라스크에 올레일 알콜 134.245g(0.5mole)과 피리딘 158g(2mole)을 가하고 10℃이하로 충분히 냉각시켰다. 동 온도에서 p-톨루엔설포닐 클로라이드 105g(0.55mole)을 20 내지 30분간 첨가하며, 이때 온도가 20℃를 넘지 않도록 하였다. 혼합물을 20℃ 이하에서 3시간동안 교반한 다음, 디클로로메탄 200㎖로 희석하였다. 여기에 HCl(sp. gr. 1. 19)300㎖가 들어있는 얼음물 1ℓ를 3등분하여 3회 세척하고, 중성이 될 때까지 증류수로 세척하였다. 유기층에 무수 황산마그네슘을 가하여 수분을 제거하고, 감압증류하여 디클로로메탄을 제거하였다. 수득된 생성물을 실리카겔 칼럼상에서 전개시켜(헥산/에테르=3/1, v/v) 순수한 올레일 p-톨루엔설포네이트를 분리하였다(수율 : 86%).

b) N-[2, 3-디-(9-(Z)-옥타데세닐옥시)]-프로프-1-일-N, N-디메틸아민의 제조

3-(디메틸아미노)-1, 2-프로판디올 1.19g(10mmole), 상기 a)에서 수득한 올레일 p-톨루엔설포네이트 12.7g(30mmole) 및 포타슘 t-부톡사이드 3.37g(30mmole)를 크실렌 50㎖에 녹이고 실온의 진공하에(약 30torr) 30분간 교반하였다. 이 혼합물을 50℃로 가열하고 15분간 더 교반한 후, 진공을 제거하고 반응용기를 실온에서 질소기체로 충진시켰다(약 1atm). 반응 온도를 140℃로 하여 3시간동안 환류시킨 다음, 혼합물을 헥산 100㎖로 희석시키고 H₂O(2×50㎖)로 추출하였다. 유기층을 농축시키고 실리카겔 150g을 채운 칼럼에서 헥산 : 에테르(1 : 2, v/v) 혼합용매로 용출시켜 표제화합물 4.5g을 수득하였다.

c) N-[1-(2, 3-디올레일옥시)프로필]-N, N, N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA)의 제조

상기 b)에서 수득한 N-[2, 3-디-(9-(Z)-옥타데세닐옥시)]-프로프-1-일-N, N-디메틸아민 10g을 고압반응기에 가하고 -78℃로 냉각시켰다. 여기에 클로로메탄 50㎖를 가하여 응축시키고 밀봉한 후, 70℃에서 48시간 동안 가열하였다.

반응 용기를 0℃로 냉각시킨 후 개봉하고 질소기체를 불어넣어 클로로메탄을 증발시켰으며, 최종 생성물을 아세토니트릴로 재결정하여 약간의 흰색을 띤 고체상으로 DOTMA를 수득하였다.

2) DOTMA와 DOPE를 혼합한 양이온성 리포솜의 제조

DOTMA와 DOPE를 동몰비로 혼합하는 것을 제외하고는 A의 2) 에서와 동일하게 실시하여 DOTMA : DOPE 리포솜을 제조하였다.

3) DOTMA : DOPE 리포솜과 재조합 플라스미드 pCMV-p53의 복합체 형성

DC-CHOL : DOPE 대신에 DOTMA : DOPE 리포솜을 사용하는 것을 제외하고는 A의 3)에서와 동일하게 실시하여 DNA와 리포솜간의 복합체(헤파토벡틴-2)를 형성하였다. 플라스미드 DNA와 DOTMA : DOPE 리포솜간의 완전 결합여부를 확인한 결과는 도 9에 나타내었다. 그 결과 DOTMA : DOPE 리포솜과 플라스미드 DNA는 4 : 1 몰비 이상으로 혼합하였을 때 서로 완벽하게 결합하는 것으로 확인되었으며, 이에 따라 헤파토벡틴-2는 재조합 플라스미드 pCMV-p53와 DOTMA : DOPE(1 : 1 몰비) 리포솜을 1 : 4 몰비로 혼합하여 제조하는 것이 바람직함을 알 수 있었다.

4) DOTMA : DOPE 리포솜과 플라스미드 DNA 복합체(헤파토벡틴-2)의 유전자 발현효율의 검사

헤파토벡틴-2를 제조하는데 사용한 DOTMA : DOPE 양이온성 리포솜을 pCMV-beta-Gal과 결합시키는 것을 제외하고는 A의 4)에서와 동일하게 실시하여 헤파토벡틴-2 복합체의 유전자 전달효율을 조사하였으며, 그 결과 유전자 전달효율은 약 90%로 평가되었다(도 10 참조).

C. 양이온성 리포솜 폴리-L-리신+DC-CHOL : DOPE 의 제조

양이온성 리포솜 폴리(Poly)-L-리신(lysine)+DC-CHOL : DOPE는 먼저 DC-CHOL과 DOPE를 혼합한 다음 여기에 Poly-L-리신을 추가하는 방법으로 제조하였으며, 이중 Poly-L-리신(MW 30,000 내지 70,000)과 DOPE는 시그마사로부터 구입하여 사용하였고, DC-CHOL은 A의 1)에 기재한 방법에 따라 합성한 것을 사용하였다.

1) DC-CHOL : DOPE 리포솜, 폴리-L-리신 및 재조합 플라스미드 pCMV-p53으로 구성된 복합체의 제조

먼저 플라스미드 DNA(pCMV-p53)와 폴리-L-리신을 Ca과 Mg이 결여된 HBSS 1㎖에 각각 가하고 10분간 실온에서 방치하였다. 플라스미드 DNA를 양이온성 폴리-L-리신에 가하고 약하게 흔들어 주고나서 다시 10분간 실온에서 방치하면 플라스미드 DNA와 폴리-L-리신은 하전에 의해 결합을 형성한다. 이 결합체를 Ca 및 Mg이 결여된 HBSS 1㎖에 가한 다음, 15분동안 실온에서 방치한 DC-CHOL : DOPE 리포솜에 가하고 약하게 흔들어주었다. 다시 30분간 실온에서 방치하면 플라스미드 DNA : 폴리-L-리신과 DC-CHOL : DOPE 리포솜은 서로 단단하게 결합을 형성하며 그 결과 DNA와 리포솜간의 복합체(헤파토벡틴-3)가 형성된다. 형성된 헤파토벡틴-3을 0.8% 아가로오스겔에서 전기영동한 후 UV 조사하여 플라스미드 DNA와 폴리-L-리신과 DC-CHOL : DOPE 리포솜간의 완전 결합여부를 확인한 결과는 도 11에 나타내었다. 그 결과 DC-CHOL : DOPE 리포솜, 플라스미드 DNA 및 폴리-L-리신은 4 : 1 : 0.375 몰비로 혼합하였을 때 서로 완벽하게 결합하는 것으로 확인되었다.

2) DOTMA : DOPE 리포솜과 플라스미드 DNA 복합체(헤파토벡틴-2)의 유전자발현효율의 검사

헤파토벡틴-3를 제조하는데 사용한 DC-CHOL : DOPE : 폴리-L-리신 양이온성 리포솜을 pCMV-beta-Gal과 결합시키는 것을 제외하고는 A의 4)에서와 동일하게 실시하여 헤파토벡틴-3 복합체의 유전자 전달효율을 조사하였으며, 그 결과 유전자전달효율은 90%이상으로 평가되었다(도 12 참조).

[실시예 4] 헤파토벡틴 1, 2 및 3의 시험관내 항암효과와 p53 유전자 발현효과

A. 돌연변이형 p53 유전자를 함유하거나 p53 유전자가 결실된 인체 암세포주에서의 항암효과

p53 유전자의 돌연변이(mutation) 및 결실(deletion)이 확인된 인체의 각종 암세포주에 대한 헤파토벡틴-1, 2, 3의 항암효과를 시험관내에서 조사하였으며, 이때 대상 세포로는 간암세포주 Hep 3B, CUHC-1, CUHC-2; 폐암세포주 NCI-H522, NCI-H596; 위암세포주 CUSC-1, CUSC-2; 대장암세포주 CUCOC-1, CUCOC-2; 신암세포주 CURC-2, CURC-3; 전립선암세포주 PC-3를 사용하였다.

각 대상세포들을 2×10⁵개/웰씩 6-웰 다중플레이트(multiplate)에 분주하고 48시간이 지난후 헤파토벡틴-1, 2 또는 3을 투여하였다. 헤파토벡틴은 웰당 1㎍의 pCMV-p53 DNA가 첨가되도록 하는 양으로 4시간동안 투여되었으며, 그후 DMEM에 10% fetal bovine serum이 함유된 정상배지(DF-10)로 바꾸어서 계속 배양하였다. 96시간 후에 tryphan blue exclusion assay로 생존세포수를 계산하였다.

또한, 헤파토벡틴 투여 후 시간별로 대상암세포의 DNA를 분리하여 1.5% 아가로우스겔에서 전기영동을 수행함으로써 세포의 고사 발생을 분석하였다. 세포에 고사가 발생할 경우 endonuclease가 활성화됨에 따라 염색체의 DNA가 nucleosome 사이에서 절단되고, 그 결과 전기영동에는 특징적으로 절단된 DNA조각들이 계단모양으로 나열되어 나타나게 된다. 이를 ladder pattern이라 하며, 이는 세포고사를 확인케 하는 소견이다(참조 : Definition and incidence of apoptosis : an historical perspective, In Tomel LD and Cope FO(eds), Apoptosis : The molecular basis of cell death, Kerr J.F.R., et al., Cold Spring Harbor Press, New York, pp5-30 (1991)).

아울러 p53의 exon 5에서 8까지의 cDNA를 RT-PCR로 증폭한 후 서던블롯팅으로 유입된 와일드타입 p53 유전자의 발현을 조사하였다. 이를 위해 와일드 타입 p53의 cDNA를 제한효소 SmaI으로 절단한 후 이를 random primer labelling kit를 이용하여³²P를 표지시켜 표식자를 형성하였다.

상기 검사결과, 헤파토벡틴의 투여후 생존세포수는 CUHC-2를 제외한 나머지 세포주 모두에서 대조군의 1 내지 30%로 유의하게 저하되었으며, 이는 표 4, 5 및 6에 나타내었다. 또한 헤파토벡틴의 투여 후 암세포 DNA를 분리하여 수행한 아가로오스 전기영동에서 ladder pattern을 보여 세포고사를 유발했음이 입증되었다(도 14 참조). 아울러 암세포 RNA에 대해 수행한 RT-PCR-서던블롯팅 분석에 의해 형질감염(transfection)된 인체 와일드타입 p53 유전자가 발현됨이 입증되었다(도 15 참조).

이상의 결과는 p53 유전자에 이상이 있는 각종 인체 암세포에 헤파토벡틴-1, 2 또는 3을 생체외에서 투여할 때 인체의 와일드 타입 p53 유전자가 발현되면서 암세포가 고사에 빠지며, 증식이 유의하게 차단됨을 나타내는 것으로서 이로부터 본 발명에 따른 헤파토벡틴-1, 2 및 3 유전자 치료제가 유력한 항암제로 작용할 수 있음을 알 수 있다.

한편, 시험된 여러가지 인체 암세포중 CUHC-2에서는 헤파토벡틴의 투여후 인체 와일드타입 p53 유전자가 발현됨에도 불구하고 증식이 유의하게 차단되지 않았는데, 이는 CUHC-2 세포에서는 p53의 작용매개물질인 bax나 p21 등의 작용에 이상이 있거나 다른 기전을 통해 세포고사가 일어나기 때문인 것으로 추측된다. 따라서 이러한 경우에는 헤파토벡틴에 의한 와일드타입 p53 유전자의 투여외에 세포고사의 강력한 촉진물질, 즉 항암제나 방사선 등의 병행처치가 있어야 유의한 항암효과를 기대할 수 있을 것이다.

[표 4]

p53의 돌연변이가 있는 인체 암세포주에 대한 헤파토벡틴-1의 시험관내 항암효과

주) 자료는 평균생존세포수 +/- 1 S.D.로 나타내었으며 Student's t test와 Anova's test로 각군을 비교분석하였음.

* p0.05으로 대조군과 유의한 차이가 있음.

** p0.01으로 대조군과 유의한 차이가 있음.

*** p0.001으로 대조군과 유의한 차이가 있음.

[표 5]

p53의 돌연변이가 있는 인체 암세포주에 대한 헤파토벡틴-2의 시험관내 항암효과

주) 자료는 평균생존세포수 +/- 1 S.D.로 나타내었으며 Student's t test와 Anova's test로 각군을 비교분석하였음.

* p0.05으로 대조군과 유의한 차이가 있음.

** p0.01으로 대조군과 유의한 차이가 있음.

*** p0.001으로 대조군과 유의한 차이가 있음.

[표 6]

p53의 돌연변이가 있는 인체 암세포주에 대한 헤파토벡틴-3의 시험관내 항암효과

주) 자료는 평균생존세포수 +/- 1 S.D.로 나타내었으며 Student's t test와 Anova's test로 각군을 비교분석하였음.

* p0.05으로 대조군과 유의한 차이가 있음.

** p0.01으로 대조군과 유의한 차이가 있음.

*** p0.001으로 대조군과 유의한 차이가 있음.

B. p53 유전자가 돌연변이되지 않은 인체 세포에서의 항암효과

대상 세포주로서 p53 유전자의 돌연변이나 결실이 없는 것으로 확인된 인체의 각종 암세포와 정상 세포, 즉 간암세포주 CUHC-3; 대장암세포주 CUCOC-3; 방광암세포주 RT-4; 정상 피부세포주 ATCC-CRL-1634; 정상 폐세포주 ATCC-CRL-1485; 정상 간세포주 ATCC-CCL-13; 정상 장세포주 ATCC-CCL-241을 사용하였다. 방법은 A에서와 동일하게 실시하여 헤파토벡틴-1, 2 및 3의 증식억제 및 고사유발의 효과를 조사하였다.

그 결과, 헤파토벡틴의 투여 후 대상세포의 RNA를 분리하여 시행한 RT-PCR-서던블롯팅 분석에서 형질감염된 인체 와일드타입 p53 유전자의 발현이 증가된 것으로 나타났다(도 15 참조). 그러나, p53 유전자에 이상이 없는 정상 세포주들과 CUCOC-3를 제외한 암세포들의 경우에는 헤파토벡틴의 투여후 대조군과 비교하여 뚜렷한 세포고사를 유발하지 않은 것으로 DNA 전기영동결과 확인되었다. 아울러 헤파토벡틴의 투여에도 불구하고 p53의 이상이 없는 정상세포주와 CUCOC-3를 제외한 암세포들의 경우에는 생존세포수가 대조군에 비해 유의하게 저하되지 않음을 확인할 수 있었다(표 7, 8 및 9 참조).

이러한 결과로부터, p53 유전자에 이상이 없는 인체의 각종 암세포나 정상세포의 경우 본 발명에 따른 헤파토벡틴을 투여함으로써 인체 와일드타입 p53 유전자 발현을 증가시켜도 세포고사가 일어나지 않고 증식이 차단되지 않음을 알 수 있으며, 따라서 본 발명에 따른 헤파토벡틴 제제가 p53 유전자의 이상으로 인하여 발생된 암의 경우에만 유력한 항암제가 될 수 있고 정상 세포에는 영향을 주지 않는다는 점에서 안전함을 알 수 있다.

단, 대장암세포주 CUCOC-3 에서는 p53 유전자에 돌연변이가 없음에도 불구하고 헤파토벡틴을 투여하는 경우 와일드타입 p53 유전자의 발현이 증가되면서 고사가 발생하며, 증식이 유의하게 차단되는 것으로 관찰되었다. 그 정확한 메카니즘에 대해서는 알기 어려우나 암세포에 따라서는 p53 유전자의 DNA 레벨에서의 돌연변이가 없이도 p53의 기능에 이상이 있을 수 있고, 이런 경우 헤파토벡틴을 투여하여 그 암세포내에 정상기능을 하는 p53의 발현을 증가시키면 고사가 발생하고 증식이 유의하게 차단될 수도 있는 것이라 예측된다. 그러나, 이는 예외적인 경우로서 정상세포에서는 통상 이러한 일이 발생치 않는 것으로 생각된다.

[표 7]

p53의 돌연변이가 없는 인체의 암세포주 및 정상세포주에 대한 헤파토벡틴-1의 시험관내 항암효과

주) 자료는 평균생존세포수 +/- 1 S.D.로 나타내었으며 Student's t test와 Anova's test로 각군을 비교분석하였음.

* p0.05으로 대조군과 유의한 차이가 있음.

[표 8]

p53의 돌연변이가 없는 인체의 암세포주 및 정상세포주에 대한 헤파토벡틴-2의 시험관내 항암효과

주) 자료는 평균생존세포수 +/- 1 S.D.로 나타내었으며 Student's t test와 Anova's test로 각군을 비교분석하였음.

* p0.05으로 대조군과 유의한 차이가 있음.

[표 9]

p53의 돌연변이가 없는 인체의 암세포주 및 정상세포주에 대한 헤파토벡틴-3의 시험관내 항암효과

주) 자료는 평균생존세포수 +/- 1 S.D.로 나타내었으며 Student's t test와 Anova's test로 각군을 비교분석하였음.

* p0.05으로 대조군과 유의한 차이가 있음.

[실시예 5] 헤파토벡틴 1, 2 및 3의 생체내 항암효과와 안전성

A. 실험방법

실시예 4의 A에서 p53의 돌연변이 또는 결실이 확인되고 본 발명에 따른 헤파토벡틴을 투여하는 경우 증식이 유의하게 억제되었던 인체의 각종 암세포주를 누드마우스의 피하 및 복강내, 신피막하에 이식하고 헤파토벡틴-1, 2 또는 3을 피하나 복강내, 혹은 꼬리정맥내로 각각 단독투여함으로써 그 항암효과 및 부작용 발생여부를 분석하였다. 위암세포주 CUSC-1는 피하이식암모델로, 간안 세포주 Hep 3B는 복강내암이식모델로, 그리고 신암세포주 CURC-2는 신피막하암 이식모델에 각각 선정하였다.

각 모델별로 헤파토벡틴-1과 헤파토벡틴-2, 헤파토벡틴-3의 항암효과와 독성을 차례대로 분석하였다. 각 실험조건에서 실험 누드마우스의 수는 30마리로 하였으며, 각각 10마리씩의 순수대조군(1군)과 치료를 하지 않은 대조군(2군), 그리고 헤파토벡틴 치료군(3군)의 3개 군으로 나누었다. 각 모델의 실험조건별로 2-3군의 20마리에 대상세포들을 2×10⁶개씩 누드마우스의 양측복부의 피하나 복강내, 또는 좌측 신피막하에 이식하였다. 그후, 각 모델의 치료군(3군)에는 헤파토벡틴-1, 헤파토벡틴-2, 또는 헤파토벡틴-3를 각각 pCMV-p53 DNA를 기준으로 100㎍의 용량으로 투여하였다. 피하이식암모델의 경우에는 암종이 직경 2-3mm로 성장한 10일후부터 1주 1회씩 도합 4주간 암종의 하부에 헤파토벡틴을 투여하였고; 복강내이식암모델의 경우에는 암종이 성장하여 악성복수가 나타나는 2주후부터 1주 1회씩 도합 4주간 복강내에 헤파토벡틴을 투여하였으며; 신피막하이식암모델의 경우에는 1주후부터 1주 1회씩 도합 4주간 꼬리 정맥내로 헤파토벡틴을 투여하였다. 이에 대해 각 모델의 치료대조군(2군)에서는 헤파토벡틴을 투여하지 않고, 대신 증류수를 피하와 복강내 및 꼬리정맥내로 투여하였다. 각 모델의 순수대조군(1군)에서는 암세포를 접종하지 않고 각각 증류수를 피하나 복강내 및 꼬리정맥내로 투여하였다. 각각에서 순수대조군을 대조군으로 하여 헤파토벡틴의 부작용을 조사하였으며, 치료대조군을 대조군으로 하여 헤파토벡틴의 항암효과를 조사하였다.

헤파토벡틴을 투여하기 시작한지 5주후에 누드마우스를 살생한 후, 첫째, 각군에서 발생한 원발 암종의 수와 용적 및 전이암의 수와 용적을 분석하여 헤파토벡틴의 항암효과를 확인하였고, 둘째, 혈액과 소변을 채취하고 vital organ을 절제하여 Complete blood count(CBC), 간기능과 신기능을 포함한 혈액 화학검사(SMA-12), 요검사 및 vital organ의 조직소견을 HE 염색후 광학현미경으로 관찰하여 헤파토벡틴의 독성을 분석하였으며, 셋째, 헤파토벡틴 투여군과 대조군의 암종에서 DNA와 RNA를 분리하여 1.5% 아가로오스 DNA 전기영동으로 세포고사의 발생여부를 확인하고 RT-PCR-서던블롯팅으로 인체의 와일드타입 p53유전자 및 이로 인해 유도되는 p21/Wafl유전자의 발현을 확인하였다.

B. 결과

1) 피하 이식모델(CUSC-1 세포주)

첫째, 헤파토벡틴-1과 헤파토벡틴-2, 그리고 헤파토벡틴-3 투여군에서 성장한 피하 원발암종의 용적이 각각의 대조군의 그것에 비해 모두 유의하게 감소됨을 확인할 수 있었다(표 10와 도 16참조). 둘째, 헤파토벡틴 투여군에서 절제한 암종에서 분리한 DNA를 1.5% 아가로오스 DNA 전기영동으로 분석하였을 때 전형적인 ladder pattern을 나타내었으므로 세포고사의 발생을 확인할 수 있었고(도 17 참조), 암종으로부터 RNA를 분리한 후 수행한 RT-PCR-서던블롯팅에서 인체의 정상형 p53 유전자가 발현됨을 확인하였다(도 18 참조). 셋째, 헤파토벡틴 투여군에서 심장과 폐, 간, 신장, 비장, 뇌, 성선등 vital organ의 조직소견을 HE염색에 의해 조사한 결과 이상소견을 발견할 수 없었으며, 아울러 헤파토벡틴 투여군과 대조군사이에 CBC(complete blood count), 간기능과 신기능을 포함한 혈액화학검사(SMA-12; serum multichannel analysis), 요검사를 수행한 결과 p0.1에서 유의한 차이를 발견할 수 없었다(표 11 참조).

따라서, 본 발명에 따른 헤파토벡틴을 p53 유전자의 이상이 있는 암종에 국소주입하는 경우 인체 와일드타입 p53 유전자를 효과적으로 전달함으로써 세포고사를 유발하여 암종의 증식을 유의하게 차단하는 한편 유의한 독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다.

[표 10]

피하 이식암모델에서 헤파토벡틴의 항암효과

주) 자료는 암종의 평균용적 +/- 표준편차로 나타내었으며 Student's test로 대조군과 치료군을 비교분석하였음.

* 대조군보다 유의하게 감소됨(p0.05).

** 대조군보다 유의하게 감소됨(p0.01).

[표 11]

피하 이식암모델에서 헤파토벡틴의 독성분석결과

주) 자료는 평균치 +/- 표준편차로 나타내고 Student's t test로 분석하였음.

모든 수치상 대조군과 헤파토벡틴 치료군 사이에 유의한 차이가 없었음(p0.1).

2) 복강내 이식모델(Hep 3B 세포주)

첫째, 헤파토벡틴 투여군에서 복강내 성장한 암종의 용적이 각각 대조군의 그것에 비해 모두 유의하게 감소됨을 확인할 수 있었다(표 12 및 도 19 참조). 둘째, 헤파토벡틴 투여군에서 절제한 암종에서 분리한 DNA를 1.5% 아가로오스 DNA 전기영동으로 분석하였을 때 전형적인 ladder pattern을 나타내었으므로 세포고사의 발생을 확인할 수 있었고(도 20 참조), 암종으로부터 RNA를 분리한 후 수행한 RT-PCR-서던블롯팅에서 인체의 와일드타입 p53 유전자가 발현됨을 확인하였다(도 21 참조). 셋째, 헤파토벡틴 투여군에서 심장과 폐, 간, 신장, 비장, 뇌, 성선등 vital organ의 조직소견을 HE염색에 의해 조사한 결과 이상소견을 발견할 수 없었으며, 아울러 헤파토벡틴 투여군과 대조군 사이에 CBC, 간기능과 신기능을 포함한 혈액화학검사(SMA-12), 요검사를 수행한 결과에서 유의한 차이를 발견할 수 없었다(p0.1, 표 13 참조).

따라서, p53 유전자의 이상으로 인한 암종이 복강내에 파종(dissemination)되어 있는 경우에 본 발명에 따른 헤파토벡틴을 복강내 국소주입하면 인체의 정상 p53 유전자를 효과적으로 전달하여 발현시킴으로써 세포고사를 유발하여 암종의 증식을 유의하게 차단하는 한편 유의한 독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다.

[표 12]

복강내 암이식모델에서 복강내 투여 헤파토벡틴의 항암효과

주) 자료는 암종의 평균용적 +/- 표준편차로 나타내었으며 Student's test로 대조군과 치료군을 비교분석하였음.

* 대조군보다 유의하게 감소됨(p0.01).

** 대조군보다 유의하게 감소됨(p0.001).

[표 13]

복강내 암이식모델에서 복강내 투여 헤파토벡틴의 독성분석결과

주) 자료는 평균치 +/- 표준편차로 나타내고 Student's t test로 분석하였음.

모든 수치상 대조군과 헤파토벡틴 치료군 사이에 유의한 차이가 없었음(p0.1).

3) 신피막하 이식모델(CURC-2 세포주)

첫째, 헤파토벡틴 투여군에서 발생한 원발 암종의 수와 용적이 대조군에 비해 모두 유의하게 감소됨을 확인할 수 있었다(표 14과 도 22 참조). 둘째, 헤파토벡틴 투여군에서 대조군에 비해 발생한 폐전이 암종의 수가 유의하게 감소됨을 확인할 수 있었다(표 15 참조). 셋째, 헤파토벡틴 투여군에서 절제한 암종에서 분리한 DNA를 전기 영동으로 분석하였을 때 전형적인 ladder pattern을 나타내었으므로 세포고사의 발생을 확인하였다.(도 23 참조). 넷째, 암종으로부터 RNA를 분리한 후 수행한 RT-PCR-서던블롯팅으로부터 유입된 p53 유전자에 의해 유도되는 p21/Wafl 유전자가 강하게 발현됨을 확인하였다(도 24 참조). 다섯째, 헤파토벡틴 투여군에서 심장과 폐, 간, 신장, 비장, 뇌, 성선 등 vital organ의 조직소견을 HE 염색에 의해 조사한 결과 이상소견을 발견할 수 없었으며, 아울러 헤파토벡틴 투여군과 대조군사이에 CBC, 간기능과 신기능을 포함한 혈액화학검사(SMA-12), 요검사를 수행한 결과 p0.1에서 유의한 차이를 발견할 수 없었다(표 16 참조).

따라서, p53 유전자의 이상으로 인한 복강장기의 암종모델에 대해 본 발명에 따른 헤파토벡틴을 혈관내 주입하면 인체의 정상 p53 유전자를 효과적으로 전달함으로써 세포고사를 유발하여 암종의 증식과 전이를 유의하게 억제하는 한편 유의한 독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다.

[표 14]

신피막하 암이식모델에서 원발암에 대한 헤파토벡틴의 항암효과

주) 자료는 암종의 평균용적 +/- 표준편차로 나타내었으며 Student's test로 대조군과 치료군을 비교분석하였음.

* 대조군보다 유의하게 감소됨(p0.05).

** 대조군보다 유의하게 감소됨(p0.01).

[표 15]

신피막하 암이식모델에서 헤파토벡틴의 폐전이 억제효과

주) 자료는 암종의 평균용적 +/- 표준편차로 나타내었으며 Student's test로 대조군과 치료군을 비교분석하였음.

* 대조군보다 유의하게 감소됨(p0.05).

** 대조군보다 유의하게 감소됨(p0.01).

[표 16]

신피막하 암이식모델에서 정맥투여된 헤파토벡틴의 독성분석결과

주) 자료는 평균치 +/- 표준편차로 나타내고 Student's t test로 분석하였음.

모든 수치상 대조군과 헤파토벡틴 치료군 사이에 유의한 차이가 없었음(p0.1).

[실시예 6] 헤파토벡틴과 항암제 병용투여시의 시험관내 항암효과

A. 실험방법

p53의 돌연변이 또는 결실이 확인되었을 뿐아니라 각종 항암제에 대해 다중내성(multidrug resistance)을 보이는 인체의 각종 암세포주를 대상으로 하여 본 발명에 따른 헤파토벡틴-1, 2, 3과 항암제를 병용투여하였을 때, 이러한 요법이 항암제에 대한 내성을 차단하여 상승적 효과(synergistic effect)를 나타내는지 확인하기 위하여 다음과 같이 시험관내 실험을 수행하였다.

대상 세포로는 간암세포주 Hep 3B; 폐암세포주 NCI-H522, NCI-H596; 및 신암세포주 CURC-2를 사용하였다. 각 대상세포들을 2×10⁵개/웰씩 6-웰 다중 플레이트에 분주하고 48시간이 지난후 헤파토벡틴-1, 2 또는 3을 투여하였다. 헤파토벡틴은 웰당 1㎍의 pCMV-p53 DNA가 첨가되도록 하는 양으로 4시간동안 투여하였으며, 그 후 정상배지 DF-10으로 바꾸어서 계속 배양하였다. 배양한지 20시간후에 시스플라틴(cisplatin), 아드리아마이신(adriamycin) 및 예톱사이드(etoposide; VP-16)를 각각 인체에서 독성없이 투여할 수 있는 최고 혈중농도의 1000배에서 100분의 1배까지의 다양한 농도로 첨가한 배지로 바꾸어 96시간동안 배양하였다. 이후 MTT assay에 따라 분광광도계로 570nm에서의 흡광도(optical density)를 측정하여 생존세포백분율과 암세포의 생존율이 50%로 감소하는 IC50을 조사하였다. 한편, 대조군에는 헤파토벡틴이 함유되지 않은 정상배지를 24시간동안 투여한 후 항암제를 투여하는 것을 제외하고는 실험군과 동일하게 실시하였다.

B. 결과

헤파토벡틴 투여군에서 대조군에 비해 암세포의 생존백분율이 유의하게 감소하며(p0.01, chi-square test), 시스플라틴, 아드리아마이신 및 에톱사이드의 IC50이 유의하게 저하되는 것으로 나타났다(p0.01, Student's t test; 표 17 참조).

[표 17]

항암제와 병용투여시 헤파토벡틴 1, 2 및 3의 시험관내 항암효과

또한, 본 발명에 따른 헤파토벡틴을 병용투여하면 시스플라틴, 아드리아 마이신, 에톱사이드 등의 항암제에 대한 내성이 극복되고, 이들을 인체에 투여 가능한 저농도로 투여해도 50% 이상의 유의한 항암효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 특히, 시스플라틴의 경우 본 발명에 따른 헤파토벡틴과 병용투여함에 따라 가장 유의하고 변함없는 상승효과를 나타내었다.

따라서, p53 유전자의 이상으로 인하여 발생한 암으로서 각종 항암제에 대해 다중내성(multidrug resistance)을 보이는 인체의 각종 암에 대해 헤파토벡틴-1, 2 또는 3과 항암화학제를 병용투여하면 헤파토벡틴이 함께 투여된 항암제에 대한 내성을 차단하여 상승적 효과(synergistic effect)가 나타남을 확인할 수 있었다. 본 발명에 따른 헤파토벡틴 제제는 특히 시스플라틴과 병용투여하는 경우 좋은 효과를 나타내므로 이에 대한 유력한 보조 항암제가 될 수 있음을 알 수 있다.

[실시예 7] 헤파토벡틴과 항암제 병용투여시의 생체내 항암효과와 안전성

A. 실험방법

p53 유전자에 이상이 있으며, 항암제에 대해 다중내성을 보이는 인체의 암세포주 CURC-2를 누드마우스의 피하에 이식하고 본 발명에 따른 헤파토벡틴-1, 2 또는 3와 시스플라틴을 병용투여함으로써 이러한 병용투여가 시스플라틴에 대한 내성을 차단하고 상승적 효과를 일으켜 월등하게 더 우수한 항암효과를 나타내는지, 또한 부작용은 증가되지 않는지에 대해 다음과 같은 방법으로 조사하였다.

각 실험조건에서 실험 누드마우스의 수는 40마리로 하였으며, 각각 10마리씩의 순수대조군(1군)과 치료를 하지 않은 대조군(2군), 시스플라틴 단독투여군(3군), 시스플라틴과 헤파토벡틴의 병용투여군(4군)의 4가지 군으로 나누었다. 각 모델의 실험조건별로 2-4군의 30마리에 대해 CURC-2 세포를 2×10⁶개씩 누드마우스의 양측복부의 피하에 이식하였다. 그후 암종이 직경 2 내지 3mm로 성정한 10일 후부터 2군에서는 1주 1회씩 4주간 꼬리정맥을 통해 생리식염수를 주사하였으며, 3군에서는 시스플라틴만을 꼬리정맥내에 1회 단독투여하였고, 4군에서는 1주 1회씩 4주간동안 헤파토벡틴을 100㎍의 pCMV-p53 DNA가 첨가되도록 하는 양으로 꼬리정맥내에 투여하고 이와 함께 시스플라틴을 암이식후 10일째에 1회만 꼬리정맥내에 병용투여하였다. 순수대조군(1군)에서는 암세포를 접종하지 않고 각각 생리식염수를 1주 1회씩 4주간동안 꼬리정맥내로 투여하였다. 각 경우에 시스플라틴은 실시예 6의 시험관내 실험결과에 의거하여 통상투여량의 50% 정도인 체표면적 m²당 50mg으로 낮추어서 투여하였다. 1군을 대조군으로 하여 3군 및 4군에서 시스플라틴 단독 및 시스플라틴과 헤파토벡틴의 병용투여의 부작용을 조사하였으며, 2군 및 3군을 대조군으로 하여 4군에서의 항암효과를 비교분석하였다.

각 약제를 투여하기 시작한지 5주후에 누드마우스를 살생하였으며, 이 후 실시예 5에서와 동일하게 검사하고 그 결과를 다음에 나타내었다.

B. 결과

첫째, 시스플라틴과 함께 헤파토벡틴-1, 헤파토벡틴-2 또는 헤파토벡틴-3를 병용투여한 4군에서 발생한 암종의 수와 용적이 대조군에 비해 가장 유의하게 감소되었으며, 그 감소의 정도는 시스플라틴 단독투여군에 비해 현저한 차이가 있음을 확인할 수 있었다. 본 실험에서 저용량의 시스플라틴을 단독투여한 경우에는 유의한 항암효과가 없었다(표 18과 도 25 참조). 둘째, 시스플라틴 단독투여군 및 시스플라틴과 헤파토벡틴의 병용투여군에서 심장과 폐, 간, 신장, 비장, 뇌, 성선등 vital organ의 조직소견을 HE염색에 의해 조사한 결과 이상소견을 발견할 수 없었으며, 아울러 헤파토벡틴과 시스플라틴의 병용투여군 및 대조군사이에 CBC, 간기능과 신기능을 포함한 혈액화학검사(SMA-12), 요검사를 수행한 결과 유의한 차이를 발견할 수 없었다(표 19 참조).

이러한 결과로부터, p53 유전자에 이상이 있을 뿐아니라 각종 항암제에 대해 다중내성을 나타내는 인체의 각종 암에 대해 시스플라틴을 병용하여 헤파토벡틴-1, 2 또는 3을 혈관내 투여하면 항암제에 대한 내성을 차단하여 암치료에 대한 상승적 효과를 나타냄으로써 시스플라틴의 투여량을 낮출 수 있고, 부작용이 오히려 감소됨을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에 다른 헤파토벡틴 제제는 기타 항암제, 특히 시스플라틴을 적용하는 경우 효과적인 보조항암제로 작용할 수 있음이 확인되었다.

[표 18]

헤파토벡틴과 시스플라틴 병용투여시의 생체내 항암효과

주) 자료는 암종의 평균용적 +/- 표준편차로 나타내었으며 Student's test와 Anova's test로 대조군과 각각의 치료군을 비교분석하였음.

* 대조군보다 유의하게 감소됨(p0.001).

** 대조군보다 유의하게 감소됨(p0.01).

# 시스플라틴단독투여군보다 더 유의하게 감소됨.

[표 19]

헤파토벡틴과 시스플라틴 병용투여시 생체내 독성분석결과

주) 자료는 평균치 +/- 표준편차로 나타내고 Student's t test로 분석하였음.

모든 수치상 대조군과 각각의 치료군 사이에 유의한 차이가 없었음(p0.1).

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에서는 와일드타입 p53 유전자를 함유하는 신규한 재조합 플라스미드 pCMV-p53을 특정의 양이온성 리포솜과 결합시킨 유전자 치료제(헤파토벡틴)를 p53 유전자의 이상과 관련되어 발생하는 모든 인체암에 단독으로 투여하거나 기타의 항암제, 방사선 치료, 수술 또는 면역요법과 병용하여 투여함으로써 이미 진행된 암을 효과적이고도 안전하게 치유시킬 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (8)

1. 와일드타입 p53 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드 pCMV-p53을 양이온성 리포솜(cationic liposome)과 결합시킨 복합체로서 p53 유전자의 돌연변이(mutated) 또는 결실(deletion)로 인하여 발생한 인체 암을 치료하기 위한 약물.
2. 제 1 항에 있어서, 양이온성 리포솜이 DC-CHOL와 DOPE로 부터 제조된 리포솜 1, DOTMA와 DOPE로부터 제조된 리포솜 2 및 폴리(Poly)-L-리신(lysine)과 리포솜 1로부터 제조된 리포솜 3 중에서 선택된 1종인 약물.
3. 제 2 항에 있어서, 리포솜 1에서 DC-CHOL와 DOPE의 배합비율이 3 : 2 몰비이고, 리포솜 2에서 DOTMA와 DOPE의 배합비율이 1 : 1 몰비이며, 리포솜 3에서 폴리-L-리신(lysine)과 리포솜 1의 배합비율이 4 : 0.375인 약물.
4. 제 2 항 또는 3항에 있어서, 재조합 플라스미드 pCMV-p53 및 리포솜 1과의 배합비율이 1 : 4.5 몰비이고, pCMV-p53 및 리포솜 2과의 배합비율이 1 : 4 몰비이며, pCMV-p53 및 리포솜 3과의 배합비율이 1 : 4.375 몰비인 약물.
5. 제 1 항에 있어서, 인체 암이 간암, 폐암, 위암, 대장암, 신암 또는 전립선암임을 특징으로 하는 약물.
6. 와일드타입 p53 유전자를 활성화시켜 세포를 고사(apoptosis)시키는 기전에 의해 세포를 발생하는 항암제와 제 1 항에 따른 약물로 구성됨을 특징으로 하는 조합 약물.
7. 제 6 항에 있어서, 항암제가 시스플라틴(cisplatin), 아드리아마이신(adriamycin) 및 에톱사이드(etoposide) 중에서 선택된 1종인 조합 약물.
8. 제 7 항에 있어서, 항암제가 시스플라틴인 조합약물.