DD255533A5 - Verfahren zur herstellung von sterolliposomen - Google Patents

Abstract

Mit der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Sterolliposomen bereitgestellt, die die in-vivo-Verabreichung von hohen Konzentrationen wasserunloeslicher Verbindungen ermoeglichen. Die Sterolliposome werden hergestellt, indem zu einer waessrigen Phase eine Salzform eines organischen Saeurederivates eines Sterols mit der Faehigkeit, geschlossene Doppelschichten bilden zu koennen, in einer fuer die Bildung vollstaendig geschlossener Blaeschen ausreichenden Mengen gegeben wird und das Gemisch bis zur Bildung einer milchigen Suspension multilamellarer Blaeschen geschuettelt wird.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Sterolliposomen, die aus Salzformen organischer Säurederivate von Sterolen zusammengesetzt sind und die Doppelschichten bilden können.

SterolejWie Cholesterin oder andere Lipoide, an die eine hydrophile Komponente wie eine Salzform einer organischen Säure gebunden ist, können zur Herstellung von Suspensionen multilamellarer oder kleiner unilamellarer Bläschen (Vesiculäe) verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Sterol-Liposome können mit oder ohne Verwendung organischer Lösungsmittel hergestellt werden. Diese Bläschen können wasserlösliche Verbindungen, teilweise wasserlösliche Verbindungen und wasserunlösliche Verbindungen einschließen.

Die hier beschriebenen Sterol-Bläschen sind besonders für die Einschließung biologisch-aktiver Verbindungen oder pharmazeutischer Verbindungen brauchbar, die in vivo verabreicht werden können. Alternativ können die erfindungsgemäßen Sterol-Liposome in vitro angewendet werden. Zum Beispiel können die hier beschriebenen Cholesterin-Hemisuccinat-Liposoma in vitro in zweiwertigen kationen-abhängigen Nachweissystemen eingesetzt werden.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Liposome sind vollständig geschlossene Zweischichtmembranen, die eine eingeschlossene wäßrige Phase enthalten. Liposome können jede beliebige Varietät mulitlamellarer Bläschen (zwiebelartige Strukturen, die durch konzentrische Membrandoppelschichten, je durch eine wäßrige Schicht getrennt, gekennzeichnet sind) oder unilamellarer Bläschen (die eine einzige Membrandoppelschicht besitzen) sein.

Zwei Parameter von Liposompräparaten sind Funktionen der Bläschengröße und der Lipoidkonzentration: (1) Eingeschlossenes Volumen, definiert als das durch eine bestimmte Lipoidmenge umschlossene Volumen, wird in Einheiten von Litern, die je Mol des gesamten Lipoids (1 ΜοΓ¹) eingeschlossen sind, ausgedrückt. Das festgehaltene Volumen hängt vom Radius der Liposome ab, der seinerseits durch die Lipoidzusammensetzung der Bläschen und die ionische Zusammensetzung des Mediums bedingt ist. (2) Einkapselungswirkungsgrad, definiert als der Bruchteil des wäßrigen, durch die Doppelschichten abgeteilten Raumes, wird in Prozentanteilen angegeben. Der Einkapselungswirkungsgrad ist der Lipoidkonzentration direkt proportional; wenn mehr Lipoid vorhanden ist, kann mehr Gelöstes innerhalb von Liposomen festgehalten werden. (Siehe Deamer und Uster, 1983, Liposome Preparation: Methods and Mechanisms [Liposom-Herstellung: Verfahren und Mechanismen)] in Liposomes, Herausgeber M. Ostro, Marcel Dekker, Inc., NY, S. 27 bis 51).

Beider ursprünglichen Verfahrensweise derLiposomherstellung (Bangham, u.a. 1965, J. Mol. Biol. 13: 238-252) wurden Phospholipoide in einem organischen Lösungsmittel suspendiert, das anschließend zur Trockne eingedampft wurde, so daß ein wachsartiger Rückstand von Phospholipoid in dem Reaktionsgefäß zurückblieb. Danach wurde eine angemessene Menge einer wäßrigen Phase zugesetzt, die Mischung zum „Quellen" stehen gelassen, und die resultierenden Liposome, die aus multilamellaren Bläschen (anschließend als MLVs bezeichnet) bestanden, wurden mit Hilfe mechanischer Einrichtungen dispergiert. Die Struktur der resultierenden Membrandoppelschicht ist so beschaffen, daß sich die hydrophoben (nicht-polaren) „Schwänze" des Lipoids zur Mitte der Doppelschicht orientieren, während sich die hydrophilen (polaren) „Köpfe" zur wäßrigen Phase orientieren. Diese Technik bildete die Grundlage für die Entwicklung der kleinen, beschallten, unilamellaren Bläschen (anschließend als SUVs bezeichnet), die von Papahadajopoulos und Miller (1967, Biochim. Biophys. Acta. 135,624-638) beschrieben werden. Sowohl MLVs als auch SUVs haben jedoch Grenzen als Modellsysteme.

Bei Versuchen, das eingeschlossene Volumen oder den Einkapselungswirkungsgrad zu ergänzen, sind eine Reihe von Verfahren für die Herstellung von Liposomen, die Phospholipoid-Doppelschichten umfassen, entwickelt worden; jedoch sind für alle Verfahren organische Lösungsmittel erforderlich. Einige dieser Methoden werden anschließend kurz erläutert. Ein Versuch zur Erhöhung des Einkapselungswirkungsgrades bestand darin, daß zuerst Liposom-Vorläufer oder -mizellen gebildet wurden, d. h. Bläschen, die eine wäßrige Phase enthielten, die von einer Einzelschicht von so orientierten Lipoidmolekülen,daßdie Kopfgruppen zur wäßrigen Phase gerichtet sind, umgeben war. Liposomvorläufer werden durch die Zugabe der wäßrigen Lösung, die eingekapselt werden soll, zu einer Lösung von polarem Lipoid in einem organischen Lösungsmittel und Beschallung hergestellt. Die Liposomvorläufer werden dann in einer zweiten wäßrigen Phase in Gegenwart von überschüssigem Lipoid emulgiert und eingedampft. Die resultierenden Liposome, die aus einer durch eine Lipoiddoppelschicht eingeschlossenen wäßrigen Phase bestehen, sind in wäßriger Phase dispergiert (siehe US-PS 4.224.179, erteilt am 23. September 1980 an M. Schneider).

Als einen anderen Versuch zur Maximierung des Einkapselungswirkungsgrades beschreibt Papahadjopoulos (US-PS 4.235.871, erteilt 25. November 1980) einen „Umkehrphasen-Eindampfungsprozeß" zur Herstellung oligolamellarer Lipoidbläschen,auch als Umkehrphasen-Eindampfungsbläschen bekannt (im weiteren als REVs bezeichnet). Nach dieser Verfahrensweise wird das einzuschließende wäßrige Material zu einer Mischung von polarem Lipoid in einem organischen Lösungsmittel gegeben. Dann wird eine homogene Emulsion vom Wasser-in-ÖI-Typ gebildet und das organische Lösungsmittel verdampft, bis ein Gel gebildet ist. Das Gel wird danach in eine Suspension umgewandelt, indem das gelartige Gemisch in einem wäßrigen Medium dispergiert wird. Die erzeugten REVs bestehen zum größten Teil aus unilamellaren Bläschen (großen unilamellaren Bläschen oder LUVs) und einigen oligolamellaren Bläschen, die nur durch einige konzentrische Doppelschichten mit einem großen dazwischen liegenden wäßrigen Raum gekennzeichnet sind.

Es ist viel über Möglichkeiten, Liposome für Arzneimittel-Freisetzungssysteme zu verwenden, geschrieben worden. Siehe beispielsweise die Darlegung in US-PS 3.993.754, erteilt am 23. November 1976 an Yeuh-Erh-Rahmao und Elizabeth A. Cerny, und US-PS 4.145.410, erteilt am 20. März 1979 an Barry D. Sears. In einem Liposom-Arzneimittel-Freisetzungssystem wird das Medikament während der Liposombildung eingeschlossen und dann dem zu behandelnden Patienten verabreicht. Das Medikament kann in Wasser oder einem nicht-polaren Lösungsmittel löslich sein. Typisch für solche Darstellungen sind US-PS 4.235.871, erteilt am 25. November 1980 an Pagahadjopoulos und Szoka und US-PS 4.224.179, erteilt am 23. September 1980 an M.Schneider. Bei der Herstellung von Liposomen für die in-vivo-Anwendung wäre es vorteilhaft, (1) die Notwendigkeit, organischer Lösungsmittel während der Herstellung von Liposomen verwenden zu müssen, auszuschalten; und (2) den Einkapselungswirkungsgrad und das eingeschlossene Volumen so zu maximieren, daß ein größeres Volumen und eine höhere Konzentration des eingeschlossenen Materials je Dosis zur Verfügung gestellt werden kann.

Weiterhin ist es bekannt, eine Vielzahl von Sterolen und deren wasserlösliche Derivate für kosmetische, pharmazeutische und diagnostische Zwecke zu verwenden. Von den wasserlöslichen Sterolen sind beispielsweise verzweigte Fettsäure-Gholesterinester. Steroidester sowie PEG-Phytosterole für kosmetische Präparate verwendet worden (EU-PA 28.456; US-PS 4.393.044; und Schrader, Drug and Cosmetic Industry, September 1983, S. 33 und Oktober 1983, S.46). Thakker und Kuehn (1969, J. Pharm. Sei. 58 [7]: 850-852) beschreiben die Solubilisierung von Steroidhormonen unter Einsatz wäßriger Lösungen von steroidalen, nicht-ionischen oberflächenaktiven Mitteln, speziell von ethoxyliertem Cholesterin (d> h. PEG-Cholesterin) in einer Konzentration von 1 bis 5%. Allerdings wurde die Wirksamkeit oder Brauchbarkeit der solubilisierten Steroidhormone in vivo nicht demonstriert. Eine Anzahl von wasserlöslichen Cholesterinen ist hergestellt und als wasserlösliche Standards für die Bestimmung des Cholesterinspiegels in biologischen Flüssigkeiten verwendet worden (US-PS 3.859.047; US-PS 4.042.330; US-PS 4.183.847; US-PS 4.040.784; US-PS 4.189.400 und US-PS 4.224.229).

Shinitzky, u.a. (1979, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76: 5313-5316) haben Tumorzellen in Gewebekultursubstrat, das eine geringe Konzentration von Cholesterin- und Cholesterylhemisuccinat enthielt, inkubiert. Durch Einbau von Cholesterin- oder Cholesterylhemisuccinat in die Zellmembran wurde die Membranfließfähigkeit verringert und die Membran-Lipoid-Mikroviskosität erhöht. ' .

Cholesterin und andere Sterole sind auch in Phospholipoid-Liposom-Membranen zur Veränderung der physikalischen Eigenschaften der Lipoid-Doppelschichten eingebaut worden. Zum Beispiel wird in einem neueren Bericht, Ellens, u.a. (1984, Biophys. J. 45: 70a), der Einfluß von H⁺ auf die Stabilität von ausPhosphatidylathanolamin und Cholesterylhemisuccinat bestehenden Lipoidbläschen besprochen. Brockerhoff und Ramsammy (1982, Biochem. Biophys. Acta, 691: 227-232) haben berichtet, daß tatsächlich Doppelschichten gebildet werden können, die vollkommen aus Cholesterin bestehen, vorausgesetzt, daß ein stabilisierendes hydrophiles Haftmittel vorhanden ist. Multilamellare und unilamellare Cholesterinliposome wurden in einer oben beschriebenen herkömmlichen Weise hergestellt, indem die Cholesterinderivate (d.h. Cholesterin-Phosphocholin, Cholesterin-Polyethylenglycol oder Cholesterin-SC^), die in einem organischen Lösungsmittel dispergiert waren, zur Trockne eingedampft wurden, wodurch ein in dem Reaktionsgefäß abgelagerter Lipoidfilm zurückblieb. Die Lipoidfilme wurden unter 2 ml Wasser mit Hilfe eines Ultraschall-Homogenisators mit einer Mikrospitze beschallt. Für die Bildung multilämellarer Bläschen war eine Beschallung von 10 Minuten erforderlich, während für die Bildung kleiner unilamellarer Bläschen 4 Stunden Beschallung notwendig waren. Die resultierenden Suspensionen multilämellarer Liposome waren milchig> wogegen die Suspensionen unilamellarer Liposome transparent waren.

Die Möglichkeit, bioaktive Mittel wirksam in Sterolbläschen, die sich für die Anwendung in vivo eignen, einzuschließen, um dadurch die Verabreichung höherer Dosen wasserlöslicher Mittel zu erzielen und die Verabreichung wasserlöslicher Mittel zu erleichtern, ist jedoch bisher noch nicht untersucht worden.

Ziel der Erfindung

Mit der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Sterolliposomen bereitgestellt, die die in-vivo-Verabreichung von hohen Konzentrationen wasserunlöslicher Verbindungen ermöglichen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Sterolliposomen zur Verfügung zu stellen, bei dem kein organisches Lösungsmittel verwendet wird und der Einkapselungswirkungsgrad und das eingeschlossene Volumen so zu maximieren ist, daß ein größeres Volumen und eine höhere Konzentration des eingeschlossenen Materials erreicht wird. Erfindungsgemäß werden Verfahren und Zusammensetzungen zur Verfugung gestellt für das Einschließen verschiedener Verbindungen in Liposome, deren Doppelschichten Salzformen organischer Säurederivate von Sterolen aufweisen. Unter Einschließen einer Verbindung ist hier die Einkapselung einer wasserlöslichen Verbindung in den wäßrigen Raum des Liposoms oder die Einkapselung einer wasserunlöslichen Verbindung innerhalb der Sterol-Doppelschicht zu verstehen. DieTris-(hydroxymethyl)aminomethan-Salzformen (Trisalzformen) von organischen Säurederivaten von Sterolen sind besonders als der Bläschen-Doppelschichtbestandteil geeignet.

Das Verfahren zur Herstellung der Sterolbläschen besteht darin, daß zu einem wäßrigen Puffer eine Salzform eines organischen Säurederivats eines Sterols, das geschlossene Doppelschichten bilden kann, in einer so ausreichenden Menge gegeben wird, daß vollständig geschlossene Doppelschichten gebildet werden, die einen wäßrigen Raum umschließen. Eine Suspension von multilamellaren Bläschen wird durch Schütteln der Mischung gebildet. Die Bildung von Bläschen wird erleichtert, wenn der wäßrige Puffer ebenfalls das Gegenion des Salzes in Lösung enthält. Außerdem sollte, wenn die dissoziierte Salzform des organischen Säurederivats eine Sterols bei neutralem pH-Wert negativ geladen ist, der wäßrige Puffer weitgehend

frei von zweiwertigen oder mehrwertigen Kationen sein. Wenn die dissoziierte Salzform des organischen Säurederivats eines Sterols bei neutralem pH-Wert positiv geladen ist, sollte der wäßrige Puffer gleichfalls weitgehend frei von mehrwertigen Anionen sein. Durch die Anwendung von Energie auf die Suspension, z. B. Beschallung oder Extrudieren der Bläschen durch eine Französische Druckzelle (French Press) oder durch ein poröses Filter mit der entsprechenden Porengröße werden die multilamellaren Sterolbläschen in unilamellare Bläschen umgewandelt.

Zum Einschließen einer wasserlöslichen Verbindung, einerteilweise wasserlöslichen Verbindung oder einer wasserunlöslichen Verbindung in die erfindungsgemäßen Sterolbläschen gibt es eine Reihe von Möglichkeiten. Verbindungen, die sich jeweils auf die Steroldoppelschichten aufteilen (z. B. wasser-unlösliche Verbindungen) oder wasserlösliche Verbindungen können vor der Bildung zu der wäßrigen Phase gegeben werden, um das Mittel innerhalb der Bläschen während der Bildung einzuschließen. Alternativ können Verbindungen, die wasser-unlöslich oder lipoidlöslich sind, der Suspension von Sterolbläschen nach der Bildung der Bläschen zugesetzt werden, wobei sich die Verbindung in diesem Fall auf die Steroldoppelschichten verteilt. Bei einem anderen Ausführungsbeispiel können eine wasserlösliche Verbindung und die Salzform eines organischen Säurederivats eines Sterols zu einem organischne Lösungsmittel gegeben werden, so daß beide solubilisiert (cosulbilisiert) werden. Das organische Lösungsmittel kann anschließend verdampft werden, so daß ein eine homogene Verteilung der wasser-unlöslichen Verbindung und des Sterolderivats enthaltender Film zurückbleibt. Die die wasserunlöslichen Verbindungen einschließenden Sterolliposome werden gebildet, wenn ein wäßriger Puffer dem Film unter Schütteln zugesetzt wird.

Die erfindungsgemäßen Sterolliposome sind besonders vorteilhaft, wenn sie für die Einschließung unlöslicher bioaktiver Mittel oder solcher Mittel, die in Wasser nur schwach löslich sind, eingesetzt werden. Dadurch können wasserunlösliche Arzneimittel in vivo verabreicht werden; außerdem ist die in-vivo-Verabreichung von hohen Konzentrationen der wasser-unlöslichen Verbindungen möglich, weil dabei das Dosis:Volumen-Verhältnis verändert werden kann. Die erfindungsgemäßen Sterolbläschen bieten ähnliche Vorteile, wenn sie zum Einschließen wasserlöslicher biokativer Mittel herangezogen werden. Außerdem können die erfindungsgemäßen Sterolbläschen für diagnostische Nachweise in vitro eingesetzt werden. Die Erfindung bietet eine Anzahl von Vorteilen, weil die Sterolbläschen

(1) leicht und schnell gebildet werden;

(2) einen hohen Einkapselungswirkungsgrad im Vergleich zu Phospholipoid MLVs aufweisen;

(3) nicht die Anwendung organischer Lösungsmittel für ihre Herstellung verlangen (obwohl die erfindungsgemäßen Sterolbläschen unter Anwendung organischer Lösungsmittel hergestellt werden (können); und

(4) ein bioaktives oder pharmazeutisches Mittel einschließen können, das bei in-vivo-Verabreichung freigesetzt und metabolisiertwird. Die Wirkung des eingeschlossenen Mittels in vivo hängt von der Art der Verabreichung ab.

Die Erfindung betrifft des weiteren eine Zusammensetzung, die aus dem Tris(hydroxymethyl)aminomethansalz von Cholesterylhemisuccinat und einer antimykotischen Verbindung besteht, vor allem, wenn das Antimykotika Miconazol, Terconazol oder Econazol, Isoconazol, Tioconazol, Bifonazol, Clotrimazol, Ketoconazol, Butaconazol, Itraconazol, Oxiconazol, Fenticonazol, Nystain, Naftifin, Amphotericin B, Zinoconazol oder Ciclopiroxolamin ist. Die Zusammensetzung kann zur Behandlung einer Pilzinfektion verwendet und örtlich, einschließlich oral oder intravaginal, verabreicht werden.

Die Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, die aus dem Tris(Hydroxymethyl)aminomethansaiz von Cholesterylsuccinat und einem Peptid, vor allem einem hydrophoben Peptid, Humanwachstumshormon, Rinderwachstumshormon, Schweinewachstumshormon oder Insulin besteht. Die Zusammensetzung kann zur Steigerung der Milchoproduktion oder zur Unterstützung oder Einleitung des Wachstums eines Säugetieres angewandt werden.

Zum besseren Verständnis der Erfindung sind graphische Darstellungen beigefügt.

In der Zeichnung stellen dar:

Fig. 1: eine graphische Darstellung der umgekehrten Beziehung des eingeschlossenen gelösten Stoffes (Chromium) und der

Konzentration von Cholesterinhemisuccinat, die zur Herstellung multilamellarer Liposome verwendet wurden; Fig. 2: die Röntgenstrahlen-Beugungsbilder von vier verschiedenen CHS-MLV-Präparaten; Fig.3: die Elektronen-Spinresonanzdaten von multilamellaren CHS-Bläschen und multilamellaren EPC-Bläschen; Fig. 4: eine graphische Darstellung der Quellungsprofile von Cholesterinhemisuccinatliposomen und Ei-

Phosphatidylcholinliposomen in wäßrigen Puffern verschiedener Tonizität; Fig. 5: eine graphische Darstellung der Wirksamkeit von in Cholesterinhemisuccinatliposomen eingeschlossenem

Indomethacin bei der Verringerung von Gelenkschwellungen bei intramuskulärer Verabreichung; Fig. 6: die Organverteilung von ¹⁴C-Diazepam, das Mäusen intravenös entweder uneingeschlossen (frei) oder in CHS-SUVs

eingeschlossen verabreicht wurde; Fig.7A, B und C: die Organverteilung von ⁵¹Chromium, das Mäusen intravenös entweder in CHS-MLVs eingekapselt (Fig.7A) oder in EPC-SPLVs eingeschlossen (Fig.7B) oder uneingeschlossen (Fig.7C) verabreicht wurden.

Erfindungsgemäß werden Verfahren und Zusammensetzungen zur Verfügung gestellt für das Einschließen wasserlöslicher, teilweise wasserlöslicher oder wasserunlöslicher Verbindungen in Liposomen, deren Doppelschichten Salzformen organischer Säurederivate von Sterolen, die geschlossene Doppelschichten bilden können, sind. Infolgedessen können die erfindungsgemäßen Sterolliposome dadurch hergestellt werden, daß(1) eine wasserlösliche Verbindung in dem wäßrigen Raum eingeschlossen wird; oder (2) eine wasserunlösliche Verbindung eingeschlossen wird, die sich auf die Steroldoppelschicht verteilt; oder (3) sowohl eine wasserlösliche Verbindung eingeschlossen als auch eine wasserunlösliche Verbindung in einem Liposompräparat eingeschlossen wird.

Für die praktische Ausführung der Erfindung kann jede Salzform eines organischen Säurederivats eines Sterols, die vollständig geschlossene Doppelschichten in wäßrigen Lösungen (d.h. Liposomen) bilden kann, eingesetzt werden. Die Eignung einer bestimmten Salzform eines organischen Säurederivats eines Sterols hängt von seiner Fähigkeit ab, eine wasserlösliche Verbindung so abzuschließen, daß die Verbindung nicht mit der äußeren Umgebung in Berührung kommt. Um einwandfrei bestimmen zu können, ob die Einschließung im wäßrigen Raum eines Liposome erfolgt ist, wurden die folgenden Kriterien festgelegt (siehe Sessä und Weissmann, 1970, J. Biol. Chem. 245:3295): (a) es muß eine klare Trennung von freierund eingeschlossener Verbindung vorhanden sein, die mit Hilfe der Gelfiltration nachgewiesen wird; (b) es darf keine hydrophobe oder Ladungs-Ladungs-Wechselwirkung zwischen der äußersten Bläschen-Doppelschicht und der eingeschlossenen Verbindung bestehen, weil sonst die Trennung der freien Verbindung von dem Liposom durch Molekularsieben nicht zu erreichen ist, wodurch künstlich der scheinbare Sequestrierungs- oder Einkapselungswirkungsgrad

erhöht wird. Zur Ausschaltung dieser Möglichkeit muß nachgewiesen werden, daß die zu einer Suspension von vorher gebildeten Liposomen gegebene wasserlösliche Verbindung nicht mehr vorgeformter Liposomen coeluiert: (c) Zerreißen von gel-filtrierten Liposomen durch die Anwendung von Detergentien oder anderen Membranstörmitteln muß eine Verschiebung in dem Gelfiltrationsverlauf des abgeschlossenen Moleküls von einer mit Liposompeak zusammenfallenden Position zu einer, die mit dem freien Molekül coeluiert, zur Folge haben.

Im allgemeinen kann jedes Sterol, das durch die Anfügung einer organischen Säure modifiziert werden kann, in der erfindungsgemäßen Praxis verwendet werden. Solche Sterole umfassen beispielsweise, sind aber nicht darauf beschränkt, Cholesterin, Vitamin D, Phytosterole (einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Sitosterol, Campesterol, Stigmasterol und dergleichen) Steroidhormone und dergleichen.

Organische Säuren, die zum Derivatisieren der Sterole verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Carbonsäure, Dicarbonsäure, Polycarbonsäuren, Hydroxysäuren, Aminosäuren und Polyaminosäuren. Da die Salzformen die Wasserlöslichkeit von organischen Säuren erhöhen, kann jede organische Säure zum Derivatisieren der Sterole eingesetzt werdendes kann jedoch ein Vorteil erzielt werden, wenn die organische Säurekomponente selbst wasserlöslich ist. Solche wasserlöslichen organischen Säurekomponenten umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, wasserlösliche aliphatische Carbonsäuren wie Essig-, Propion-, Butter-, Valeriansäuren und dergleichen (N.B. Säuren mit bis zur vier Kohlenstoffatomen sind mit Wasser mischbar; die freie Säure mit fünf Kohlenstoffatomen ist teilweise löslich und die längerkettigen freien Säuren sind tatsächlich unlöslich); wasserlösliche aliphatische Dicarbonsäuren wie Malon-, Succin-, Glutar-, Adipin-, Pimelin-, Maleinsäure und dergleichen (N.B. die kürzeren Ketten sind in Wasser wesentlich besser löslich; Grenzlinien-Löslichkeit in Wasser tritt bei C6 bis C₇ auf); und wasserunlösliche aromatische Dicarbonsäuren wie Hemimeilith-, Trimesin-, Succinimidsäure und dergleichen; Polycarbonsäuren; wasserlösliche Hydroxysäuren wie Glycol-, Milch-, Mandel-, Glycerin-, Malin-, Weinstein-, Zitronensäure, und dergleichen (N.B. α-Hydroxysäuren, die eine an einen α-Kohlenstoff der Carbonylgruppe angefügte verzweigte Kette enthalten, wären gegen Hydrolys weniger empfindlich und daherfür die erfindungsgemäße Praxis vorteilhaft); und jede der Aminosäuren und Polyaminosäuren.

Die organische Säure kann an die Hydroxylgruppe des Sterols über eine Ester-oder eine Etherbindung unter Anwendung herkömmlicher Methoden geknüpft sein (siehe beispielsweise US-PS 3.859.047; US-PS 4.040.784; US-PS 4.042.330; US-PS 4.183.847; und US-PS 4.189.400). Die Salzformen der derivatisierten Sterole können durch Auflösen sowohl des organischen Säürederivats des Sterols als auch des Gegenions des Salzes (z.B. der freien Base des Salzes) in einem entsprechenden flüchtigen Lösungsmittel und Entfernen des Lösungsmittels durch Verdampfen oder eine ähnliche Technik, damit ein Rückstand zurückbleibt, der aus der Salzform des organischen Säurederivates des Sterols besteht, hergestellt werden. Zur Bildung des entsprechenden Salzes können folgende Gegenionen verwendet werden, sind aber nicht darauf beschränkt, Tris-2-amino-2-methyl-1,3-propandiol, 2-Aminoethanol, Bis-tris-propan, Triethanolamin und dergleichen. Tatsächlich kann die freie Base eines ionisierbaren biokativen Mittels, wie freie Miconazolbase und dergleichen, als das Gegenion verwendet werden. Daher kann das bioaktive Mittel als ein Gegenion eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäßen Sterolliposome können dadurch hergestellt werden, daß zu einer wäßrigen Phase eine Salzform eines organischen Säürederivats eines Sterols gegeben wird, das Doppelschichtne bilden kann, so daß das derivatisierte Sterol in einer zur Bildung von Bläschen ausreichenden Mengen vorhanden ist (d. h. vollständig geschlossene Doppelschichten, die einen eingeschlossenen wäßrigen Raum enthalten). Das Präparat wird anschließend geschüttelt, bis eine milchige Suspension von multilamellaren Sterolbläschen gebildet wurde. In dem bevorzugten Ausführungsbeispiel sollte die wäßrige Phase das Salz in Lösung enthalten, um die Bläschenbildung zu erleichtern. Außerdem sollte der wäßrige Puffer, wenn die dissoziierte Salzform des organischen Säurederivats des Sterols bei neutralem pH-Wert negativ geladen ist, im wesentlichen frei von mehrwertigen Kationen sein. Gleichfalls sollte der wäßrige Puffer, wenn die dissoziierte Salzform des organischen Säurederivats bei neutralem pH-Wert positiv geladen ist, weitgehend frei von mehrwertigen Anioneh sein.

Im vollkommenen Gegensatz zu den zur Bildung multilamellarer Bläschen veröffentlichten Verfahren (z.B. Phospholipoidbläschen oder der Cholesterinliposome von Brockerhoff und Ramsammy, 1982, Biochem. Biophys. Acta 691: 227-232), ist die Verwendung von organischen Lösungsmitteln zur Bildung der multilamellaren Sterolbläschen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht erforderlich. Außerdem ist im Gegensatz zu dem Verfahren von Brockerhoff und Ramsammy (siehe oben) auch eine Beschallung nicht erforderlich, um multilamellare Sterolbläschen bilden zu können. Tatsächlich können eine Beschallung der erfindungsgemäßen milchigen Suspension von multilamellaren Sterolbläschen oder die Anwendung einer Französischen-Presse (SLM-Aminco, Urbana, 111.) und anschließende Beschallung erfolgen, um die milchige Suspension der multilamellaren Sterolbläschen in eine klare Suspension unilamellarer Sterolbläschen umzuwandeln. Mehrmalige Extrudieren der multilamellaren Sterolbläschen kann bei mäßigem Druck durch ein Filter mit einer Porengröße von gleich oderwenigerals 100nm Durchmesser vorgenommen werden, um unilamellare Sterolbläschen zu gewinnen. Dieses Extrudierverfahren wird ausführlich in der gleichfalls anhängigen Anmeldung, Anmeldeaktenzeichen 622.690, eingereicht am 20. Juni 1984 von Cullis, u.a. für „Extrusion Technique for Producing Unilamellar Vesicles" (Extrudierverfahren zur Erzeugung unilamellarer Bläschen) beschrieben, die hier durch Bezugnahme einbezogen wird.

Wie oben erwähnt, kann die Tris-Salzform jedes organischen Säurederivats eines Sterols vorteilhaft bei der erfindungsgemäßen Praxis eingesetzt werden. Zum Beispiel ist die Tris-Salzform einer Sterolhemidicarbonsäure wie ein Sterolhemisuccinat oder eine Mischung von Sterolhemisuccinatenfürdie Bildung der Bläschen-Doppelschichten derfürdiein-vivo-Verabreichung vorgesehenen Steroidliposome besonders geeignet. Wird beispielsweise Cholesterinhemisuccinat verwendet, dann können 2,5 bis 700μ,ΜοΙ der Tris-Salzform zu 2,0 ml wäßrigem Puffer, derTris-HCI (Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid) enthält, zur Bildung von Bläschen gegeben werden; in diesem Fall sollte der wäßrige Puffer im wesentlichen frei von zweiwertigen oder mehrwertigen Kationen sein.

Erfindungsgemäß kann das Einschließen von wasserlöslichen Verbindungen, wasserunlöslichen Verbindungen oder schwachwasserlöslichen Verbindungen in aus der Salzform von organischen Säurederivaten von Sterolen bestehende Liposome auf den verschiedensten Wegen vorgenommen werden:

(1) Eine wasserunlösliche Verbindung kann zu einer Suspension von Sterolliposomen (entweder multilamellaren Sterolbläschen oder unilamellaren Sterolbläschen) gegeben werden, die nach der obigen Beschreibung hergestellt wurden, indem eine entsprechende Salzform eines organischen Säurederivats eines Sterols verwendet wurde. Die Verbindung wird in die Liposome· eingeschlossen, weil sie sich in den Steroldoppelschichten verteilt. Dieses Ausführungsbeispiel kann am besten wie folgt ausgeführt werden: Die wasserunlösliche Verbindung kann in einem entsprechenden organischen Lösungsmittel gelöst werden, das anschließend verdampft wird, so daß ein Film oder Rückstand der Verbindung zurückbleibt. Wenn eine wäßrige Suspension von vorher gebildeten Sterolliposomen zu dem Rückstand gegeben wird, wird der Rückstand in den Doppelschichten der Sterolliposome eingeschlossen.

(2) Eine wasserunlösliche Verbindung und die Salzform eines organischen Säurederivats eines Sterols können beide in einem organischen Lösungsmittel cosolubilisiert werden, das dann verdampft wird, so daß ein aus einer homogenen Verteilung der wasserunlöslichen Verbindung und dem Sterolderivat bestehender Film zurückbleibt. Eine Suspension multilamellarer Sterolbläschen, die die eingeschlossene Verbindung enthalten, wird mit einer wäßrigen Phase gebildet, die unter Schütteln zu dem Film gegeben wird. Die multilamellaren Bläschen können wie oben beschrieben in unilamellare Bläschen umgewandelt werden.

(3) Eine wasserlösliche Verbindung oder eine wasserunlösliche Verbindung kann in die Sterolliposome eingeschlosen werden, indem die Verbindung zu der bei der Herstellung der Sterolbläschen verwendeten wäßrigen Phase gegeben wird, d. h. die Verbindung kann vor oder gleichzeitig mit der Zugabe der Salzform eines organischen Säurederivats eines Sterols zu der wäßrigen Phase gegeben werden. In diesem Fall wird eine wasserunlösliche Verbindung eingeschlossen, wenn sie sich während der Bläschenbildung in den Doppelschichten verteilt; dagegen wird eine wasserlösliche Verbindung in den wäßrigen Raum der Sterolbläschen während der Bläschenbildung eingeschlossen. In beiden Fällen können die multilamellaren Bläschen wie oben beschrieben in unilamellare Bläschen umgewandelt werden.

(4) Wenn das biokative Mittel ionisierbar ist, dann kann die freie Base des bioaktiven Mittels als Gegenion zur Herstellung der Salzform des organischen Säurederivats eines Sterols verwendet werden. Die Sterolliposome können nach jedem der oben beschriebenen Verfahren unter Verwendung der aus dem bioaktiven Mittel gebildeten Salzform des organischen Säurederivats des Sterols hergestellt werden. Zum Beispiel kann die freie Base von Miconazol, eines Antimykotikums, zur Herstellung des Salzderivates in diesem erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiels verwendet werden.

Unter Anwendung eines der vier oben beschriebenen Verfahren kann sowohl eine wasserlösliche Verbindung als auch eine wasserunlösliche Verbindung in ein Sterolliposom-Präparat eingeschlossen werden.

Bei den oben beschriebenen Verfahren für die Einschließung von wasserunlöslichen Verbindungen unter Anwendung der erfindungsgemäßen Sterolbläschen ist es nicht erforderlich, daß die Bläschen intakt bleiben, sobald sich eine wasserunlösliche Verbindung in den Doppelschichten, verteilt hat. Es ist durchaus vorstellbar, daß die Bläschen, sobald sich die Verbindung in den Doppelschichten verteilt hat, zerstört und zerrisssen werden, so daß Auslaufen öder Freisetzung von wäßrigen, eingeschlossenen Verbindungen erfolgen kann.

Nach einem erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiel werden Sterolliposome unter Verwendung der Tris-Salzform von Cholesterinhemisuccinat wie folgt hergestellt: 4,5 bis 200 mg der Tris-Salzform von Cholesterinhemisuccinat werden je ml wäßrigem Puffer, der 0,01 M Tris-HCI, 0,14 M NaCI enthält, zugegeben. Die Mischung wird geschüttelt, und es wird eine milchige Suspension von multilamellaren Cholesterinhemisuccinat-Bläschen gebildet. Die Bläschen können durch Zentrifugieren pelletisiert und wiederholt mit wäßrigem Puffer gewaschen werden. Die Suspension von multilamellaren Cholesterinhemisuccinatbläschen (CHS-MLVs) kann beschallt werden (z.B. in einem badartigen .Beschallungsgerät), Um kleine unilamellare Cholesterinhemisuccinat-Bläschen (CHS-SUVs) zu bilden. Alternativ können die CHS-MLVs durch eine Französische-Druckzelle (French Press) mit 40000psi gepreßt werden, oder die CHS-MLVs können durch zwei 100-nm-Nucleopore (TM)-Filter mit 300 bis 400 Pa passiert werden, um CHS-SUVs zu bilden. Die Cholesterinhemisuccinat-Bläschen (gleich ob MLVs oder SUVs) sind in Gegenwart von zweiwertigen Kationen unbeständig; d.h. bei der Einwirkung von zweiwertigen Kationen werden der eingeschlossene wäßrige Raum und die wasserlöslichen Verbindungen freigesetzt. Daher sollte das für die Herstellung oder während der Lagerung der Bläschen verwendete wäßrige Medium weitgehend frei von zweiwertigen Kationen sein.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eingeschlossenen Verbindungen können auf verschiedene Weise verwendet werden. Wenn es sich bei der Verbindung beispielsweise um ein bioaktives Mittel handelt, kann die in Sterolliposom eingeschlossene Verbindung in vivo verabreicht werden. Dadurch wird die in-vivo-Freisetzung von bioaktiven Mitteln erleichtert, die normalerweise in wäßrigen Lösungen unlöslich oder nur schwachlöslich sind. Durch das Einschließen in aus der Salzform von organischen Säurederivaten von Sterolen zusammengesetzten Liposome wird die Verabreichung solcher unlöslicher Verbindungen in einem höheren DosisiVolumen-Verhältnis erleichtert. Tatsächlich lassen sich die erfindungsgemäßen Sterolbläschen besonders vorteilhaft in vivo anwenden, weil die Bläschen zum Einschließen von einem oder mehreren bioaktiven Mittel(n) für die Abgabe in vivo verwendet werden können. Außerdem bieten die erfindungsgemäßen Bläschen einen Vorteil gegenüber herkömmlichen Lipoidbläschen oder Liposomen, wenn sie in vivo angewendet werden, weil sie ohne die Verwendung organischer Lösungsmittel hergestellt werden können. Das Verhalten des eingeschlossenen Mittels in vivo hängt vom Verabreichungsweg oder der Verabreichungsart ab. Wenn beispielsweise das in Sterolliposom eingeschlossene Mittel intravenös verabreicht wird, erfolgt die Freisetzung des Mittels in vivo auf einem anderen Weg als die von nichteingeschlossenem Mittel oder von einem Mittel, das in herkömmlichen aus Phospholipoiden zusammengesetzten Liposomen (d. h. MLVs, SUVs, REVs, LUVs) eingeschlossen ist. Andererseits resultiert die intramuskuläre Verabreichung des in Sterolliposom eingeschlossenen Mittels in einer anhaltenden Freigabe des Mittels in vivo.

Tatsächlich kann jedes bioaktive Mittel in den erfindungsgemäßen Sterolliposomen eingeschlossen werden. Solche Mittel umfassen, sind aber nicht auf diese beschränkt; antibakterielle Mittel, Antivirusmittel, Antimykotika, Antiparasitenmittel, Antitumormittel, Antimetaboliten, Polypeptide, Peptide, Proteine, Toxine, Enzyme, Hormone, Neuromittlersubstanzen, Glycoproteine, Lipoproteine, Immunoglubuline, Immunomodulatoren, Vasodilatoren, Farbstoffe, radiomarkierte Atome, radioopake Verbindungen, fluoreszente Verbindungen, Rezeptorbindemoleküle, entzündungshemmende Verbindungen, Antiglaukomverbindungen, pupillenerweiternde Verbindungen, Lokalanästhetika, Narkotika, Vitamine, Nucleinsäure, Polynucleotide usw. Das gleichzeitige Einschließen von zwei oder mehr Verbindungen kann besonders dann empfehlenswert sein, wenn solche Verbindungen komplementäre oder synergistische Wirkungen hervorrufen.

Das in Sterolliposom eingeschlossene Mittel kann in vivo auf jedem geeigneten Weg verabreicht werden, und zwar durch, allerdings nicht darauf beschränkt: Impfen oder Injektion (z. B. intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, intraaural, intraartikulär, intramammär und dergleichen), örtliche Anwendung (z.B. auf Bereiche wie Augen, Haut, in Ohren oder auf Verletzungen wie Wunden und Verbrennungen) und durch Absorption durch Epithel- oder Schleimhäute (z. B; nasale, orale, vaginale, rektale, gastrointesinale Schleimhäute und dergleichen).

tn einem anderen Anwendungsbeispiel kann die in Sterolliposom eingeschlossene Verbindung in eine breite Palette von Stoffen eingebaut werden, und zwar, aber nicht darauf beschränkt, andere Lipoidbläschen oder Liposome, Gele, Öle, Emulsionen und dergleichen. Beispielsweise kann die Suspension von Sterolliposomen, die die eingeschlossene Verbindung enthält, zu der wäßrigen Phase als ein Bestandteil in jeder Art von Liposom-Präparat gegeben werden (z.B. Phospholipoid MLVs, SUVs, LUVs, REVs und andere). Dadurch kann die Verbindung in Phospholipoidliposome eingeschlossen werden. Andere Anwendungsmöglichkeiten können je nach den betreffenden Eigenschaften eines Präparats von Fachleuten ins Auge gefaßt werden. Wegen ihrer Sensitivität gegenüber zweiwertigen Kationen können die erfindungsgemäßen Cholesterinhemisuccinatliposome so zubereitet werden, daß sie Indikatorfarbstoffe einschließen, die auf zweiwertige Kationen empfindlich reagieren und daher für den Gebrauch bei kolorimetrischen diagnostischen Nachweisen in vitro geeignet sind. Das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise angewandt werden für die Herstellung antifuhgaler CHS-tris-Zusammensetzungen.

Das Tris(hydroxymethyl)aminomethansalz von Cholesterinsuccinat („CHS-Tris") bildet ein halbfestes Gel, wenn es in hoher Konzentration (zum Beispiel etwa 100 mg/ml oder höher) in heißen organischen Lösungsmitteln wie Ethanol gelöst wird und dann auf etwa 25⁰C abkühlen kann. Das resultierende Gel hat eine einheitlichere Beschaffenheit, wenn die heiße Lösungsmittel-CHS-Tris-Lösung kurz in einem Badbeschallungsgerät beschallt wird. Das Lösungsmittel in dem Gel kann durch Verdampfen in Luft oder unter Vakuum entfernt werden. Das Gel dispergiert (vor oder nach der Entfernung des Lösungsmittels) nach der Hydratisierung als kleine Bläschen.

Bioaktive Mittel, beispielsweise Antimykotikaverbindungen, können vor der Gelbildung in das Gel eingearbeitet werden, und das Gel kann dann intravaginal, intrarektal, örtlich oder oral verabreicht werden. Antimykotikaverbindungen, die in den erfindungsgemäßen Formulierungen vorhanden sein können, sind Miconazol, Terconazol, Econazol, Isoconazol, Tioconazol, Bifonazol, Butaconazol, Itraconazol, Oxiconazol, Fenticonazol, Nystatin, Naftifin, Ketoconazol, Ciclopiroxolamin, Clotrimazol, Zinoconazol, Amphotericin B und dergleichen. Es ist vorgesehen, daß freie Basen oder pharmazeutisch annehmbare Salze der Antimykotikaverbindungen im Geltungsbereich der Erfindung liegen. Unter einem pharmazeutisch annehmbaren Salz ist eines zu verstehen, das nicht toxisch ist und keine unannehmbaren Nebenwirkungen hevorruft. Im allgemeinen kann jede mit den Formulierungen verträgliche Anti mykotikaverbindung verwendet werden. Vordem Gelieren können andere Bestandteile zu der Ethanollösung gegeben werden, um den fertigen Proben wünschenswerte physikalische Eigenschaften wie Weichheit, Gleitfähigkeit, Beständigkeit, Geruch, Geschmack und dergleichen zu verleihen. Brauchbare zusätzliche Ingredienzien sind Wachse, Pflanzbutterarten, wie entweder von pflanzlichen Fetten abgeleitete Hartbutter triglyeeride von Laurinsäure, oder Kakaobutter und Phospholipoide, wie Ei-Phosphocholin. Organische Carbonsäuren, die schwach bis mäßig sauer sind, wie Milchsäure, können zur Senkung des pH-Wertes und/oder Erhöhung der Löslichkeit von basischen Medikamenten zugesetzt werden. Vorzugsweise hat die organische Carbonsäure bis zu 12 Kohlenstoff atome, besser noch bis zu 6 Kohlenstoffatomen. Eine bessere Solubilität von polaren basischen Antimykotika, wie Terconazol, in CHS-Tris wird erzielt, wenn etwa 5 bis 15 Ma.-% einer organischen Carbonsäure wie Milchsäure in der Formulierung vorhanden sind. Bestimmte Verbindungen wie Milchsäure können auch wegen ihrer Fähigkeit, Wasser zu halten und somit die Formulierung „Weich zu machen" erwünscht sein. Die zusätzlichen Ingredienzien oder Arzneimittelträger sollten beständig, pharmazeutisch annehmbar, d. h. nicht toxisch sein, dürfen die Wirksamkeit und die Sicherheit des bioaktiven Mittels nicht negativ beeinflusen und sollten für die Art der Verabreichung, wie z. B. intravaginal, angemessen sein.

Erfindungsgemäß können auch Suppositorien hergestellt werden. Das Gel kann in jedem beliebigen Behälter geformt werden. Für Suppositorien können die Gele in Formen entsprechender Größe und Gestalt geformt und als ein intravaginales Zäpfchen verabreicht werden, das langsam „dispergiert" und Liposome in vivo bildet. Das Gel kann auch vor Gebrauch hydratisiert werden, um eine Creme oder Suspension zu bilden, die örtlich oder intravaginal verabreicht wird. Wie durch Röntgenstrahlenbeugung gezeigt wurde, bestehen die hydratisierten Gele aus multüamellaren Strukturen, die für Liposome typisch sind, Alternativ kann das Gel mit Hilfe anderer, dem Fachmann bekannter Verfahren als Cremes oder Suspensionen hergestellt werden.

Bei der Herstellung von Suppositorien lassen sich die CHS-Tris-Gele im allgemeinen wegen mangelhafter Adhäsion oder Gelpartikel aneinander nur schlecht formen. Daher kann ein Wachs, eine Pflanzenbutter, ein Phospholipoid oder ein anderes Formmittel zugegeben werden. Bei Hartbutterarten wie Wecobee M liegt das Masseverhältnis von CHS-Tris und Hartbutter etwa zwischen 0,15:1 und 4:1. In Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Ausg., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1980, Seiten 1530 bis 1533, werden Suppositorienformulierungen beschrieben, und dieser Artikel wird hier durch Bezugnahme einbezogen. Bei Phospholipoiden wie Ei-Phosphocholin liegt das Masseverhältnis von CHS-Tris zur Phospholipoid zwischen etwa 10:1 und 1:1. Bei der Verwendung von Phospholipoiden wie Ei-Phosphocholin kann eine organische Carbonsäure, die zum Beispiel 1 bis 6 Kohlenstoffatome hat, wie Milchsäure, zugesetzt werden, um die Solubilität des Antimykotikums notfalls zu erhöhen. Die Menge der einem Antimykotikum, wie Miconazol oder Terconazol, zugesetzten Milchsäure ist vorzugsweise äquimolar oder geringer.

Es werden Wachse, Pflanzenbutterarten und dergleichen gewählt, die mit der Antimykotikum-CHS-Tris-Formulierung verträglich sind, bei Raumtemperatur fest sind und bei Körpertemperatur schmelzen. Phospholipoide, die verträglich mit der Antimykotikum-CHS-Tris-Formulierung sind und sich in der Vaginalschleimhaut dispergieren, werden gewählt. Andere im Fachgebiet bekannte Trägermittel können für die intravaginale Verabreichung der erfindungsgemäßen Formulierungen verwendet werden.

Weiterhin können erfindungsgemäß Cremes hergestellt werden. Erfindungsgemäße CHS-Tris-Cremeformulierungen werden durch Auflösen von CHS-Tris in einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise zwischen etwa 50 und 100 mg CHS-Tris je ml Lösungsmittel, hergestellt. Brauchbare Lösungsmittel sind Alkohole wie Methanol.

Ethanol und Isopropanöl, oder diejenigen, in denen die Antimykotikaverbindung oder das andere bioaktive Mittel löslich ist. Das CHS-Tris wird dem siedenden Lösungsmittel zugesetzt, das dann von der Wärmequelle entfernt wird. Das bioaktive Mittel wird danach unter leichtem Rühren zugegeben. Die resultierende Lösung wird in einen großen Behälter gegossen, so daß eine beträchtliche freiliegende wirksame Oberfläche der Lösung zur leichten Lösungsmittelverdunstung vorhanden ist.

Die Lösung wird kurzzeitig etwa 30 bis 180 Sekunden lang beschallt, bis das Gelieren beginnt. Die Begriffe „Gel" und „Gelieren" beziehen sich auf eine viskose Zusammensetzung, die in ihrer Beschaffenheit einem Gelee oder Gelatine ähnelt. Die kolloidalen Eigenschaften der viskosen Zusammensetzung sind nicht bekannt. Der Behälter wird fest zugedeckt, und das Gelieren ist bei etwa 20 bis 30°C, vorzugsweise bei 25⁰C, im Laufe von etwa vier Stunden abgeschlossen. Der Deckel wird abgenommen und das Lösungsmittel kann verdunsten. Das Lösungsmittel kann auch unter Vakuum entfernt werden.

Das resultierende trockene Gel ist fest und kann in Stücke geschnitten und in einem Mischer mit gefrorenem Kohlendioxid gemahlen werden, bis ein feines körniges Pulver erzielt ist. Das Pulver wird mit Wasser gemischt, bis eine homogene Creme in dem verlangten Volumen gewonnen wird. Die Konsistenz der Creme ist von der zugegebenen Wassermenge abhängig. Im allgemeinen ist die resultierende Zusammensetzung, wenn die endgültige Konzentration von CHS-Tris weniger als etwa 200 mg/ ml beträgt, fließfähig und könnte als Spülung verabreicht werden. Alternativ kann eine Creme durch die Zugabe von Wachsen oder dergleichen hergestellt werden, die die Viskosität der Zusammensetzung erhöhen. Wenn die Konzentration etwa 200 bis 400mg/ml beträgt, kann die resultierende Zusammensetzung als Creme verabreicht werden. Liegt die Konzentration höher als etwa 450 mg/ml, dann wird die resultierende Zusammensetzung ein halbfestes bis festes Gel sein, das als Suppositorium verabreicht werden könnte.

Erfindungsgemäße CHS-Tris-Formulierungen, die Antimykotika, wie Miconazol, Terconazol und dergleichen enthalten, sind für die Behandlung von Vaginalinfektionen, wie sie durch Candida, zum Beispiel Candida albicans, bei Säugetieren, einschließlich Menschen hervorgerufen werden, nützlich. Infektionen in anderen Körperteilen, wie Mundfäule, können gleichfalls unter Einsatz erfindungsgemäßer Formulierungen behandelt werden. Diese Formulierungen werden am besten intravaginal als Spülungen, Cremes oder Suppositorien verabreicht. Die Menge des Antimykotikums in Spülungs-, Creme- oder Suppositoriumdosisformen wird von verschiedenen Faktoren abhängen, zum Beispiel der Stärke des Medikaments, der durch das Medikament hervorgerufenen Reizung, wie schnell des Medikament durch normale Vaginalsekretionen aus dem Vaginalraum ausgespült wird, usw., kann aber zwischen etwa 10 und 1 500 mg liegen. Zum Beispiel sind 50 mg bis 1,2 g bei Miconazol oder etwa 20 mg bis 480mg bei Terconazol nützliche Dosen. Diese Mengen des Medikaments kann in ein etwa 3g oder weniger wiegendes Suppositorium oder in eine Cremedosis von etwa 5 ml oder weniger eingearbeitet werden. Im allgemeinen ist vom Gesichtspunkt der Bequemlichkeit und Annehmlichkeit für den Patienten eine in einem geringeren Volumen verabreichte stärker konzentrierte Formulierung wünschenswerter.

Oftmals ist nur eine Verabreichung der erfindungsgemäßen Formulierung zur Heilung einer auf das Antimykotikum ansprechenden Vaginalinfektion erforderlich. Von einer dem bisherigen Stand derTechnik entsprechenden Formulierung waren im allgemeinen drei bis sechs und sogar bis vierzehn Dosen erforderlich.

Proteine und andere Peptide, vor allem solche, die hydrophob sind, wie Wachstumshormone, Insulin, Lipoproteine niedriger Dichte und dergleichen, können in erfindungsgemäßen Formulierungen vorhanden sein, um sie zu solubilisieren, die >

Freisetzungsgeschwindigkeit zu steuern oder die Wirkungsstelle zu lokalisieren. Die Peptide werden im allgemeinen parenteral, wie intravenös, intramuskulär oder intraperitoneal verabreicht. Für die Verwendung vorgesehene Wachstumshormone umfassen Humanwachstumshormone, Rinderwachstumshormone und Schweinewachstumshormone. Rinderwachstumshormon kann beispielsweise in wäßrigem Puffer unter Verwendung von CHS-Tris solubilisiert werden. Zwischen etwa 5 und 170 mg oder mehr, vorzugsweise 150 bis 170 mg, Rinderwachstumshormon je ml wäßriger Puffer kann mit CHS-Tris, vorzugsweise zwischen etwa 5 und 300 mg CHS-Tris und besser noch zwischen etwa 25 und 50 mg CHS-Tris je ml wäßriger Puffer, solubilisiert werden.

Eine Möglichkeit zur Solubilisierung von Proteinen und anderen Peptiden unter Verwendung von CHS-Tris besteht in der Herstellung eines multilamellaren Liposoms (MLV) in wäßrigem Puffer. Die resultierenden MLVs können in dieser Form verwendet oder beschallt werden, so daß SUV's gewonnen werden. Das Peptid wird in dem Gemisch von wäßrigen Puffer-Liposom suspendiert und verteilt sich in die Liposom-Doppelschichten, wobei es solubilisiert wird. Alternativ kann das solubilisierte Peptid als die wäßrige Phase bei der Herstellung von SPLVs verwendet werden. Die resultierende solubilisierte Peptidzusammensetzung kann einem Säugetier, einschließlich Menschen, verabreicht werden.

Wachstumshormone können zur Steigerung der Milchproduktion oder zur Verbesserung oder Einleitung des Wachstums angewandt werden. Für die intramuskuläre Verabreichung von Rinderwachstumshormon an Milchkühe zur Steigerung der Milchproduktion sind im allgemeinen etwa 10mg pro Tag erforderlich. Für eine erfindungsgemäße über 30 Tage gesteuerte Freisetzungsdosisform werden etwa 300 bis 1200 mg als eine einzige Dosis verabreicht.

Für Dosisformen von Peptiden mit gesteuerter Freisetzung wird die zu verabreichende Menge jeweils von einem Veterinär oder einem Arzt bestimmt. Die Freisetzungscharakteristika der Dosisform, die Menge Peptid, die der Körper aufnehmen kann, toxikologische Erwägungen und dergleichen werden die tatsächliche Dosis bestimmen.

Ausführungsbeispief

Die folgenden Beispiele sollen zur Erläuterung dienen, aber nicht den Geltungsbereich der Erfindung einschränken.

Beispielsweise werden Cholesterinhemisuccinatliposome beschrieben, die wasserlösliche Verbindungen einschließen.

Insbesondere wird in den folgenden Abschnitten die Herstellung von Cholesterinhemisuccinat-Bläschen beschrieben, die Arsenazo III, Inulin oder Chromium einschließen. Parameter wie der Einkapselungswirkungsgrad und das festgehaltene Volumen werden ermittelt; die von Calcium abhängige Instabilität der Cholesterinbläsche;i wird demonstriert. Gefrier-Ätz-Elektronenmikroskopie, Röntgenbeugung und Elektronenspinresonanz der Cholesterinhemisuccinat-Bläschen werden ebenfalls beschrieben.

Speziell beschrieben werden unter Verwendung verschiedener Salzformen von Cholesterinhemisuccinat hergestellte Liposome.

In den folgenden Unterabschnitten wird die Herstellung von CHS-Liposomen unter Anwendung verschiedener Salzformen von Cholesterinhemisuccinat beschrieben.

In allen Beispielen, die Tris-Salzformen von Cholesterinhemisuccinat (anschließend als Tris-Salz-CHS bezeichnet) umfassen, wurde das Tris-Salz-CHS entweder von Sigma Biochemicals, St. Louis, MO, gekauft und ohne Reinigung verwendet, oder wie folgt synthetisiert: 30 ml einer 3,3 M Lösung von Tris-Base wurde zu 1,5 Liter einer 67 M Lösung von Cholesterinhydrogensuccinat (INC, Cleveland, Ohio) in Ethe gegeben. Die resultierende Lösung wurde zu einem nassen Rückstand drehverdampft und 12 Stundenlang lyophilisiert. Das resultierende Tris-Salz-CHS wurde dreimal aus Ethylacetat rekristallisiert. Zurückgebliebenes Ethylacetat wurde durch Erhitzen auf 56⁰C unter Vakuum (0,1 mm Hg) entfernt.

Beispiel 1 Tris-Salz-Cholesterinhemisuccinat-MLVs

Tris-Salz-CHS (54mg) wurde eine 1-ml-Lösung von Arsenazo II! (4,5mM, endgültige Konzentration) in 0,01 M Tris-HCI (pH-Wert 7,3), 0,14M NaCI gegeben. Durch mechanisches Schütteln wurde eine milchige Suspension von CHS-MLVs gebildet. Die CHS-MLVs wurden durch 15 Minuten Zentrifugieren mit 10000 χ g pelletisiert, und das resultierende Pellet wurde dreimal unter Verwendung von 10ml 0,01 M Tris-HCI (pH-Wert 7,3) 0,14M NaCI gewaschen. Das resultierende Peilet hatte eine rote Farbe, ein Anzeichen für die Einschließung von Arsenazo III.

Beispiel 2 ^-Amino^-methyl-i^-propandiol-cholesterinhemisuccinat-MLVs

Das 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiolsalz von Cholesterinhemisuccinat (50 mg) wurde zu einer 1-ml-Lösung von Arsenazo III (4,5mM, endgültige Konzentration) in 0,01 M 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol-HCI (pH-Wert 7,3), 0,07M KCL, 0,07 M NaCI gegeben. Die Suspension von CHS-MLVs wurde durch Wirbelmischen mit Glasperlen gebildet. Die CHS-MLVs wurden durch 15 Minuten Zentrifugieren mit 10000 x g pelletisiert, und das resultierende Pellet wurde dreimal nach der Beschreibung in Beispiel 1 gewaschen. Das resultierende Pellet war rotgefärbt, ein Anzeichen für die Einschließung von Arsenazo III.

Beispiel 3 2-Aminoethanol-cholesterinhemisuccinat-MLVs

Das 2-Aminoethanolsalz von Cholesterinhemisuccinat (50 mg) wurde zu einer 1-ml-Lösung von Arsenazo III (4,5 mM, endgültige Konzentration) in 0,01 M 2-Aminoethanol-HCI (pH-Wert 7,3), 0,07 M KCL, 0,07 M NaCI gegeben. Die Suspension von CHS-MLVs wurde durch Wirbelmischen mit Glasperlen gebildet. Die CHS-MLVs wurden durch 15 Minuten Zentrifugieren mit 10000 x g pelletisiert, und das resultierende Pellet wurde dreimal nach der Beschreibung in Beispiel 1 gewaschen. Das resultierende Pellet war rot gefärbt, ein Anzeichen für die Einschließung von Arsenazo III.

Beispiel 4 Bis-tris-propan-cholesterinhemisuccinat-MLVs

Die Bis-tris-propansalzvon Cholesterinhemisuccinat (50 mg) wurde zu einer 1-ml-Lösung von Arsenazo III (4,5 mM, endgültige Konzentration) ίηΟ,ΟίΜ Bis-tris-propan-HCI (pH-Wert 7,3), 0,07 M KCI, 0,07M NaCI gegeben. Die Suspension der CHS-MLVs wurde durch Wirbelmischen mit Glasperlen gebildet. Die CHS-MLVs wurden durch 15 Minuten Zentrifugieren mit 10000 χ g pelletisiert, und das resultierende Pellet wurde dreimal nach der Beschreibung in Beispiel 1 gewaschen. Das resultierende Pellet war rot gefärbt, ein Anzeichen für die Einschließung von Arsenazo III.

Beispiel 5 Triethanolamin-cholesterinhamisuccinat-MLVs

DasTriethanolaminsalzvon Cholesterinhemisuccinat (50mg) wurde zu einer 1-ml-Lösung von Arsenazo III (4,5mM), endgültige Konzentration) in 0,01 M Triethanolamin-HCI (pH-Wert 7,3), 0,07 M KCI, 0,07 M NaCI gegeben. Die Suspension von CHS-MLVs wurde durch Wirbelmischen mit Glasperlen gebildet. Die CHS-MLVs wurden durch 15 Minuten Zentrifugieren mit 10000 χ g pelletisiert, und das resultierende Pellet wurde dreimal nach der Beschreibung in Beispiel 1 gewaschen. Das resultierende Pellet war rot gefärbt, ein Anzeichen für die Einschließung von Arsenazo IM. »

Beispiel 6 Miconazol-Cholesterinhemisuccinat-MLVs

Die freie Base von Miconazol wurde wie folgt hergestellt: Eine wäßrige Lösung von NaOH wurde in eine Suspension von Miconazolnitrat in Ether titriert. DieEtherphase wurde gesammelt, und der Ether wurde verdampft, so daß ein die freie Base von Miconazol enthaltendes Öl zurückblieb. Das Öl wurde anschließend zu Cholesterinhydrogensuccinat enthaltendem Ethanol gegeben. Das Ethanol wurde verdampft, so daß ein aus der Salzform von Miconazol-Cholesterinhemisuccinat bestehender Film zurückblieb. Danach wurde eine salzige Lösung dem Film zugesetzt. Nach gründlichem Wirbelmischen wurden Bläschen in der Lösung festgestellt.

Beispiel 7 Cholesterinhemisuccinat-SUVs, hergestellt durch Beschallung

CHS-MLVs wurden nach der Beschreibung in den Beispielen 1,2,3,4 und 5 hergestellt, nur wurde dabei auf das Arsenazo III verzichtet. Jedes fertige Pellet von Bläschen wurde wieder in 2 ml des Puffers, in dem es hergestellt worden war, suspendiert und in einem Bad-Beschallungsgerät beschallt, bis die milchige Suspension klarwurde, ein Anzeichen für die Umwandlung von CHS-MLVs in CHS-SUVs.

' Beispiel 8 Cholesterinhemisuccinat-SUVs, hergestellt durch Extrudierverfahren

CHS wurde in 1OmM HEPES, 15OmM NaCI (pH-Wert 7,5) in einer Konzentration von 100mg/ml dispergiert. Dieses Material wurde zehnmal durch ein 30-nm-Nucleopore-Polycarbonatfilter extrudiert, so daß CHS-SUVs gewonnen wurden.

Beispiel 9 Miconazol-CHS-Tris-Creme

Das Tris(hydroxymethyl)aminornethan(„Tris")-Salz von Cholesterylhemisuccinat („CHS-Tris") (20,64g); wurde in 206ml siedendem Ethanol gelöst. Wenn die Ethanol-CHS-Tris-Lösung klar war, wurde sie von der Wärmequelle entfernt, und 5,16 Gramm Miconazol base in 103ml Ethanol wurden unter leichtem Rühren zugegeben. Die klare Lösung wurde in eine große flache Schale (243 x 243 χ 18mm) gegossen und kurz in einem großen Badbeschallungsgerät beschallt, bis das Gelieren einsetzte. Die Schale wurde dann fest zugedeckt und zum vollständigen Gelieren vier Stunden lang bei 25°C stehen gelassen. Der Deckel wurde abgenommen, und das Ethanol konnte verdunsten. Das getrocknete Gel wurde anschließend in Stückchen geschnitten, in einen Mischer mit gefrorenem Kohlendioxid gegeben und gemahlen, bis ein feines körniges Pulver erzielt worden war. Das

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resultierende Pulver wurde mit sterilem destilliertem Wasser gemischt, bis eine homogene Creme mit einem Endvolumen von 51,6ml mit einer Konzentration von Miconazol von 100mg/ml gewonnen war.

Das Verfahren wurde unter Verwendung von 10,32g Miconazol wiederholt, um eine Creme mit einer Miconazol-Konzentration von 200mg/ml zu gewinnen.

Weitere Miconazol-CHS-Tris-Formulierungen wurden nach den oben beschriebenen Verfahrensweisen und mit den oben beschriebenen Stoffen hergestellt, wobei die Stoffe in folgenden Anteilen vorhanden waren:

Miconazol (mg)	CHS-Tris (mg)	Wasser (mg)
50	100	850
100	200	700
100	400	400
200	400	500

Beispiel 10 Terconazol-CHS-Tris-Creme

CHS-Tris (2,0g) wurde in 200 ml siedendem Ethanol gelöst. Wenn die Ethanol-CHS-Tris-Lösung klar war, wurde sie von der Wärmequelle entfernt, und 1,0gTerconazol (in 50 ml Ethanol) und 83 mg L(+!-Milchsäure (in 2 ml Ethanol) wurden unter leichtem Rühren zugesetzt. Die klare Lösung wurde in ein großes Becherglas gegossen und beschallt, bis das „Gelieren" begann. Das Becherglas wurde fest zugedeckt und zur Beendigung des Gelierprozesses vier Stundenlang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Der Deckel wurde abgenommen, und das Ethanol konnte bei 25⁰C an der Luft verdunsten. Das getrocknete Gel wurde in Stückchen geschnitten, in einen Mischer mit gefrorenem Kohlendioxid gegeben und gemahlen, bis ein feines körniges Pulver entstanden war. Dieses Pulver wurde mit 10 ml Wasser vermischt, das 6,3 g beschallte CHS-Tris-Bläschen enthielt. Die resultierende Suspension wurde mit destilliertem sterilem Wasser gemischt, bis eine homogene Creme mit einem Endvolumen von 20,8 ml gewonnen wurde, die 48 mg Terconazol je ml Creme enthielt.

Beispiel 11 Miconazol-CHS-Tris-Suppositorium

CHS-Tris (400 mg) wurde in 4ml siedendem Ethanol gelöst. 100 mg Miconazolbase in 1 ml Ethanol und 1,2 g eines geschmolzenen Hartbuttertriglycerids von Milchsäure, das von pflanzlichen Fetten stammte, wurden unter leichtem Rühren zugegeben, die resultierende klare Lösung wurde aliquot in 1,5-ml-Polypropylen-Mikroröhrchen verteilt, kurz beschallt (annähernd 60 Sekunden), um das CHS-Tris zu „gelieren ",und zur vollständigen Verfestigung vier Stunden lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Polypropylen-„Form" wurde entnommen, und die halbfesten Gele wurden über Nacht in einem Vakuum-Exsikkator zur Entfernung des zurückgebliebenen Ethanols aufbewahrt.

Andere nach der oben beschriebenen Verfahrensweise hergestellten Miconazol-CHS-Tris-Suppositorium-Formulierungen sind im folgenden aufgeführt:

Miconazol	CHS-Tris	Wecobee M	Milchsäure	Ei-Phosphocholin
(mg)	(mg)	(m9)	(mg)	(mg)
3,4	6,8	80,3
3,4	13,6	20,5
6,9	13,8	80,3
6,9	27,6	44,0
10,3	20,6	80,3 .
20,0	41,0	12,0
20,6	41,2
20,6	° 41,2		2,2	10,3
20,6	41,2	79,4

Beispiel 12 In-vivo-wirksamkeit bei Candida-Infektionen der Vagina

Einer Ovarektonomie unterzogene Ratten (Charles River Bredding Laboratories) wurden wöchentlich mit Beta-Estradiolvalerat behandelt, um einen Zustand konstanter Brunst (und Anfälligkeit für Candida-Infektionen der Vagina) hervorzurufen. Die Ratten wurden intravaginal mit 5 χ 10⁶CFU von Candida albicans geimpft. Vom dritten Tage nach der Impfung an wurden infizierte Ratten intravaginal drei Tage lang zweimal täglich mit 2Ma.-%/Volumen Miconazolnitrat-Creme, 12% Miconazolnitrat-Creme einmal am dritten Tag nach der Impfung oder mit einem erfindungsgemäßen CHS-Tris-Suppositorium- oder Creme-Präparat durch nur einmalige Verabreichung am dritten Tag nach der Impfung behandelt. Einige Ratten wurden nicht behandelt. Am sechsten oder zehnten Tag nach der Impfung wurden den Vagina aller Ratten Proben hinsichtlich Candida albicans entnommen. Ratten mit weniger a\j 25 CFU/Vagina-Abstrich wurden als geheilt betrachtet.

Beispiel 13 Einschließung von Inusil in Cholesterinhemisuccinat-MLVs

Multilamellare Cholesterinhemisuccinat-Bläschen (CHS-MLVs), die ³H-lnulin als das eingeschlossene Mittel enthielten, wurden wie folgt hergestellt: ³H-lnulin (1,0,Ci/ml, New England Nuclear, Boston, MA) wurde in 2 ml 0,01Tris-HCI (pH-Wert 7,3), 0,14 M NaCI gelöst. Anschließend wurden 40mg Tris-Salz-CHS zu der Lösung gegeben, und das resultierende Gemisch wurde mecchanisch durch Schütteln dispergiert. Es bildete sich eine milchige Suspension, ein Anzeichen für die Bildung multilamellarer Bläschen. Die Suspension wurde 2 Stunden lang ruhig stehen gelassen, danach wurde die Suspension auf ein endgültiges Volumen unter Verwendung von TOmI 0,01 MTris-HCI (pH-Wert 7,3). 0,14M NaCI verdünnt. Die Radioaktivität einer 10-ml-Aliquote wurde als 24625ΰριη/10μηι ermittelt, indem die Aliquote zu 10 ml Szintillationsflüssigkeit (40g Omnifluor (New England Nuclear, Boston, MA), 6IToluen,4l Ethylglycolmonoethylether) gegeben und die Radioaktivität unter Verwendung eines Beckmann L6800 Flüssig-Szintillationszählers mit auf 0,400 eingestellten Öffnungen bestimmt wurde. Die Radioaktivität

in Zählungen pro Minute (cpm) wurde in Disintegrationen pro Minute (dpm) durch Anwendung der H # Methode zur Löschkorrektur (Horrock, D. L. The Number Concept, Beckman Instruments, 1977) umgewandelt. Die CHS-MLVs wurden anschließend durch 15 Minuten Zentrifugieren mit 100000 x g pelletisiert. Das resultierende Pellet wurde dreimal durch erneutes Suspendieren des Pellets in 10ml 0,01 M Tris-HCI (pH-Wert 7,3), 0,14M NaCI und erneutes Pelletisieren durch 15 Minuten Zentrifugieren mit 10000 χ g gewaschen. Das gewaschene Pellet von Bläschen wurde erneut in 0,01 M Tris-HCL (pH-Wert 7,3), 0,14M NaCI bis zu einem endgültigen Volumen von 10ml suspendiert; die Radioaktivität einer 10μ,Ι-Aliquote wurde mit3442cpm/10^l ermittelt. Daher war eine Gesamtmenge von annähernd 14% des Ausgangs-³H-lnulins in den CHS-MLVs eingeschlossen wurden.

Beispiel 14 Einkapselungswirkungsgrad von Insulin in Cholesterinhemisuccinat-MLVs und Ei-Phosphatidylcholin-MLVs

Die Einkapselungswirkurigsgrade von Insulin, das in verschiedene Konzentrationen von Cholesterinhemisuccinat aufweisende MLVs eingeschlossen war, wurden mit den Einkapselungswirkungsgraden von Inulin verglichen, das in verschiedene Konzentrationen von Ei-Phosphatidylcholin aufweisende MLVs eingeschlossen war. (N.B. der Einkapselungswirkungsgrad für jedes Liposom wird als der Bruchteil des wäßrigen Raumes, der durch Doppelschichten abgeteilt wird, definiert und in Prozent angegeben, siehe Abschnitt 2.1 oben).

Aus Ei-Phosphatidylcholin (EPC) oder Tris-Salz-CHS bestehende multilamellare Bläschen wurden unter Anwendung identischer Formulierungen hergestellt, um die Einkapselungswirkungsgrade zu vergleichen. Dazu wurde Tris-Salz-CHS in einer Konzentration von 40, 80,160,320 oder 400mg in 2 ml 0,01 M Tris-HCI (pH-Wert 7,3), 0,14M NaCI Puffer mit 5μΙ ³H-lnulin (217,0mCi/mg) durch Wirbeln vermischt und 2 Stunden lang stehen gelassen, wodurch sich CHS-MLVs mit³H-lnulin als der eingeschlossenen Verbindung bildeten. Weitere 3 ml 0,01 M Tris-HCI (pH-Wert 7,3), 0,14 M NaCI Puffer wurden zu der Suspension gegeben, die über Nacht bei Raumtemperatur gehalten wurde. Anschließend wurden annähernd 3,0 ml 0,01 M Tris-HCI (pH-Wert 7,3), 0,14M NaCI Puffer zugesetzt, um das Gesamtvolumen auf 10ml zu bringen.

Aus Ei-Phosphatidylcholin bestehende multilamellare Bläschen (EPC-MLVs) (Avanti, Birmingham, AL) wurden nach folgender Formulierung hergestellt: 40,80,160,320 oder 400 mg/ml EPC wurden in soviel Chloroform suspendiert, daß das Phospholipoid vollständig gelöst wurde. Das Chloroform wurde zur Trockne eingedampft, so daß ein wachsartiger Rückstand an dem Prüfröhrchen zurückblieb. Danach wurden 2,0ml 0,01 MTris-HCI (pH-Wert 7,3), 0,14 M NaCI Puffer mit 5μΙ³Η-ΙηυΙϊη (217,OmCi/ mg) zugegeben, das Gemisch zum „Quellen" stehen gelassen, und die resultierenden EPC-MLVs wurden durch gründliches Wirbelmischen dispergiert. Weitere 3 ml 0,01 MTris-HCI (pH-Wert 7,3), 0,14 M NaCI Puffer wurden zu der Suspension gegeben, die über Nacht bei Raumtemperatur gehalten wurde. Danach wurde das Gesamtvolumen der Mischung durch 0,01 m Tris-HCI (pH-Wert 7,3), 0,14M NaCI Puffer auf 10ml gebracht.

Der Einkapselungswirkungsgrad von ³H-lnulin durch die CHS-MLVs und EPC-MLVs wurde wie folgt bestimmt: Die Radioaktivität in der 20-/xl-Aliquote jedes Anfangsgemischs von Ingredienzien wurde durch Szintillationszählung nach obiger Beschreibung ermittelt. Nach ihrer Bildung wurden die Liposome durch 10 bis 20 Minuten dauerndes Zentrifugieren der Suspension mit 10000 x g pelletisiert, jedes Pellet wurde viermal in 10 ml 0,01 MTris-HCI (pH-Wert 7,3), 0,14M NaCI Puffer gewaschen und erneut bis zu einem endgültigen Volumen von 10 ml in 0,01 MTris-HCI (pH-Wert 7,3), 0,14M NaCI Puffer suspendiert. Die Radioaktivität einer 20-^I-Aliquote dieser fertigen gewaschenen Probe wurde ermittelt. Der Bruchteil der in dieser fertigen Probe gemessenen anfänglichen Radioaktivität repräsentierte das in den Lipoidbläschen eingeschlossene ³H-lnulin. Wie aus Tabelle I hervorgeht, ist eine Erhöhung des Einkapselungswirkungsgrades einer Erhöhung der CHS-Konzentration proportional, aber noch wichtiger ist, daß die unter Verwendung von 20 bis 200 mg/ml CHS hergestellten CHS-MLVs einen höheren Einkapselungswirkungsgrad für Inulin aufweisen als die unter Anwendung der gleichen Konzentration von Phospholipoid hergestellten EPC-MLVs.

Tabelle I Vergleich der Einkapselungswirkungsgrade von Inulin in Phospholipoidbläschen und Cholesterinhemisuccinatbläschen

Konzentration von % ³H^InUUn Eingeschlossene

Lipoid (mg/ml) EPC-MLVs^al CHS-MLVs^bl

10 14 29 38 60

a) Multilamellare Ei-Phosphatidylchlolin-Bläschen

b) Multilamellare Cholesterinhemisuccinat-Bläschen

Um ermitteln zu können, obderEinkapselungswirdungsgrad von CHS-MLVs durch den Zeitraum, in dem das CHS mit freiem ³H-lnulin in wäßrigem Puffer in Berührung stand, beeinflußt wurde, wurden CHS-MLVs wie folgt hergestellt: Entweder wurden 80 oder 300mg Tris-Salz-CHS durch Wirbeln in 20ml 0,01 M Tris-HCI, 0,14M NaCI Puffer, der 10/xl ³H-lnulin (217mCi/mg, spezifische Radioaktivität) enthielt, vermischt, wodurch CHS-MLVs unter Anwendung einer Konzentration von 40 bzw. 150 mg/ml CHS gebildet wurden.

Fünf Proben von jeder der beiden Lipoidkonzentrationen wurden zubereitet, und die CHS-MLVs-Suspensionen wurden bei Raumtemperatur in den 2,0 ml von 0,01 MTris-HCI (pH-Wert 7,3), 0,14 M NaCI Puffer stehen gelassen. In den folgenden Zeitabständen: 0,15, 30, 60 und 120 Minuten wurden die Proben mit dem gleichen Puffer auf 10ml aufgefüllt. Eine anfängliche 10/Al-Aliquote jeder Probe wurde für die oben beschriebene Szintillationszählung entnommen. Die Proben wurden danach 10 Minuten lang mit 10000 x g zentrifugiert, und jedes Pellet wurde viermal in 10 ml Puffer gewaschen. Das fertige Pellet

20	2
40	4
80	5
160	8
200	11

wurde in Puffer bis zu einem endgültigen Volumen von 10ml suspendiert, und die Radioaktivität einer ΙΟμΙ-Aliquote jeder fertigen Probe wurde zu jedem Zeitpunkt mit der der anfänglichen Probe verglichen. Die Ergebnisse zeigten bei jeder getesteten Lipoidkonzentration keinen erheblichen Unterschied im Einkapselungswirkungsg rad zu den fünf Zeitpunkten. Das zeigt, daß die Einschließung von etwa 12% oder 20% des anfänglichen, dem Präparat zugesetzten ³H-lnulins unabhängig von der Kontaktzeit bei 40 bzw. 150 mg/ml erfolgte. Daraus geht hervor, daß im Gegensatz zur herkömmlichen Herstellung von MLVs unter Verwendung von Ei-Phosphatidylcholin, für die Herstellung von CHS-MLVs keine „Quellzeit" erforderlich ist.

Beispiel 15 Einkapselung von Inulin in Cholesterinhemisuccinat-SUVs

Kleine, unilamealre, aus Cholesterinhemisuccinat bestehende Bläschen (CHS-SUVs), die ³H-lnulin als das eingeschlossene Mittel enthielten, wurden wie folgt hergestellt: 100/aI von 1,0mCi/ml³H-lnulin (New England Nuclear, Boston, MA) wurden in 2,5ml 0,01 M Tris-HCI (pH-Wert 7,3), 0,14 M NaCI gelöst, dem entweder 100 oder 200 mg Tris-Salz-CHS zugesetzt worden war. Nach Wirbelmischen mit Glasperlen wurde die Mischung von den Perlen in eine Pipette abgesaugt und bis zur Klärung beschallt, d. h. annähernd 2 Stunden lang. Das Klarwerden der Suspension ist ein Anzeichen für den Übergang von CHS-MLVs in kleine unilamellare Bläschen. Die Endkonzentrationen von CHS in den CHS-SUV-Suspensionen betrugen 40mg/ml bzw. 80mg/ml. Zur Demonstration der Inulin-Einschließung (siehe Abschnitt 5 oben) wurden die CHS-SUVs von uneingeschlossenem Inulin durch Gelfiltration wie folgt getrennt: Jede Liposomsuspension wurde einzeln auf eine Agarose-Säule mit Bio-Gel A, 15m, Siebfeinheit 100 bis 200 (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Ca) mit einem Betriebsbereich von 40000 bis 15000000 Dalton relative Molekülmasse aufgegeben, mit 0,01 M Tris-HCI (pH-Wert 7,3) 0,14M NaCI Puffer äquilibriert und kalibriert. Danach wurden von der Säule eluiertei-ml-Fraktionen gesammelt, und die Radioaktivität einer ΙΟμΙ-Aliquote jeder Fraktion wurde nach obiger Beschreibung bestimmt. Eine klare Trennung von freiem von eingeschlossenem Imulin wurde durch die Gelfiltration erzielt, wodurch die Einschließung des Inulins in den CHS-SUVs demonstriert wurde. Diese Analyse ergab, daß etwa 1 % des Inulins in den CHS-SUVs festgehalten wurde.

Beispiel 16 Einschließung von Chromium in Cholesterinhemisuccinat-MLVs

Multilamellare Cholesterinhemisuccinat-Bläschen, die ⁵¹Chromium als das eingeschlossene Mittel enthielten, wurden wie folgt hergestellt: 15,0,40,0,65,8,100,0,175,0,263,2,526,4 oder 658,0μΜοΙ Tris-Salz-CHs wurden zu 5 ml 0,01 M Tris-HCI, 0,14M NaCI, pH-Wert 7,3, gegeben, worin sich Spuren von ⁵¹Chromium (New England Nuclear, Boston, MA) befanden, und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur stehen gelassen, wodurch sich eine Suspension von CHS-MLVs, die eingeschlossenes ⁵¹Chromium enthielten, ergab.

Beispiel 17 Einkapselungswirkungsgrad von Chromium in Cholesterinhemisuccinat-MLVs

Zur Bestimmung des Einkapselungswirkungsgrades der in Abschnitt 6.4 hergestellten CHS-MLVs wurden Proben jedes Präparates in Dialysierhülsen (Thomas Scientific, Katalog-Nr. 3787-D22, Molekülmasseverringerung von 12000 Dalton), die dreimal in destilliertem Wasser ausgekocht worden waren, pipettiert. Die Proben in den Dialysierhülsen wurden anfangs in einem Gammazähler (TmAnalytic, Modell Nr. 1191 (gezählt. Die Proben wurden anschließend 20 Stunden lang gegen den gleichen 0,01 M Tris-HCI, 0,14M NaCI, pH-Wert 7,3, Puffer in Retentat:Dialysat-Verhältnissen von jeweils über 1:150dialysiert; das Dialysat wurde in den ersten 6 Stunden alle 2 Stunden gewechselt. Der Einkapselungswirkungsgrad wurde durch Berechnung des Prozentanteils von zurückgehaltenen Anfangszählungen ermittelt.

Wie aus Tabelle Il zu erkennen ist, ist eine Erhöhung des Einkapselungswirkungsgrades einer Erhöhung in der CHS-Konzentration proportional.

Tabellen Einkapselungswirkungsgrad von Chromium in Cholesterinhemisuccinat-Bläschen

Konzentration von CHS (μ,ΜοΙ) % eingeschlossenes ⁵¹Chromium

15,0 14,79

40,0 15,20

65,8 15,09

100,0 ' 16,10 165,0 . 20,13

263,2 27,90

526,4 40,74

658,0 48,03

Beispiel 18 In Cholesterinhemisuccinat-MLVs festgehaltenes Volumen: Chromium-Einschließung und Cholesterinhemisuccinat- Konzentration

Das festgehaltene Volumen der nach der Beschreibung in Beispiel17 hergestellten CHS-Bläschen wurde für jede Konzentration von Cholesterinhemisuccinat durch Berechnen des festgehaltenen Gelösten unter Anwendung der folgenden Berechnung ermittelt:

%Einkapselung χ anfängliches wäßriges Volumen ^MoICHS

Die in Fig. 1 angeführten Daten zeigen, daß weniger Chromium/Mol Lipoid eingeschlossen wird, wenn die Konzentration von Tris-Salz-CHS erhöht wird. Somit nimmt, obwohl eine Erhöhung des Einkapselungswirkungsgrades einer Erhöhung der Lipoidkonzentration proportional ist, das festgehaltene Gelöste mit Zunahme der Lipoidkonzentration ab. Die Anzahl von Versuchen je Punkt ist in Klammern heben jedem Punkt angegeben.

Beispiel 19 Ultrastruktur von Cholesterinhemisuccinatliposomen

Proben von CHS-MLVs und CHS-SUVs, die nach der Beschreibung in Beispiel 1 unter Verwendung des Tris-Salzes von Cholesterinhemisuccinat, allerdings unter Verzicht auf das Inulin, hergestellt worden waren, wurden für die Gefrier-Ätz-Elektronenmikroskopie vorbereitet (hinsichtlich der Gefrier-Ätz-Methode siehe Pfenniger u.a., 1975, J. Cell Biol. 65:15 bis 28).

Die Elektronenmikroskopie des gefrier-geätzten CHS-MLV-Präparates ergab einzelne durch mindestens eine Lamelle, d. h.

Liposome oder Lipoidbläschen, gebundene Einheiten. Es bestand eine ungeheure Heterogenität in der Größe der CHS-MLVs, die im Durchmesser von 800 bis lOOOOnm reichte.

Die größeren Bläschen konnten in eine Anzahl von Klassen eingeordnet werden, die diejenigen mit einer oder wenigen äußeren Lamellen und diejenigen mit vielen Lamellen umfassen, die meisten der größeren Bläschen wiesen beträchtliche Bereiche im Inneren mit einem körnigen Aussehen auf, das möglicherweise auf wäßrige Kammern hindeutet. In vielen Fällen waren kleine Bläschen oder Gruppen kleiner Bläschen, mehr oder weniger frei im Inneren der größeren Bläschen, manchmal vier oder fünf Schichten tief, erkennbar.

Diese scheinbare „Nestbildung" wird gewöhnlich bei herkömmlichen, mit einem negativ geladenen Phospholipoid hergestellten Liposomen beobachtet.

Gelegentlich waren Zonen von dicht gegenüberliegenden Lamellen zu sehen. Diese scheinen in allen Beziehungen den Lamellen herkömmlicher Phospholipoid-MLVs zu gleichen.

Die untersuchten beschallten Proben enthielten auch viele kleine Sphäroide, die von 50 nm bis 500 nm reichten. Diese Bläschen sind vermutlich den durch Beschallung von Phospholipoid-MLVs erzeugten SUVs vergleichbar. Da sich die kleineren CHS-Bläschen nicht spalteten, war es unmöglich, die Struktur des Inneren oder ihrer Komponentenlamellen zu ergründen.

Bei den durch das 30 nm-Filter (zehnmal) extrudierten CHS-Bläschen waren Bläschen mit einer durchschnittlichen Größe von etwa 65 nm festzustellen. Das steht im Gegensatz zu den durch das Verfahren mit der Französischen Presse hergestellten Bläschen, die extrem klein waren (durchschnittlicher Durchmesser 25 nm oder weniger).

Beispiel 20 Röntgenbeugungsanalyse von Cholesterinhemisuccinatliposomen

Die Röntgenbeugung von verschiedenen CHS-MLV-Präparaten wurde unter Anwendung des an anderer Stelle beschriebenen zweidimensionalen Bildverstärker-Röntgendetektor-Gerätes vorgenommen (Grüner, S. IVI. 1977, Dr.-Dissertation, Princeton Universität, Princeton, NJ 09540 USA; Reynolds, Geo. T., Milch, J. R. und Grüner, S. M. 1978, Rev. Sei. Instr. 49:1241-1249; Tilcock, C. P.T., Bally, M. B., Farren, S. B., Cullins, P.R. und Grüner, S. M., 1984, Biochem. 23:2696-2703). Röntgensträhl-Wiederholabstände werden als ±0,5Ä angegeben. CHS-Dispersionen wurden in 1,5mm Röntgenglaskapillarröhrchen, die mit Epoxystopfen verschlossen waren, aufbewahrt. Die Proben wurden entweder sanft oder kräftig hydratisiert. Für eine sanfte Hydratisierung wurde der Puffer durch eine Spritze auf das trockene CHS im Boden des Rötgenkapillarröhrchens heruntergeführt. Das Kapillarröhrchen wurde sofort in einer Tischzentrifuge zur Beseitigung von Luftblasen aus der Lipoid-Wasser-Paste zentrifugiert. Die Kapillarröhrchen wurden anschließend verschlossen und zum Äquilibrieren mindestens 4 Stunden lang bei 5 ⁰C gehalten. Kräftige Hydratisierung erfolgte durch Wirbelmischung von trockenem CHS mit Puffer und zwei Glasmischperlen in einem Teströhrchen. Eine Aliquote wurde dann in ein Röntgenkapilalrröhrchen übertragen. Die Röntgenbeugung ergab, daß hydratisierr.es CHS multilamellare Strukturen bildet. Fig.2a und 2b zeigen die geringe Winkelbeugung, die bei sanft hydratisierten, aus 68,9 Ma.-% bzw. 59,1 Ma.-% CHS zusammengesetzten Proben resultierte. Bis zu vier im gleichen Abstand angeordnete Beugungssysteme sind sichtbar, die mit muitilamellaren Wiederholungsbereichen von 68,1 Ä bzw. 79,8Ä übereinstimmen. Die Systeme waren scharf und gut aufgelöst, ein Anzeichen dafür, daß das Gitter sehr wenig Störung aufwies. Diese konzentrierten CHS-Proben wiesen einen einheitlichen pastenartigen Zustand ohne sichtbaren überschüssigen Puffer auf, was mit der Tatsache übereinstimmt, daß der Wiederholabstand mit Zunahme des wäßrigen Gehaltes größer wurde. Bei sehr hohen wäßrigen Konzentrationen zeigten sanft hydratisierte CHS-Proben eine deutlich sichtbare Ansammlung von überschüssiger Pufferlösung oben auf dem hydratisierten Lipoid. Die Beugung einer solchen Probe (20,2 Gesamt-Ma.-% CHS) wird in Fig. 2 c gezeigt. Die Verbreiterung der höheren Winkelbeugungspeaks ist ein Anzeichen für eine erhebliche Störung in dem Gitter. Durch die Störung in dem Gitter war eine endgültige Gitterzuordnung schwierig, wenn aber eine lamellare Anpassung vorgenommen wurde, wie sie Fig.2 c zeigt, dann betrug die Wiederholung etwa86Ä, was auf große wäßrige Räume zwischen den Lipoiddoppelschichten schließen läßt.

Wenn, anstelle eine sanfte Hydratisierung durchzuführen, eine 20,7-%-CHS-Probe durch Wirbelmischen des trockenen Lipoids mit dem Puffer hergestellt wurde, dann hatte die resultierende Probe ein einheitliches milchiges Aussehen. Wie aus Fig.2d hervorgeht, zeigte die gerince Winkelbeugung ein breites Streuungsband mit geringen Anzeichen für ein scharf definiertes Gitter. Ein ähnliches Beugungsverhalten müßte bei einem muitilamellaren System zu erwarten sein, in dem die interlamellare wäßrige Breite beträchtlich variierte. Die Röntgenbeugung der verdünnten CHS-Dispersionen wird am häufigsten als von einem muitilamellaren System stammend interpretiert, in dem die interlamellaren Kräfte schwach sind. Bei anderen Lipoidsystemen, wie verdünnten Ei-Phosphatidylcholin-Dispersionen, zeigt das Röntgenbeugungsmuster ein scharf definiertes lamellares Gitter, das massemäßig vorwiegend aus Lipoid besteht (Rand, 1981, Annu. Rev. Biophys. Bioeng. 10: 277-314). Diese gut definierte Gitterwiederholung resultiert aus einem verhältnismäßig scharfen Minimum im Gitterpotential als Funktion der Lipoidschichttrennung. Wenn die Kurve des Potentials über dem Abstand nur eine flache Vertiefung hat, dann schließt man auf schwache interlamellare Kräfte und erhebliche Gitterstörung. Das scheint bei CHS-Bläschen der Fall zu sein. Die Probe in Fig.2d hat eine annähernde Wiederholung von 86Ä, im Vergleich zu der Wiederholung von 68,1 Ä in Fig. 2 a. Das deutet darauf hin, daß dieCHS-Liposomen in Gegenwart von überschüssigem Puffer ein hohes Wasser:Lipoid-Verhältnis besitzen. Ähnliche Ergebnisse sind bei anderen geladenen Lipoidsystemen beobachtet worden (Rand, 1981, oben).

Beispiel 21 Elektronenspinresonanzanalyse von Cholesterinhemisuccinatliposomen

Aus Ei-Phosphatidylcholin (EPC) hergestellte multilamellare Liposome wurden spinnmarkiert und mit ähnlich markierten Tris-Salz-CHS-MLVs verglichen, die im wesentlichen nach obiger Beschreibung hergestellt worden waren. Im Falle der EPC-MLVs wurde 1 Mol-% von jeweils 5,7,9,10,12 oder 16 Doxylstearat zu 40 mg Lipoid in Chloroform gegeben, und die resultierende Lösung wurde durch Drehverdampfung zu einem dünnen Film getrocknet. Danach wurden 2ml Tris-HCI-Puffer verwendet, um diesen Film durch Wirbelmischen zu hydratisieren, bis der Film vollständig suspendiert war. Die resultierenden EPC-MLVs wurde vor der Spektroskopie zweimal gewaschen.

Bei CHS-MLVs wurde 1 Mol-% der entsprechenden Spinmarkierung in Ethanol zu einem dünnen Film an der Seite eines Prüfröhrchens getrocknet, in das 40 mg Tris-Salz-CHS-Pulver und 2 ml Tris-HCI-Puffer gegeben wurden. Diese Suspension wurde durch Wirbeln gemischt, und die resultierenden Liposome wurden zweimal gewaschen. Alle Elektronenspinresonanzversuche wurden mit einem ER 100D ESR Spektrometer von IBM Instruments ausgeführt. Der Ordnungsparameter (S) wurde nach der Beschreibung an anderer Stelle berechnet (Griffith und Jist in Spin Labelling, Berliner, L. J. (Herausg.), Academic Press, N. Y., 1976).

Fig. 3 zeigt die Ordnungsparameterprofile von CHS-MLVs und EPC-MLVs, wie sie durch Spinmarkierung dieser Präparate mit jeweils 5,6,7,9,10,12 oder 16 Doxylstearat bestimmt wurden. Bei EPC-Doppelschichten nimmt der Ordnungsparameter mit steigender Kohlenstoffzahl in der Doppelschicht ab, wie oben bereits erläutert wurde. Die Supra-Molekül-Struktur von CHS-Dpppelschichten unterscheidet sich erheblich: die Doppelschicht ist nicht nur beträchtlich starrer als die EPC-Doppelschicht, sondern die CHS-Systeme zeigen wirklich eine Zunahme der Ordnung vom 50. zum 90. Kohlenstoff, ein Anzeichen für eine gänzlich andere physikalische und chemische Doppelschichtstruktur als kürzlich berichtet wurde.

Beispiel 22 Isotonische Quellung von Cholesterinhemisuccinatliposomen

In den folgenden Versuchsreihen wurde das isotonische Quellungsverhalten von multilamellaren Cholesterinhemisuccinat- und Phospholipoidbläschen verglichen:

(1) CHS-MLVs wurden nach der Beschreibung in Abschnitt 6.1 unter Verwendung von 40mgTris-Salz-CHS in 2,0 ml 0,01 M Tris-HCI, 0,1 M KCI Puffer hergestellt.

(2) EPC-MLVs wurden nach der Beschreibung in Abschnitt 6.2.1 unter Verwendung von 51,8mg EPC in 2,0 ml 0,01 M Tris-HCI, 0,1 M KCI Puffer hergestellt.

(3) Multilamellare Bläschen mit einer aus EPC und Ei-Phosphatidinsäure (EPA) bestehenden Doppelschicht wurden unter Anwendung des in Abschnitt 6.2.1 für die Herstellung von EPC-MLV beschriebenen Verfahrens unter Anwendung von 41,1 mg EPC und 9,79mg EPA in 2,0ml 0,01 Tris-HCI, 0,1 M KCl Puffer hergestellt. Die resultierenden MLVs (EPC:EPA:MLVs) enthielten EPC:EPA in einem Molverhältnis von jeweils 8:2.

Nach dem Wirbelmischen wurde jede Suspension von MLVs (d.h. die CHS-MLVs, die EPC-MLVs und die EPC:EPA:MLVs) zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in dem Herstellungspuffer stehen gelassen. Eine 20ftl-Aliquote jedes Liposompräparates wurde anschließend zu 1,0 ml einer Reihe von 0,01 M Tris-HCI-Puffem mit von 0,055 M bis 0,5 M reichenden KCI-Konzentrationen gegeben. Nach halbstündiger Äquilibrierung wurde die Lichtstreuung durch Messen des Absorptionsvermögens der Proben bei einer Wellenlänge von 550 nm bestimmt.

Die Ergebnisse sind graphisch in Fig.4 dargestellt, in der das Absorptionsvermögen gegen den reziproken Wert der KCI-Konzentrationen des Mediums, dem die Bläschen ausgesetzt waren, aufgetragen ist. Erhöhtes Absorptionsvermögen deutet auf Quellung von Lipoidbläschen hin. Die Kurven B und D demonstrieren, daß sich die Phospholipoid MLVs (d. h. EPC-MLVs und EPC:EPA:MLVs) erwartungsgemäß wie ideale Osmometer verhielten. Auch Kurve C geht jedoch hervor, daß die CHS-MLVs, obwohl sie sich wie geschlossene Bläschenstrukturen verhielten, ein nicht-ideales Verhalten in Hypo- und.hypertonischen Medien zeigten. Dieses in Fig. 4 gezeigte Verhalten unterscheidet sich ganz wesentlich von dem bei den Cholesteriniiposomen von Brockerhoff und Ramsammy (1982, Biochim. Biophys. Acta691: 227-232) beobachteten.

Die folgenden Beispiele betreffen Cholesterinhemisuccinatliposome, die schwach lösliche Verbindungen einschließen. Das Einschließen von in Wasser schwach löslichen Verbindungen in CHS-Liposome wird anhand von Rinderwachstumshormon, Insulin und Tylosin demonstriert.

Beispiel 23 In Cholesterinhemisuccinat-SUVs eingeschlossenes Rinderwachstumshormon

Rinderwachstumshormon (BGH), ein einfaches aus einer einzigen Kette von annähernd 191 Aminosäuren zusammengesetztes Protein, ist teilweise wasserlöslich. Die normale Löslichkeit beträgt 1 bis 1,5 mg/mI bei einem pH-Wert von 8,0. BGH fällt in organischen Lösungsmitteln wie Chloroform aus.

CHS-MLVs wurden nach der Beschreibung in Abschnitt 6.2 unter Verwendung von 25 mg Tris-Salz-CHS in 1,0ml 0,01 M Tris-HCI (pH-Wert 7,4), 0,14 M NaCI Puffer hergestellt. Das CHS-MLV-Präparat wurde zur Klärung und zur Bildung beschallter CHS-SUVs beschallt, und anschließend wurden jeweils 5,10,15,25,30 oder 166 mg BGH zugesetzt, um Aliquoten der beschallten CHS-SUV-Suspensionen abzutrennen. Die Suspensionen wurden kräftig durch Wirbeln gemischt, wodurch sich das Protein auf die CHS-SUV-Doppelschichten verteilte. Die beschallten CHS-SUV-Suspensionen wurden visuell am 1., 2. und 21.Tag auf das Vorhandensein von Präzipitat beurteilt. War kein Präzipitat zu sehen, war das ein Anzeichen, daß das Rinderwachstumshormon bei allen innerhalb von 21 Tagen bei Raumtemperatur getesteten Konzentrationen in den CHS-Liposomen eingeschlossen blieb.

Beispiel 24 In Cholesterinhemisuccinat-SUVs eingeschlossenes Insulin

Zink-Insulin, ein Polypeptidhormon, ist, obwohl es in verdünnter.Säure oder Alkali oder weiteres löslich ist, in wäßrigen Phasen im pH-Wert-Bereich von 4,5 bis 7,0 praktisch unlöslich. Tatsächlich ist die Tendenz von Insulinlösungen zur Bildung von Makroaggregaten ein Hindernis bei der Entwicklung langvorhaltender Insulinabgabesysteme.

CHS-MLVs wurden nach der Beschreibung in Abschnitt 6.2 unter Verwendung von 25 mg Tris-Salz-CHS in 1,0ml 0,01 M Tris-HCI (pH-Wert 7,4), 0,14 M NaCI Puffer hergestellt. Das CHS-MLV-Präparat wurde bis zur Klärung beschallt, um beschallte CHS-SUVs

zu bilden, und bis zu 47 mg Zink-Insulin-Pulver wurden der CHS-SUV-Suspension zugesetzt. Die Suspension wurde durch Wirbeln gründlich gemischt, wodurch sich das Insulin in den CHS-SUV-Doppelschichten verteilte. Die beschallten CHS-SUVs wurden visuell auf das Vorhandensein von Präzipitat am 1., 2. und 21.Tag beurteilt. War kein Präzipitat zu sehen, war das ein Anzeichen dafür, daß Insulin bei einer Konzentration von 5 mg/ml bei Raumtemperatur für mindestens 21 Tage eingeschlossen bleibt. Die Insulineinschließung erfolgt schneller bei 37°C.

Beispiel 25

In Cholesterinhemisuccinat-SUVs eingeschlossenes Tylosin

Tylosin ist ein Antibiotikum, das in Wasser bei 25°C mit 5mg/ml löslich ist, und es ist außerdem löslich in niederen Alkoholen, Estern und Ketonen, chlorierten Kohlenwasserstoffen, Benzen und Ether.

Kleine unilamellare Bläschen wurden wie folgt hergestellt: 100 mg Tylosinbase und 200 mg Tris-Salz-CHS wurden durch Wirbeln in 4ml gepufferter Phosphatsalzlösüng (pH-Wert 7,4) gemischt. Die resultierende milchige Suspension von CHS-MLVs wurde 15 Minuten lang mit einem Sondenspitzen-Beschallungsgerät beschallt. (Als Vorsichtsmaßnahme wurde ein Eisbad um das Teströhrchen angebracht, um die Temperatur der Mischung niedrig zu halten). Das Gemisch wurde anschließend 1 Stunde und 45 Minuten lang in ein Badbeschallungsgerät gestellt.

Nach einer Beschallungsdauer von 2 Stunden wurde das in CHS-SUV eingeschlossene Tylosin durch 10 Minuten Zentrifugieren der Suspension mit 10000 χ g von der Suspension getrennt, wodurch ein kleines Pellet und eine opalisierende überstehende Flüssigkeit gebildet wurden. Die in der überstehenden Flüssigkeit enthaltenen beschallten CHS-SUVs wurden visuell mit einer Suspension von 100mg Tylosinbase verglichen, die zu dem gleichen Volumen Wasser gegeben worden war. In der Suspension von Tylosinbase bildete sich ein Präzipitat, jedoch bildete sich kein Präzipitat in dem CHS-SUV-Präparat. Somit hat es den Anschein, als ob das Tylosin mindestens 48 Stunden lang eingeschlossen gehalten wird.

Die folgenden Beispiele betreffen die Verwendung von Cholesterinhemisuccinatliposomen zum Einschließen von löslichen Lipoidverbindungen.

Die Einschließung von löslichen bioaktiven Lipoidverbindungen wird anhand von Indomethacin und Diazepam demonstriert.

Beispiel 26 In Cholesterinhemisuccinat-MLVs eingeschlossenes Indomethacin

Indomethacin, ein Prostaglandin-Inhibitor, ist praktisch in Wasser unlöslich. Die freie Säure von Indomethacin ist in Ethanol, Ether, Aceton und Rizinusöl löslich.

CHS-MLVs, die verschiedene Mengen von Indomethacin als bioaktives Mittel enthielten, wurden wie folgt hergestellt: In einem Rundkolben wurden 25mg Tris-Salz-CHS, 1 bis 5mg Indomethacin und 10μ.1¹⁴C-lndomethacin (22,OmCiZmMoI) vereinigt. Es wurde ausreichend Methanol zum Lösen aller Bestandteile zugegeben. Das Gemisch wurde danach zur Bildung eines dünnen Films am Gefäß drehverdampft und über Nacht vakuumgetrocknet, um die Entfernung des gesamten Methanols zu gewährleisten-Anschließend wurden CHS-MLVs durch Zugabe von 1,0ml 0,01 MTris-HCI (pH-Wert 7,3), 0,14M NaCI Puffer zu jedem Kolben gebildet. Die Suspensionen wurden durch Wirbeln mit Glasperlen gemischt und 2 Stunden ruhig stehen gelassen.

Nach 2 Stunden wurde die in den CHS-MLVs eingeschlossene relative Menge von Indomethacin wie folgt ermittelt: 9,0 ml 0,01 M Tris-HCI (pH-Wert 7,3), 0,14 M NaCI Puffer wurden zu jeder Probe gegeben, und die Mischung wurde 10 bis 20 Minuten lang mit 10000 χ g zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde dreimal in 10ml 0,01 MTris-HCI (pH-Wert 7,3), 0,14 M NaCI Puffer gewaschen und in einem endgültigen Volumen von 1,0 ml 0,01 MTris-HCI (pH-Wert 7,3), 0,14M NaCI Puffer suspendiert. Ein „Standard" wurde in der gleichen Weise wie die Proben hergestellt, mit dem Unterschied, daß nur radiomarkiertes Indomethacin zu dem anfänglichen Gemisch gegeben wurde (d.h. die 1 bis 5mg Indomethacin wurden in dem CHS-MLV-Standardpräparat weggelassen). Die in filtrierten 20-/xl-Aliquoten von jeder Probe vorhandene Radioaktivität wurde in 10 ml Szintillationsflüssigkeit gezählt. Der Vergleich des „Standards" mit den verschiedenen Konzentrationen von Indomethacin enthaltenden Proben ermöglichte die Bestimmung des prozentual eingeschlossenen Indomethacins. Die Ergebnisse sind in Tabelle III enthalten.

Tabelle III Einschließen von Indomethacin in CHS-MLVs

Konzentration von %¹⁴C-lndomethacin

Indomethacin eingeschlossen

(mg/ml) in CHS-MLVs ...

1 78

2 .70

3 37

4 28

5 34

die Ergebnisse zeigen, daß bis zu 78% Indomethacin in CHS-MLVs eingeschlossen werden können.

Beispiel 27 Ultrastruktur von Indomethacin enthaltenden Cholesterinhemisuccinat-Bläschen

Um bestimmen zu können, ob das eingeschlossene Indomethacin die Membranbläschen veränderte, wurden die in Gegenwart von Indomethacin hergestellten CHS-MLVs (siehe Beispiel 26) wie oben beschrieben für die Gefrier-Ätz-Elektronenspektroskopie behandelt. Bei der Gefrier-Ätz-Elektronenmikroskopie waren die „leeren" CHS-MLVs bei geringer Vergrößerung nicht von denen zu unterscheiden, die Indomethacin enthielten. Das heißt, es gab kein deutliches Merkmal, das man als einzigartig für die einen oder die anderen erkennen konnte. Bei starker Vergrößerung war die „Doppelschicht" der Indomethacin enthaltenden CHS-MLVs jedoch deutlich erkennbar. Da Indomethacin ein wasserunlösliches Medikament ist und in Ethanol, Ether, Aceton und anderen nicht-polaren Lösungsmitteln löslich ist, kann man annehmen, daß das Indomethacin in Gegenwart von Lipoiden so

angeordnet sein würde, daß es von dem Wasser getrennt gehalten wird. Eine Untersuchung der mit Hilfe der Elektronenmikroskopie betrachteten Doppelschichten zeigte, daß die Dicke der Doppelschichten im Querschnitt variiert. Das führt zu der Vermutung, daß das Indomethacin tatsächlich in dem Lipoidanteil der Doppelschichten so verteilt war, daß es möglicherweise zu der zusätzlichen Dicke und einer sehr uneinheitlichen Konfiguration beigetragen hat; das heißt, die Dicke variierte, wenn eine Doppelschicht an einer Bruchlinie entlang verfolgt wurde. Dieser Effekt tritt vermutlich speziell bei denjenigen Medikamenten auf, deren Löslichkeiten so beschaffen sind, daß sie sich in dem Lipoidanteil der Doppelschichten verteilen.

Beispiel 28

in Cholesterinhemisuccinat-SUVs eingeschlossenes Diazepam

Diazepam, ein Sedativ oder Tranquilizer (d. h. Valium) ist in Chloroform, Dimethylformamid, Benzen, Aceton und Alkohol löslich; es ist aber nur schwach löslich in Wasser.

Diazepam enthaltende CHS-SUVs wurden wie folgt hergestellt: 2,3,4 oder 5 mg Diazepam wurden in ein Teströhrchen gegeben, in dem sich 5μ\ ³H-Diazepam (76,7Ci/mMol) befanden. In jedes Röhrchen wurde ausreichend Methanol gegeben, um das Medikament zu lösen (maximal 2ml Methanol). Das Gemisch wurde anschließend zu einem dünnen Film drehverdampft und über Nacht unter Vakuum getrocknet, um eine Entfernung des gesamten Methanols zu gewährleisten. Der getrocknete Film wurde wieder in 1 ml einer Suspension von beschallten CHS-SUVs (hergestellt nach der unten folgenden Beschreibung unter Verwendung von 50,100 oder 200 mg/ml CHS) suspendiert, durch Wirbeln mit Glasperlen vermischt und unter Anwendung von O,22^m-Millipore-Filtem filtriert.

Die CHS-SUVs wurden nach folgender Formulierung hergestellt: 50,100 oder 200mg Tris-Salz-CHS wurden durch Wirbeln mit 1,0ml 0,01 MTris-HCI (pH-Wert 7,3), 0,14 M NaCI Puffer vermischt. Unter Anwendung eines Sondenbeschallungsgerätes wurde die Mischung bis zu einer optischen Dichte von etwa 0,40, gemessen bei einer Wellenlänge von 550 nm, beschallt (d.h. eine „klare" Lösung) und anschließend mit 1000 x g zentrifugiert, um jegliches Titanium, das von der Spitze der Beschallungsgerätsonde stammen könnte, zu entfernen. Die Suspension von CHS-SUVs wurde danach von dem Röhrchen dekantiert.

Die relative Menge von Diazepam, die von den beschallten CHS-SUVs eingeschlossen worden sein könnte, wurde mit Hilfe eines Vergleichs der Proben mit einem „Standard"-Präparat bestimmt. Das „Standard"-Präparat war in der gleichen Weise wie die Proben hergestellt worden, mit dem Unterschied, daß nur radiomarkiertes Diazepam zugesetzt wurde (d.h. die 2 bis 5mg Diazepam waren in dem CHS-SUV-Standardpräparat weggelassen worden). In jedem Fall wurde die in ΙΟμΙ-Aliquoten der filtrierten Suspensionen enthaltene Radioaktivität in 10 ml Szintillationsflüssigkeit gezählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV enthalten.

Tabelle IV Einschließung von Diazepam in beschallten CHS-Bläschen

Konzentration von	%3H-Diazepam eingeschlossen	100	200
Diazepam	Konzentration CHS (mg/ml)	100	100
(mg/ml)	50 '	95	89
2	86	100	100
3	79	100	100
4	58
5	53

Die Ergebnisse zeigen, daß sowohl 100 als aus 200 mg/ml CHS 100% der höchsten angewandten Konzentration von Diazepam (5mg/ml) einschließen. Da sowohl 100 als auch 200mg/ml CHS das Diazepam ausreichend einschließen, stellen die 100mg/ml eine idealere Konzentration von CHS für das Einschließen von Diazepam dar.

Beispiel 29 Die Verwendung von Cholesterinhemisuccinatliposomen zur Bestimmung der Konzentration von Aminoglycosid in Serum

Man hat beobachtet, daß eine verhältnismäßig geringe Konzentration von CHS-Bläschen (weniger als 1 //,g/ml CHS) rote Blutkörperchen (RBC) stark aus einer Suspension von phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) agglutinieren. Da CHS-Bläschen durch Ca⁺⁺ und andere Kationen, wie Aminoglycosidantibiotika, ausgefällt werden, können die CHS-Bläschen zur Bestimmung der Konzentration von Aminoglycosid-Antibiotika in Seren verwendet werden, indem:

(a) von dem Serum, das Antibiotika enthält, die Verdünnung, bei dereine bestimmte Menge von CHS-Bläschen ausgefällt wird, bestimmt wird; und

(b) durch Hämagglutination-Titration die Konzentration der übrigen freien Bläschen, die nach der Zugabe zu dem das Antibiotikum enthaltenden Serum nicht ausgefällt werden, ermittelt wird.

In beiden Fällen könnte die genaue Menge des Antibiotikums durch Anwendung eines Vergleichs mit einer Standardkurve, die von bekannten Konzentrationen von Antibiotika abgeleitet wurde, festgestellt werden. Die grundlegenden Versuche werden unten beschrieben:

Dazu wurden 24μΙ Gentamycinsulfat in PBS (1 mg/ml) reihenmäßig in Serum verdünnt (d.h. 25/xl-Aliquoten von Serum).

Anschließend wurde eine 24-/xl-Aliquote von unilamellaren CHS-Bläschen, die durch Beschallung von Tris-Salz-CHS bei einer Konzentration von 25 mg/ml in 0,01 MTris-HCI (pH-Wert 7,3), 0,14 M NaCI Puffer bei einem pH-Wert von 7,4 hergestellt worden waren, zu jeder Probe gegeben.

Nach etwa 10 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Trübung jeder Mischung notiert. Nur Mischungen mt50^g oder mehr Gentamycin zeigten eine sichtbare Präzipitation, ein Anzeichen, daß die CHS-Bläschen mit dem Gentamycin zusammenwirkten.

Als nächstes wurde das ausgefällte Material pelletisiert und die überstehende Flüssigkeit zur Bestimmung der Konzentration von CHS-SUVs durch Hämagglutination roter Blutkörperchen von Hühnern verwendet. Die Hämagglutinationsanalyse wurde in 96 U-förmigen Mikrovertiefungsplatten durch reihenmäßige Verdünnung der Bläschensuspension auf 50μΙ PBS und die folgende Zugabe von 40μΙ 0,5% RBC in PBS in jede Vertiefung durchgeführt. Nach 60 Minuten bei 4°C wurde die Hämagglutination mit einem umgekehrten Spiegel verfolgt. Die Kontrolle (RBC ohne CHS-Bläschen) zeigte keine Hämagglutination. Alle CHS enthaltenden Proben hämagglutinierten das RBC stark, eine Ausnahme bildeten diejenigen, die bei dem vorhergehenden Versuch trübe waren. Dieses Ergebnis zeigt, daß CHS-Bläschen mit Gentamycin so zusammenwirkten, daß im Verhältnis weniger Bläschen für die Hämagglutination zur Verfügung standen als bei der nur CHS enthaltenden Kontrollsuspension. Die folgenden Beispiele betreffen die in-vivo-Verabreichung von Cholesterinhemisuccinatliposomen.

In den folgenden Unterabschnitten werden Verfahren und Zusammensetzungen für die in-vivo-Verabreichung von bioaktiven Mitteln unter Anwendung der erfindungsgemäßen Cholesterinhemisuccinatliposome beschrieben. Die klinische Wirksamkeit des eingeschlossenen bioaktiven Mittels wird festgestellt, und die Medikamentverteilung innerhalb bestimmter Organe wird gegebenenfalls verfolgt.

Beispiel 30 Behandlung von Gelenkarthritis unter Anwendung von in Cholesterinhemisuccinat-MLVs eingeschlossenem Indomethacin

Männliche weiße Neuseeland-Kaninchen (2 bis 2,5 kg) wurden zweimal in Abständen von 2 Wochen intradermal mit 1 ml von 20 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA), das in vollständigem Freundchen-Adjuvans emulgiert war, immunisiert. In der dritten Woche erhielten die Kaninchen eine einzige intraarticuläre Injektion von 20 mg BSA in 1,0 ml Salzlösung in das rechte Kniegelenk, um Gelenkarthritis hervorzurufen. Die linken Kniegelenkedienten als Kontrollen. Der Durchmesser der Gelenke wurde mit Hilfe einer Schieblehre mit einer Genauigkeit von 0,01 mm nach Fowler gemessen. Die die BSA-Injektion erhaltenen Gelenke schwollen an und waren praktisch 3 bis 4mm dicker als die Kontrollgelenke. In der vierten Woche erhielten die Kaninchen eine weitere intraarticuläre Injektion von BSA in Salzlösung, um eine Gelenkentzündung hervorzurufen.

CHS-MLVs wurden nach der Beschreibung in Abschnitt 8.1 unter Verwendung von 270,0 mg CHS und 10 mg Indomethacin, so daß sich eine Endkonzentration von 1,0 mg/ml Indomethacin ergab, hergestellt. Drei Tage nach der Entstehung der Entzündung erhielten die mit BSA-injizierten Tiere eine einzige intramuskuläre Injektion des in CHS-Bläschen eingeschlossenen 1 mg/ml Indomethacins (Gesamtdosis 1 mg/Tier). Die Gelenkschwellung wurde weitere 10 Tage lang gemessen. Die graphisch in Fig. 5 wiedergegebenen Ergebnisse zeigen, daß das in CHS-MLVs eingeschlossene Indomethacin die Gelenkschwellung bei intramuskulärer Verabreichung wirksam verringert hat.

Beispiel 31 In-vivo-Verabreichung von in Cholesterinhemisuccinat-SUVs eingeschlossenem Diazepam

Mäuse wurden intravenös oder intramuskulär mit 500/xg/kg Körpergewicht Diazepam, das in nach der Beschreibung in Abschnitt 8.2 hergestellten CHS-SUVs eingeschlossen war, geimpft. Das Diazepam hatte eine sedative Wirkung bei den Mäusen (die Mäuse schliefen nach der Impfung ein), wodurch die Retention der Wirksamkeit des eingeschlossenen Medikaments demonstriert wurde.

Beispiel 32 Organverteilung nach intravenöser Impfung

Eingeschlossenes Diazepam enthaltende CHS-SUVs wurden nach der Beschreibung in Beispiel 28 hergestellt. Nach der Beschallung in einem Badbeschallungsgerät betrug das Absorptionsvermögen der Suspension, das bei einer Wellenlänge von 550 nm gemessen wurde, 0,370. Danach wurde eine 44,2-/u.l-Aliquote der CHS-SUV-Suspension in ein Glasteströhrchen gegeben, auf die 40 μο ¹⁴C-Diazepam (die spezifische Aktivität entspricht 181 /xCi/mg, geliefert als 100/iCi/ml in Ethanol) unter Stickstoff aufgetrocknet worden war. Nach einer Wirbelmischdauer von 5 Minuten wurden 1,282 ml 0,01 MTris-HCI (pH-Wert 7,3), 0,14 M NaCI Puffer der Lösung zugesetzt, wodurch die Suspension dreißigfach verdünnt wurde und eine therapeutische Dosis für die Mäuse von 0,167 mg/μΙ Diazepam gewonnen wurde.

Eine 0,1-ml-Aliquote der CHS-SUV-¹⁴C-Diazepam-Suspension wurde in die Schwanzvene von bei Bewußtsein gehaltenen 35g schweren Swiss Webster Mäusen eingespritzt. Kontrollmäuse wurden in gleicher Weise mit einer äquivalenten Dosis von nicht eingeschlossenem ¹⁴C-Diazepam geimpft. 1, 2 oder 5 Stunden nach der Injektion wurden die Mäuse durch Zervikalluxation getötet, und die inneren Organe (Niere, Lunge, Milz, Leber, Darm, Gehirn, Herz, Bauchspeicheldrüse und Fett) und eine Blutprobe wurden entnommen. Die Organe wurden gewogen, und eine kleine Probe (20 bis 40^g) von jedem wurde nach dem Verfahren von Mahim und Kohberg (1966, Analytical Biochem. 16: 500) digeriert und entfärbt. Die Proben wurden anschließend fünf Tage lang im Dunkeln gehalten, damit Chemilumineszenz vor dem Messen der Radioaktivität stattfinden konnte. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Fig. 6 zu sehen. In den Mäusen, die mit dem in CHS-SUV eingeschlossenen Diazepam geimpft wurden, sammelt sich das Medikament nicht in der Milz an, ein Zeichen dafür, daß sich das in CHS-SUVs eingeschlossene Diazepam nicht wie ein in Phospholipoidliposom eingeschlossenes Medikament bei intravenöser Verabreichung in vivo verhält.

Beispiel 33

In-vivo-Verabreichung von in Cholesterinhemisuccinat-MLVs eingeschlossenem Chromium Um bestimmen zu können, ob die CHS-Bläschen bei in-vivo-Verabreichung intakt bleiben, wurde die Organverteilung eines freien wäßrigen Markierungsstoffes im Vergleich mit der des in CHS-Bläschen eingeschlossenen wäßrigen Markierungsstoffes nach intravenöser Injektion bei Mäusen bestimmt. Zu diesem Zweck wurde die Organverteilung von nichteingeschlossenem ⁵¹Chromium (⁵¹Cr), in CHS-MLVs eingeschlossenem ⁵¹Chromium und in Phospholipoidbläschen eingeschlossenden ⁵¹Chromium verglichen. Es wurden die folgenden Formulierungen angewandt:

(a) Uneingeschlossenes ⁵¹Cr. ⁵¹Cr wird als ⁵¹CrO₂ = in steriler 0,9%iger Salzlösung geliefert (New England Nuclear, Newton, MA). Der freie ⁵¹Cr-I njektionsstoff wurde durch Verdünnen von 100μΙ⁶¹Cr in 0,9%iger Salzlösung auf ein Gesamtvolumen von 1,5ml mit 0,01 M Tris-HCI, pH-Wert 7,3, 0,14M NaCI, 5% Dexstrose zubereitet. Sechzehn 40g schwere männliche Swiss Webster Mäuse erhielten eine intravenöse Injektion von jeweils 0,1 ml (etwa 700000cpm) in die Schwanzvene.

(b) ⁵¹Cr in CHS-MLVs wurde durch Lösen von trockenem Tris-Salz-CHS-Pulver in 0,01 Μ Tris-HCI, pH-Wert 7,3,0,14M NaCI, 5% Dextrose mit einer Spurenmenge von ⁵¹Cr (⁵¹CrO₂ = in steriler 0,9%iger Salzlösung) zubereitet. Das Gemisch wurde durch Wirbeln gemischt und danach kurz 30 Minuten lang beschallt. Nach Pelletisieren durch Zentrifugieren und dreimaligem Waschen nach obiger Beschreibung wurde das fertige Pellet erneut bis zu einer Endkonzentration von 10 mg/ml CHS suspendiert und auf einen Durchmesser von 1 Mikrometer mit Hilfe der quasielastischen Lichtstreuungsanalyse nach Nicomp gebracht. Zwölf 40g schwere männliche Swiss Webster Mäuse erhielten jeweils eine intravenöse Injektion von 0,1 ml (etwa 120000cpm) in die Schwanzvene.

(c) ⁵¹Cr in EPC-SPLVs wurden nach der allgemeinen Verfahrensweise hergestellt, die ausführlich in der gleichfalls anhängigen Anmeldung, Anmeldeaktenzeichen 476.496, eingereicht am 24. März 1983 von Lenk, u. a., mit dem Titel „Beständige multilamellare Bläschen, ihre Herstellung und Anwendung" die hier unter Bezugnahme einbezogen ist, beschrieben wird. Zu diesem Zweck wurden 5-ml-Chargen durch Auflösen von 65 mg Ei-Phosphatidylcholin (EPC) in Chloroform und Austrocknen des EPC zur Bildung eines Filmes hergestellt. Der Film wurde erneut in 10ml Ether suspendiert, und 0,3ml ⁵¹CrO₂ = in 0,9%iger Salzlösung (pH-Wert 8) wurden zugegeben. Das Gemisch wurde anschließend durch Beschallung unter gleichzeitiger Verdampfung des Ethers unter N₂ emulgiert. Die resultierenden beständigen multilamellaren Bläschen (SPLVs) wurden erneut in 5 ml 0,01 M Tris-HCI, pH-Wert 7,3,0,14 M NaCI, 5% Dextrose suspendiert und durch Zentrifugieren pelletisiert. Das Pellet wurde dreimal zur Entfernung von nicht eingeschlossenem ⁵¹Chromium gewaschen, und das fertige Pellet wurde erneut in 5 ml 0,01 M Tris-HCI, pH-Wert 7,3,0,14M NaCI, 5% Dextrose suspendiert. Die Endkonzentration von EPC betrug 13 mg/ml. Zwölf 40g schwere männliche Swiss Webster Mäuse erhielten eine intravenöse Injektion von jeweils 0,1 ml (etwa lOOOOOcpm) in die Schwanzvene.

Nach Ablauf von 1,2,5 und 24 Stunden wurden 3 Mäuse von jeder mit dem Liposompräparat behandelten Gruppe und 4 Mäuse von der mit uneingeschlossenem ⁶¹Chromium behandelten Gruppe durch Zervikalluxation getötet. Die Organe wurden entfernt, mit 0,9%iger Salzlösung gespült, gewogen und nach obiger Beschreibung gezählt, um die %-Dosis und die %-Dosis/Gramm, die in jedem behandelten Organ zurückgeblieben waren, zu bestimmen. Die in Fig.7 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß das uneingekapselte Chromium (Fig.7C) schnell ausgeschieden wird und nicht in einem der untersuchten Organe konzentriert war. In EPC und CHS eingekapseltes Chromium ist 24 Stunden nach der Injektion in meßbaren Mengen vorhanden, woraus man schließen kann, daß die CHS-Bläschen wie die EPC-SPLVs in vivo intakt bleiben. Darüber hinaus sammeln sich EPC-SLPVs (13mg/ml), die einen mittleren Durchmesserzwischen 0,5 und 1,0 Mikrometer haben, in der Leber, Lunge, und Milz an (siehe Fig. 7 B), d. h. der typische Verlauf der Liposomverteilung. Äquimolare CHS-Bläschen sammeln sich vorwiegend in der Leber und in einem viel geringeren Ausmaß in der Lunge und der Milz (siehe Fig.7A). Ein Hinweis für einen Unterschied in dem Verteilungsmuster der beiden Liposompräparate in vivo. .

Beispiel 34 In-vivo-Verabreichung von in Cholesterinhemisuccinat-MLVs eingeschlossenem Humanwachstumshormon

Multilamellare CHS-Bläschen, die ^12BI-Humanwachstumshormon (HGH, New England, Nuclear, Boston, MA) enthielten, wurden wie folgt hergestellt: Tris-Salz-CHS wurde zu 0,01 M Tris-HCI, 0,14M NaCI Puffer (pH-Wert 7,4) gegeben, der 1 yuCi/ml ¹²⁵I-HGH (New England Nuclear, Boston, MA) enthielt, um eine endgültige Konzentration von 25mg/ml Tris-Salz-CHS zu erzielen. Die Suspension wurde durch Wirbeln mit Glasperlen gemischt. Die resultierenden CHS-MLVs schlossen 10% der ¹²⁵I-HGH ein, wie durch einen Vergleich mit den anfänglichen Zählungen der Radioaktivität ermittelt wurde.

Eine Gruppe von 12 weiblichen Swiss Webster Mäusen erhielt eine intramuskuläre Injektion von 0,5 ml der ¹²⁵I-HGH einschließenden CHS-MLV-Suspension in das Hinterbein. Eine Kontrollgruppe von 12 Mäusen erhielt eine Injektion von 0,5ml freiem ¹²⁵I-HGH in 0,01 M Tris-HCI, 0,14M NaCI Puffer. JedesTier in beiden Gruppen erhielt annähernd 35000cpm/Tier. In periodischen Abständen nach der Injektion wurden die Mäuse getötet, das Hinterbein wurde seziert, und die erhalten gebliebene Gesamtradioaktivität wurde in % bestimmt. Die Angaben in Tabelle V zeigen eine erhebliche Zunahme in der Retention von ¹²⁵I-HGH, wenn es in CHS-MLVs enthalten ist. Somit wird das in CHS-Liposom eingeschlossene Medikament bei intramuskulärer Injektion in anhaltender Weise freigesetzt.

Tabelle V Retention von verabreichtem, in MLV eingeschlossenem ^1Z5l-Humanwachstumshormon

Inokulum	% im Bein verbleibende Radioaktivität	5	24	72	168
	Zeit (Stunden)
(N = 12Tiere)	3	56	0,7	0,2	0,3
Kontrolle3'
125I-HGH	37	29	22
125-l-HGHin
CHS-Bläschenb)

a) Die Tiere erhielten 0,5 ml ¹²⁵l-Humanwachstumshormon in 0,01 M Tris-HCI, 0,14M NaCI

b) Die Tiere erhielten 0,5 ml ¹²⁵l-Humanwachstumshormon in CHS-Bläschen (25mg/ml CHS) in 0,01 IVI Tris-HCI, 0.14M NaCI

Claims (19)

1. Verfahren zur Herstellung von Sterolliposomen, gekennzeichnet dadurch, daß zu einer wäßrigen Phase eine Salzform eines organischen Säurederivates eines Sterols mit der Fähigkeit, geschlossene Doppelschichtenbilden zu können, in einer für die Bildung vollständig geschlossener Bläschen ausreichenden Menge gegebenen wird und das Gemisch bis zur Bildung einer milchigen Suspension multilamellarer Bläschen geschüttelt wird.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die milchige Suspension unilamellarer Bläschen beschallt wird.

3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Doppelschichten eine Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Salzform eines organischen Säurederivats eines Sterols aufweisen.

4. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Doppelschichten eine 2-Amino-2-methyl- 1,3-propandiol-, eine 2-Aminoethanol-, eine Bis-tris-prppan- oder eine Triethanolamin-Salzform eines organischen Säurederivats eines Sterols aufweisen.

51 Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Doppelschicht eine Antimykotikaverbindungs-Salzform eines organischen Säurederivats eines Sterols aufweist.

6. Verfahren nach Punkt 5, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem organischen Säurederivat um Succinat handelt.

7. Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Sterol um Cholesterin handelt.

8. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Doppelschichten eine Miconazol-Salzform eines organischen Säurederivats eines Sterols aufweisen.

9. Verfahren nach Punkt 8, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem organischen Säurederivat um Succinat handelt.

10. Verfahren nach Punkt 9, gekennzeichnet dadurch, daß Sterol Cholesterin ist.

11. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Doppelschicht eine Antimykotikaverbindungs-Salzform eines organischen Säurederivats eines Sterols aufweist.

12. Verfahren nach Punkt 11, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem organischen Säurederivat um Succinat handelt.

13. Verfahren nach Punkt 12, gekennzeichnet dadurch, daß das Sterol Cholesterin ist.

14. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das organische Säurederivat Succinat ist.

15. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Doppelschichten eine Salzform eines organischen Säurederivats eines Cholesterins aufweisen.

16. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Doppelschichten die Tris(hydroxyrnethyl)aminomethan-Salzform eines Hemisuccinatderivats von Cholesterin aufweisen.

17. Verfahren nach Punkt 16, gekennzeichnet dadurch, daß die wäßrige Phase im wesentlichen frei von zweiwertigen Kationen ist.

18. Verfahren nach Punkt 17, gekennzeichnet dadurch", daß das Cholesterinhemisuccinat im Bereich von etwa 4,5mg bis etwa 200mg fürjeden ml derwäßrigen Phase vorhanden ist.

19. Verfahren nach Punkt 16, gekennzeichnet dadurch, daß es die Zugabe eines Tris-Salzes zu der wäßrigen Phase umfaßt.

20. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß es die Zugabe einer für das Einschließen in den Sterolbläschen vorgesehenen Verbindung zu derwäßrigen Phase umfaßt.

Hierzu 9 Seiten Zeichnungen ₀