JP3026271B2 - 活性薬剤の制御放出に用いる多小胞リポソームの調製 - Google Patents

活性薬剤の制御放出に用いる多小胞リポソームの調製

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、生物学的活性物質を封入するリポソームの
多小胞（multivesicular）リポソーム組成物に関する。
さらに特定すると、本発明は、封入した物質の放出速度
が制御可能な多小胞リポソームの製造法及び使用に関す
る。
背景技術 多くの医薬を用いて最適の治療を行うには、医薬濃度
が長期間にわたって維持されることが必要であることが
多い。例えば、細胞周期特異的代謝拮抗物質を用いて最
適の抗癌治療を行うには、長期間にわたって細胞毒性薬
の濃度を維持することが必要である。シタラビンは極め
て時期依存性の抗癌剤である。この医薬はDNA合成時に
のみ細胞を殺すので、細胞を最適に殺すには治療的濃度
の医薬に長期間暴露することが必要である。このような
薬剤は静脈内又は皮下投与後の半減期が数時間と短いと
いう事実のために、薬剤の治療有効性はさらに複雑にな
ることが多い。シタラビンのような細胞周期特異的医薬
を用いて癌細胞を最適に殺すには、次の２つの主要な要
求を満たさなければならない：まず第１に、宿主に不可
逆的な有意な害を与えることなく、高濃度の医薬に癌細
胞を暴露しなければならない；そして第２には、細胞増
殖のうちで感受性なDNA合成期にある癌細胞の数を最大
にするために腫瘍を長期間医薬に暴露しなければならな
い。
時期依存性である別のクラスの医薬の例としては、ア
ミノグリコシドクラスの抗生物質が挙げられる。例え
ば、アミカシンはグラム陽性及びグラム陰性細菌に対し
て臨床的に重要な活性をもつアミノグリコシド抗生物質
である。従来の治療法では、この医薬は通常１日１回又
は２回、静脈内又は筋肉内経路で投与される。最も普通
に用いられる臨床用量は、１日1gの最大推奨日用量と同
等な15mg/Kg/日である。しかしながら、この方法では患
者に全身投与することになり、医薬によっては毒性の副
作用の危険が増加する。従って、柔組織又は骨の局所領
域に限定されるような感染治療用の局所デポ除放性製剤
が、治療的な全身用量と比較して医薬の局所組織濃度増
加に有利であり、一方遊離薬の全身性毒性を減少又は回
避する。
特に、数時間、数日又は数週間にさえ及ぶ長期間にわ
たって治療的濃度の医薬を送達するのに使用できる制御
放出製剤が有用である。
医薬送達のための制御放出組成物を提供するのに用い
られてきた１つのアプローチはリポソーム封入である。
多くのリポソーム型のうち、多重小胞（multivesicula
r）リポソーム（Kim,et al.,Biochim,Biohys.Acta;728:
339−348,1983）は、単ラメラ（unilamellar）リポソー
ム（Huang,Biochemistry.8:334−352,1969;Kim.et al.,
Biochim.Biophys.Aata;646:1−10,1981）、多重ラメラ
（multilamellar）リポソーム（Bangham,et al.,J.Mol.
Bio.,13:238−252,1965）、及び安定な多ラメラ（pluri
lamellar）リポソーム（米国特許第4,522,803号）とは
異なってユニークである。単ラメタリポソームとは対照
的に、多少胞リポソームは複数の水性隔質（chamber）
を含む。多重ラメラリポソームとは対照的に、多小胞リ
ポソームの複数の水性隔室は同心円状でない（non−con
centric）。各種の型の単ラメラ及び多重ラメラリポソ
ームを製造する多数の方法は文献に記載されている：例
えば、Lenkに付与された米国特許第4,522,803号;Baldes
chwielerに付与された米国特許第4,310,506号;Papahadj
opoulosに付与された米国特許第4,235,871号;Schneider
に付与された米国特許第4,224,179号;Papahadjopoulos
に付与された米国特許第4,078,052号;Taylorに付与され
た米国特許第4,394,372号;Marchettiに付与された米国
特許第4,308,166号;Mezeiに付与された米国特許第4,48
5,054号；及びRedziniakに付与された米国特許第4,508,
703号;Szoka,et al.,1980,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.,9:
465−508:Liposomes.Marc J.Ostro編集.Marcel−Dakke
r,Inc.,New York,1983,Chapter 1:Poznansky and Julia
no,Pharmacol.Rev.,36:277−236,1984）。先行技術はさ
らに多小胞リポソームの製造法を記載する（Kim,et a
l.,Biochim.Biophys.Acta,728:339−348,1983）。
Kimらの方法（Biochim.Biophys.Acta,728:339−348,1
983）では、シタラビン又はAra−Ｃとしても知られるシ
トシンアラビノジドのようないくつかの小さい分子の封
入効率は比較的低く、生物学的流体中への封入分子の放
出速度は高かった。従って、生物学的流体への封入分子
の放出速度を遅くするために塩酸塩を用いる組成物が開
発された（Kimにより1993年２月21日出願の米国特許出
願第08/020,483号の一部継続出願）。
さらなる研究の結果、ヒト血漿中における多小胞リポ
ソームからの物質の放出速度は、多小胞リポソーム形成
前に物質を溶解する酸溶液の性質を変更することによっ
て制御できることが示された（Sankaram及びKimにより1
993年11月16日出願の米国特許出願第08/153,657号）。
これらの研究では、塩酸、硝酸及び過塩素酸のようなあ
る種の鉱酸が最も遅い放出速度をもたらし、一方その他
の酸、例えば酢酸、トリフルオロ酢酸、及びトリクロロ
酢酸などは即時の放出速度をもたらした。最も速い放出
速度は硫酸及びリン酸などの二−又は三−プロトン酸に
よって得られた。この方法で製造されたリポソームの組
成物は、所望の医薬放出動力学をもつ多小胞リポソーム
を製造するのに酸を使用する必要があるという欠点をも
つ。さらに、多小胞リポソームからの所望の医薬放出速
度を提供する酸のいくつかは、製造に用いる金属容器及
び部品の腐食のような薬動力学的プロセスにおける問題
を生じる。また、もしもin vivo環境で実用に供される
多小胞リポソームを酸を用いないで製造する場合には、
酸不安定物質の安定性についての問題点が回避されるで
あろう。
水性環境中へのリポソームからの封入された生物学的
物質の放出速度は、リポソーム中にプロトノファア又は
イオノフォアを導入して膜ポテンシャルを作り出すこと
によって調節できることが示された（米国特許第5,077,
056号）。さらに、小胞組成物からの医薬の放出速度を
制御する方法がヨーロッパ特許出願第0126580号に開示
されている。この後者の方法では、一定の浸透圧を与え
るために十分な溶質を含む溶液中に懸濁した小胞中に封
入された治療薬の溶液を含む組成物を提供する。この浸
透圧は小胞内の溶液の浸透圧に関して少なくとも実質的
に等張であり、またこの小胞内の溶液の浸透圧は生理的
食塩水よりも大きい浸透圧をもつ。小胞内の溶液の浸透
圧は一定に保たれ、一方小胞が懸濁される溶液の浸透圧
は変化する。このような条件下では、懸濁媒質が小胞内
の溶液に関して等張又は高張な関係に達するにつれて、
放出速度が低下する。しかしながら、この方法の欠点
は、放出速度を制御するために、その中に治療薬を放出
する媒体の浸透圧が変化しなければならない点である。
その結果、医薬送達システムの投与部位における生物学
的流体の浸透圧は実質的に固定しており変更できないの
で、これらの組成物は医薬用途などの実際の使用に関し
ては厳しく限定されてしまう。例えば、血漿などの生物
学的流体は生理食塩水（normal saline:水中0.9重量％N
aCl）に関して等張に近く、これは310mOsmの浸透圧をも
つ。従って、懸濁媒体の浸透圧は理想的には310mOsm近
くであるべきである。
従来のリポソーム組成物及びその製造法についての公
知の限定に鑑み、酸を用いることなく安定な多小胞リポ
ソームを製造する技術が求められている。本発明はこの
ような需要に答えるものである。
発明の要約 本発明は、生物学的活性物質の制御放出のできる多小
胞リポソーム（MVL）を提供する。生理的環境、例えばi
n vivoでのヒト組織中への生物学的活性物質の放出速度
は、リポソーム中に封入される第１水性成分の浸透圧を
変えることによって制御される。こうすることによっ
て、本発明のMVLは、in vivo部位に導入されたときに薬
物の治療的放出を維持することによって大きな改良され
た結果をもたらす。予期せぬことに、リポソーム中に封
入される第１水性成分の浸透圧が増加するにつれて、放
出速度が低下する。
第１水性成分の浸透圧は、生物学的活性物質の濃度を
増加するか、あるいは浸透圧スペーサーを加えることに
よって増加できる。
本発明はまた、長期間のin vivo治療用途を提供する
制御放出性を持つ多小胞リポソームを製造するための酸
を用いない（non−acidic）方法を提供する。本発明の
多小胞リポソームは、高い封入効率、封入物質の制御さ
れた放出速度、一定の再生可能なサイズ分布、球形状、
容易に調節可能な平均サイズ及び調節可能な内部隔室サ
イズ及び数をもつ。
多重状胞性脂質小胞又は多小胞リポソームを製造する
本発明の方法は、（ａ）１以上の有機溶媒中に少なくと
も１つの両親媒性脂質及び１つの中性脂質を含む脂質成
分を溶解し、（ｂ）前記脂質成分を、封入すべき１以上
の生物学的活性物質を含む非混和性の第１水性成分と混
合し、（ｃ）前記２つの非混和性成分から油中水型エマ
ルジョンを形成し、（ｄ）前記油中水型エマルジョン
を、第２の非混和性の水性成分中に移して浸漬して溶媒
小球を形成し、そして（ｅ）前記溶媒小球から蒸留など
によって有機溶媒を除去することを含む。両親媒性脂質
は正味の負電荷をもつ両親媒性脂質；ステロール；及び
双性イオン脂質から選択できる。生物学的流体及びin v
ivoへの封入分子の放出速度は、生物学的活性物質の濃
度を増加するか、あるいは浸透圧スペーサーを用いる
か、又は物質の増加と浸透圧スペーサーの使用を組み合
わせることによって、低下することができる。
発明を実施するための好ましい態様 本発明は、生物学的流体中における治療的活性物質の
制御された放出を可能にする多小胞リポソーム（MVL）
組成物に関する。これらの組成物では、塩酸塩又は酸の
不在下に、封入された治療的活性物質の維持された放出
を達成するために、封入された水性相の浸透圧を新規な
方法で操作する。本発明の方法を行うことによって、当
業者は物質の広範な放出速度を持つMVLを選択的に製造
することができる。
“多小胞リポソーム”の語は、複数の同心円状でない
水性隔室を囲む人工の顕微的脂質小胞を意味する。これ
とは対照的に、従来のその他のリポソームでは、例えば
単ラメラリポソームでは１つの水性隔室をもち、多重ラ
メラ及び多ラメラリポソームは、水性成分を含むスペー
スをそのあいだにもつ複数の同心円状の“タマネギの
皮”様の膜をもつ。
“溶媒小球”の語は、有機溶媒の顕微的球状小滴を意
味し、その中に生物学的活性薬剤を含む、水性成分の複
数のより小さい小滴が存在する。溶媒小球は第２水性成
分中に懸濁され完全に浸漬している。
“中性脂質”の語は、それ自体が小胞形成能をもた
ず、荷電した又は親水性の“頭部”基をもたない油脂又
は脂肪を意味する。中性脂質の例としては、荷電した又
は親水性の“頭部”基をもたないグリセロースエステ
ル、グリコールエステル、トコフェロールエステル、ス
テロールエステル、ならびにアルカン及びスクアレンを
含むが、これに限定されない。
“両親媒性脂質”の語は、親水性の“頭部”基と疎水
性の“尾部”基をもち、膜形成能をもつ分子を意味す
る。本明細書では、両親媒性脂質には、正味の負電荷、
正味の正電荷をもつ両親媒性脂質、双性イオン脂質、及
びステロールを含む。
“双性イオン脂質”の語は、等電点でゼロ正味電荷を
もつ両親媒性脂質を意味する。
本明細書では、多小胞リポトームの隔室中に存在する
物質を記載するときに用いる“生物学的活性”の語は、
小胞中に存在する形で生物学的活性を有する物質、なら
びに小胞隔室から放出された後に活性となる物質（すな
わち、“静止状態の”生物学的活性を有する）、例えば
酵素との相互作用によって治療活性をもつ活性成分に変
換されるプロドラッグのような物質を含む。
さらに、導入される生物学的活性物質には間接的に作
用する物質を含む。あるいは、このような物質は本明細
書で記載する浸透圧スペーサーとして作用する。例え
ば、各種賦形剤及び安定化剤が存在する。このような物
質は、例えば特定医薬の保存寿命又は生物学的適合性を
増加する作用をする。あるいは、一般に賦形剤として分
類される物質の多くは、ごくわずかなものからかなり重
要なものまで直接的生物学的活性を実際にもっている。
例えば、よく使う賦形剤であるマンニトールは利尿剤と
しても生物学的に作用するし、水でさえも生物学的に作
用して脱水に影響する。このような間接的に活性な物質
には水性又は非水性の溶液、懸濁液、及びエマルジョン
を含む。非水性溶液の例としては、プロピレングリコー
ル、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物
油、及びオレイン酸エステルなどの注射可能な有機エス
テルを含む。水性担体には、食塩水及び緩衝化媒体を含
む水、アルコール−水溶液、エマルジョン又は懸濁液を
含む。非経口的ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リ
ンゲル・デキストロース、デキストロース、及び乳酸加
リンゲル液を含む。静脈内ビヒクルには、液体及び栄養
補充物、電解質補充物（リンガル・デキストロースに基
づくものなど）などを含む。保存剤及びその他の添加
剤、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性
ガスなど（Remingtons Pharmaceutical Sciences,16th
Ed.,A.Olso,編集,Mark,Easton,PA,1980参照）が存在し
ていてもよい。当業者は過度の実験を行うことなく、本
発明の小胞に用いることのできる化合物の各種組み合わ
せを容易に確認し想到することができる。
浸透圧は水性溶液中に存在する溶質のモル濃度の合計
として定義される。もしも溶質が解離、イオン化又は凝
集した形で存在するならば、浸透圧は解離、イオン化又
は凝集した形のモル濃度の合計として定義される。溶質
には、生物学的活性薬剤及び浸透圧スペーサーを含む、
これに限定されない。
“浸透圧スペーサー”の語は、生物学的活性物質でな
い、水溶液中の全ての生物学的に適合性の溶質分子を意
味する。電解質及び非電解質の両方が浸透圧スペーサー
として機能する。特定の分子が浸透圧スペーサーとして
機能するかどうかを決定するにあたって、あるいは多小
胞リポソーム中に封入する浸透圧スペーサーの濃度を決
定するにあたっては、多小胞リポソーム内の条件（例え
ばpH）下で、その分子が完全に又は部分的にイオン化し
ているかどうか、そしてこのようなイオンが脂質膜を透
過するかどうかを考慮に入れなければならない（The Bi
molecular Lipid Bilayer Membrane,Mahendra K.Jain,v
an Nostrand Reinhold Co.,1972,470pp.）。当業者であ
れば、本発明の使用にあたって、本発明のMVLの使用に
よる治療を受ける被験者に毒性又は有害なことが証明さ
れている物質を避けて浸透圧スペーサーを選ばなければ
ならないことが理解されよう。当業者は過度の実験を行
うことなく、本発明で使用する特定の浸透圧スペーサー
が適当なものであるかを容易に評価できる。
“第１水性成分”の語は、多小胞リポソームを製造す
る工程で使用する、場合により浸透圧スペーサーの存在
下に生物学的活性物質を含む水性相を意味する。
“第１水性成分の浸透圧”の語は、多小胞リポソーム
を製造する工程で使用する生物学的活性物質を含む水性
成分の浸透圧を意味する。
“生物学的に関連のある水性環境”の語は、血漿、血
清、脳脊髄、筋肉内、皮下、腹膜、眼内、又は滑膜液な
どの生物学的流体、ならびに生物学的流体とほぼ等張な
0.9％食塩水又は緩衝塩溶液などの貯蔵媒質を意味す
る。
水性環境中への封入された生物学的物質の放出速度を
制御する従来の方法は、１）リポソーム内の酸溶液の性
質、又は２）リポソーム内の水性成分の浸透圧につい
て、リポソームがその中に導入される外部水性環境の浸
透圧を増加することに依っていた。後の方法の論理的結
論として、リポソームがその中に導入される水性媒体の
浸透圧を一定に保ちながら、第１水性成分の浸透圧が増
加するにつれて封入される物質の放出速度が増加しなけ
ればならないことになる。しかしながら、本発明による
知見は驚くべきことに従来法の教示に基づいて予想され
ることとは反対であった。すなわち、たとえ外部の水性
媒体の浸透圧が一定に保たれていても、MVL内の内部水
性成分の浸透圧が増加するにつれて封入される物質の放
出速度は実際には低下する。従って、本発明の方法は多
小胞リポソーム内に封入される第１水性成分の浸透圧を
用いて放出を制御し、このとき外部媒質の浸透圧強度は
ほぼ生理的である。
さらに、一定濃度の生物学的活性物質で、浸透圧スペ
ーサーを含むMVLを製造するときは、浸透圧スペーサー
の濃度が増加すると、予期せぬことに物質の放出速度が
低下する。第１水性成分の浸透圧増加を伴う放出速度の
低下は、治療薬剤の長期間放出によって恩恵を受ける全
ての型の治療に多小胞リポソームを用いる機会を多くす
る。
本発明の多小胞リポソームからの封入された治療薬又
はその他の活性薬剤の放出速度を低下させるには、活性
物質の濃度を増加するか、あるいは浸透圧スペーサーの
使用により、MVL内の第１水性成分の浸透圧を、MVLが貯
蔵される（0.9重量％食塩水など）又はその中にMVLを導
入する（in vitro及びin vivoの両方で）生理学的に関
連のある水性環境の浸透圧と比較して増加させる。逆
に、活性物質の濃度を減少するか、あるいは浸透圧スペ
ーサーの濃度を減少するか又はその使用を除去すること
により放出速度は増加できる。第１水性成分の浸透圧
は、リポソームから生物学的活性物質の放出速度を最適
に低下させるために生理学的に関連のある水性環境に関
して高張することもでき、これによって等張条件下より
も封入工程の収率が高くなる。従って、本発明では、第
１水性成分を、貯蔵媒体又は生物学的活性薬剤がその中
に放出される水性環境に関して低張、等張又は高張にす
ることを含む。その結果、当業者は、特定の治療に最適
な生物学的活性物質の予め選択した放出速度をもつMVL
を日常的に製造することができる。
生理食塩水の浸透圧はヒト血漿及び脳脊髄液、滑膜
液、ならびに皮下や筋肉内空間などのその他のin vivo
環境の浸透圧とほぼ同じであるので、このような環境中
のMVL医薬放出の予測されるモデルとして食塩水を用い
ることができる。本発明のMVLの好ましい使用は、in vi
vo注射又は組織や体空洞への移植用（例えば、デポ剤と
して）のものであり、これらは生理食塩水、リン酸緩衝
化塩溶液などの媒体、又はその他の浸透圧的に同様の媒
体中に貯蔵するのが好ましい。
簡単に述べると、本発明に含まれる方法においては、
MVLはまず両親媒性脂質及び中性脂質を前記脂質成分の
ための揮発性有機溶媒中に溶解し、前記脂質成分に、封
入すべき生物学的活性物質を含む非混和性の第１水性成
分を加え、次いで例えば混合、震盪、超音波処理によ
り、超音波エネルギー、ノズル霧状化により、又はこれ
らの組み合わせにより作られる撹流によって混合物を乳
化する。次いで全エマルジョンを第２水性成分中に浸漬
し、上述したようにして機械的に撹拌して、第２水性成
分中に懸濁した溶媒小球を形成する。得られる溶媒小球
は、その中に生物学的活性物質が含まれる多数の水性小
滴からなる（水中油中水の二重エマルジョン）。
例えば、水蒸気又はガスを懸濁液の上又は中を通すこ
とによって溶媒を蒸発させて揮発性の有機溶媒を小球か
ら除去する。溶媒が完全に蒸発したとき多小胞リポソー
ムが形成される。溶媒を蒸発させるのに使用できるガス
の代表としては、窒素、ヘリウム、アルゴン、酸素、水
素及び二酸化炭素を含む。あるいは、例えば上記のガス
のスパージング、減圧下での蒸発、及びスプレードライ
など一般に使用される溶媒除去システムによって有機溶
媒を除去してもよい。
これに限定するものではないが、グルコース、スクロ
ース、トレハロース、コハク酸塩、シクロデキストリ
ン、アルギニン、ガラクトース、マンノース、マルトー
ス、マンニトール、グリシン、リシン、クエン酸塩、ソ
ルビトール、デキストラン及びその組み合わせを含む浸
透圧スペーサーを用いて多小胞リポソームを形成し、多
小胞リポソームからの封入された物質の放出速度を制御
することができる。封入された生物学的活性物質の濃度
は、約数ピコモルから約数百ミリモルまでの範囲を変更
しうる。生物学的活性物質の濃度は、治療すべき疾患の
性質、患者の年齢や症状、なびにその物質の特定の性質
によって変更される。物質が毒性などの副作用を通常も
つ場合には、低濃度の物質をもつMVLを製造し、また高
濃度の浸透圧スペーサーを用いるのが望ましい。一定の
MVL組成物を選択し製造するにあたって、当業者はこれ
らの各種パラメーターの相互関係を過度の実験を行うこ
となく容易に評価することができる。
多数の異なる種類のエーテルなどの揮発性の疎水性溶
媒、炭化水素、ハロゲン化炭化水素、CO2、NH3、フレオ
ンを含む（ただしこれに限定されない）超臨界流体を脂
質相溶媒として使用できる。例えば、ジエチルエーテ
ル、イソプロピルエーテル及びその他のエーテル、ジク
ロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、ハロ
ゲン化エーテル、エステル及びその組み合わせが満足の
いくものである。
少なくとも１つの中性脂質及び少なくとも１つの両親
媒性脂質が含まれる限り、各種の型の脂質を多小胞リポ
ソームの製造に使用できる。両親媒性脂質は（１）正味
の負電荷をもつ両親媒性脂質；（２）ステロール、及び
（３）双性イオン脂質からなる群より選択できる。例え
ば、脂質成分は中性脂質と正味の負電荷をもつ両親媒性
脂質からなる。別の態様では、脂質にはさらにステロー
ルを含んでいてよい。さらに別の態様では、脂質にはさ
らにステロールとと双性イオン脂質の両方を含んでもよ
い。
双性イオン脂質の例としては、ホスファチジルコリ
ン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエ
リン、及びその組み合わせが挙げられる。中性脂質の例
としては、トリオレイン、トリカプリリンなどのトリグ
リセリド、ダイズ油などの植物油、ラード、牛脂、トロ
フェロール、スクワレン及びその組み合わせが挙られ
る。正味の負電荷をもつ両親媒性脂質の例としては、カ
ルジオリピン、ホスファチジルセリン、ホスファチジル
グリセロール、ホスファチジルイノシトール及びホスフ
ァチジン酸が挙げられる。正味の正電荷をもつ両親媒性
脂質の例としては、ジアシルトリメチルアンモニウムプ
ロパン、ジアシルジメチルアンモニウムプロパン及びス
テアリルアミンが挙げられる。
多小胞リポソーム中には封入によって各種の生物学的
活性物質を導入できる。これらの物質には、医薬、なら
びにDNA、RNA、各種の型のタンパク質、タンパク質ホル
モン、例えばインスリン、成長因子、サイトカイン、モ
ノカイン、リンホカイン、及び予防接種の免疫源として
作用するタンパク質や炭水化物などの医療材料を含む。
化粧用途に用いるのに有効な生物学的活性物質も多小
胞リポソーム中に封入によって導入できる。これには湿
潤剤、ビタミン、酵素及び香料を含む。さらに、除草
剤、殺虫剤、殺菌剤などは多小胞リポソーム中に封入で
きる農業用途をもつ生物学的活性物質の例である。
表１は、本発明の多小胞リポソーム中に封入できる生
物学的活性物質の代表的クラスを含む。
本発明の多小胞リポソーム中の生物学的活性物質のヒ
トにおけるin vivo使用のための適当な投与量範囲は、
0.001−6000mg/m2体表面積を含む。上記の範囲外の投与
量を与えてもよいが、この範囲は実質的に全ての生物学
的活性物質に使用できる広さを包含する。しかしなが
ら、特定の治療剤には上述したように好ましい濃度を容
易に確かめることができる。
多小胞リポソームはあらゆる所望の経路で投与するこ
とができ、例えば、腫瘍内、体節内（関節内）、筋肉
内、莢膜内、腹腔内、皮下、静脈内、リンパ内、経口及
び粘膜下で投与できる。多小胞リポソーム、器官又は細
胞標的特異性を与えるために、スペーサー分子又はペプ
チド、標的特異的リガンド、例えば抗体及びその他の受
容体特異的タンパク質リガンドなどを当業者に公知の方
法で直接又は間接に結合して修飾することができる（Ma
lone et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:6077,1989;Gr
egoriadis,Immunology Today,11（３）:89,1990;これら
を参照として包含する）。
以下の実施例は本発明を実施する方法を説明する。し
かしながら、実施例は説明のためのものであり、本発明
は実施例の特定の材料又は条件のいずれによっても限定
されるものではない。
実施例１ A.多小胞リポソームの製造 工程１）清浄なガラス円筒（内径2.5cmx高さ10.0cm）中
に、クロロホルム中にジオレオイルホスファチジルコリ
ン（Avanti Polar Lipids,Birmingham,AL）46.5μモ
ル、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（Avan
ti Polar Lipids,Birmingham,AL）10.5μモル、コレス
テロール（Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）75μモ
ル、トリオレイン（Avanti Polar Lipids,Birmingham,A
L）9.0μモルを含む溶液5mLを入れた。この溶液を脂質
成分と呼ぶ。
工程２）シタラビン（Upjohn,Kalamazoo,MI）又は硫酸
アミカシン（Bristol Myers Squibb,Syracuse,NY）を水
に溶解したいずれかの第１水性成分5mLを、脂質成分を
含む上記のガラス円筒中に加えた。シタラビンの場合、
濃度は41mM、82mM、164mM、246mM、369mM及び410mMを用
いた。硫酸アミカシンの場合、濃度は13mM、26mM、52mM
及び88mMを用いた。硫酸アミカシンはアミカシン１分子
当たり1.8硫酸イオンを含む。従って、濃度を2.8倍とす
ると浸透圧が得られる。
工程３）油中水型エマルジョンを作るために、工程２の
混合物をホモジェナイザー（AutoHomoMixer,Model M.To
kushu Kika,Osaka,Japan）で9000rpmの速度で８分撹拌
した。
工程４）水中に懸濁したクロロホルム小球を作るため
に、４％デキストロース及び40mMリシンを含む溶液20mL
を、油中水型エマルジョンの上に層としてのせ、4000rp
mの速度で60秒混合してクロロホルム小球を形成した。
工程５）多小胞リポソームを得るために、ガラス円筒中
のクロロホルム小球懸濁液を、水30mL、グルコース（3.
5g/100mL）及び遊離−塩基性リシン（40mM）を含む1000
mLのエーレンマイヤーフラスコ中に注いだ。フラスコ中
の懸濁液に窒素ガスを7L/分を通して、37℃で20分かけ
てゆっくりとクロロホクムを蒸発させた。生理食塩水
（0.9％塩化ナトリウム）60mLをフラスコに加えた。次
に600xgで10分遠心することによりリポソームを分離
し、上清を捨てて、ペレットを生理食塩水50ml中に再懸
濁した。600xgで10分遠心することによりリポソームを
分離した。上清を捨てて、ペレットを食塩水中に再懸濁
した。
B.多小胞リポソームの平均直径の測定 上述したようにして製造した多小胞リポソームの平均
直径を、Horida,Inc.（Irvine,CA）から販売されている
モデルLA−500粒子サイズ分析計を用いるレーザー光回
折法によって測定した。得られるリポソームの平均直径
は５〜20μｍの範囲であった。
C.シタラビンの血漿放出アッセイ この実施例では、37℃でヒト細胞質中におけるシタラ
ビン及びアミカシンの放出速度が、第１水性成分中の医
薬濃度の増加につれて低下することを示す。
シタラビンを含む多小胞リポソーム懸濁液500μＬ
を、Ｏ型のスクリーニングしたヒト血漿1.2mLに加え
た。混合物を37℃でインキュベートした。所望の間隔で
少量を取り出し、600xgで遠心して多少胞リポソームを
ペレットとして分離し、ペレットをイソプロピルアルコ
ール中に溶解し、ペレット分画中のシタラビンの量を高
圧液体クロマトグラフィー（例えば、U.S.Pharmacopei
a,XXII,p.376,1990）によってアッセイした。
D.アミカシンの血漿放出アッセイ アミカシンを含む多小胞リポソーム懸濁液500μＬ
を、Ｏ型のスクリーニングしたヒト血漿1.2mLに加え
た。混合物を37℃でインキュベートし、所望の間隔で少
量を取り出した。600xgで遠心して多小胞リポソームを
ペレットとして分離した。ペレットをイソプロピルアル
コール中に溶解し、ペレット分画中のアミカシンの量を
ポリスチレンビーズを用いる蛍光免疫アッセイによって
アッセイした（Varma−Nelson et al.,Therapeutic Dru
g monitoring,13:260−262,1991）。保持されたアミカ
シンの割合を、この方法で得られた量から計算した。
表２に示すように、種々の当初濃度又は浸透圧で第１
水性成分中に用いた全薬剤の％として表す封入率は、半
減期として示すヒト血漿中への多小胞リポソームからの
放出速度に顕著な影響を及ぼした。薬剤放出の半減期は
単純な指数関数減衰モデルを推定して計算した。表２の
データは３つの実験の平均及び標準偏差を示す。シタラ
ビンのヒト血漿への放出の半減期は、等張条件と比較し
ての高張条件下で本質的に変化しなかった。このデータ
はまた、製造中の多小胞リポソーム中に封入される生物
学的活性物質の濃度（mOsmとして示す）を約246mOsmま
で増加すると、シタラビン及びアミカシンの半減期値が
増加することを示す。多重小胞性小胞内に封入される第
１水性成分の浸透圧を増加すると、予期せぬことに、ヒ
ト血漿に長期間わたって薬剤を徐放するのに増強された
用途をもつリポソームを製造することができた。
実施例２ 本実施例は、血漿中でのシタラビンの放出速度が、生
物学的活性物質の濃度を固定した場合に、第１水性成分
の浸透圧が増加するにつれ低下することを示す。多小胞
リポソームは実施例１の工程１から工程５で記載したよ
うにして製造したが、工程２は以下のように改変した。
工程２）水、又は３重量％グルコース、又は５重量％グ
ルコースのいずれかに82mM濃度で溶解した第１水性成分
であるシタラビン（Upjohn,Kalamazoo,MI）5mLを、脂質
成分を含む上記のガラス円筒中に加えた。得られる溶液
の計算した浸透圧は、それぞれ82、220及び335mOsmであ
る。種々のグルコース濃度におけるヒト血漿中、37℃で
インキュベーションした後の多小胞リポソーム中に保持
されるシタラビンの％を、インキュベーション時間の関
数として測定した。表３は、０、３及び５重量％グルコ
ースを含む組成物について、平均直径、シタラビンの封
入率、及び37℃におけるヒト血漿への放出の半減期を示
す。各場合につき３回の実験の平均及び標準偏差を示
す。生物学的活性物質を固定濃度に維持しておいて、浸
透圧スペーサーであるグルコースを種々の濃度で導入す
ると、ヒト血漿中でインキュベートした多小胞リポソー
ムからの放出速度に顕著な影響を与えた。表３のデータ
が示すように、ヒト血漿への多小胞リポソームからのシ
タラビンの放出半減期は、第１水性成分の浸透圧が増加
するにつれ増加する。約248mOsmまでは第１水性成分の
浸透圧の増加につれ封入率も増加する。
実施例３ この実施例では、生理食塩水溶液を第２水性成分とし
て用いて多小胞リポソームが製造できることを示す。多
小胞リポソームは以下のようにして製造した。
工程１）清浄なガラス円筒（内径2.5cmx高さ10.0cm）中
に、クロロホルム中にジオレオイルホスファチジルコリ
ン（Avaniti Polar Lipids,Birmingham,AL）46.5μモ
ル、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（Avan
ti Polar Lipids,Birmingham,AL）10.5μモル、コレス
テロール（Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）75μモ
ル、トリオレイン（Avanti Polar Lipids,Birmingham,A
L）9.0μモルを含む溶液5mLを入れた。この溶液を標準
脂質成分と呼ぶ。
工程２）シタラビン（Upjohn,kalamazoo,MI）を水に246
mMの濃度で溶解した第１水性成分5mLを、標準脂質成分
を含む上記のガラス円筒中に加えた。
工程３）油中水型エマルジョンを作るために、ホモジェ
ナイザー（AotoHomoMixer,Model M,Tokushu Kika,Osak
a,Japan）を用いて9000rpmの速度で８分混合した。
工程４）水中に懸濁したクロロホルム小球を作るため
に、生理食塩水（0.9％塩化ナトリウム）20mLを、油中
水型エマルジョンの上に層としてのせ、4000rpmの速度
で60秒混合してクロロホルム小球を形成した。これによ
って水中油中水の二重エマルジョンが構成される。
工程５）ガラス円筒中のクロロホルム小球懸濁液を、生
理食塩水（0.9％塩化ナトリウム）30mLを含む100mLのエ
ーレンマイヤーフラスコ中に注いだ。フラスコ中の懸濁
液に窒素ガスを7L/分を通して、37℃で20分かけてゆっ
くりとクロロホルムを蒸発させた。50μｍのフィルター
を通してリポソームを濾過した。600xgで10分遠心する
ことにより懸濁液からリポソームを分離した。上清を捨
てて、ペレットを食塩水中に再懸濁した。
水中の246mMシタラビン溶液、及び第２水性成分とし
て生理食塩水を用いて製造される多小胞リポソームから
のシタラビンの放出の半減期は、15.7±4.8日であっ
た。この値は、水中の246mOsmシタラビン溶液、及び第
２水性成分としてグルコース−リシン溶液を用いて製造
される多小胞リポソームからの放出の半減期と同様であ
った（14.1±1.5日、表２参照）。
実施例４ 本発明の多小胞リポソームのin vivoでの徐放性を試
験するために薬動力学的研究をマウスで行った。
実施例１に記載するようにして多小胞リポソームを製
造した。第１水性成分として82mM又は246mM濃度の水中
シタラビン溶液を用いた。得られた多小胞リポソームを
生理食塩水で２回洗浄し、600xgで10分遠心し、生理食
塩水中に懸濁液1mL当たり10mgシタラビン濃度で保存し
た。
2.55±0.25mgシタラビンを含む多小胞リポソームをマ
ウス（CD1ICR、累系交配、雌）に腹腔内注射した。注射
前に、注射しようとするシタラビンと同じ量を含む多小
胞リポソームの懸濁液の少量をゼロ時サンプルとして取
り出した。
注射の108時間後までの種々の時点で、マウスを頚部
脱きゅうによって殺した。生理食塩水200μＬを含む試
験管中に、未希釈腹腔液20μＬを腹腔から回収した。試
験管をEppendorf Microfuge（Brinkman Instruments,We
stbury,NY）中で、最大速度で１分遠心した。上清とペ
レットを分離した。上述のようにした腹腔液20μＬを回
収した後、腹腔を２〜3mlの0.9％NaCl溶液で入念に洗浄
した。全てのサンプルを分析まで−20℃に保存した。
ペレットと上清分画、及び洗浄分画をイソプロピルア
ルコールで可溶化した。可溶化分画中のシタラビンの量
を高圧液体クロマトグラフィーでアッセイした（U.S.Ph
armacopeia,XXII:376,1990参照）。ペレット分画中のシ
タラビン濃度（μg/mL）を表４に示す。同じく表４に示
す腹腔中にあるシタラビンの全量（μｇ）は、未希釈腹
腔液サンプル20μＬのペレット及び上清分画中の量、及
び腹腔洗浄分画中の量を加えて得られた。
薬動力学的データ、すなわちペレット及び上清分画
中、ならびに全量中のシタラビン濃度の時間依存的減少
を、シングルコパートメントモデル及び重みゼロを用い
るRSTRIPプログラム（MicroMath Scientific Software,
Salt Lake City,Utah）で分析した。減衰半減期を表４
に示す。
表４に示すデータの82mM（初期シタラビン濃度）製剤
と、246mM（初期シタラビン濃度）製剤とを比較する
と、246mM製剤よりも82mM製剤の方がシタラビンの全量
が迅速に減少していた。ペレット分画中の濃度も246mM
製剤よりも82mM製剤の方が迅速に減少する。従って、こ
の研究では、生理学的関連環境、すなわち実施例１で示
すようなヒト血漿においてのみなく、in vivoにおいて
も、シタラビン放出速度は、第１水性成分の浸透圧が増
加するにつれて低下することを示す。
表 82mM又は246mMシタラビンのいずれかを含む溶液を用
いて製造した製剤の腹腔内注射後の種々の時点におけ
る、腹腔液のペレット分画中のシタラビン濃度、及び腹
腔内のシタラビンの全量。３つのグループサイズを使用
した。
本発明の現時点における好ましい態様を開示目的のた
めに記載したが、付属の請求の範囲で定義される本発明
の精神の範囲内で変更が可能である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平１−125318（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−201815（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−1404（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−48614（ＪＰ，Ａ) Ａｒｃｈ Ｏｏｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖ ｏｌ105，1987，ｐｐ400〜403 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 9/00 - 9/72 A61K 47/00 - 47/48

Claims (40)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】以下の工程を含む多小胞リポソームの製造
    方法： （ａ）少なくとも１つの有機溶媒、少なくとも１つの両
    親媒性脂質及び中性脂質を含む脂質成分と、少なくとも
    １つの生物学的活性物質を含む第１水性成分との２つの
    非混和性成分から油中水型エマルジョンを形成し； （ｂ）前記油中水エマルジョン型を第２水性成分中に分
    散させて溶媒小球を形成し； （ｃ）前記溶媒小球から有機溶媒を除去して多小胞リポ
    ソームを形成し； ここで、第１水性成分の浸透圧は、多小胞リポソームか
    ら生理学的に関連のある水性環境への放出速度を調節す
    るように選択される、前記製造方法。
  2. 【請求項２】両親媒性脂質が正味の負電荷をもつ両親媒
    性脂質である請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】両親媒性脂質がカルジオリピン、ホスファ
    チジルセリン、ホスファチジルグリロール、ホスファチ
    ジルイノシトール及びホスファチジン酸からなる群より
    選択される請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】脂質成分がステロールをさらに含む請求項
    ２記載の方法。
  5. 【請求項５】脂質成分が双性イオン脂質をさらに含む請
    求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】両親媒性脂質が双性イオン脂質である請求
    項１記載の方法。
  7. 【請求項７】双性イオン脂質がホスファチジルコリン、
    ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン
    及びリソホスファチジルコリンからなる群より選択され
    る請求項５記載の方法。
  8. 【請求項８】両親媒性脂質が正味の正電荷をもつ請求項
    １記載の方法。
  9. 【請求項９】両親媒性脂質がジアシルトリメチルアンモ
    ニウムプロパン、ジアシルジメチルアンモニウムプロパ
    ン及びステアリルアミンからなる群より選択される請求
    項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】第１水性成分が、第１水性成分の浸透圧
    を増加するための浸透圧スペーサーをさらに含む請求項
    １、２、４、６又は８記載の方法。
  11. 【請求項１１】脂質成分がリン脂質及びリン脂質混合物
    からなる群より選択される請求項１、２、４、６又は８
    記載の方法。
  12. 【請求項１２】生理学的に関連のある水性環境が貯蔵媒
    体である請求項１又は６記載の方法。
  13. 【請求項１３】生理学的に関連のある水性環境が、生理
    食塩水、緩衝塩溶液、ヒト血漿、血清、脳脊髄液、皮下
    液、滑膜液、眼内液、腹腔内液、筋肉内液、又はその組
    み合わせを含むがこれに限定されない群より選択される
    請求項１又は６記載の方法。
  14. 【請求項１４】少なくとも１つの両親媒性脂質が正味の
    負電荷をもつ請求項１記載の方法。
  15. 【請求項１５】両親媒性脂質をコレステロールとの混合
    物として提供する請求項１記載の方法。
  16. 【請求項１６】親油性の生物学的活性物質を脂質成分と
    の混合物として提供する請求項１記載の方法。
  17. 【請求項１７】中性脂質がトリオレイン、トリカプリリ
    ン、ダイズ油、ラード、牛脂、トコフェロール、スクワ
    レン及びその組み合わせからなる群より選択される請求
    項11記載の方法。
  18. 【請求項１８】有機溶媒がエーテル、炭化水素、ハロゲ
    ン化炭化水素、ハロゲン化エーテル、エステル、CO2、N
    H3、フレオン及びその組み合わせからなる群より選択さ
    れる請求項１記載の方法。
  19. 【請求項１９】生物学的活性物質が親水性である請求項
    １記載の方法。
  20. 【請求項２０】前記２つの成分の乳化を機械的撹拌、超
    音波エネルギー及びノズル霧状化からなる群より選択さ
    れる方法を用いて行う請求項１記載の方法。
  21. 【請求項２１】小胞内の水性隔室の平均サイズ及び数
    を、選択した乳化方法の時間及び持続によって決定する
    請求項20記載の方法。
  22. 【請求項２２】第１水性成分が実質的に水と生物学的活
    性物質とからなる請求項１記載の方法。
  23. 【請求項２３】第２水性成分が遊離−塩基性リシン、遊
    離−塩基性グリシン及び遊離−塩基性ヒスチジン及びそ
    の組み合わせからなる群より選択される物質と；グルコ
    ース、スクロース、トレハロース、コハク酸塩、シクロ
    デキストリン、アルギニン、ガラクトース、マンノー
    ス、マルトース、マンニトール、グリシン、リシン、ク
    エン酸塩、ソルビトール、デキストラン、塩化ナトリウ
    ム及びその組み合わせからなる群より選択される物質と
    を含む請求項１記載の方法。
  24. 【請求項２４】第２水性成分が単糖、二糖、多糖及びそ
    の他のポリマーからなる群より選択される物質を含む請
    求項１記載の方法。
  25. 【請求項２５】有機溶媒の除去を、スパージング、蒸
    発、溶媒小球上へのガス通気、スプレードライ及びその
    組み合わせからなる群より選択される溶媒除去システム
    によって行う請求項１記載の方法。
  26. 【請求項２６】生物学的活性物質が抗アンギナ剤、抗生
    物質、抗ヒスタミン剤、抗新生物剤、モノクローナル抗
    体、放射線核種、トランキライザー、抗不整脈剤、抗糖
    尿病剤、抗高血圧剤、抗ウイルス剤、ホルモン、神経伝
    達物質、抗喘息剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤、グリコシド
    心臓剤、免疫調節剤、核酸及び類似体、放射線造影剤、
    ステロイド、血圧上昇剤、ワクチン、鎮静剤及び鎮痛薬
    並びにその組み合わせからなる治療カテゴリーから選択
    される請求項１又は６記載の方法。
  27. 【請求項２７】生物学的活性物質がシタラビンである請
    求項１又は６記載の方法。
  28. 【請求項２８】生物学的活性物質がアミカシンである請
    求項１又は６記載の方法。
  29. 【請求項２９】生物学的活性物質が治療的タンパク質及
    びペプチドからなる群より選択される請求項１又は６記
    載の方法。
  30. 【請求項３０】生物学的活性物質が除草剤、殺虫剤、殺
    菌剤、殺昆虫剤及びその組み合わせからなる群より選択
    される請求項１又は６記載の方法。
  31. 【請求項３１】生物学的活性物質が核酸からなる群より
    選択される請求項１又は６記載の方法。
  32. 【請求項３２】生物学的活性物質が化粧品、香料、湿潤
    剤及びその組み合わせからなる群より選択される請求項
    １又は６記載の方法。
  33. 【請求項３３】持続した放出のために塩酸塩または酸の
    不在下に内部に封入された生物学的活性物質を含む第１
    水性成分をもつ多小胞リポソームであって、前記多小胞
    リポソームは生理学的に関連のある水性環境中にあり、
    また第１水性成分の浸透圧の増加が前記リポソームから
    の生物学的活性物質の放出速度の低下をもたらし、第１
    水性成分の浸透圧の減少が前記生物学的活性物質の放出
    速度の上昇をもたらすことを特徴とする、前記多小胞リ
    ポソーム。
  34. 【請求項３４】第１水性成分が所望の浸透圧を得るため
    に十分な生物学的活性物質を含む請求項33記載の多小胞
    リポソーム。
  35. 【請求項３５】第１水性成分が所望の浸透圧を得るため
    に十分な浸透圧スペーサーをさらに含む請求項34記載の
    多小胞リポソーム。
  36. 【請求項３６】結合された標的特異的リガンド又は親水
    性コーティングをもつ請求項33記載の多小胞リポソー
    ム。
  37. 【請求項３７】請求項33〜36のいずれか１項に記載の多
    小胞リポソームを含む医薬組成物。
  38. 【請求項３８】請求項１〜29および31のいずれか１項に
    記載の方法によって製造される多小胞リポソームを含む
    医薬組成物。
  39. 【請求項３９】生理学的に関連のある水性環境中への多
    小胞リポソームからの活性薬剤の放出速度を制御する方
    法であって、リポソームからの活性薬剤の放出速度を低
    下させるために第１水性成分の浸透圧を調節することを
    含み、浸透圧の増加は放出速度の低下をもたらす前記方
    法。
  40. 【請求項４０】第１水性成分の浸透圧を変更するために
    第１水性成分中に浸透圧スペーサーを導入する請求項39
    記載の方法。
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