JPH01290634A - インターフェロン含有リポソーム製剤およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、リポソーム製剤、特にインターフェロン含有
リポソーム製剤およびその製造法に関する。

〔従来の技術〕

リポソームは、水溶液を内包した脂質二分子膜からなる
カプセル状であり、一枚膜（二分子膜）リポソームと多
重膜リポソームとに分類される。

リポソームは、生体膜との親和性が良いことから、従来
より内部の水層や膜成分の脂質に種々の薬物を含有させ
、吸収性改善、活性増大、安定化。

標的部位分布などの製剤学的研究が多く進められている
。

リポソームの製造法に関しても種々検討が行われており
、これまでに薄膜振盪法、超音波法、逆相蒸発法、界面
活性剤除去法等が知られている。

一方、近年バイオテクノロジーの進展が著しく、生体内
因性の生理活性物質の臨床的応用に至るものも多く見ら
れ、その有用性が高く評価されている。

この中で特にインターフェロンは、抗ウイルス効果、制
癌効果等が認められ、−早く臨床に供されている。

しかし、現在のバイオテクノロジーでは、その生産性に
おいて必ずしも充分でなく、インターフェロンは非常に
高価なものである。

そこで、製剤学的効率を高める方法として、インターフ
ェロンをリポソームに含有する研究がなされている（特
開昭６２−２８３９３４）。しかし、インターフェロン
は温度１機械的振動及び他薬品との接触で失活しやすい
性質があるため、これまでの方法では、その調製過程で
の失活が著しく、実用上の利用価値が乏しいものである
。

〔発明が解決しようとする課題］ 従来のインターフェロン含有リポソームの製造上の問題
点である調製過程において生じる失活を防ぐことと、生
体内利用効率をさらに高めるため、組織選択性を有した
インターフェロン含有リポソーム製剤およびその製造法
を提供することである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、以前よりリポソームの医療への応用研究
を行っており、リポソームが薬物担体として非常に優れ
ていることを確認するに至っている。

一方、インターフェロンは、抗ウイルス効果及び制癌効
果に優れているが、生体内半減期が短いこと及び高価で
あることという問題を有している。

そこで本発明者らは長年の蓄積されたリポソーム技術を
活用してインターフェロンのリポソーム化の検討を行っ
た。

しかし、従来のリポソーム製造法によりインターフェロ
ンを内包させることを試みたところ、いずれの方法を用
いても充分なインターフェロン活性を有したリポソーム
を製造することは出来なかった。

この原因について種々研究した結果、次のような事実を
見出した。

■脂質を有機溶媒に溶解し、適当な減圧装置を用いて有
機溶媒を留去し脂質の薄膜を作った後、インターフェロ
ン溶液を加え、攪拌する方法では、攪拌が弱いと、リポ
ソームが大きくなり過ぎて利用価値がなくなり、攪拌を
強くすると、失活する。

■超音波法では、攪拌後部音波を照射することによりイ
ンターフェロンが失活する。

■逆相蒸発法では、攪拌による失活のほか有機溶媒との
接触により失活する。

■界面活性剤除去法では、界面活性剤として用いるコー
ル酸ナトリウムまたはデオキシコール酸ナトリウムとの
接触において失活する。

以上の如く、従来の方法における問題点は、機械的振動
あるいはインターフェロンを失活させる化学物質との接
触にあり、従来の方法では、この２点ともに避けて目的
とするリポソームを作ることが出来なかった。

そこで種々研究を行った結果、予め従来の方法でリポソ
ームを形成させた後、インターフェロン溶液を加え凍結
・融解することによりインターフェロンの活性を保持し
た状態でリポソームに含有させることが出来ることを見
出し、かがる知見に基いて本発明を完成するに至った。

すなわち本発明はインターフェロンをアシアロフェツイ
ンのＮ−脂肪酸アマイドで修飾されたリポソームに内包
せしめたインターフェロン含有リポソーム製剤に関し、
さらに一枚膜リポソームまたは多重膜リポソームの懸濁
液にインターフェロンを添加し凍結した後、融解するこ
とによりインターフェロンを内包させることを特徴とす
るインターフェロン含有リポソーム製剤の製造法に関す
る。

本発明に用いるリポソームの脂質組成は特に限定される
必要はなく、例えばリン脂質のほが膜安定化剤、電荷付
与剤などが用いられ、リン脂質としては卵黄ホスファチ
ジルコリン、シミリストイルホスファチジルコリン、ジ
パルミトイルホスファチジルコリン等のホスファチジル
コリン類がある。膜安定化剤としてはコレステロールな
どがあり、目的に応じて電荷を与えるための物質として
はステアリルアミン、ジセチルホスフェート、ホスファ
チジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノ
シトール等がある。

予めリポソームを調製する方法としては制限がなく、薄
膜振とう法、超音波法、逆相蒸発法、界面活性剤除去法
等いずれの方法でも良く、さらに調製されたリポソーム
は一枚膜でも多重膜でも支障ない。

また、インターフェロンはインターフェロンα。

インターフェロンβ及びインターフェロンγのいずれの
インターフェロンも利用出来るが、その中で比較的不安
定なインターフェロンγのリポソーム化に有用である。

本発明者らは、さらに組織移行性を高め、臨床上での治
療効果を上げるための研究を行った。

そこで、インターフェロンの抗ウイルス効果に着目し、
難治性疾患となっているウィルス性肝炎の治療用製剤を
、前述の製造法を用い、これに肝実質細胞に結合するこ
とが知られているアシアロフェツインを表面に修飾する
ことを検討した。

その結果、インターフェロンの活性を保持した状態でア
シアロフェツイン修飾リポソーム中に含有させることが
出来、そのインターフェロン含有アシアロフェツイン修
飾リポソームは、肝実質細胞と良く結合し、肝実質細胞
中へインターフェロンを効率良く送達することを見出し
た。

ここで用いるアシアロフェツインは牛血清フェツイン、
馬血清フェツイン及び人血清フェツインのいずれかのフ
ェツインから調製されたものを用いるが、好ましくは人
血清フェツインから得たアシアロフェツインが良い。

アシアロフェツインをリポソーム表面に修飾するために
疎水性側鎖の導入が必要であり、該側鎖の導入されたア
シアロフェツインとしては適当な方法で合成されたＮ−
バルミトイルアシアロフェツイン、Ｎ−ミリストイルア
シアロフェツイン。

Ｎ−ステアロイルアシアロフェツイン等があり、これら
の中から選ばれた１種または２種以上のアシアロフェツ
インのＮ−脂肪酸アマイドを用いる。

〔実施例］ 次に実施例により本発明をさらに詳細に説明する。

なお、実施例で用いたインターフェロンは明治製菓■薬
品開発研究所で作られた、大腸菌による遺伝子組み換７
ヒトインターフエロンγ（比活性Ｉ　Ｘ　１０’Ｕ／■
）を用いた。

実施例１ 卵黄ホスファチジルコリン、コレステロール。

ホスファチジン酸及びホスファチジルセリンを表１に示
した量をクロロホルム：エタノール（１：１）混液１０
１ｄに溶解してナス型フラスコに入れ、ロータリーエバ
ポレーターを用いて溶媒を留去した。

ガラス内面に生じた脂質薄膜に１０＋ｗＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣｆｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ（ｐＨ７，４）
４−を加え、ポルテックスミキサーで５分間振盪した。

この懸濁液を遠心分離（１００，０００ｇ、１ｈｒ）し
て得られたペレットにｒ８Ｃ−ヒトインターフェロンγ
２Ｘ１０ｈＵを含んだｌ　ＯｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＡ　
ｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ（ｐＨ７，４）ｌａｌ
！を加え、−４０°Ｃで２４時間凍結した後、室温で融
解した。

得られたｒｅｃ−ヒトインターフェロンＴ含有リポソー
ムを遠心分離を行った後、ラジオイムノアッセイ（東し
・フジバイオ社）でインターフェロンγの含量を測定し
た。

一方、コントロールとして先の溶媒を留去後のガラス内
面に生じた脂質薄膜にｒｅｃ−ヒトインターフェロンｒ
２Ｘ１０６Ｕを含んだ１０ｗＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆｂｕ
ｆｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ（ｐＨ７，４）２ｍを加え
、ポルテックスミキサーで５分間振盪して得られたｒｅ
ｃ−ヒトインターフェロンＴ含有リポソームを遠心分離
を行った後、ラジオイムノアッセイ（東し・フジバイオ
社）でインターフェロンγの含量を同様に測定した。そ
れぞれの結果を表１に示す。

実施例２ 卵黄ホスファチジルコリン５０．４μｍｏｌ及びコレス
テロール５０．４μｍｏｌをクロロホルム：エタノール
（１：　１）混液１０ｒＩｄｌに溶解してナス型フラス
コに入れ、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留
去した。

ガラス内面に生じた脂質薄膜に１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃ／！ｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ（ｐＨ７，４）
４１ｎＩｌを加え、ポルテックスミキサーで３分間振盪
した。

さらに、Ｎ−バルミトイルアシアロフェツイン１０■及
び２％デオキシコール酸ナトリウムを含んだ１０ｎ＋Ｍ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ（
ｐ）Ｉ　７．４）２ｄを加え、ポルテックスミキサーで
５分間振盪した。

この懸濁液をセルロース膜を用いて４８時間１０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣＡ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ（
ｐＨ７，４）で透析を行った。セルロース膜中に残った
懸濁液を遠心分Ｈ（１００，０００ｇ、１ｈｒ）して得
られたペレットにｒｅｃ−ヒトインターフェロンγ２Ｘ
１０’Ｕを含んだ１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　ｂｕｆ
ｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ（ｐＨ７，４）１−を加え、
細孔径０．４μｍのポリカーボネート製フィルターを用
いて加圧濾過を行った。濾液を一４０″Ｃで２４時間凍
結した後、室温で融解してｒｅｃ−ヒトインターフェロ
ンＴ含有アシアロフェツイン修飾リポソームを得た。

実施例３ 実施例２で得られたｒｅｃ−ヒトインターフェロンＴ含
存アシアロフェツイン修飾リポソームを５ｅｐｈａｄｅ
ｘＧ−１００カラム（１，２Ｘ４０ｃｍ）に負荷し、１
０ｎ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａ
ｌｉｎｅ（ｐＨ７，４）で溶出させ、各画分中のインタ
ーフェロンＴ＊量及びリン脂質含量を測定した。その結
果を第１図に示す。

実施例４ 卵黄ホスファチジルコリン５０６４μｍｏｌ、ホスファ
チジン酸８．４μｍｏｌ及びコレステロール５０．４μ
ｍｏｌをクロロホルム：エタノール（１：１）混液１０
−に溶解してナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポ
レーターを用いて溶媒を留去した。

ガラス内面に生じた脂質薄膜に１０１１ＩＭ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣｆｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ（ｐＨ７，４
）４ｍを加え、ポルテックスミキサーで３分間振盪した
。

さらに、Ｎ−バルミトイルアシアロフェツインｌＯ■及
び２％デオキシコール酸ナトリウムを含んだ１０ｗＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣＬｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ（ｐ
Ｈ７，４）２−を加え、ポルテックスミキサーで５分間
振盪した。

この懸濁液をセルロース膜を用いて４８時間１０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣＬｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ（ｐ
Ｈ７，４）で透析を行った。セルロース膜中に残った懸
濁液を遠心分離（１００，０００ｇ、　　１　ｈｒ）　
Ｌ、て得られたペレットに３２ｐで標識したｒｅｃ−ヒ
トインターフェロンＴ１００μＣｉを含んだ１０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ（
ｐｉ−１７，４）　２　ｌｌｌ１を加え、細孔径０．４
〜０．１μｍのポリカーボネート製フィルターを用いて
逐次加圧濾過を行った。濾液を一４０°Ｃで２４時間凍
結した後、室温で融解しＩ細孔径０．１μｍのポリカー
ボネート製フィルターを用いた１　０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣｊｚ　ｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ（ｐＨ７，４
）で透析を行った。

これを、ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ潅流法により調製した
ラット肝実質細胞と共に３７°Ｃでインキュベートし、
細胞内へ取り込まれたｉｚｐ放射活性を測定した。

その結果、非修飾リポソームに封入した３ｔｐ標識ｒｅ
ｃ−ヒトインターフェロンＴの場合は、添加量の７％が
肝実質細胞に取り込まれたのに対して、アシアロフェツ
イン修飾リポソームに封入した３２Ｐ標識ｒｅｃ−ヒト
インターフェロンγでは、添加量の２０％が肝実質細胞
に取り込まれた。

〔発明の効果〕

本発明によれば、高価で貴重なインターフェロンを著し
い活性の低下を防ぎ、効率良くリポソームに含有させる
ことが可能となり、本則を静脈内投与することにより、
血中にインターフェロン濃度を著しく高く維持すること
が出来る。特にアシアロフェツインで修飾したリポソー
ム中にインターフェロンを含有させることにより、難治
性疾患であるウィルス性肝炎及び肝癌の治療用製剤を提
供することが出来る。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例３で得られたインターフェロン含有リポ
ソームの各両分中のインターフェロン含量及びリン脂質
含量を示すグラフである。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）インターフェロンをアシアロフェツインのＮ−脂
   肪酸アマイドで修飾されたリポソームに内包せしめたイ
   ンターフェロン含有リポソーム製剤。
2. （２）一枚膜リポソームまたは多重膜リポソームの懸濁
   液にインターフェロンを添加し凍結した後、融解するこ
   とによりインターフェロンを内包させることを特徴とす
   るインターフェロン含有リポソーム製剤の製造法。