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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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1. Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Herstellung
und Verwendung von multivesikularen Liposomen, die eine eingekapselte
Substanz mit einer kontrollierbaren (steuerbaren) Geschwindigkeit (Rate)
freisetzen.
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2. Beschreibung des verwandten
Standes der Technik
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Eine
optimale Behandlung mit vielen Arzneimitteln macht es häufig erforderlich,
dass der Arzneimittel-Gehalt (-Konzentration) über eine längere Zeitspanne hinweg konstant
gehalten (aufrechterhalten) wird. Beispielsweise macht es eine optimale
Antikrebs-Behandlung mit Zellzyklen-spezifischen Antimetaboliten
erforderlich, einen zytotoxischen Arzneimittel-Gehalt ( -Konzentration) über einen
längeren
Zeitraum hinweg konstant zu halten (aufrechtzuerhalten). Cytosin-arabinosit
(hier als "Cytarabin") bezeichnet, ist
ein von einem Verabreichungsprogramm bzw. -zeitplan stark abhängiges Antikrebs-Arzneimittel.
Da dieses Arzneimittel Zellen nur abtötet, wenn sie DNA synthetisieren,
ist eine längere
Einwirkung des Arzneimittels in einer therapeutischen Konzentration
für eine
optimale Zellenabtötung
erforderlich. Die therapeutische Wirksamkeit dieser Arzneimittel
wird häufig
weiter kompliziert durch den Umstand, dass die Halbwertszeit nach
einer intravenösen oder
subkutanen Verabreichungsdosis nur einige wenige Stunden betragen
kann. Um eine optimale Krebszellen-Abtötung mit einem Zellenzyklusphasen-spezifischen
Arzneimittel wie Cytarabin zu erzielen, müssen zwei Hauptforderungen
erfüllt
sein: erstens muss die Krebszelle einer hohen Konzentration des
Arzneimittels ausgesetzt werden, ohne den Wirt (Patienten) irreversibel
signifikant zu schädigen;
und zweitens muss der Tumor dem Arzneimittel über einen längeren Zeitraum hinweg ausgesetzt
werden, um die Anzahl der Krebszellen, zu maximieren, die in dem
zur DNA-Synthese fähigen
Zyklus der Zellenvermehrung vorliegen.
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Ein
Beispiel für
eine andere Klasse von Arzneimitteln, die von dem Verabreichungsprogramm
abhängen,
ist die Aminoglycosid-Klasse der Antibiotika. Beispielsweise ist
Amikacin ein Aminoglycosid-Antibiotikum, das eine klinisch signifikante
Aktivität
gegenüber
Stämmen
sowohl von Gramnegativen als auch von Gram-positiven Bakterien aufweist.
Unter den heute gängigen
therapeutischen Behandlungsverfahren wird das Arzneimittel normalerweise
auf intravenösem
oder intramuskulärem
Wege einmal oder zweimal am Tag verabreicht. Die gebräuchlichste
angewendete klinische Dosis beträgt
15 mg/kg/Tag, die einer empfohlenen maximalen täglichen Dosis von 1 g pro Tag
entspricht. Dieses Verfahren führt
jedoch dazu, dass die Patienten dem Arzneimittel systemisch chemisch
ausgesetzt sind, und dass in Abhängigkeit
von dem Arzneimittel die Gefahr von toxischen Nebenwirkungen steigt.
Infolgedessen wäre
ein lokales Depot mit langsamer Freisetzung des Präparats für die Behandlung
von Infektionen, wie z.B. solchen, die auf einen lokalen Bereich
von weichem Gewebe oder Knochengewebe begrenzt sind, vorteilhaft
in Bezug auf die Erhöhung
der lokalen Gewebe-Konzentration des Arzneimittels im Vergleich
zu therapeutischen systemischen Dosen, während gleichzeitig die systemische
Toxizität
des freien Arzneimittels vermindert oder vermieden wird.
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Besonders
vorteilhaft wären
Präparate
mit einer kontrollierten Freisetzung, die zur Abgabe von therapeutischen
Konzentrationen des Arzneimittels über Zeiträume hinweg verwendet werden
können,
die in dem Bereich von Stunden, Tagen oder sogar Wochen liegen.
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Eine
Methode, die bereits angewendet wird, um eine kontrollierte Freisetzung
von Zusammensetzungen für
die Arzneimittelzufuhr zu erzielen, ist die Einkapselung in einem
Liposom. Unter den Haupttypen von Liposomen sind multivesikulare
Liposome (Kim et al., "Biochim.
Biophys. Acta";
728: 339–348,
1983), in neuartiger Weise verschieden von unilamellaren Liposomen
(Huang, "Biochemistry"; 8: 334–352, 1969;
Kim et al., "Biochim.
Biophys. Acta";
646: 1–10,
1981), multilamellaren Liposomen (Bangham et al., "J. Mol. Bio.", 13: 238–252, 1965)
und stabilen plurilamellaren Liposomen (US-Patent Nr. 4 522 803).
Im Gegensatz zu unilamellaren Liposomen enthalten multivesikulare
Liposome mehrere wässrige
Kammern. Im Gegensatz zu multilamellaren Liposomen sind die multiplen
wässrigen
Kammern der multivesikularen Liposome nicht konzentrisch angeordnet.
Aus dem Stand der Technik ist eine Reihe von Methoden zur Herstellung
von verschiedenen Typen von unilarellaren und multilamellaren Liposomen
bekannt, beispielsweise aus den US-Patenten Nr. 4 522 803 (Lenk);
4 310 506 (Baldeschwieler); 4 235 871 (Papahadjopoulos); 4 224 179,
(Schneider); 4 078 052 (Papahadjopoulos); 4 394 372 (Taylor); 4
308 166 (Marchetti); 4 485 054 (Mezei) und 4 508 703 (Redziniak);
Szoka et al., 1980, "Ann.
Rev. Biophys. Bioeng.",
9: 465–508;
aus "Liposomes", Marc J. Ostro,
Ed., Marvel-Dekker, Inc., New York, 1983, Kapitel 1; Poznansky und
Juliano, "Pharmacol.
Rev.", 36: 277–236, 1984.
Aus dem Stand der Technik sind auch Verfahren zur Herstellung von
multivesikularen Liposomen bekannt (Kim et al., "Biochim. Biophys. Acta", 728: 339–348 (1983)).
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Bei
dem Verfahren von Kim et al. ("Biochim.
Biophys. Acta";
728: 339–348,
1983) ist der Einkapselungs-Wirkungsgrad einiger kleiner Moleküle, wie
z.B. von Cytosinarabinosid, auch bekannt unter der Bezeichnung "Cytarabin" oder Ara-C, verhältnismäßig niedrig
und die Freisetzungsrate der eingekapselten Moleküle in biologische
Flüssigkeiten
ist hoch. Infolgedessen wurde eine Zusammensetzung entwickelt, in
der das Hydrochlorid verwendet wird, um die Freisetzungsrate der
eingekapselten Moleküle
in biologische Flüssigkeiten bzw.
Fluids zu verlangsamen (US-continuation-in-part Patentanmeldung
Nr. 08/020 483, eingereicht am 21. Februar 1993 von Kim).
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Weitere
Forschungsarbeiten haben gezeigt, dass die Freisetzungsrate von
Substanzen aus multivesikularen Liposomen in Human-Plasma kontrolliert
bzw. gesteuert werden kann durch Variieren der Art der Säurelösung, in
der die Substanz vor der Bildung des multivesikularen Liposoms gelöst wird
(US-Patentanmeldung Nr.
08/153 657, eingereicht am 16. November 1993 von Sankaram und Kim,
oder EP-A-0 280 503). In diesen Studien ergaben bestimmte Mineralsäuren, wie
z.B. Chlorwasserstoffsäure,
Salpetersäure
und Perchlorsäure, die
niedrigsten Freisetzungsraten, während
andere Säuren,
wie z.B. Essigsäure,
Trifluoressigsäure
und Trichloressigsäure,
mittlere Freisetzungsraten ergaben. Die höchsten Freisetzungsraten wurden
erhalten bei Verwendung von Säuren
mit zwei und drei Protonen, wie z. B. Schwefelsäure und Phosphorsäure. Die
Zusammensetzung der nach diesem Verfahren hergestellten Liposome
hat den Nachteil, dass die Verwendung einer Säure erforderlich ist zur Herstellung
eines multivesikularen Liposoms mit der gewünschten Arzneimittel-Freisetzungskinetik.
Außerdem
können
bei einigen der Säuren,
die wünschenswerte
Arzneimittel-Freisetzungsraten aus multivessikularen Liposomen ergeben,
pharmazeutische Verfahrensprobleme auftreten, wie z.B. eine Korrosion
der Metallbehälter
und der Teile, die bei der Herstellung verwendet werden. Auch könnten potentielle Probleme
in Bezug auf die Stabilität
von Säure-labilen
Substanzen vermieden werden, wenn multivesikulare Liposome, die
in der Praxis in einer in vivo-Umgebung vorliegen, ohne Verwendung
einer Säure
hergestellt werden könnten.
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Studien
haben gezeigt, dass die Rate (Geschwindigkeit) der Freisetzung einer
eingekapselten biologischen Substanz aus Liposomen in eine wässrige Umgebung
moduliert werden kann durch Erzeugung eines Membran-Potentials durch
Einführen
von Protonophoren oder Ionophoren in Liposome (US-Patent Nr. 5 077 056).
Außerdem
ist ein Verfahren zur Kontrolle (Steuerung) der Freisetzungsrate
von Arzneimitteln aus Vesikel-Zusammensetzungen
in der Europäischen
Patentanmeldung
EP 0 126 580 beschrieben.
Bei dem zuletzt genannten Verfahren wird eine Zusammensetzung verwendet,
die umfasst eine Lösung
eines therapeutischen Agens, das in Vesikula eingekapselt ist, die
in einer Lösung
suspendiert sind, die eine ausreichende Menge des gelösten Materials
enthält,
um eine bestimmte Osmolarität
zu ergeben. Diese Osmolarität
ist mindestens im Wesentlichen isotonisch mit der Osmolarität der Lösung innerhalb
der Vesikula, die ihrerseits eine höhere Osmolarität aufweisen
als eine physiologische Salzlösung.
Die Osmolarität
der Lösung
innerhalb der Vesikula wurde konstant gehalten, während die
Osmolarität
der Lösung,
in der die Vesikula suspendiert waren, variiert wurde. Unter diesen
Bedingungen nahm die Freisetzungsrate bzw. -geschwindigkeit ab,
wenn das Suspensionsmedium sich einem isotonischen Wert oder sogar
einem hypertonischen Wert, verglichen mit der Lösung innerhalb der Vesikula,
näherte.
Ein Nachteil dieses Verfahrens besteht jedoch darin, dass die Osmolarität des Mediums,
in welches das therapeutische Agens freigesetzt wird, variiert werden
muss, um die Freisetzungsrate zu kontrollieren (zu steuern). Als
Folge davon unterliegen diese Zusammensetzungen strengen Beschränkungen
in Bezug auf ihre praktische Verwendung, beispielsweise bei pharmazeutischen
Anwendungen, da die Osmolarität
der biologischen Flüssigkeit
(Fluid) an der Stelle der Verabreichung des Arzneimittelzuführungssystems
in der Regel festgelegt ist und nicht variiert werden kann. So sind
beispielsweise biologische Flüssigkeiten
(Fluids), wie z.B. Plasma, annähernd
isotonisch in Bezug auf eine normale Salzlösung (0,9 Gew.-% NaCl in Wasser),
die eine Osmolarität
von 310 mOsm aufweist. Die Osmolarität des Suspensionsmediums sollte
daher im Idealfalle nahe bei 310 mOsm liegen.
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Im
Hinblick auf die empfundenen (festgestellten) Beschränkungen
für bereits
existierende Liposom-Zusammensetzungen und -Herstellungsverfahren
besteht ein Bedarf für
Methoden, die nicht auf der Verwendung von Säuren für die Herstellung von stabilen
multivesikularen Liposomen beruhen. Dieser Bedarf wird durch die
vorliegende Erfindung befriedigt.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Gemäß einem
ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur
Steuerung (Kontrolle) der Freisetzung von biologisch aktiven Substanzen
aus multivesikularen Liposomen das die Stufen umfasst:
- (a) Herstellung einer Wasser-in-Öl-Emulsion aus zwei nicht miteinander
mischbaren Komponenten, einer Lipid-Komponente, die mindestens ein
organisches Lösungsmittel,
mindestens ein amphipathisches Lipid und ein neutrales Lipid umfasst,
und einer ersten wässrigen
Komponente, die mindestens eine biologisch aktive Substanz umfasst;
- (b) Dispergieren der Wasser-in-Öl-Emulsion in einer zweiten
wässrigen
Komponente zur Bildung von Lösungsmittel-Kügelchen;
und
- (c) Entfernen des organischen Lösungsmittels aus den Lösungsmittel-Kügelchen zur Bildung von multivesikularen
Liposomen;
wobei die Osmolarität der ersten wässrigen
Komponente so gewählt
wird, dass die Geschwindigkeit (Rate) der Freisetzung aus den multivesikularen
Liposomen in eine physiologisch relevante wässrige Umgebung so moduliert
wird, dass dann, wenn die Osmolarität der ersten wässrigen
Komponente erhöht
wird, die Geschwindigkeit (Rate) der Freisetzung abnimmt oder, umgekehrt,
die Geschwindigkeit (Rate) der Freisetzung erhöht wird durch Herabsetzung
der Osmolarität.
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Das
amphipathische Lipid kann eine amphipathische Flüssigkeit mit einer negativen
Gesamtladung sein. Das amphipathische Lipid kann ausgewählt werden
aus der Gruppe, die besteht aus Cardiolipinen, Phosphatidylserinen,
Phosphatidylglycerinen, Phosphatidylinositen und Phosphatidsäuren. Die Lipid-Komponente kann
außerdem
ein Sterin umfassen und bei dieser Ausführungsform kann die Lipid-Komponente
ferner ein zwitterionisches Lipid umfassen. Das zwitterionisches
Lipid kann ausgewählt
werden aus der Gruppe, die besteht aus Phosphatidylcholinen, Phosphatidylethanolaminen,
Sphingomyelinen und Lysophosphatidylcholinen.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
des Verfahrens gemäß dem ersten
Aspekt der Erfindung kann das amphipathische Lipid ein zwitterionisches
Lipid sein. Das amphipathische Lipid kann eine positive Gesamtladung
aufweisen. Das amphipathische Lipid kann ausgewählt werden aus der Gruppe,
die besteht aus Diacyl-trimethylammonium-propanen, Diacyl-dimethylammonium-propanen und Stearylamin.
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Bei
dem Verfahren gemäß dem ersten
Aspekt der vorliegenden Erfindung kann die erste wässrige Komponente
außerdem
einen osmotischen Abstandhalter umfassen, um die Osmolarität der ersten
wässrigen Komponente
zu erhöhen.
Die Lipid-Komponente kann ausgewählt
werden aus der Gruppe, die besteht aus einem Phospholipid und einer
Mischung von Phospholipiden.
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Die
physiologisch relevante wässrige
Umgebung kann ein Speicher- bzw. Vorratsmedium bzw. Lagermedium
sein. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen kann die physiologisch
relevante wässrige Umgebung
ausgewählt
werden aus der Gruppe, die umfasst, ohne dass die Erfindung darauf
beschränkt
ist, eine normale Salzlösung,
eine gepufferte Salzlösung,
ein Human-Plasma, ein Serum, eine Cerebrospinal-Flüssigkeit,
eine subkutane Flüssigkeit,
eine Synovial-Flüssigkeit,
eine intraokulare Flüssigkeit,
eine intraperitoneale Flüssigkeit,
ein intramuskuläre
Flüssigkeit
oder Kombinationen davon.
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Bei
einigen bevorzugten Ausführungsformen
des Verfahrens gemäß dem ersten
Aspekt der vorliegenden Erfindung kann mindestens eines der amphipathischen
Lipide eine negative Gesamtladung aufweisen. Das amphipathische
Lipid kann im Gemisch mit Cholesterin eingesetzt werden. Ein lipophiles,
biologisch aktives Material kann im Gemisch mit der Lipid-Komponente verwendet
werden. Das neutrale Lipid kann ausgewählt werden aus der Gruppe,
die besteht aus Triolein, Tricaprylin, Sojabohnenöl, Schweineschmalz,
Rindertalg, Tocopherol, Squalen und Kombinationen davon. Das organische
Lösungsmittel
kann ausgewählt
werden aus der Gruppe, die besteht aus Ethern, Kohlenwasserstoffen,
halogenierten Kohlenwasserstoffen, halogenierten Ethern, Estern,
CO2, NH3, Freonen
und Kombinationen davon. Das biologisch aktive Material kann hydrophil
sein.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
des Verfahrens gemäß dem ersten
Aspekt der vorliegenden Erfindung kann das Emulgieren der genannten
beiden Komponenten durchgeführt
werden unter Anwendung eines Verfahrens, das ausgewählt wird
aus der Gruppe, die besteht aus einem mechanischen Rühren, der
Zufuhr von Ultraschall-Energie und einer Düsenzerstäubung. Die durchschnittliche
Größe und Anzahl
der wässrigen
Kammern innerhalb der Vesikula kann bestimmt (festgelegt werden)
durch die Zeit und die Dauer des ausgewählten Emulgierverfahrens.
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Die
erste wässrige
Komponente kann im Wesentlichen bestehen aus Wasser und der biologisch
aktiven Substanz. Die zweite wässrige
Komponente kann Substanzen umfassen, die ausgewählt werden aus der Gruppe,
die besteht aus der freien Base Lysin, der freien Base Glycin und
der freien Base Histidin und eine Kombination davon; und Substanzen,
ausgewählt
aus der Gruppe, die besteht aus Glucose, Saccharose, Trehalose,
Succinat, Cyclodextrin, Arginin, Galactose, Mannose, Maltose, Mannit,
Glycin, Lysin, Citrat, Sorbit, Dextran, Natriumchlorid und Kombinationen
davon. Die zweite wässrige
Komponente kann alternativ Substanzen umfassen, die ausgewählt werden
aus der Gruppe, die besteht aus Monosacchariden, Disacchariden,
Polysacchariden und anderen Polymeren. Die Entfernung des organischen
Lösungsmittels
kann durchgeführt werden
mittels eines Lösungsmittel- Entfernungssystems,
ausgewählt
aus der Gruppe, die besteht aus einem Zerstäuben, einem Verdampfen, einem Überleiten
von Gas über
die Lösungsmittel-Kügelchen,
einem Sprühtrocknen
und Kombinationen davon.
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Die
biologisch aktive Substanz kann ausgewählt werden aus therapeutischen
bzw. Arzneimittel-Kategorien, die bestehen aus Antiangina-Mitteln,
Antibiotika, Antihistaminika, antineoplastischen Mitteln, monoklonalen
Antikörpern,
Radionucliden, Tranquilizern, Antiarrhythmika, Antidiabetika, antihypertensiven
Mitteln, antiviralen Mitteln, Hormonen, Neurotransmittern, Antiasthmatika,
Antifungi-Mitteln, Antiparasiten-Mitteln, Herzglycosiden, Immunmodulatoren,
Nucleinsäuren
und Analogen davon, Bestrahlungskontrastmitteln, Steroiden, Blutdruck-steigernden
Mitteln, Impfstoffen, Sedativa und Analgetika und Kombinationen
davon. Vorzugsweise kann die biologisch aktive Substanz Cytarabin
oder Amicazin sein.
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Alternativ
kann die biologisch aktive Substanz ausgewählt werden aus der Gruppe,
die besteht aus thermoplastischen Proteinen und Peptiden. Ferner
kann die biologisch aktive Substanz ausgewählt werden aus der Gruppe,
die besteht aus Herbiziden, Pestiziden, Fungiziden, Insektiziden
und Kombinationen davon. Die biologisch aktive Substanz kann außerdem ausgewählt werden
aus der Gruppe, die besteht aus Nukleinsäuren. Die biologisch aktive
Substanz kann ferner ausgewählt
werden aus der Gruppe, die besteht aus Kosmetika, Parfüms, Feuchthaltemitteln
und Kombinationen davon.
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Das
multivesikulare Liposom kann einen daran gebundenen Target-spezifischen
Liganden oder einen hydrophilen Überzug
aufweisen.
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Gemäß einem
zweiten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zur Kontrolle bzw. Steuerung der Geschwindigkeit (Rate) der Freisetzung
eines aktiven Agens aus einem multivesikularen Liposom in eine physiologisch
relevante wässrige
Umgebung, wobei das Verfahren umfasst die Einstellung der Osmolarität der ersten
wässrigen
Komponente, um auf diese Weise die Geschwindigkeit (Rate) der Freisetzung
des aktiven Agens aus dem Liposom zu verringern, wobei eine Erhöhung der
Osmolarität
zu einer Verminderung der Freisetzungsgeschwindigkeit bzw. -rate
führt.
Bei einem solchen Verfahren kann das biologisch kompatible gelöste Molekül in die
erste wässrige
Komponente eingeführt
werden, um ihre Osmolarität
zu erhöhen.
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Nach
der vorliegenden Erfindung, wie sie in den Patentansprüchen definiert
ist, erhält
man multivesikulare Liposome (MVLs) mit einer kontrollierten (gesteuerten)
Freisetzung einer biologisch aktiven Substanz. Die Geschwindigkeit
bzw. Rate der Freisetzung der biologisch aktiven Substanz in die
physiologische Umgebung, wie z.B. ein Human-Gewebe in vivo, wird
gesteuert (kontrolliert) durch Variieren der Osmolarität der ersten
wässrigen
Komponente, die innerhalb der Liposome eingekapselt wird. Auf diese
Weise liefern die erfindungsgemäßen MVLs,
wie sie in den Patentansprüchen
definiert sind, stark verbesserte Ergebnisse durch Bereitstellung
einer anhaltenden therapeutischen Freisetzung eines Arzneimittels,
wenn es an der gewünschten Stelle
in vivo eingeführt
wird. Überraschenderweise
nimmt die Geschwindigkeit bzw. -rate der Freisetzung ab, wenn die
Osmolarität
der ersten wässrigen
Komponente, die innerhalb der Liposome eingekapselt ist, ansteigt.
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Die
Osmolarität
der ersten wässrigen
Komponente kann erhöht
werden entweder durch Erhöhung
der Konzentration der biologisch aktiven Substanz oder durch Zugabe
eines osmotischen Abstandhalters.
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Die
vorliegende Erfindung, wie sie in den nachfolgenden Patentansprüchen definiert
ist, umfasst auch nicht-saure Verfahren zur Herstellung von multivesikularen
Liposomen mit kontrollierten Freisetzungs-Eigenschaften, die eine
anhaltende therapeutische Verwendung in vivo ermöglichen. Die in den Patentansprüchen definierten
erfindungsgemäßen multivesikularen
Liposome weisen einen hohen Einkapselungs-Wirkungsgrad auf, ergeben
eine kontrollierte Freisetzung der Geschwindigkeit bzw. Rate der
eingekapselten Substanz, weisen eine gut definierte reproduzierbare
Größenverteilung,
eine kugelförmige
Gestalt, eine leicht einstellbare durchschnittliche Teilchengröße und eine
einstellbare Innenkammer-Größe und Innenkammer-Anzahl
auf.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
zur Herstellung von multivesikularen Lipid-Vesikula oder multivesikularen Liposomen,
wie es in den Patentansprüchen
definiert ist, umfasst:
- a) die Auflösung einer
Lipid-Komponente, die mindestens ein amphipathisches Lipid und ein
neutrales Lipid umfasst, in einem oder mehreren organischen Lösungsmitteln,
- b) das Vermischen der Lipid-Komponente mit einer damit nicht
mischbaren ersten wässrigen
Komponente, die eine oder mehr biologisch aktive Substanzen enthält, die
eingekapselt werden soll(en),
- c) die Bildung einer Wasser-in-Öl-Emulsion aus den beiden nicht
miteinander mischbaren Komponenten,
- d) die Überführung und
das Eintauchen der Wasser-in-Öl-Emulsion
in eine zweite damit nicht mischbare wässrige Komponente, die Lösungsmittel-Kügelchen bildet, und
- e) die Entfernung der organischen Lösungsmittel beispielsweise
durch Verdampfen aus den Lösungsmittel-Kügelchen.
Das (die) amphipathische(n) Lipid(e) kann (können) ausgewählt werden
aus amphipathischen Lipiden mit einer negativen Gesamtladung; Sterinen
und zwitterionischen Lipiden. Die in vivo-Freisetzungsrate bzw.
-geschwindigkeit der eingekapselten Moleküle in biologische Flüssigkeiten
können
verringert werden entweder durch Erhöhung der Konzentration der
biologisch aktiven Substanz, durch Verwendung eines osmotischen
Abstandhalters oder durch kombinierte Verwendung einer erhöhten Konzentration
der Substanz und eines osmotischen Abstandhalters.
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BESCHREIBUNG BEVORZUGTER
AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Kontrolle bzw.
Steuerung der Freisetzung von biologisch aktiven Substanzen aus
vesikularen Liposom(MVL)-Zusammensetzungen, die eine kontrollierte bzw.
gesteuerte Freisetzung einer therapeutisch wirksamen Substanz in
biologischen Flüssigkeiten
bzw. Fluids erlauben. In diesen Zusammensetzungen wird die Osmolarität der eingekapselten
wässrigen
Phase auf eine neuartige Weise so eingestellt, dass eine anhaltende
Freisetzung der eingekapselten therapeutisch wirksamen Substanz
in Abwesenheit von Hydrochloriden oder Säuren erhalten wird. Durch Modifizieren
des erfindungsgemäßen Verfahrens
kann der Fachmann auf diesem Gebiet auf selektive Weise MVLs mit
einem breiten Bereich von Freisetzungsraten bzw. -geschwindigkeiten
für die
therapeutisch aktive Substanz herstellen.
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Der
hier verwendet Ausdruck "multivesikulare
Liposome" steht
für künstlich
hergestellte mikroskopische Lipid-Vesikula, die mehrere nicht-konzentrische
wässrige
Kammern umschließen.
Im Gegensatz dazu weisen die bisher beschriebenen Liposome, wie
z.B. unilamellare Liposome, eine einzige wässrige Kammer auf und multilamellare
und plurilamellare Liposome weisen mehrere konzentrische "Zwiebelschalen"-artige Membranen
auf, zwischen denen Hohlräume
vorliegen, die eine wässrige
Komponente enthalten.
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Der
hier verwendete Ausdruck "Lösungsmittel-Kügelchen" steht für ein mikroskopisches
kugelförmiges
Tröpfchen
aus einem organischen Lösungsmittel,
innerhalb dessen mehrere kleinere Tröpfchen aus der wässrigen
Komponente, welche das biologisch aktive Agens enthält, vorhanden
sind. Die Lösungsmittel-Kügelchen
sind darin suspendiert und vollständig eingetaucht in eine zweite
wässrige
Komponente.
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Der
hier verwendete Ausdruck "neutrales
Lipid" steht für Öle oder
Fette, die an sich nicht die Fähigkeit zur
Bildung von Vesikula haben und denen eine geladene oder hydrophile "Kopf"-Gruppe fehlt. Zu
Beispielen für
neutrale Lipide gehören,
ohne dass die Erfindung darauf beschränkt ist, Glycerinester, Glycolester,
Tocopherolester, Sterinester, die keine geladene oder hydrophile "Kopf"-Gruppe aufweisen,
und Alkane und Squalen.
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Der
hier verwendete Ausdruck "amphipathische
Lipide" steht für solche
Moleküle,
die eine hydrophile "Kopf"-Gruppe und eine
hydrophobe "Schwanz"-Gruppe aufweisen und die Fähigkeit
zur Membranbildung haben können.
Der hier verwendete Ausdruck "amphipathische
Lipide" umfasst
solche amphipathischen Lipide, die eine negative Gesamtladung und
eine positive Gesamtladung aufweisen, zwitterionische Lipide und
Sterine.
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Der
hier verwendete Ausdruck "zwitterionisches
Lipid" steht für ein amphipathisches
Lipid mit einer Gesamtladung, die an seinem isoelektrischen Punkt
Null beträgt.
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Der
hier verwendete Ausdruck "biologisch
aktiv" umfasst,
wenn er für
die Beschreibung von Substanzen verwendet wird, die in den Kammern
des multivesikularen Liposoms enthalten sind, solche Substanzen, die
eine biologische Aktivität
in der Form haben, wie sie in dem Vesikulum vorliegt, sowie Substanzen,
die nach der Freisetzung aus der Vesikel-Kammer aktiv werden (d.h.
die eine "ruhende" biologische Aktivität aufweisen),
wie z.B. ein Pro-Drug, das bei der Wechselwirkung mit einem Enzym
in einen aktiven Rest mit einer therapeutischen Wirksamkeit bzw.
Aktivität
umgewandelt wird.
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Außerdem gehören zu biologisch
aktiven Substanzen, die eingearbeitet werden können, solche Substanzen, die
indirekt wirken. Alternativ können
diese Substanzen als osmotischer Abstandhalter wirken, wie nachstehend
beschrieben. Beispielsweise können
verschiedene Exzipienten und Stabilisatoren vorhanden sein. Diese
Substanzen können
beispielsweise dienen zur Erhöhung
der Lagerbeständigkeit
oder biologischen Verfügbarkeit
eines speziellen Arzneimittels. Alternativ können viele Substanzen, die üblicherweise
als Exzipienten klassifiziert werden, tatsächlich eine direkte biologische
Aktivität
von sehr schwach bis zu hoch signifikant aufweisen. So kann beispielsweise
der übliche
Exzipient Mannit biologisch wirksam sein als Diuretikum und selbst
Wasser kann biologisch wirksam sein, um eine Dehydratation zu bewirken.
Zu diesen indirekt aktiven Substanzen gehören wässrige oder nicht-wässrige Lösungen,
Suspensionen und Emulsionen. Beispiele für nicht-wässrige Lösungen sind Propylenglycol,
Polyethylenglycol, pflanzliche Öle,
wie z.B. Olivenöl,
und injizierbare organische Ester, wie Ethyloleat. Zu wässrigen
Trägern
gehören
Wasser, alkoholisch-wässrige
Lösungen,
Emulsionen oder Suspensionen, z.B. eine Salzlösung (Kochsalzlösung) und
gepufferte Medien. Zu parenteralen Vehikula gehören eine Natriumchlorid-Lösung, einer
Ringer-Dextrose-Lösung,
eine Dextrose-Lösung und
eine Lactat-Ringer-Lösung.
Zu intravenösen
Vehikula gehören
flüssige
(fließfähige) und
Nährstoff-Ergänzungsmittel,
Elektrolyt-Ergänzungsmittel
(wie z.B. solche auf der Basis von Ringer-Dextrose) und dgl. Es
können
auch Konservierungsmittel und weitere (andere) Additive vorhanden
sein, wie z.B. antimikrobielle Agentien, Antioxidantien, Chelatbildner
und inerte Gase und dgl. (vgl. "Remingtons
Pharmaceutical Sciences",
16. Auflage, A. Oslo, Ed., Mack, Easton, PA. 1980). Der Fachmann
auf diesem Gebiet kann leicht feststellen und ermitteln verschiedene
Kombinationen von Verbindungen, die in den erfindungsgemäßen Vehikula verwendet
werden können,
ohne dass übermäßig viel
Experimente erforderlich sind.
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Die
Osmolarität
ist definiert als die Summe der molaren Konzentrationen der in einer
wässrigen
Lösung
vorhandenen gelösten
Stoffe. Wenn der gelöste
Stoff in einer dissoziierten, ionisierten oder aggregierten Form
vorliegt, ist die Osmolarität
definiert als die Summe der molaren Konzentrationen der dissoziierten,
ionisierten oder aggregierten Formen. Die gelösten Stoffe umfassen beispielsweise,
ohne dass die Erfindung darauf beschränkt ist, biologisch aktive
Agentien und osmotische Abstandhalter.
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Der
hier verwendete Ausdruck "osmotischer
Abstandhalter" steht
für ein
beliebiges biologisch kompatibles Molekül eines gelösten Stoffes in einer wässrigen
Lösung,
bei dem es sich nicht um die biologisch aktive Substanz handelt.
Sowohl die Elektrolyten als auch die Nicht-Elektrolyten fungieren
als osmotische Abstandhalter. Bei der Bestimmung, ob ein spezielles
Molekül
als osmotischer Abstandhalter fungiert, oder bei der Bestimmung
der Konzentration eines osmotischen Abstandhalters, der innerhalb
eines multivesikularen Liposoms eingekapselt ist, muss berücksichtigt
werden, ob unter den Bedingungen innerhalb des multivesikularen Liposoms
(beispielsweise dem pH-Wert) das Molekül vollständig oder teilweise ionisiert
ist und ob diese Ionen die Lipid-Membran durchdringen ("The Bimolecular Lipid
Bilayer Membrane",
K. Jain Mahendra, Reinhold van Nostrand Co., 1972, Seiten 470 pp.).
Für den
Fachmann auf diesem Gebiet ist klar, dass für die erfindungsgemäße Verwendung
der osmotische Abstandhalter so ausgewählt werden muss, dass Substanzen
vermieden werden, die sich als toxisch oder anderweitig schädlich für einen
Patienten, der unter Verwendung der erfindungsgemäßen MVL
therapeutisch behandelt wird, erweisen könnten. Der Fachmann auf diesem
Gebiet kann leicht die Eignung eines gegebenen osmotischen Abstandhalters
für die
erfindungsgemäße Verwendung
feststellen, ohne dass übermäßig viele
Versuche erforderlich sind.
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Der
hier verwendete Ausdruck "erste
wässrige
Komponente" steht
für die
wässrige
Phase, welche die biologisch aktive Substanz, gegebenenfalls in
Gegenwart eines osmotischen Abstandhalters, enthält, die in dem Verfahren zur
Herstellung von multivesikularen Liposomen verwendet wird.
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Der
hier verwendete Ausdruck "Osmolarität der ersten
wässrigen
Komponente" steht
für die
Osmolarität
der wässrigen
Komponente, welche die biologisch aktive Substanz enthält, die
in dem Verfahren zur Herstellung von multivesikularen Liposomen
verwendet wird.
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Der
hier verwendete Ausdruck "physiologisch
relevante wässrige
Umgebung" steht
für biologische Flüssigkeiten
bzw. Fluids, wie z.B. Plasma-, Serum-, cerebrospinale, intramuskuläre, subkutane,
peritoneale, intraokulare oder Synovial-Flüssigkeiten bzw. -Fluids und
für Lager-
bzw. Speichermedien, wie z.B. eine 0,9 gew.-%ige Kochsalzlösung oder
eine gepufferte Kochsalzlösung,
die gegenüber
der biologischen Flüssigkeiten
bzw. Fluids nahezu isotonisch sind.
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Die
Verfahren des Standes der Technik zur Kontrolle bzw. Steuerung der
Freisetzungsrate bzw. geschwindigkeit der eingekapselten biologischen
Substanz in die wässrige
Umgebung beruhen (1) auf der Art der Säurelösung innerhalb der Liposome
oder (2) auf einer Erhöhung
der Osmolarität
der äußeren wässrigen Umgebung,
in welche die Liposome eingeführt
werden, verglichen mit der Osmolarität der wässrigen Komponente innerhalb
der Liposome. Das logische Korollar des zuletzt genannten Verfahrens
besteht darin, dass die Freisetzungsrate der eingekapselten Substanz
ansteigen sollte, wenn die Osmolarität der ersten wässrigen Komponente
erhöht
wird bei gleichzeitiger Konstanthaltung der Osmolarität des wässrigen
Mediums, in welches die Liposome eingeführt werden sollen. Gemäß der vorliegenden
Erfindung wurde jedoch überraschend das
Gegenteil dieser Erwartung gemäß dem Stand
der Technik gefunden, nämlich
dass die Freisetzungsrate der eingekapselten Substanz tatsächlich abnimmt,
wenn die Osmolarität
der inneren wässrigen
Komponente innerhalb der MVLs zunimmt, selbst wenn die Osmolarität des äußeren wässrigen
Mediums konstant bleibt. Daher wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
die Osmolarität
der ersten wässrigen
Komponente, die innerhalb der multivesikularen Liposome eingekapselt
ist, zur Steuerung bzw. Kontrolle der Freisetzung verwendet, wenn
die osmotische Stärke
des äußeren Mediums
in der Nähe
der physiologischen Stärke
liegt.
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Außerdem führt dann,
wenn MVLs gebildet werden, die einen osmotischen Abstandhalter in
einer gegebenen Konzentration der biologisch aktiven Substanz enthalten,
die Erhöhung
der Konzentration des osmotischen Abstandhalters überraschenderweise
zu einer Abnahme der Freisetzungsrate bzw. -geschwindigkeit der
Substanz. Durch die Abnahme der Freisetzungsgeschwindigkeit bzw.
-rate mit steigender Osmolarität
der ersten wässrigen
Komponente wird die Nützlichkeit
der multivesikularen Liposome für
jeden beliebigen Typ einer therapeutischen Behandlung, die von einer
längeren
Freisetzung des therapeutischen Agens profitiert, verbessert.
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Zur
Herabsetzung der Freisetzungsrate bzw. -geschwindigkeit von eingekapselten
therapeutischen Agentien oder anderer aktiver Agentien aus den erfindungsgemäßen multivesikularen
Liposomen wird die Osmolarität
der ersten wässrigen
Komponente innerhalb der MVLs erhöht, bezogen auf diejenige der
physiologisch relevanten wässrigen
Umgebung, in der die MVLs gelagert werden (wie z.B. einer 0,9 gew.-%igen
Kochsalzlösung),
oder in welche die MVLs eingeführt
werden (sowohl in vitro als auch in vivo) entweder durch Erhöhung der
Konzentration der aktiven Substanz oder durch Verwendung eines osmotischen
Abstandhalters. Umgekehrt kann die Freisetzungsrate bzw. -geschwindigkeit
erhöht
werden entweder durch Verringerung der Konzentration der aktiven
Substanz oder durch Herabsetzung der Konzentration eines osmotischen
Abstandhalters oder durch Eliminierung der Verwendung desselben.
Die Osmolarität
der ersten wässrigen
Komponente kann auch hypertonisch in Bezug auf die physiologische
relevante wässrige
Umgebung sein, um eine optimale Abnahme der Rate bzw. Geschwindigkeit
der Freisetzung der biologisch aktiven Substanz aus den Liposomen
zu erzielen, die begleitet ist von einer höheren Ausbeute des Einkapselungsverfahrens
als unter isotonischen Bedingungen. Deshalb liegt es innerhalb des
Schutzbereiches der vorliegenden Erfindung, dass die erste wässrige Komponente
hypotonisch, isotonisch oder hypertonisch in Bezug auf das Lager-
bzw. Speichermedium oder in Bezug auf die wässrige Umgebung, in die das
biologisch aktive Agens freigesetzt werden soll, sein kann. Infolgedessen
kann ein Fachmann auf diesem Gebiet routinemäßig ein MVL herstellen mit
einer vorher ausgewählten
Rate bzw. Geschwindigkeit der Freisetzung der biologisch aktiven
Substanz, die für
eine gegebene Therapie optimal ist.
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Da
die Osmolarität
einer normalen Kochsalzlösung ähnlich derjenigen
des Human-Plasmas und anderer in einer in vivo-Umgebung ist, wie
z.B. der Cerebrospinal-Flüssigkeit,
der Synovial-Flüssigkeit,
sowie der subkutanen und intramuskulären Flüssigkeiten (Fluids), kann eine
Kochsalzlösung
als Vorhersagemodell der MVL-Arzneimittel-Freisetzung in solche
Umgebungen verwendet werden. Die bevorzugte Verwendung der erfindungsgemäßen MVLs
ist die in vivo-Injektion oder die Implantation in ein Gewebe oder
in Körperhohlräume (z.B.
als Arzneimittel-Depots) und sie werden vorzugsweise in einem Medium,
wie z.B. einer normalen Kochsalzlösung, einer Phosphatgepufferten
Kochsalzlösung
oder in einem anderen osmotisch vergleichbaren Medium aufbewahrt
(gelagert).
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Kurz
zusammengefasst werden in dem erfindungsgemäßen Verfahren die MVLs hergestellt,
indem man zuerst eine Wasser-in-Öl-Emulsion
herstellt durch Auflösung
des (der) amphipathischen Lipids (Lipide) und des neutralen Lipids
in einem flüchtigen
organischen Lösungsmittel
für die
Lipid-Komponente durch Zugabe einer damit nicht mischbaren ersten
wässrigen
Komponente, die eine biologisch aktive Substanz enthält, die
eingekapselt werden soll, zu der Lipid-Komponente und durch anschließendes Emulgieren
der Mischung, beispielsweise durch eine Turbulenz, die erzeugt wird
durch Mischen, Schütteln,
durch eine Ultraschall-Behandlung, durch Zuführung von Ultraschallenergie,
durch Düsenzerstäubung oder
durch Kombinationen davon. Die gesamte Emulsion wird dann in eine
zweite wässrige
Komponente eingetaucht und danach wie oben angegeben mechanisch
gerührt,
um Lösungsmittel-Kügelchen
zu bilden, die in der zweiten wässrigen
Komponente suspendiert sind. Die resultierenden Lösungsmittel-Kügelchen
bestehen aus multiplen wässrigen
Tröpfchen,
in der die biologisch aktive Substanz (eine Wasser-in-Öl-in-Wasser-Doppelemulsion)
enthalten ist.
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Das
flüchtige
organische Lösungsmittel
wird aus den Kügelchen
entfernt, beispielsweise durch Darüberleiten oder Hindurchleiten
eines Gasstromes über
die oder durch die Suspension, um das Lösungsmittel zu verdampfen.
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Wenn
das Lösungsmittel
vollständig
verdampft ist, entstehen multivesikuläre Liposome. Zu repräsentativen
Gasen, die zufriedenstellend sind für die Verwendung zum Verdampfen
des Lösungsmittels,
gehören Stickstoff,
Helium, Argon, Sauerstoff, Wasserstoff und Kohlendioxid. Alternativ
kann das organische Lösungsmittel
entfernt werden durch Lösungsmittel-Entfernungssysteme,
wie sie üblicherweise
verwendet werden, beispielsweise durch Versprühen mit den oben genannten
Gasen, durch Verdampfung unter vermindertem Druck und durch Sprühtrocknung.
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Zur
Bildung der multivesikularen Liposome und zur Kontrolle der Freisetzungsrate
bzw. -geschwindigkeit der eingekapselten Substanz aus den multivesikularen
Liposomen können
osmotische Abstandhalter verwendet werden, die umfassen, ohne dass
die Erfindung darauf beschränkt
ist, Glucose, Saccharose, Trehalose, Succinat, Cyclodextrin, Arginin,
Galactose, Mannose, Maltose, Mannit, Glycin, Lysin, Citrat, Sorbit,
Dextran und Kombinationen davon. Die Konzentration der eingekapselten
biologisch aktiven Substanz kann variieren von etwa einigen wenigen
Picomol bis zu etwa mehreren hundert Millimol. Die Konzentration
der biologisch aktiven Substanz variiert in Abhängigkeit von verschiedenen
Charakteristika, wie z.B. der zu behandelnden Krankheit, dem Alter
und dem Gesundheitszustand des Patienten sowie den speziellen Eigenschaften
der Substanz. Für
den Fall, dass die Substanz normalerweise Nebenwirkungen, wie z.B.
eine Toxizität,
aufweist, kann es wünschenswert
sein, ein MVL mit einer niedrigeren Konzentration der Substanz herzustellen
und eine höhere
Konzentration an osmotischem Abstandhalter zu verwenden. Die Wechselbeziehung
zwischen diesen verschiedenen Parametern kann vom Fachmann auf diesem
Gebiet leicht beurteilt werden durch Auswahl und Herstellung einer
gegebenen MVL-Zusammensetzung,
ohne dass übermäßig viele
Experimente erforderlich sind.
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Als
Lipidphasen-Lösungsmittel
können
viele verschiedene Typen von flüchtigen
hydrophoben Lösungsmitteln
verwendet werden, wie z.B. Ether, Kohlenwasserstoffe, halogenierte
Kohlenwasserstoffe, superkritische Flüssigkeiten bzw. Fluids, wie
z.B., ohne dass die Erfindung darauf beschränkt ist, CO2,
NH3 und Freone. Zufriedenstellend sind beispielsweise
Diethylether, Isopropyl- und andere Ether, Dichlormethan, Chloroform,
Tetrahydrofuran, halogenierte Ether, Ester und Kombinationen davon.
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Es
können
verschiedene Typen von Lipiden verwendet werden zur Herstellung
der multivesikularen Liposome, so lange mindestens ein neutrales
Lipid und mindestens ein amphipathisches Lipid darin enthalten sind.
Das (die) amphipathische Lipid(e) kann (können) ausgewählt werden
aus der Gruppe, die besteht aus (1) amphipathischen Lipiden mit
einer negativen Gesamtladung; (2) Sterinen und (3) zwitterionischen
Lipiden. Die Lipid-Komponente
kann beispielsweise umfassen ein neutrales Lipid und ein amphipathisches
Lipid mit einer negativen Gesamtladung. Bei einer alternativen Ausführungsform
umfasst die Lipid-Komponente ferner ein Sterin. Bei noch einer weiteren
alternativen Ausführungsform
umfasst das Lipid ferner sowohl ein Sterin als auch ein zwitterionisches
Lipid.
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Beispiele
für zwitterionische
Lipide sind Phosphatidylcholine, Phosphatidylethanolamine, Sphingomyeline
und Kombinationen davon. Zu Beispielen für neutrale Lipide gehören Triglyceride,
wie z.B. Triolein, Tricaprylin, pflanzliche Öle, wie z.B. Sojabohnenöl, Schweineschmalz,
Rindertalg, Tocopherol, Squalen und Kombinationen davon. Zu Beispielen
für amphipathische
Lipide mit einer negativen Gesamtladung gehören Cardiolipine, Phosphatidylserine,
Phosphatidylglycerine, Phosphatidylinosite und Phosphatidsäuren. Zu
Beispielen für
amphipathische Lipide mit einer positiven Gesamtladung gehören Diacyltrimethylammoniumpropane,
Diacyldimethylammoniumpropane und Stearylamin.
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Es
können
verschiedene biologisch aktive Substanzen durch Einkapselung in
die multivesikularen Liposome eingearbeitet werden. Zu diesen Substanzen
gehören
Arzneimittel sowie andere Arten von pharmazeutischen Materialien,
wie z.B. DNA, RNA, Proteine verschiedener Typen, Proteinhormone,
wie z.B. Insulin, Wachstumsfaktoren, Cytokine, Monokine, Lymphokine
und Proteine und Kohlenhydrate, die als Immunogene für die Impfung
dienen.
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Es
können
auch biologisch aktive Substanzen, die für kosmetische Verwendungszwecke
geeignet sind, durch Einkapselung in multivesikulare Liposome eingearbeitet
werden. Dazu gehören
Feuchthaltemittel, Vitamine, Enzyme und Parfüms. Außerdem sind Herbizide, Pestizide,
Fungizide und dgl. Beispiele für
biologisch aktive Substanzen für
landwirtschaftliche Verwendungszwecke, die in multivesikulare Liposome
eingekapselt werden können.
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In
der folgenden Tabelle 1 sind repräsentative Klassen für biologisch
aktive Substanzen angegeben, die in die erfindungsgemäßen multivesikularen
Liposome eingekapselt werden können.
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Der
für die
in vivo-Verwendung der biologisch aktiven Substanz in erfindungsgemäßen multivesikularen
Liposomen bei Menschen geeignete Dosierungsbereich umfasst den Bereich
von 0,001 bis 6 000 mg/m2 Körperoberfläche. Obgleich
auch Dosen außerhalb
des oben genannten Dosierungsbereiches anwendbar sind, umfasst dieser
Bereich die Breite der Verwendbarkeit für praktisch alle biologisch
aktiven Substanzen. Für
ein spezielles therapeutisches Agens kann jedoch die bevorzugte
Konzentration, wie weiter oben angegeben, leicht bestimmt werden.
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Die
multivesikularen Liposome können
auf irgendeinem gewünschten
Wege verabreicht werden: beispielsweise intratumoral, intraartikular
(in die Gelenke), intramuskulär,
intrathekal, intraperitoneal, subkutan, intravenös, intralymphatisch, oral und
submucosal. Die multivesikularen Liposome können unter Anwendung von Verfahren,
wie sie allgemein bekannt sind, modifiziert werden, indem man entweder
direkt oder indirekt, beispielsweise mittels eines Abstandhalter-Moleküls oder
Peptids, Target-spezifische Liganden, wie z.B. Antikörper und
andere Rezeptor-spezifische Protein-Liganden daran befestigt, um
ihnen eine Organ- oder Zellen-Target-Spezifität zu verleihen (Malone et al., "Proc. Natl. Acad.
Sci, U.S.A.", 86:
6077, 1989; Gregoriadis, "Immunology
Today", 11(3): 89,
1990).
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Die
folgenden Beispiele erläutern
die Art und Weise, in der die Erfindung praktisch durchgeführt werden
kann. Es ist jedoch klar, dass die Beispiele nur der Erläuterung
der Erfindung dienen und die Erfindung nicht auf irgendeines der
darin genannten spezifischen Materialien oder auf irgendeine der
darin genannten Bedingungen beschränkt ist.
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Beispiel 1
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A. Herstellung von multivesikularen
Liposomen
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Stufe
1) In einen sauberen Glaszylinder (Innendurchmesserd 2,5 cm × Höhe 10,0
cm) wurden 5 mL einer Lösung
eingeführt,
die in Chloroform 46,5 μmol
Dioleoylphosphatidylcholin (Avanti Polar Lipids, Birmingham, AL),
10,5 μmol
Dipalmitoylphosphatidylglycerin (Avanti Polar Lipids, Birmingham,
AL), 75 μmol
Cholesterin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) und 9,0 μmol Triolein
(Avanti Polar Lipids, Birmingham, AL) enthielt. Diese Lösung wird
nachstehend als Lipid-Komponente bezeichnet.
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Stufe
2) In den oben genannten Glaszylinder, der die Lipid-Komponente
enthielt, wurden eingeführt
5 mL entweder der ersten wässrigen
Komponente, Cytarabine (Upjohn, Kalamazoo, MI), oder Amikacinsulfat (Bristol
Myers Squibb, Syracuse, NY), gelöst
in Wasser. Die für
Cytarabin angewendeten Konzentrationen betrugen 41 mM, 82 mM, 164
mM, 246 mM, 369 mM und 410 mM. Die für Amikacinsulfat angewendeten
Konzentrationen betrugen 13 mM, 26 mM, 52 mM und 88 mM. Amikacinsulfat
enthält
1,8 Sulfationen pro Amikacin-Molekül, um die Osmolarität zu erhalten,
wird die Konzentration mit 2,8 multipliziert.
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Stufe
3) Zur Herstellung der Wasser-in-Öl-Emulsion wurde die Mischung
der Stufe (2) mit einem Homogenisator (AutoHomoMixer, Modell M,
Tokushu Kika, Osaka, Japan) 8 min lang mit einer Geschwindigkeitch von
9000 UpM gerührt.
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Stufe
4) Zur Herstellung der in Wasser suspendierten Chloroform-Kügelchen wurden 20 mL einer
Lösung,
die 4 % Dextrose und 40 mM Lysin enthielt, in Form einer Schicht
auf die Wasser-in-Öl-Emulsion
aufgebracht und dann 60 s lang mit einer Geschwindigkeit von 4000
UpM durchmischt zur Bildung der Chloroform-Kügelchen.
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Stufe
5) Zur Herstellung der multivesikularen Liposome wurde die Suspension
der Chloroform-Kügelchen
in dem Glaszylinder in einen 1000 mL Erlenmeyer-Kolben gegossen,
der 30 mL Wasser, Glucose (3,5 g/100 mL) und die freie Base Lysin
(40 mM) enthielt. Über
die Suspension in dem Kolben wurde ein Stickstoffgasstrom mit einer
Geschwindigkeit von 7 L/min geleitet, um das Chloroform über einen
Zeitraum von 20 min bei 37 °C
langsam zu verdampfen. In den Kolben wurden 60 mL einer normalen
Kochsalzlösung
(0,9 Natriumchlorid) gegeben. Die Liposome wurden dann durch 10-minütiges Zentrifugieren
mit 600 × g
abgetrennt, die überstehende
Flüssigkeit
wurde dekantiert und das Pellet wurde in 50 mL normaler Kochsalzlösung wieder suspendiert.
Die Liposome wurden durch 10-minütiges
Zentrifugieren mit 600 × g
abgetrennt. Die überstehende
Flüssigkeit
wurde dekantiert und das Pellet wurde in einer Kochsalzlösung wieder
suspendiert.
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B) Bestimmung des mittleren
Durchmessers der multivesikularen Liposome
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Der
mittlere Durchmesser der wie vorstehend beschrieben hergestellten
multivesikularen Liposome wurde unter Anwendung eines Laserlicht-Beugungsverfahrens
unter Verwendung des Partikelgrößen-Analysators
Modell LA-500 der Firma Horiba, Inc. (Irvine, CA) bestimmt. Der
mittlere Durchmesser der resultierenden Liposome lag in dem Bereich
von 5 bis 20 μm.
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C. Assay zur Freisetzung
von Cytarabin in Plasma
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Dieses
Beispiel zeigt, dass die Freisetzungsrate bzw. -geschwindigkeit
von Cytarabin und Amikacin in Human-Plasma bei 37 °C mit steigender
Konzentration des Arzneimittels in der ersten wässrigen Komponente abnimmt.
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500 μL der multivesikularen
Liposom-Suspension, die Cytarabin enthielt, wurden zu 1,2 mL gesiebtem Human-Plasma
vom Typ O zugegeben. Die Mischung wurde bei 37 °C inkubiert. In den gewünschten
Zeitintervallen wurde ein Aliquot entnommen, die multivesikularen
Liposome wurden als Pellet durch Zentrifugieren mit 600 × g abgetrennt
und das Pellet wurde in Isopropylalkohol solubilisiert und die Cytarabin-Menge
in der Pelletfraktion wurde durch Hochdruck-Flüssigchromatographie quantitativ
bestimmt (vgl. z.B. U.S. Pharmacopeia, XXII, Seite 376, 1990).
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D) Assay zur Freisetzung
von Amikacin in Plasma
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500 μL der multivesikularen
Liposom-Suspension, die Amikacin enthielt, wurden zu 1,2 mL gesiebtem Human-Plasma
vom Typ 0 zugegeben. Die Mischung wurde bei 37 °C inkubiert und in den gewünschten
Zeitintervallen wurde ein Aliquot entnommen. Die multivesikularen
Liposome wurden in Form eines Pellets durch Zentrifugieren mit 600 × g isoliert.
Das Pellet wurde in Isopropylalkohol solubilisiert und die Amikacin-Menge in
der Pelletfraktion wurde quantitativ bestimmt unter Anwendung eines
Fluoreszenz-Immunoassays
auf Basis einer Polystyrol-Perle (Varma-Nelson, et al., "Therapeutic Drug
Monitoring", 13:
260–262,
1991). Der Prozentsatz des zurückgehaltenen
Amikacins wurde aus der bei diesem Verfahren erhaltenen Mengen errechnet.
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Wie
aus der Tabelle 2 ersichtlich, hatte die Einkapselungsausbeute,
ausgedrückt
als Prozentsatz des in der ersten wässrigen Komponente in unterschiedlichen
Anfangskonzentrationen oder Osmolaritäten verwendeten gesamten Arzneimittels,
einen ausgeprägten
Einfluss auf die Rate bzw. Geschwindigkeit seiner Freisetzung aus
den inkubierten multivesikularen Liposomen in Human-Plasma, die
als Halbwertszeit angegeben ist. Die Halbwertszeit der Arzneimittel-Freisetzung
wurde errechnet unter der Annahme eines einfach exponentiellen Zerfall-Modells.
Die Daten in der Tabelle 2 geben den Mittelwert und die Standardabweichung
von drei Versuchen wieder. Die Halbwertszeit für die Freisetzung von Cytarabin
in Human-Plasma bleibt unter hypertonischen Bedingungen, verglichen
mit isotonischen Bedingungen, im Wesentlichen unverändert. Die
Daten zeigen außerdem,
dass die Cytarabin- und Amikacin-Halbwertszeiten ansteigen mit steigender
Konzentration der biologisch aktiven Substanz (angegeben in mOsm),
die in die multivesikularen Liposome eingekapselt worden ist, während der
Herstellung bis zu etwa 246 mOsm. Die Erhöhung der Osmolarität der ersten wässrigen
Komponente, die innerhalb der multivesikularen Vesikel eingekapselt
ist, führt
unerwartet zur Bildung von Liposomen mit einer verbesserten Verwendbarkeit
für die
langsame Freisetzung von Arzneimitteln über lange Zeiträume hinweg
in Human-Plasma.
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Beispiel 2
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Dieses
Beispiel zeigt, dass die Freisetzungsrate bzw. -geschwindigkeit
von Cytarabin in Plasma mit steigender Osmolarität der ersten wässrigen
Komponente bei einer festgelegten Konzentration der biologisch aktiven
Substanz abnimmt. Multivesikulare Liposome wurden hergestellt wie
in den Stufen 1 bis 5 des Beispiels 1 beschrieben, wobei die folgende
Modifikation in der Stufe 2 durchgeführt wurde:
Stufe 2) 5
mL der wässrigen
Komponente, Cytarabin (Upjohn, Kalamazoo, MI), gelöst in einer
Konzentration von 82 mM entweder in Wasser oder in 3 Gew.-% Glucose
oder in 5 Gew.-% Glucose, wurden in den oben genannten Glaszylinder,
der die Lipid-Komponente enthielt, eingeführt. Die errechneten Osmolaritäten der
resultierenden Lösungen
betrugen jeweils 82, 220 bzw. 335 mOsm.
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Der
in den multivesikularen Liposomen nach der Inkubation bei 37 °C in Human-Plasma
für die
verschiedenen Glucose-Konzentrationen verbliebene Prozentsatz an
Cytarabin wurde gemessen als Funktion der Inkubationszeit. Die folgende
Tabelle 3 zeigt den mittleren Durchmesser, die Einkapselungsausbeute
von Cytarabin und die Halbwertszeit bei der Freisetzung in Plasma
bei 37 °C
für die
0, 3 Gew.-% und 5 Gew.-% Glucose enthaltenden Zusammensetzungen.
Der Mittelwert und die Standardabweichung aus drei Versuchen sind
in jedem Fall angegeben. Die Einarbeitung eines osmotischen Abstandhalters,
Glucose, in verschiedenen Konzentrationen, während die biologisch aktive
Substanz bei einer festgelegten Konzentration gehalten wurde, hatte
einen ausgeprägten
Einfluss auf die Rate bzw. Geschwindigkeit der Freisetzung aus den
inkubierten multivesikularen Liposomen in Human-Plasma. Wie durch
die Daten in der Tabelle 3 erläutert,
stieg die Halbwertszeit für
die Freisetzung von Cytarabin aus multivesikularen Liposomen in
Human-Plasma mit steigender Osmolarität der ersten wässrigen
Komponente an. Die Einkapselungsausbeute nahm ebenfalls zu mit steigender
Osmolarität
der ersten wässrigen
Komponente bis auf etwa 248 mOsm. Tabelle
3
- a) Die Osmolarität umfasst
sowohl Cytarabin als auch Glucose.
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Beispiel 3
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Dieses
Beispiel zeigt, dass multivesikulare Liposome hergestellt werden
können,
wenn als zweite wässrige
Komponente eine normale Kochsalzlösung verwendet wird. Die multivesikularen
Liposomen wurden wie nachstehend beschrieben hergestellt.
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Stufe
1) In einen sauberen Glaszylinder (Innendurchmesser 2,5 cm × Höhe 10,0
cm) wurden 5 mL einer Lösung,
die 46,5 μmol
Dioleoylphosphatidylcholin (Avanti Polar Lipids, Birmingham, AL),
10,5 μmol
Dipalmitoylphosphatidylglycerin (Avanti Polar Lipids, Birmingham,
AL), 75 μmol
Cholesterin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) und 9,0 μmol Triolein
(Avanti Polar Lipids, Birmingham, AL) enthielt, in Chloroform eingeführt. Diese
Lösung
wird nachstehend als Standard-Lipid-Komponente bezeichnet.
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Stufe
2) 5 mL der ersten wässrigen
Komponente, Cytarabine (Upjohn, Kalamazoo, MI), gelöst in Wasser
in einer Konzentration von 246 mM, wurde in den oben genannten Glaszylinder
gegeben, der die Standard-Lipid-Komponente
enthielt.
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Stufe
3) Zur Herstellung der Wasser-in-Öl-Emulsion wurde ein Homogenisator
(AutoHomoMixer, Model M, Tokushu Kika, Osaka, Japan) verwendet zum
8-minütigen
Durchmischen mit einer Geschwindigkeit von 9000 UpM.
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Stufe
4) Zur Herstellung der in Wasser suspendierten Chloroform-Kügelchen
wurden 20 mL einer normalen Kochsalzlösung (0,9 % Natriumchlorid)
in Form einer Schicht auf die Wasser-in-Öl-Emulsion aufgeschichtet und
dann 60 s lang mit einer Geschwindigkeit von 4000 UpM durchmischt
zur Bildung der Chloroform-Kügelchen.
Dies stellt die Wasser-in-Öl-in-Wasser-Doppelemulsion dar.
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Stufe
5) Die Chloroform-Kügelchen-Suspension
in dem Glasszylinder wurde in einen 1000 mL Erlenmeyer-Kolben gegossen,
der 30 mL einer normalen Kochsalzlösung (0,9 % Natriumchlorid)
enthielt. Über
die Suspension in dem Kolben wurde ein Stickstoffgasstrom mit einer
Geschwindigkeit von 7 L/min geleitet, um das Chloroform über einen
Zeitraum von 20 min bei 37 °C
zu verdampfen. Die Liposome wurde durch ein 50 μm-Filter abfiltriert. Die Liposome wurden
aus der Suspension abgetrennt durch 10-minütiges Zentrifugieren mit 600 × g. Die überstehende
Flüssigkeit
wurde dekantiert und das Pellet wurde in der Kochsalzlösung wieder suspendiert.
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Die
Halbwertszeit für
die Freisetzung von Cytarabin aus multivesicularen Liposomen, die
unter Verwendung einer 246 mOsm Cytarabin-Lösung in Wasser und einer normalen
Kochsalzlösung
als zweite wässrige
Komponente hergestellt worden waren, betrug 15,7 ± 4,8 Tage.
Dieser Wert ähnelt
der Halbwertszeit für die
Freisetzung aus multivesikularen Liposomen, die unter Verwendung
einer 246 mOsm Cytarabin-Lösung
in Wasser und einer Glucose-Lysin-Lösung als
zweite wässrige
Komponente hergestellt worden waren (14,1 ± 1,5 Tage, vgl. Tabelle 2).
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Beispiel 4
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Es
wurden pharmakokinetische Studien mit Mäusen durchgeführt, um
die langsamen Freisetzungseigenschaften der erfindungsgemäßen multivesikularen
Liposome in vivo zu bestimmen.
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Wie
in Beispiel 1 beschrieben wurden multivesikulare Liposome hergestellt.
Als erste wässrige
Komponente wurden Cytarabin-Lösungen
in Wasser in Konzentrationen von 82 mM oder 246 mM verwendet. Die erhaltenen
multivesikularen Liposome wurden zweimal mit einer normalen Kochsalzlösung gewaschen,
10 min lang mit 600 × g
zentrifugiert und in einer normalen Kochsalzlösung bei einer Konzentration
von 10 mg Cytarabin pro mL Suspension gelagert.
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Den
Mäusen
(weibliche ausgewachsene CD1ICR-Mäuse) wurden multivesikulare
Liposome, die 2,55 ± 0,25
mg Cytarabin enthielten, injiziert. Vor der Injektion wurden Aliquote
der Suspension der multivesikularen Liposome, welche die gleiche
Menge Cytarabin wie für
die Injektion vorgesehen enthielten, als Proben zum Zeitpunkt Null
entnommen.
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Zu
unterschiedlichen Zeitpunkten von bis zu 108 h nach der Injektion
wurden die Tiere durch Cervikal-Dislokation getötet. Es wurden 20 μl der unverdünnten Peritoneal-Flüssigkeit
aus der Peritoneal-Höhle
in ein Reagensglas eingeführt,
das 200 μL
normale Kochsalzlösung
enthielt. Das Reagensglas wurde in einer Eppendorf-Mikroschleuder
(Brinkman Instruments, Westbury, NY) mit maximaler Geschwindigkeit
1 min lang zentrifugiert. Die überstehende
Flüssigkeit
und das Pellet wurden voneinander getrennt. Nach der Gewinnung von
20 μL Peritoneal-Flüssigkeit,
wie vorstehend beschrieben, wurde die Peritoneal-Höhle mit
2 bis 3 ml einer 0,9 %igen NaCl-Lösung gründlich ausgewaschen. Alle Proben
wurde vor Durchführung
der Analyse bei –20 °C gelagert.
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Die
Pellet- und überstehenden
Flüssigkeits-Fraktionen
und die Waschfraktion wurden mit Isopropylalkohol solubilisiert.
Die Cytarabin-Menge in den solubilisierten Fraktionen wurde durch
Hochdruck-Flüssigchromatographie
quantitativ bestimmt (vgl. z.B. U.S. Pharmacopeia, XXII: 376, 1990).
Die Cytarabin-Konzentrationen (μg/mL)
in der Pellet-Fraktion sind in der folgenden Tabelle 4 angegeben.
Die Gesamtmengen an Cytarabin (μg)
in der Intraperitoneal-Höhle,
die ebenfalls in der Tabelle 4 angegeben sind, wurden erhalten durch Addition
der Mengen in dem Pellet und der überstehenden Fraktion der 20 μL unverdünnten Peritoneal-Flüssigkeitsprobe
und der Menge in der Peritoneal-Waschfraktion.
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Die
pharmakokinetischen Daten, d.h. die zeitabhängige Abnahme der Cytarabin-Konzentrationen
in dem Pellet und in den überstehenden
Fraktionen und in der Gesamtmenge wurden mit dem RSTRIP-Programm
(MicroMath Scientific Software, Salt Lake City, Utah) unter Verwendung
eines Einzelabteil-Modells
und unter Auswiegen des Null-Werts analysiert. Die Zerfalls-Halbwertszeiten sind
in der Tabelle 4 angegeben.
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Ein
Vergleich der in der Tabelle 4 angegebenen Daten mit der 82 mM Formulierung
(Anfangs-Cytarabin-Konzentration) und der 246 mM Formulierung (anfängliche
Cytarabin-Konzentration) zeigt, dass die Gesamtmenge an Cytarabin
schneller abnimmt für
die 82 mM-Formulierung als für
die 246 mM-Formulierung. Die Konzentration in der Pellet-Fraktion
nimmt ebenfalls schneller ab für
die 82 mM-Formulierung als für
die 246 mM-Formulierung.
Deshalb zeigt diese Studie, dass die Rate bzw. Geschwindigkeit der
Freisetzung von Cytarabin mit steigender Osmolarität der ersten
wässrigen
Komponente nicht nur in der physiologisch relevanten Umgebung, d.h.
in Human-Plasma, wie in Beispiel 1 angegeben, sondern auch in vivo
abnimmt.
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Tabelle 4
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Cytarabin-Konzentration
in den Pellet-Fraktionen der Peritoneal-Flüssigkeit und Gesamtmenge des Cytarabins
in der Peritoneal-Höhle
zu unterschiedlichen Zeiten nach der intraperitonealen Injektion
von Formulierungen, die hergestellt worden waren unter Verwendung
einer Lösung,
die entweder 82 mM Cytarabin oder 246 mM Cytarabin enthielt. Es
wurde eine Gruppe aus drei Proben verwendet.
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