JPH0545568B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

イ 発明の目的 産業上の利用分野 本発明はリポソーム製剤の製造方法に関する。 従来の技術 リポソーム製剤を安定に貯蔵しておくためにリ
ン脂質、薬物およびアジユバントより調製したリ
ポソーム組成物を凍結乾燥品とするリポソーム製
剤の製法は特開昭53−142514に示されている。ま
た、有機溶媒を用いずにリポソーム凍結乾燥品を
製造し、同乾燥品を水性媒体もしくは薬剤含有水
性媒体を用いてリポソーム製剤を製造する方法が
特開昭57−82310および特開昭57−82311に開示さ
れている。 一方、特開昭58−152812には、特定のリン脂質
をPH値が限定された水性媒体中に分散することに
より、小さな一枚膜リポソーム（small
unilamella vesicles、以下SUVと略記）または
大きな一枚膜リポソーム（large unilamella
vesicles、以下LUVと略記）を製造する方法が記
載されている。 発明が解決しようとする問題点 従来法に従つて、リポソーム組成物の凍結乾燥
品を水性媒体もしくは薬物含有水性媒体に分散す
ると、一般に再生されたリポソームは多重層リポ
ソーム（Multilamella vesicles、以下MLVと略
記）よりなる。したがつて、内包容積が小さく薬
物の取り込み率も低い。また、合成レシチンで調
製したリポソームの凍結乾燥を室温で水性媒体に
分散させた場合は、リポソームさえも再生されな
い。 本発明者はリポソームの凍結乾燥を水性媒体に
分散させてリポソーム製剤を製造する際に内包容
積が大きく、内包される薬物の取り込み率の高い
リポソームに再生することを目的として、研究を
重ねた。 ロ 発明の構成 問題点を解決するための手段 リポソームの凍結乾燥品を水性媒体に分散させ
てリポソーム製剤を製造するに際し、(1)リポソー
ムを構成するレシチンのゲル／液晶相転移温度
（Tc）以上に加温することにより、リポソームを
構成する脂質としていかなるレシチンが用いられ
ていてもリポソームは再生しうるし、また(2)水性
媒体中に存在する１価陽イオンのイオン強度を約
0.05以下にすることにより、大きな一枚膜リポソ
ーム（LUV）ないし大きな数枚膜リポソーム
（large oligolamella vesicles、以下LOVと略記）
に再生し得る。 内包される薬物は、リポソームの凍結乾燥時
に加えてもよいし、リポソームの凍結乾燥品に
混和してもよく、これら混合物を用いて本発明方
法を実施する。さらに、薬物を溶解または分散
させた水性媒体にリポソーム凍結乾燥品を分散さ
せるときに、本発明方法を実施することもでき
る。 本発明においては、リポソームを形成するリン
脂質として、レシチンすなわち飽和または不飽和
のホスフアチジルコリンを用いる。これらレシチ
ンはホスフアチジルセリン、ホスフアチジルエタ
ノールアミン、ホスフアチジルイノシトール、ジ
ホスフアチジルグリセロール、ホスフアチデート
（phosphatidate）、スフインゴミエリンなどを含
んでいてもよく、更にコレステロールや荷電物質
（例、ステアリルアミン、ジセチルホスフエイト）
を含んでもよい。具体例としては、卵黄、大豆、
その他の動植物より得たレシチン類およびそれら
の水素添加物ならびに合成レシチンを単独または
組合せて用いる。例えば、ジパルミトイル・ホス
フアチジルコリン、ジステアロイル・ホスフアチ
ジルコリン、１−パルミトイル−２−ステアロイ
ル・ホスフアチジルコリン、１−ステアロイル−
２−パルミトイル・ホスフアチジルコリンなどを
単独でまたは混合して使用する。 なお、主なリン脂質のゲル／液晶相移転温度は
Ann.Rev.Biophys.Bioeng.，９、467（1980）に記
載されている。ゲル／液晶相転位温度が室温以下
であるリン脂質からなるリポソームの凍結乾燥品
を再生する場合は、当然再生時に加温する必要は
ない。したがつて、本発明方法の適応対象から除
かれる。 本発明方法で用いるリポソームの凍結乾燥品は
公知の方法により製造された凍結乾燥MLVまた
はSUVであり、いかなる凍結乾燥方法では製造
されたものであつてもよい。 内包される薬物としては、５−フルオロウラシ
ル、ネオマイシン、ブレオマイシンなどの制がん
剤、クロラムフエニコール、テトラサイクリン、
セフアレキシン、ラタモキセフなどの抗生物質、
ウロキナーゼなどの酵素類、インターフエロン、
インターロイキン、グロブリン、インシユリンな
どのペプチド系薬物、DNA、RNAなどの核酸
類、スルフアメトキサゾール、フエノバルビター
ルなどの一般薬物、ビタミン類、その他が例示さ
れる。 リポソームの凍結乾燥品を分散させる水性媒体
としては、得られるリポソーム製剤の用途に応じ
て、水、食塩水（例、生理食塩水）、緩衝液（例、
リン酸緩衝液、トリスアミノメタン緩衝液）など
を用いうるが、同水性媒体中の一価陽イオンのイ
オン強度（Ｉ）を0.05以下、より好ましくは0.02
以下にすることにより、LUVまたはLOVに再生
しうる。ここに一価陽イオンとはリチウム、ナト
リウム、カリウム、アンモニウムイオン等を含
む。したがつて、水性媒体として精製水を用いる
のが好ましく、一価陽イオンを含有する緩衝液を
水性媒体として用いる場合および内包させる薬剤
が一価金属イオンを含むものである場合には、イ
オン高度が0.05以下になるように希釈すること
で、LUVまたはLOVを得ることができる。な
お、分散させるリポソームの凍結乾燥品は、その
構成リン脂質のゲル／液晶相移転温度にかかわり
なく、凍結乾燥前にMLVまたはSUVであれば、
上記条件の水性媒体に分散させることにより
LUVまたはLOVに再生させることが可能であ
る。 かくして得られたリポソーム製剤は分散液のま
まで投与対象に経口または非経口で投与してもよ
いし、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過などの方法
で内包されなかつた薬剤を除去したのち使用して
もよい。 作 用 本発明方法で調製したリポソーム製剤は取り込
み率が高く、用いた薬剤を効率よく内包してい
る。また、再生されたリポソームは内包容積が大
きいため、脂質当りの内包薬物量が多く、リポソ
ーム製剤を投与する際に生じるリン脂質による毒
性、その他のトラブルを回避できる。 さらに内包させる薬物は、リポソームの凍結乾
燥品を再生させる際に、混和することが可能であ
るため、リポソームおよび薬物を安定に保存する
ことができる。 実施例 以下に実施例により本発明の実施態様を示す
が、これら実施例はなんら本発明を限定するもの
ではない。 実施例 (1) ジパルミトイルホスフアチジルコリン
（DPPC）700mgをクロロホルムに溶解し、ロータ
リーエバポレーターにて、クロロホルムを除去
し、ナス型フラスコの内壁にリン脂質の薄膜を形
成させる。その後十分減圧下で乾燥した後、25ml
の精製水を加え、50℃で約７分間手でしんとうし
ながら乳濁化をおこない多重層リポソーム
（MLV）の分散液を得た。次に、これをドライア
イス―アセトンで凍結させた後、真空下で凍結乾
燥をおこなつた。得られた粉末はストツクしてお
き、次にこの粉末を10mgずつ遠心チユーブに秤取
し、これに、精製水、1/2と1/10に生理食塩水を
希釈した水溶液及び、0.02Mリン酸緩衝溶液に溶
解した５−フルオロウラシル（5FU）（５mg／ml）
の水溶液を0.4mlずつ加えた後、十分膨潤、分散
したところで50℃で５分間加温した。次に室温下
で等張のリン酸緩衝液（PH7.4）を加えて超遠心
分離機（85000ｇ×60分）を用いて２回洗浄して
得たリポソームの5FU取り込み率と内包容積
（captured volume）を表１に示した。 取り込み率は リポソームに含まれた薬物量／用いた薬物量×100 で表した。リポソームに含まれた薬物量は、トラ
イトン×−100でリポソームを破壊して解放され
た薬物を液体クロマトグラフイーにより定量し
た。 5FUに対するクロマトを条件は、ヌクレオシル
₁₀C₁₈、0.05Mリン酸２水素カリウム／アセトニト
リル＝75／25、265nｍである。内包容積は 用いた薬物水溶液量（μ1）×取り込み率／用いた脂
質重量（mg） で表した。尚、5FUは、リポソーム膜に吸着しな
いことを実験的に確かめた。

【表】 実施例 (2) DPPC300mgを用いて、実施例１と同様の方法
で製造したMLVの分散液に超音波照射（大岳超
音波粉砕器、中型tip、120W×３分）を、行なつ
た。次に、この超音波処理して得たSUVの分散
液を超遠心機（85000ｇ×30分）にかけて、分離
し、その上清を(1)と同様、凍結乾燥した。このよ
うにして得た、SUVの凍結乾燥試料を用いて、
実施例１と同じリポソームの再生実験をおこなつ
た。その結果を表２に示したが、比較のために、
膜の相転移温度以上に加温せず、単に凍結乾燥リ
ポソームと5FU水溶液を室温で混合しただけの実
験例をに示した。

【表】 実施例 (3) 実施例１で得られたMLVの凍結乾燥試料10mg
に5FUの結晶２mgを配合し、その後精製水0.4ml
を加えて、十分膨潤分散したところで、50℃で５
分間加温し、後は実施例１と同じ方法で得られた
リポソームの取り込み率を測定た結果、取り込み
率37.5％、内包容積14.5μ／mgであつた。 実施例 (4) 実施例１の5FUの代りにセフアレキシン（５
mg／ml）とラタモキセフ（３mg／ml）を用い、溶
媒には精製水、生理食塩水を1/2に希釈した水溶
液、0.05Mリン酸緩衝液（PH7.4）を用いて得た
結果を表３に示した。比較のためには、通常の
水和法（実施例１で記したMLV調製の際、精製
水の代りに薬物水溶液を用いる方法）で得たラタ
モキセフ含有リポソーム（MLV）の結果を示し
た。脂質の単位重量当りに加える薬物水溶液の量
は全て同じ条件（40μ／mg・lipid）である。加
温は50℃、２分間行なつた。定量は液体クロマト
グラフイーによつた。条件：ヌクレオシル₁₀C₁₈、
セフアレキシン：0.02Mリン酸緩衝液（PH
7.4）／メタノール＝60／35、270nｍ、ラタモキ
セフ：0.05M酢酸アンモニウム／メタノール11／
１、276nｍ

【表】 実施例 (5) DPPCに対してステアリルアミン（SA）とジ
セチルホスフエイト（DCP）をそれぞれ、
DPPC／SA＝９／１、DPPC／CP＝９／１のモ
ル比で配合したMLVの凍結乾燥試料を調製し、
それぞれの15mgに対してラタモキセフ（10mg／
ml）水溶液を0.2mlずつ加えて50℃で１分間加温
してリポソームを再生させた。得られたリポソー
ムは、それぞれ42.3％、28.7％の取り込み率を示
した。 実施例 (6) 実施例１で得られたMLVの凍結乾燥試料30mg
に対してインシユリン水溶液（10mg／ml、0.01N
塩酸含有）を加え、50℃で10分間加温、室温
で放置、試料30mgを0.01N塩酸存在下50℃で10
分間加温後インシユリンを添加した。以後実施例
１と同様にしてインシユリンの取り込みを測定
し、表４の結果を得た。

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 凍結乾燥した多重層リポソームまたは小さな
   単層リポソームを薬物存在下にゲル／液晶相転移
   温度以上で水性媒体に分散することを特徴とする
   リポソーム製剤の製造方法。 ２ 薬物を凍結乾燥前に多重層リポソームまたは
   小さな単層リポソームに混和する特許請求の範囲
   １の製造方法。 ３ 凍結乾燥した多重層リポソームまたは小さな
   単層リポソームに薬物を混和したのち水性媒体に
   分散する特許請求の範囲１の製造方法。 ４ 薬物をあらかじめ水性媒体に添加しておく特
   許請求の範囲１の製造方法。 ５ 凍結乾燥した多重層リポソームまたは小さな
   単層リポソームを薬物存在下に１価陽イオンのイ
   オン強度が0.05以下の水性媒体に分散することを
   特徴とするリポソーム製剤の製造方法。 ６ 薬物を凍結乾燥前に多重層リポソームまたは
   小さな単層リポソームに混和する特許請求の範囲
   ５の製造方法。 ７ 凍結乾燥した多重層リポソームまたは小さな
   単層リポソームに薬物を混和したのち水性媒体に
   分散する特許請求の範囲５の製造方法。 ８ 薬物をあらかじめ水性媒体に添加しておく特
   許請求の範囲５の製造方法。