JPS6362490B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明はリポイド合成小嚢及びこれを作る方
法並びに生物学的活性物質をその中にカプセル化
する方法及びこのものを応用する方法に関する。 本発明以前に既に合成リポソームを作るための
方法及び生物学的活性物質をカプセル化する方法
が幾つか提案されていた。例えばRobinsonは
Trans.Faraday Soc.、56：1260−1264（1960）
に、及びPapahadjopoulos等は雑誌Biochim.
Biophys.Acta、135、639（1967）にエーテル−リ
ポイド−水の二相系から燐脂質の分散液を生成す
る方法を記述しており、この方法はその混合物を
通して窒素ガスを吹きこむことによつてエーテル
を蒸発させることを含んでいる。ここではこの方
法を有機物質の捕獲に用いるための試みは成され
ておらず、またその捕獲効率についても詳細には
検討されていない。クロロホルム−水の二相系か
らの似たような蒸発技術がChowhan等によつて
雑誌Biochim.Biophys.Acta、266：320−342
（1972）に記述されている。ここに記述されてい
る方法も過剰の水性相を使用すること及び燐脂質
小嚢の均一な集団を作るためにクロロホルム相を
ゆつくりと除去することを含んでいる。しかしな
がらこの場合にも捕獲された水性物質の量を最大
にすることについてはなんら試られておらず、そ
してこの方法の捕獲効率についての検討も全くな
されていない。 Bangham等は雑誌J.Mol.Biol.、13：238−252
（1965）に小さな捕獲体積を有して低い捕獲効率
（10％）及び圧縮された水性空間（15ないし35Å）
を有することによつて特徴づけることができる多
層膜のリポイド小嚢を記述している。 超音波によつて作られた単一膜の小嚢はまず最
初D.Papahadjopoulos及びN.Millerによつて雑誌
Biochim.Biophys.Acta、135：624−638（1967）
に記述されており、そしてその後他の多くの人々
によつて報告されているけれども、これは極めて
低い捕獲効率を示し、そしてそれらの単位胞の水
性区画が小さいことによつて（250Å）大きな巨
大分子をカプセル化するためには不適当である。 有機相中のリポイドを水性溶液中に注入するこ
とによつて作られるリポイド小嚢はBatzri及び
Kornによつて雑誌Biochim.Biophys.Acta、
298：1015（1973）にエタノールを用いたものが記
述されており、Deamar及びBanghamによつて
雑誌Biochim.Biopys.Acta、443：629−634
（1976）にエタノールを用いたものが記載されて
いる。これらの方法では単一膜の小嚢又は小数膜
の小嚢が作られるけれども、しかしながらこれら
の方法はそのカプセル化における高い効率を達成
することはできない。エタノールを用いる注入の
場合にはこの低い効率はエタノールの分散される
水性相の体積が極めて大きいこと及びこの技術に
よつて作られる小嚢のサイズが極めて小さいこと
によるものである。エーテルを用いた注入方法の
場合には、この低効率はエーテルの注入される水
性相の空間体積が非常に大きいことと、この方法
で用いられるリポイドの量が少ないことと、及び
その小嚢の形成される仕方との組合わせにもとづ
くものである。 単一層の大粒嚢の作成については
Papahadjopoulos等によつて雑誌Biochim.
Biophys.Acta、394：483−491（1975）に記述さ
れており、この方法はカルシウムによつて誘起さ
れるそのリポイド嚢のユニークな構造変化を含む
けれども、しかしながらこの技術は単一の燐脂質
（ホスフアチジルセリン）にのみ限定されており、
そしてまたその小嚢を再構成するための方法に基
づいてカプセル化の効率が比較的低い。 リポイド小嚢を作るための他の方法がドイツ特
許第2532317号に記載されており、この方法はリ
ポイド−水−エーテルのエマルジヨンを遠心分離
して水性相にすることを含んでいる。この技術の
欠点は高速度の遠心分離が必要であること及び界
面において多量のリポイド−水性エマルジヨンが
捕獲されて水性相の中には入いつてゆかないとい
うことである。これがその目的物質を捕獲させる
割合を減少させる。 米国特許第3804776号は油又は脂肪にカプセル
化されたアミノ酸あるいはポリペプチドを、その
カプセル化のための所望の物質の粉末を上記油脂
又は油の溶融混合物中に分散させ、そしてそのあ
とでこの溶融混合物を水の中に流し込むことによ
つて製造する方法を開示しているという点で注目
に値いする。そのカプセル化された物質はリポイ
ドの比較的大きな液滴の中に含まれており、従つ
てこれが動物への経口的投与に用いることを制限
している。この方法はこれが粉末のカプセル化に
のみ限定されかつそのリポイドが二重層を形成し
ないと考えられる点で若干限定的である。 最後に米国特許第4016100についても言及すべ
きであると考えられ、これは薬剤とリポイドとの
水性燐脂質分散液を凍結させることによつてリポ
イド小嚢中にある種の薬剤を取入れることを記述
している。この場合にその参照方法によるカプセ
ル化のために開示された薬剤化合物は一般に水か
ら有機相中への分配係数が高いものである。従つ
てそのカプセル化のため物質は生成した小嚢の燐
脂質の二重層の中に侵入するであろうことが予想
される。理論的にはこれはカプセル化の高い度合
いをもたらすと考えられるけれども、しかしなが
ら全体のカプセル化された物質の生物学的有用度
に関しては明らかな問題が残されている。もしこ
の技術がより極性の性質を有してその小嚢の二重
層を浸透することがより少ないと考えられるよう
な薬剤をカプセル化するのに適用された場合には
カプセル化の比較的高い度合いは得られないとい
うことが予想されるであろう。 本発明の方法によれば寡少層のリポイド小嚢
（合成リポソーム）を迅速に、簡便に、温和な条
件のもとで高い収率で、しかもこれがこれと一緒
に加工された生物学的に活性ある極めて多種多様
の物質を高い割合でその中に取入れうる如くに作
ることができる。本発明に従う方法によつてカプ
セル化することのできる物質の代表的な例として
は薬剤的に有効な種々の化合物及びそれらの配合
物、炭水化物、ヌクレオチド類、ポリヌクレオチ
ド類（何れも天然又は合成のもの）、殺菌剤、殺
虫剤、殺だに剤、殺回虫剤及び殺軟体動物剤を含
む殺虫剤、水溶性肥料及び農業用栄養剤、ペプチ
ド、プロテイン、酵素、ビールス等が挙げられ
る。 これらの物質の多くは細胞のプラズマ膜を一般
には滲透せず、そして生体の中で循環している間
に、または培養された組織或は培養された器官と
接触することによつて不活性化される。殺虫剤、
農業栄養剤、或は肥料の場合にこれらはその適用
した部分から雨或いは潅漑によつて除かれてしま
う。このような物質のカプセル化はこれらが不活
性化されたり除去されたりすることを防止し、即
ち生物学的な有用度を維持する。例えばC.
parvum或はE.coli等のような細菌類の細胞も本
発明の方法によつて保護し且つ生物学的有用度を
維持するためにカプセル化することができる。 本発明に従う方法はまた米国特許3957971号に
記述されているように有効に用いることのできる
化粧品調剤をカプセル化するのにも用いることが
できる。 本発明は生物学的に活性ある物質を寡少層の合
成リポイド小嚢中にカプセル化するにあたり、有
機溶剤中の小嚢壁形成性化合物の混合物と、その
カプセル化されるべき生物学的活性物質の水性混
合物とを、有機相の水性相に対する割合が油中水
型のエマルジヨンを生ずるような量比となるよう
に準備し、上記混合物の、超音波照射によつても
たらされる性質を持つ均質エマルジヨンを形成
し、このエマルジヨンから有機溶剤を除去してそ
れによりゲル様の性質を持つた混合物を得、そし
てこのゲル様混合物を上記生物学的活性物質のカ
プセル化されている寡少層の合成小嚢に変えるこ
とよりなる、上記生物学的活性物質のカプセル化
方法を含む。 本発明はまた、上述の中間生成物としてのゲル
様物質、合成されたリポイド小嚢生成物、これを
使用する方法、及び活性成分としてこの合成小嚢
を含む担体組成物をも含む。 本願明細書を通じて用いられている生物学的活
性物質なる語はこれが有効量で存在した場合に生
体細胞及び生成と反応し及び／又はこれに影響を
与えるような化合物または組成物を意味する。 更にまた本願明細書において用いられている寡
少層の合成リポイド小嚢（リポソーム）なる語
は、実験室で作られて部分的に一つまたは幾つか
のリポイド二分子膜がその小嚢壁を形成している
ことによつて特徴付けられるところの人造のリポ
イド小嚢を意味するものである。 本発明に従う方法は単一膜の、或は寡少層のリ
ポイド合成小嚢を作るのに有用であり、そしてこ
のものはまた多種多様の方法に効果的にすること
ができるものである。例えば本発明の方法によつ
て作られたリポイド小嚢は医薬の生物学的有用度
を促進するために用いることができ、酵素の置
換、薬剤の経口的投与、薬剤の局所的な投与を促
進するために用いることができ、また発生学的な
情報を試験管内の、または生体内の細胞の中に導
入するために利用することができ、ワクチンを製
造するために用いることができ、微生物細胞の中
に再結合性デオキシリボ核酸セグメントを導入す
るために用いることができ、或はまた臨床的な試
験用の診断用薬剤として、また引続いてその取り
入れられた“レポータ”分子の放出のために用い
ることができる。本発明の方法によつて作られる
リポイド小嚢はまた化粧用調剤、殺虫剤、植物の
成長をもたらすために抑制されたゆつくりとした
放出をもたらすための化合物等をカプセル化する
のにも用いることができる。 広い意味において本発明の方法は先づ最初有機
相中での逆転ミセル（“inverted micelles”）の
形成を必要とし、そして次にその有機相を除去す
るが要求される。この系は次に自然に二重層類似
の構造に変化し、その際多量の水性相が大粒の寡
少膜の胞嚢中にカプセル化される。この方法の利
点は水性相の高い捕獲効率をもたらし且つ大きく
て安定な嚢胞を与えるという点である。燐脂質は
上記の逆転ミセル及びそれに引続いて小嚢の二重
膜を形成するのに優れた分子である。より特別に
は本発明の方法は次のように行われる。 本発明の方法の第１段階は有機溶剤中のリポイ
ド小嚢壁形成性組成物の混合物、及びこの小嚢の
中にカプセル化さるべき生物学的活性物質の水性
混合物を提供することである。小嚢壁形成性化合
物は一般によく知られており、またその調製の方
法も同様である。例えば如何なる種類の燐脂質或
はリポイド化合物もこの小嚢壁を形成するのに用
いることができる。このような小嚢壁形成性化合
物の代表例としては、天然または合成的に作られ
るホスフアチジルコリン（以下においてこれは
PCと略記する）、ホスフアチジン酸（以下におい
てこれはPAと略記する）、リンホスフアチジルセ
リン（以下においてこれはPSと略記する）、ホス
フアチジルエタノールアミン（以下においてこれ
をPEと略記する）、スフインゴリポイド、ホスフ
アチジルグリセロール（以下においてこれをPG
と略記する）スフインゴミエリン、カルジオリピ
ン、グリコリポイド、ガングリオシド、セレプロ
シド、等が挙げられこれらは何れも単独で、また
は例えば大豆燐脂質におけるように混合して
（Asolectin、Associated Concentrates）用いら
れる。更にまた、例えばステロイド、コレステロ
ール、長鎖状脂肪族アミン類のような脂肪族アミ
ン類、及びカルボン酸類、長鎖状サルフエート、
燐酸エステル、燐酸ジセチル、ヒドロキシトルエ
ンブチレート、トコフエノール、レチノール、及
びイソプレノイド化合物類の如き他のリポイド類
も燐脂質成分と混合して或る特定の望ましい且つ
公知の性質をその得られた小嚢にもたらすために
用いることができる。加えてまた、例えばヒドロ
キシル基、分岐炭素鎖、環状誘導体、芳香族誘導
体、エーテル類、アミド類、ポリ不飽和誘導体、
ハロゲン化誘導体等のような変性した脂肪族部分
または炭水化物、グリコール、ホスフエート、ホ
スホネート、第４級アミン、サルフエート、スル
ホネート、カルボキシ基、アミノ基、スルフヒド
リル基、イミダゾール基及びこれらの基の組合せ
を含む変性した親水性部分を含む合成燐脂質を上
述した燐脂質と置き換えるかまたは互いに混合す
ることができる。上記のことから、本発明の方法
によつて作られた小嚢のリポイド成分の化学組成
を、この小嚢のサイズはそのリポイド組成によつ
て変化を受けるとしても捕獲割合を著しく減少さ
せることなしに極めて大きく変えることができる
ということが理解されるであろう。本発明者等が
頻繁に使用しそして本発明の方法に有利に用いら
れるリポイド混合物の代表例でもある適当な混合
物の一つは上に明示したPSとPCとからなるかま
たはPGとPCとからなつている（好ましくは何れ
の場合にも１：４のモル比において）。これらの
PC、PG、PA、及びPEは精製した卵の黄味から
誘導することができる。例えばジパルミトイルの
ような合成飽和PC及び飽和PGを用いることがで
きる。他の使用可能な両親媒性のリポイドは好ま
しくはPCと１：４のモル比で用いることができ
るものであるがこれらは例えばガングリオシド、
グロボシド、脂肪酸、ステアリルアミン、長鎖状
アルコール類等である。 上記リポソーム壁形成性組成物はもし望む場合
にそのリポイドまたは燐脂質化合物を実質的に除
いていてもよい如何なる不活性溶剤中にも溶解し
て最初に準備することができる。このような溶剤
の代表例としては極めて多種多様のエーテル類、
エステル類、アルコール類、ケトン類、炭化水素
類（弗素化炭化水素を含む芳香族並びに脂肪族の
もの）及び水性相が著しい溶解度を示さないよう
なシリコーン類等が挙げられる。これらの溶剤は
単独でまたは混合して用いることができる。しか
しながら夫々の溶剤または溶剤混合物についてそ
のリポイドと水性部分と及び溶剤との最適の割合
が異つており、従つて当業者に評価されていると
ころのトライアルアンドエラーの方法によつて
夫々の場合毎に決定する必要がある。この明細書
において用いられている“不活性溶剤”の語は本
発明に従う方法の所望の経過を妨害したりまたは
何等かその他の方法で逆の影響をもたらしたりす
るようなことのないリポイドまたは燐脂質のため
の溶剤を意味する。 燐脂質やリポイドは全てのリポイド可溶性添加
物と共に適当な反応容器の側部において蒸発によ
り有利にその溶剤と分離される。本発明の逆転相
蒸発小嚢がその中で形成される有機相は次に反応
容器に加えられ、これは上述した如きリポイド及
び燐脂質のための不活性有機溶剤である。撹拌に
よつて、その形成さるべき小嚢の既に反応容器壁
面に析出しているリポイド成分の溶解がもたらさ
れる。本発明の方法に従う有機相を形成するため
に、その用いた方法の下記のような条件に応じて
多数の不活性有機溶剤が好ましい。低温条件のた
めには、即ち比較的低い温度においてその有機相
を次に除去するためにはジエチルエーテルが最も
有効であることが見出されており、但しクロロホ
ルムやテトラヒドロフランも有利に用いることが
できる。比較的高い温度での加工のためにはイソ
プロピルエーテルが好ましい不活性有機溶剤であ
り、特にリポイド成分として飽和燐脂質を含むリ
ポイド小嚢を作るために好ましい溶剤である。有
機相を形成するために燐脂質またはリポイドを溶
解するのに引続いて水性相を加えて不均一な二相
混合物を得る。その水性相は溶液／分散液の形
で、本発明の方法により作られる合成リポイド小
嚢中にカプセル化さるべき化合物または組成物を
含んでいる。この水性相はカプセル化される物質
の安定性を維持するのに適したPH値に緩衝される
のがよい。この水性相のイオン強度は本発明の方
法で得られるカプセル化効率に関係を持つてい
る。一般的な規則として、この水性相のイオン強
度が高ければ高いほどその取り入れの割合が低く
なる。例えば塩化ナトリウムが15ミリモル存在す
る場合にはその水性相の約60％をカプセル化する
ことができるのに対し、一方塩化ナトリウム500
ｍＭが存在する場合には、その水性相の僅かに20
％がカプセル化されるに過ぎない。従つて巨大分
子のカプセル化を最大にするためにはイオン強度
の低い（0.3よりも低い）緩衝液を用いるのが好
ましい。カプセル化効率はまたその二相系の中に
存在するリポイド又は燐脂質の濃度にも或る程度
依存する。好ましくはこのリポイドまたは燐脂質
成分の割合は不活性有機溶剤の１ml当り約0.5mg
から約50mgまでの範囲であるのがよい。好ましく
はこの有機相の水性相に対する比が約２：１から
約20：１の容積比の範囲内であり、そして最も好
ましくは約４：１の比であるのが油中水型のエマ
ルジヨンを形成するのに好ましい。 上述の如くに得られた不均一二相混合物は次に
乳化して超音波照射によつてもたらされる性質の
エマルジヨンを得る。好ましくはこれは浴槽タイ
プのソニケータを用いて行うか或は大容積の製造
のためには工業規模の乳化装置の中で行われる。
一般にはこの二相混合物は約３乃至５分間にわた
つて超音波乳化されるか、または透明な一相混合
物或は均質エマルジヨンが形成されるまで行われ
る。これはその容器を簡単に超音波乳化用浴の中
に任意の高さ水準に配置することによつて達成さ
れる。乳化は広い範囲の温度にわたつて行うこと
ができ、即ち約−10゜から約50℃までの温度、有
利には０℃から20℃までの間の温度において行う
ことができる。乳化を行うのに最も適した条件は
その溶剤、燐脂質、その調整に用いた水性相の容
積に依存する。この乳化のための最適条件を決定
するためにトライヤルアンドエラーの方法を用い
ることが考慮される。そのエマルジヨン混合物は
次にその不活性有機溶剤の実質的な部分を除去す
るために処理される。これは簡便に回転エバポレ
ーターを用いて約20℃乃至60℃の温度において減
圧のもとで、即ち真空のもと（10mm乃至50mmHg）
において行うことができる。このエマルジヨンか
ら有機溶剤を蒸発除去させるために用いられる温
度はその時々の用いた有機溶剤の沸点及びそのカ
プセル化さるべき生物学的活性物質の安定度に依
存する。この蒸発の間にエマルジヨンは先づ最初
粘稠なゲルとなり、このものは中間生成物であ
る。このゲルは安定であつてこの状態で最低一週
間程度の短期間４℃において例えば窒素ガスのよ
うな不活性の雰囲気のもとで貯蔵することができ
る。次にこのゲルに少量の水または緩衝液を加え
ることができ、そして次にその得られた混合物を
更に追加的な約15分程度の時間にわたつて蒸発さ
せることができ、それにより有機溶剤の残りの痕
跡を除去することを助け、そしてこのゲルを均一
な外観を呈する寡少膜のリポイド小嚢の懸濁物に
変化させることを促進することができる。上記の
ゲルは例えば緩衝溶液のような水性媒体中に分散
させることにより、或はまた撹拌することによつ
て上記の懸濁物に変えることができる。得られた
小嚢はその直径が平均2000乃至4000Åの直径の範
囲にある。その水性緩衝液中に含まれているカプ
セル化さるべき薬剤、薬品、巨大分子、或はその
他の化合物更には生物的な物質の著しく大きな割
合がこのリポイド小嚢の中に取り込まれる（リポ
イドの量、水性相の容積、有機相：水性相：リポ
イドの割合、不活性有機溶剤の種類、その方法に
用いたリポイドの種類等によつて変化するが約60
％に達する）。必要の場合には小嚢内に取り込ま
れなかつた水性相内の物質は公知の適当な方法、
例えば遠心分離の繰り返し、カラムクロマトグラ
フイ、イオン交換クロマトグラフイ、透析等によ
つて除くことができる。その中に取り込まれた
種々の内容物を含むリポイド小嚢は次に等張の
（isotonic）緩衝液中に懸濁させて用いることが
できる。これらの小嚢はもしも殺菌状態が望まし
い場合には0.4ミクロンのフイルタ（nucleopore）
を通過させることによつて滅菌することができ
る。 本発明に従う方法によつてカプセル化すること
のできる物質並びに化合物の代表例には、もちろ
んこれらに限定されるわけではないけれども、例
えばシトシンアラビノシド及びこのものゝ加燐酸
化誘導体等の薬剤、例えば環状3′，5′アデノシン
モノホスフエートの如き化学薬品、シユークロー
ズ、例えばペニシリンやストレプトマイシンのよ
うな抗生物質、例えばインシユリン、オキシトシ
ン、及びバソプレツシンの如きポリレプチドホル
モン類、例えばデキストランのような巨大分子、
例えばアルブミン、フエリチン、及び免疫グロブ
リンＧの如きプロテイン類、例えばアルカリ性ホ
スフアターゼの如き酵素類、例えばポリアデニル
酸（poly Ａ）、リボ核酸、レオキシリボ核酸の如
き核酸類、ビールス、及び例えばC.parvumの如
きバクテリヤ、その他の物質が含まれる。 本発明に従う方法は不活性の雰囲気のもとで有
利に実施することができる。本願明細書において
用いられている“不活性雰囲気”の語は例えば窒
素ガス雰囲気、アルゴン雰囲気その他の不活性ガ
ス雰囲気のような非酸化性雰囲気を意味する。 以上の記述からわかるように、本発明に従う方
法は従来の方法に比していくつかの点で異つてい
る。例えば本発明に従う方法によればそのカプセ
ル化さるべき物質はリポイドと一諸にその有機相
の中に加えられ、そしてこゝで全体として一緒に
カプセル化される。更にまたこの有機相は過剰の
水性相を加えるに先立つて実質的に除去される。
最初の水性相の有機相中への乳化、及び過剰の水
性相を加えるに先立つて行われる有機相の除去は
この方法における取り込みのパーセンテージが高
いということに対して本質的な点であり、そして
これは本発明の方法とすべての従来記述された方
法との間の重要な差異である。本発明に従う方法
によれば多くの異つた種類のリポイドから単独で
または組合せて大粒の寡少膜小嚢を作ることがで
きる。本発明に従う方法の一つの利点はその有機
相の蒸発除去が温和な温度並びに真空のもとで行
われ、それにより敏感な種々の分子の不活性化の
ための能力を実現することができたという点であ
る。 以下に記述する若干の実施例によつて本発明に
従う方法の実施の態様並びに本発明に従うカプセ
ル化物の利用の仕方並びに本発明者等が最もよい
と信ずる具体例を記述するが、但し本発明がこれ
によつて限定されることを意図するものではな
い。以下に記述する全ての過程において例えば
NDB−PE（旧生化学剤）と類似の螢光性燐脂質
の0.5乃至1Mをそのリポイド又は燐脂質成分と共
に含有させてその小嚢がカラムの上で分離される
のを可視的に追跡することができるようにするこ
とも可能である。 例 １ 酵素のカプセル化 長く延びた頚部を有する内容積50mlの丸底フラ
スコに24/40接合部材を取り付けてフラツシユ蒸
発装置に簡便に連結できるようにする。このフラ
スコに窒素ガスで連続的にパージするための連結
手段も取り付けられている。このフラスコに
10μMのホスフアチジルグリセロール、40μMの
ホスフアチジルコリン、及び50μMのコレステロ
ールをクロロホルムに溶解して装入する。回転蒸
発装置を用いて上記溶剤を蒸発させ、それにより
このフラスコの内壁面上に薄いリポイドの層が残
される。次にこのフラスコを窒素ガスでパージし
て５mlのジエチルエーテルを撹拌と共に加えて上
記リポイドを溶解する。次にPH7.4に緩衝された
10ｍＭの塩化ナトリウムと４ｍＭのヒスチジン／
２−｛〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕アミ
ノ｝エタンスルホン酸（以下これをTESと呼ぶ）
及び10mg／mlのアルカリ性ホスフアターゼの水性
混合物1.5mlをこのフラスコに加えて不均一な二
相混合物を形成させる。この混合物を次に超音波
によつて浴槽型の超音波クリーナ（New York、
HicksvilleのLaboratory Supplies：model Ｔ−
80−80−IRSの中で０℃において５分間超音波処
理することによつて乳化させる。次に得られたエ
マルジヨンを回転エバポレータ（Buchi）で25℃
において減圧のもとに（約10乃至50mmHg）水流
ポンプを用いて粘稠なゲルが得られるまで蒸発さ
せる。このゲルは調整しようとする合成リポソウ
ムの前駆中間生成物である。このゲルは安定であ
つて少なくとも一週間以上の期間にわたり約４℃
の温度において不活性雰囲気のもとで貯蔵するこ
とができる。 上述のようにして得られたゲルに対して前記し
た塩化ナトリウム／ヒスチジン／TES緩衝溶液
の1.5mlを加え、そしてフラスコをゆるやかに回
転させてこのゲルの水性懸濁液を得る。得られた
混合物を約10乃至50mmHgの圧力のもとで追加的
な15分間の間に30℃において蒸発させて平均直径
が0.2乃至0.6ミクロンの燐脂質小嚢（合成リポン
ウム）の不透明な懸濁液が得られる。追加的に緩
衝液を加えることなく更に蒸発を続けた場合にも
同様な懸濁液が得られる。電子顕微鏡で検査した
結果、得られた小嚢は実質的に寡少膜の小嚢であ
ることを示している。この小嚢の不透明懸濁液を
Bio−gel A1.5アガロースカラムを通してその寡
少膜小嚢をなおカプセル化されていないアルカリ
性ホスフアターゼの混合物と分離する。カプセル
化のパーセントは34％と計算される。この分離さ
れた小嚢は如何なる等張性緩衝液の中に懸濁させ
ることも可能であり、そして酵素試薬の出発物質
として用いることができる。同様にして、上述の
例１の操作を繰り返し、但しそこで用いたアルカ
リ性ホスフアターゼの代りに10mg／mlのＬ−アス
パラギナーゼを用いて合成小嚢が得られこの中に
上記Ｌ−アスパラギナーゼがカプセル化されてい
る。この合成小嚢は哺乳動物における或る種の腫
瘍の成長を抑制するのに有効である〔その使用技
術についてはChang、T.；“Nature”229、117−
118（1971）参照〕更にまた同様にして、例１の上
述した操作を繰り反し、但しアルカリ性ホスフア
ターゼの代りに10mg／mlの種々のグリコシダーゼ
類を用いて合成小嚢が得られ、その中に上記の酵
素類がカプセル化されている。得られた小嚢の生
成物は酵素置換療法に効果的であり、その使用技
術については例えばNorth−Hullang Publ.Co.か
ら1974年に出版されたTager.Hooghwinkel及び
Daems著“Enzyme Therapy in Lyposomal
Storage Diseasesを参照されたい。 更に同様に、上記例１の操作を繰り返し、但し
そこで用いられたアルカリ性ホスフアターゼの代
りに84mg／mlの１−β−Ｄ−アラビノフラノシル
シトシンを用いて合成小嚢が得られ、その中に上
記アラビノフラノシルシトシンがカプセル化され
ておりこのものは哺乳動物における或る種の腫瘍
の成長を防止するのに用いられ、このものゝ使用
技術についてはMayhew著；“Cancer Research”
36、4406−4411、1967年10月号参照されたい。同
じ様な方法でアラ−Ｃ、メトトレキセート
（Methotrexata）等の代謝拮抗物質のヌクレオシ
ド類似体をカプセル化して哺乳動物における或る
種の腫瘍の成長を防止することができる。 同様にして上記例１の操作を繰り返し、但しそ
こで用いたアルカリ性ホスフアターゼの代りに
0.6mg／mlのアクチノマイシンＤを用いてこの化
合物をカプセル化する。上述の操作でカプセル化
されたアクチノマイシンＤは癌の反応に苦しめら
れている患者にGregoriadis等（雑誌Lancet、６
月、29、1974；1313−1316頁）の方法に従つて投
与することができる（なおこれに関してはD.
Papahadjopoulos等；“Cancer Research”36、
2988−2994、1976年９月号をも参照）。 同様にして上述の例１の操作を繰り返し、但し
そこで用いられたホスフアターゼの代りに燐酸塩
で緩衝された塩水溶液中に溶解したヘパリンのナ
トリウム塩を用いて合成小嚢が得られ、その中に
ヘパリンがカプセル化されている。これらの小嚢
は緩衝溶液中に懸濁させることができ、そして抑
制的に放出される抗凝結剤として反応症状を処置
するために静脈投与することができる。 同様にしてアンチモン酸メグルミン
（meglumine antimoniate）のような薬剤を例１
と同じ操作によつて続けることができる。上記の
方法によつてカプセル化されたアンチモン酸メグ
ルミンは例えばレイシユマニアのような寄生動物
に対して哺乳類に用いることができる。同様にし
て上記例１の操作を繰り返し、但しそこで用いた
ホスフアターゼの代りに例えばエチレンジアミン
４酢酸（edta）、ペニシラミン、等の如き金属キ
レート化合物を用いて合成小嚢を得ることがで
き、このものは金属毒、金属蓄積問題、或いは或
る種の貧血症にかゝつている患者を処置するのに
用いることができる（米国特許第4016290号参
照）。 例 ２ 核酸のカプセル化 上記例１において記載した丸底フラスコに
10μMのホスフアチジルグリセロール、40μMの
ホスフアチジルコリン及び50μMのコレステロー
ルをクロロホルムに溶解してチヤージする。この
内容物を回転エバポレータの上で蒸発させてその
フラスコの内壁面上に薄いリポイドの層を析出さ
せる。このフラスコを窒素ガスでパージし、そし
てこのフラスコに５mlのジエチルエーテルを撹拌
しながら加えて上記リポイドを再溶解させる。次
に４ｍＭのヒスチジン／TES及び１mg／mlのリ
ボ核酸（RNA）（ポリアデニル酸かまたは25S4
膜リポソーム状RNA）でPH7.4に緩衝した10ｍＭ
の塩化ナトリウムの水性混合物1.5mlを加える。
得られた混合物を浴槽型超音波クリーナ（上記
Laboratory Suppliesのもの）の中で０℃の温度
において５分間超音波処理することによつて乳化
する。次にこのエマルジヨンを０℃の温度におい
て10−50mmHgの圧力のもとでフラツシユエバポ
レータでゲルが生成するまで蒸発させる。この得
られたゲルに対して上記した鉛化ナトリウム／ヒ
スチジン／TES緩衝溶液の1.5mlを加えて蒸発を
更に15分間継続する。得られた不透明な懸濁物は
その中にリボ核酸をカプセル化した合成小嚢であ
る。20℃の温度において約30分間放置した後この
懸濁物を30分間100000Gにおいて遠心分離する。
上澄液を除去し、残渣としてカプセル化された合
成小嚢が残留する。RNAのカプセル化のパーセ
ントは40乃至43％と計算される。これらの小嚢は
細胞膜を通してRNAを注入するのに有効である。 同様にして上記例２の操作を繰り返し、但しそ
こで用いたリポ核酸の代りに核多角体病の昆虫ビ
ールス及び１ml当り１mgのパラアミノ安息香酸を
用いてこのビールスがその中にカプセル化されて
殺虫剤として用いることのできる合成小嚢が得ら
れる。この小嚢の中にカプセル化された殺虫剤は
North Holland publishing Co.から出版された
A.J.Gibbs E.d.の“ビールス及び無脊椎動物”の
第29章に詳細に挙げられている多数の害虫をコン
トロールするのために上記カプセル化された殺虫
剤の有効量を水性混合物の形でその被害を受けた
地域に散布することによつて用いることができ
る。或与えられた害虫に対する有効量を決定する
ための方法はよく知られており、例えば米国特許
第3474170号、同第3476836号、及び第3478029号
を参照されたい。そのようにして適用された小嚢
は生物体をコントロールするために相当長期間に
わたつてその効果を持続する。 同様にして、例えばポリイノシン−ポリシトシ
ン酸または他の合成ポリヌクレオチド類の如き他
のポリヌクレオチド類が上記例２の操作において
そのポリ核酸の代りに置き換えることができ、そ
れによりこれらの化合物がカプセル化された抗ビ
ールス剤として用いることのできる合成リポイド
小嚢が形成される。このような小嚢を用いる技術
はよく知られている。 同じようにして上述の操作を繰り返し、但しそ
こで用いられているリボ核酸の代りにデオキシリ
ボ核酸を用いてこのデオキシリボ核酸がカプセル
化された合成小嚢が得られる。その小嚢生成物は
発生学的な情報をエンカリオチツクな又はバクテ
リア性細胞に移し変える手段として用いることが
できる。 例 ３ インシユリンのカプセル化 上記例１に記載した丸底フラスコに50μMのジ
パルミトイルホスフアチジルコリン及び50μMの
コレステロールをクロロホルムに溶解してチヤー
ジする。この装入物を回転エバポレータで蒸発し
てそのリポイドの混合物をフラスコの内壁面上に
析出させる。次いでこのフラスコを窒素ガスでパ
ージし、そして7.5mlのイソプロピルエーテル及
び7.5mlのクロロホルムを撹拌しながら加えて上
記リポイドを再溶解する。この溶液にインシユリ
ン（牛、7Mの尿素中に20mg／ml）を水性緩衝液
（10ｍＭの塩酸トリエチルアミン：PH＝7.9）の中
に溶解した水性混合物1.5mlを加える。得られた
混合物を次に超音波浴（上記Labolatory
Supplies）の中で45℃において５分間にわたり超
音波処理することによつて乳化する。このエマル
ジヨンを次いで45゜の温度において10−50mmHgの
圧力のもとでフラツシユエバポレータによりゲル
が生成するまで蒸発する。このゲルに前述した塩
化ナトリウム／TES緩衝溶液1.5mlを撹拌しなが
ら加える。得られた不透明な懸濁液を45℃の温度
で30分間静置する。次にこの懸濁液をＧ−
75Setnadexカラムを室温（約26℃）において通
過させて上記インシユリン溶液がカプセル化され
ている合成リポイド小嚢を分離する。インシユリ
ンのカプセル化のパーセントは34％と計算され
る。この小嚢は燐酸塩で緩衝された塩水中に懸濁
させることができ、そしてインシユリンによりコ
ントロールされた糖尿病に罹つている患者に対し
て通常の投薬水準において経口的にまたは筋肉内
に投与することができる。上記の操作はもしも液
体の燐脂質が上記ジパルミトイルフオスフアチジ
ルコリンの代りに液体の燐脂質がこの小嚢の形成
のために用いられている場合には低い温度におい
て超音波処理及び蒸発の間に（0゜−20℃）繰り返
すことができる。 同様にして上記の操作を繰り返し、但しインシ
ユリンの代りに他の例えばバソクレシン、ソマト
スタチン、またはそれらの合成的誘導体並びに類
似体の如き他の水溶性ペプチドホルモン類を用
い、これらの物質がカプセル化されている合リポ
イド小嚢が得られ、これらは伝染病に罹つている
哺乳動物に治療的な適用をするのに用いることが
できる。 例 ４ スルフオキソンのカプセル化 前記の例１において記載した丸底フラスコに
50μMの大豆レシチン（Asolectin、Associated
Concentrates、Woodside、New York）及び
50μMのβ−シトステロールをクロロホルムに溶
解したものをチヤージする。この混合物を回転エ
バポレータの上で蒸発させてリポイド混合物をフ
ラスコ中の内壁面上に析出させる。次にこのフラ
スコを窒素ガスでパージし、そして５mlのジエチ
ルエーテルを撹拌しながら加えて上記リポイドを
再溶解させる。この溶液にスルホキソンナトリウ
ム（ジソジユーム〔スルホニルビス（ｐ−フエニ
レンイミノ）〕ジメタンスルフイネート）の25
mg／ml及びアスコルビン酸ナトリウム５mg／mlの
水性混合物1.5mlを加える。得られた混合物をソ
ニケータ（前述のLaboratory Suppoliesのもの）
の中で０℃の温度で５分間にわたり超音波処理す
ることによつて乳化させる。このエマルジヨンを
次に20℃の温度において10−50mmHgの圧力のも
とでフラツシユエバポレータによりゲルが生成す
るまで蒸発させる。このゲルに対して10mmの塩化
アンモン水溶液1.5mlを撹拌しながら加える。蒸
発を更に15分間継続する。カプセル化されたスル
ホキソンが透析によつてカプセル化されなかつた
スルホキソン溶液と分離される。このようにして
得られた小嚢は次いで抗菌性錠剤としてこれを緩
衝溶液に懸濁させて抗菌剤として作用するに効果
的な量で植物の根の部分にこの溶液を散布するこ
とによつて植物に適用することができる。 同様にして上記の操作を繰り返し、但しスルホ
キソンナトリウムの代りにアスコルピン酸ナトリ
ウムを50mg／mlのストレプトマイシンサルフエー
トと共に用いることによつてこれらの物質がカプ
セル化された合成リポイド小嚢が得られ、これは
植物に適用するための抗菌性調剤として用いられ
る。 上に述べたようにカプセル化するための水性混
合物のイオン強度が本発明に従う方法で得られる
カプセル化の度合に対して決定的な因子である。
カプセル化するための水性混合物のイオン強度が
増大するにつれてカプセル化のパーセンテージも
更にまた燐脂質の1μM当りカプセル化される水
性部分の体積が減少する。シウクローズ、グリセ
ロール、尿素、等の高濃度はカプセル化するため
の混合物中のイオン種の濃度の増大に対して同一
の効果を有しない。この効果は次の例５において
示す。 例 ５ 前記例１の方法を６回繰り返し、但し夫々の場
合に例１で用いたアルカリ性ホスフアターゼを
0.84mg／mlの１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシ
トシン（アラーＣ）で置き換え、そして各繰り返
し毎に塩化ナトリウムの割合を上記カプセル化す
るためのアラ−Ｃ−混合物のイオン強度が変化す
るように変える。存在する塩化ナトリウムの割合
及び得られたカプセル化の度合を下記第１表中に
示す。 【表】 乳化のための二相混合物中のリポイドの濃度も
本発明の方法によつて得られるカプセル化のパー
セントに関係を有する。例えばアラ−Ｃのカプセ
ル化のパーセントは全リポイド濃度が減少するに
つれて減少する。しかしながら燐脂質の1M当り
カプセル化される水性相の容積は増大する。 リポイドの量が合計して５mlの溶剤当り約
100μMになる場合に1Mの燐脂質当り約11.2の
水性相の容積がカプセル化され、そしてこれはそ
の全リポイドの量が20μMに減少したならば1M
の燐脂質当り約22.5に増大する。20−100μM／
５ml当りの範囲が好ましく100μM以上になると
多層の小嚢の数が増大する。種々のリポイド濃度
のもとで得られたアラ−Ｃのカプセル化のパーセ
ントを次に例６に示す。 例 ６ 前記例１の操作を５回繰り返し、但し夫々の場
合にそこで用いたアルカリ性ホスフアターゼを84
mg／mlの１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシ
ン（アラ−Ｃ）で置き換えそして全リポイドの濃
度を各繰り返し如に変化させる（PG：PC：コレ
ステロールの割合は等しく保つ）。夫々の繰り返
し過程に用いた全リポイドの割合及び得られたカ
プセル化のパーセントを下記第２表に示す。 【表】 本発明の方法において用いたリポイドまたはリ
ポイド混合物の性質は重要ではないようである。
例えばPG、PS、カルジオリピン、またはホスフ
アチジン酸等を単独で用いた場合に負に荷電した
リポイドを除いて同じようなリポイド／溶剤／緩
衝液の割合において異なつたリポイドの組成は得
られたカプセル化の度合に対して温和な影響しか
与えない。下記例７にこの結果を示す。 例 ７ 前記例１の操作を、そこで用いたアルカリ性ホ
スフアターゼを0.84mg／mlのアラーＣで置き換え
るかまたかTESの代りに1/10のDulbeccoの燐酸
塩で緩衝された温水中の0.01Mの塩化ナトリウム
で置き換えたことを除いて数回繰り返しそして各
繰り返しにおいてそのリポイド成分を変える。操
業No.4においては3.5mlのジエチルエーテルと
1.05mlの上記Dulbecco塩水（PBS）を用い、操
業No.5においては7.5mlのイソプロピルエーテル
を7.5mlのイソプロピルエーテルを7.5mlのクロロ
ホルムと共に上記ジエチルエーテルの代りに用
い、そして第２の蒸発を45℃において行つた。操
業No.6においては7.5mlのイソプロピルエーテル
と7.5mlのエタノールとの混合物をジエチルエー
テルの代りに用いた。操業No.7及びNo.8におい
ては５mlのジエチルエーテルと１mlのメタノール
との混合物をジエチルエーテル単独の代りに用い
た。用いたリポイド、採用したリポイドの濃度、
及び得られたカプセル化のパーセントを夫々の場
合について下記第３表に示す。 【表】 本発明の方法によつて作られた小嚢はその中に
カプセル化された生物学的に有用に保たれた生物
学的活性物質の担体の役目をする。この小嚢の壁
は下記例８に示すようにそのカプセル化された材
料に対して不透過性である。 例 ８ 前記例５の操業No.5において作られた小嚢の
10ml毎の三つの部分を分離して１夜透析し、それ
によりそのアラーＣをカプセル化した小嚢の懸濁
液中に存在するカプセル化されなかつた物質を除
去した。次に夫々の透析された部分を透析袋中に
入れてDulbeccoの燐酸緩衝した塩水の一つ続き
の夫々10ml毎に三つの部分に対して夫々異つた温
度において１時間にわたり透析を行つた。この透
析袋を通して１時間当りに拡散して通つたアラー
Ｃの濃度を次に観測した。下記第４表中にこれら
の観測、採用した温度及び透析の長さを示す。 【表】 例 ９ バクテリヤのカプセル化 前記例１に記載した丸底フラスコに50μMの
TG：TC（１：４）及び50Mのコレステロールを
クロロホルム中に分散したものをチヤージする。
回転蒸発装置を用いてその溶剤を蒸発させ、それ
によりフラスコの内壁面上にリポイド混合物の膜
を残留させる。次にこのフラスコを窒素ガスでパ
ージして５mlのジエチルエーテルを撹拌しながら
加えてそのリポイドを再溶解させる。この溶液に
対して加熱滅菌したバクテリウムC.Parvumを
Dulbeccoの燐酸塩緩衝塩水（NaCl0.137M、
NaHPO₄8.2×10^-3M、TCl2.7×10^-3M、
KH₂PO₄1.9×10^-3M、MgCl₂1.1×10^-3M、及び
CaCl₂0.9×10^-3M）の中に溶解した水性懸濁液
1.1Mを加える。得られた混合物をソニケータ
（前記のLaboratory Suppoliesのもの）の中で０
℃において５分間超音波処理することにより乳化
させる。次にこのエマルジヨンを20℃の温度にお
いて10−50mmHgの電圧のもとでフラツシユエバ
ポレータ２よりゲルが生成するまで蒸発させる。
このゲルに対してDulbeccoの燐酸塩緩衝塩水1.5
mlを加え、そしてその蒸発を更に15分間継続す
る。カプセル化されたC.parvumをシユークロー
ズプラジエントの上で遠心分離することによりカ
プセル化されなかつたC.parvumと分離する。存
在したC.parvumの30％がカプセル化される。そ
のようにして得られた小嚢はSeminars Cncol.1、
367−378（1974）の中に詳述されているような或
種の癌に対する調材として用いることができる。 同様にして、上記例９の操作を繰返えし、但し
そこで用いたC.parvumの代りに例えばBCG、イ
ンタクト癌細胞、又はそれらの精製フラクシヨン
のような他の免疫促進剤を用いて、これらの物質
のカプセル化されている合成小嚢が得られる。こ
れらの小嚢は対応症状をもつ哺乳動物に投与した
場合に免疫療法に有用であろう。 この例９はまた、種々の物質を溶液の形でカプ
セル化するばかりでなく、水性媒体中に分散して
いる種々の物質をもカプセル化できると言う本発
明方法の特別な利点をも示している。カプセル化
されるべき物質はもしこれが可溶性であれば水性
相中に溶解されるであろう。或はまた、この物質
は微細に分割されて水性媒体中に懸濁され、又は
ビールスや細胞的物質の場合には懸濁状態の巨大
分子であつてもよい。もしその懸濁された物質の
ための室が生成小嚢内部に存在するならばこれは
本発明方法によつてカプセル化できると考えられ
る。このことは、従来の多くのカプセル化方法が
溶解物質以外のカプセル化を実現できなかつたこ
とを考えるならば本発明の一つの利点である。 本発明方法によつて作られた小嚢生成物は既に
生物学的活性ある比較的大きな物質或は大容積を
カプセル化することを実証してしまつている。そ
のカプセル化された物質の性質に依存して、これ
らの小嚢生成物は極めて広い用途範囲を有してい
る。例えば、カプセル化された抗生物質を用い
て、これらは生体内で、或は試験管内で、抗生物
質に抵抗性ある病原菌を、グラム陰性のE.coli、
H.influenzae、P.aeruginosa等をも含めて処置す
るのに用いることができる。理論は、細菌性生物
により拡げられた薬剤抵抗性が細胞壁の不滲透性
の増大の結果であると表現されている。生物への
任意の抗生物質の注入は、もしリポイド小嚢の手
段により行なわれた場合には促進され、と言うの
はリポイド小嚢が細菌性細胞壁を容易に浸透して
その中にカプセル化されていた抗生物質をその病
原菌内で放出するものゝ如くであるからである。 同様にして、上に簡単に記述したように、駆虫
性化合物をカプセル化することにより、このカプ
セル化された物質を宿主哺乳動物の細胞内皮系に
送り込むことができる。リポイド小嚢は薬物を交
果的に送り込んで宿主動物に最小限の毒作用のも
とに寄生虫を麻ひさせることができる。 例えば不活性化したポリオビールス或はP.
aeruginosa等のビールス及びバクテリア剤をカ
プセル化することにより、哺乳動物にこの剤によ
つて伝染病に対する免疫を与えるために投与でき
るようなワクチンが、本発明方法によつてカプセ
ル化されていないこのようなワクチンの示す毒性
強さの減少と共に提供される。 本発明方法は上記したデオキシリボ核酸をカプ
セル化するのに利用することができる。カプセル
化されたDNAフラグメントはリポイド小嚢の担
体によつて植物にも、又は動物にもその生きてい
る細胞中に注入することができる。その利点はこ
の方法の労力と時間との節約になると言う点で、
プラスミド及び結合技術よりなる。小嚢中にカプ
セル化されたDNAは酵素分解に対して保護され
ている。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 生物学的活性物質を寡少層の合成リポイド小
   嚢中にカプセル化するに当り、有機溶剤中の小嚢
   壁形成性化合物の混合物と、カプセル化されるべ
   き生物学的活性物質の水性混合物とを、その有機
   相の水性相に対する割合が油中水型エマルジヨン
   を生ずるような量比となるように準備し、上記混
   合物の均質な油中水型エマルジヨンを形成し、こ
   のエマルジヨンから有機溶剤を除去してそれによ
   りゲル様の性質を持つた混合物を得、そしてこの
   ゲル様混合物を上記生物学的活性物質のカプセル
   化されている寡少層の合成小嚢の懸濁液に変える
   ことを特徴とする、上記生物学的活性物質のカプ
   セル化方法。 ２ 小嚢壁形成性化合物が燐脂質である、上記特
   許請求の範囲第１項に従う方法。 ３ 上記燐脂質が第二の燐脂質とコレステロール
   とに混合されたホスフアチジルコリンより成る、
   上記特許請求の範囲第２項に従う方法。 ４ 上記ホスフアチジルコリンの上記第二の燐脂
   質に対する割合が４：１である、上記特許請求の
   範囲第３項に従う方法。 ５ 小嚢壁形成性化合物が最初不活性溶剤中で準
   備され、次いでその反応容器の側壁面上に上記不
   活性溶剤の蒸発によつて析出せしめられる、前記
   特許請求の範囲第１項に従う方法。 ６ 有機溶剤がジエチルエーテル、クロロホル
   ム、テトラヒドロフラン、及びイソプロピルエー
   テルよりなる群から選ばれる、前記特許請求の範
   囲第１項に従う方法。 ７ 水性混合物がその生物学的活性物質の安定性
   を維持するのに適当なPH−値に緩衝される、前記
   特許請求の範囲第１項に従う方法。 ８ 上記緩衝剤が0.3よりも低い強度のイオン性
   化合物である、上記特許請求の範囲第７項に従う
   方法。 ９ 小嚢壁形成性化合物の割合が有機溶剤の１ml
   あたり約0.5ないし約50mgの範囲内である、前記
   特許請求の範囲第１項に従う方法。 １０ 乳化を約マイナス10゜から約50℃までの間
   の温度において超音波照射を用いて行なう、前記
   特許請求の範囲第１項に従う方法。 １１ 有機溶剤の除去を、そのエマルジヨンから
   有機溶剤の部分をゲル様混合物が得られるまで蒸
   発させることによつて行い、次にこのゲル様混合
   物にこれをゲルに変えるのに十分な割合で水を加
   え次いで残りの溶剤を蒸発させる、前記特許請求
   の範囲第１項に従う方法。 １２ ゲル様混合物に加えられる水が生物学的活
   性物質の安定性を維持するのに適当なPH−値に緩
   衝されている、前記特許請求の範囲第１１項に従
   う方法。 １３ 不活性の雰囲気のもとで行う、前記特許請
   求の範囲第１項に従う方法。 １４ 懸濁液が生物学的活性物質の安定性を維持
   するのに適当なPH−値に緩衝されている水性懸濁
   液である、前記特許請求の範囲第１項に従う方
   法。 １５ 寡少層の小嚢がいまだカプセル化されてい
   ない生物学的活性物質から分離される、前記特許
   請求の範囲第１項に従う方法。 １６ 生物学的活性物質が酵素である、前記特許
   請求の範囲第１項に従う方法。 １７ 生物学的活性物質が抗生物質である、前記
   特許請求の範囲第１項に従う方法。 １８ 生物学的活性物質が核酸である、前記特許
   請求の範囲第１項に従う方法。 １９ 上記核酸がデオキシリボ核酸である、上記
   特許請求の範囲第１８項に従う方法。 ２０ 生物学的活性物質が殺虫剤である、前記特
   許請求の範囲第１項に従う方法。 ２１ 生物学的活性物質がポリペプチドである、
   前記特許請求の範囲第１項に従う方法。 ２２ 上記ポリペプチドがインシユリンである、
   上記特許請求の範囲第２１項に従う方法。 ２３ 生物学的活性物質が細菌性生物である、前
   記特許請求の範囲第１項に従う方法。 ２４ 生物学的活性物質がビールスである、前記
   特許請求の範囲第１項に従う方法。 ２５ 小嚢壁形成性化合物がコレステロールと、
   ホスフアチジルグリセロールと、及びホスフアチ
   ジルコリンとの重量で５：１：４の割合の混合物
   である、前記特許請求の範囲第１項に従う方法。