KR101638156B1

KR101638156B1 - C형 간염 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR101638156B1
Application number: KR1020140144534A
Authority: KR
Inventors: 윤승규; 김정희; 허원희; 조미라; 최정은; 이은별
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2013-10-29
Filing date: 2014-10-23
Publication date: 2016-07-08
Also published as: US20160271229A1; US10195166B2; KR20150050384A

Abstract

본 발명은 C형 간염 바이러스(hepatitis C virus, HCV) 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 GRIM19 단백질 또는 이의 단편; 및 상기 단백질 또는 단백질 단편을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 C형 간염 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 C형 간염 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물에 관한 것이다.

Description

C형 간염 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 {Pharmaceutical composition for preventing or treating hepatitis C virus infectious disease}

본 발명은 C형 간염 바이러스(hepatitis C virus, HCV) 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 GRIM19(Genes-associated with Reinoid-Interferon induced Morality 19) 단백질 또는 이의 단편; 및 상기 단백질 또는 단백질 단편을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 C형 간염 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 C형 간염 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물에 관한 것이다.

C형 간염 바이러스는 전세계적으로 대략 1억 8천만의 사람들이 감염되어 있으며, HCV에 감염된 환자는 급성간염을 거쳐 일부는 완치되나 대부분의 환자의 경우 (50-80%) 만성감염으로 진행된다. 이러한 만성 간염 환자의 약 20%는 간경화 및 간암이 발병하는 것으로 알려져 있다.

현재 HCV에 대한 백신은 상용화된 것이 없어 의학적 접근의 예방은 불가능한 상황이고, HCV의 표준치료법으로 페길화 인터페론(peg-IFN-α)과 뉴클레오사이드 유사체인 리바비린(ribavirin)의 병행치료를 사용하고 있으나, 독감 유사 증상(flu like symptom; 발열, 피로, 근육통, 두통, 오한 등), 빈혈, 호중구 감소증(Neutropenia), 혈소판 감소증(Thrombocytopenia), 혈청 ALT 상승, 신경정신과적 이상, 갑상선 기능 이상, 호흡기 관련 질환(간질성 폐렴 등), 안과적 이상(망막 출혈, 색각 소실 등), 피부 질환(홍반, 발진 등), 탈모 등의 부작용이 있을 수 있다.

또한, 상기 HCV 표준치료법은 HCV의 유전자형(genotype)에 따라 제한적인 효과를 보인다. 유전자형 2와 3에 대해서는 약 80%의 지속적인 바이러스성 반응율(sustained virological response, SVR; 치료 종료 후 6개월동안 혈중 HCV가 검출되지 않는 상태)을 나타내나, 유전자형 1과 4는 지속적인 바이러스성 반응율이 50% 미만으로, 재발 가능성이 높다.

최근, 페길화 인터페론과 리바비린 병행치료의 제한적 효과를 극복하고자 DAA(Direct-Acting Antivirals)개념의 치료제 개발이 이루어졌으며, HCV NS3-NS4A 단백질 저해효소(protease inhibitors)로 텔라프레비어(telaprevir)와 보세프레비어(boceprevir)가 승인을 받아 사용되고 있다. 그러나 이 치료제 역시 유전자형 1b에 제한적으로 효과가 나타나는 것으로 알려져 있으며 치료제 저항성이 우려되고 있다.

따라서, HCV 표준치료법이 듣지 않는 환자들에게 적용될 수 있고, 유전자형에 제한없이 적용 가능한 항-HCV 약물의 개발이 절실한 상태이다.

한편, GRIM19은 세포의 죽음과 관련된 유전자로, 최근에는 yeast-2-hybrid 스크리닝을 통해 STAT3와 상호작용을 하는 파트너로 알려져 있고(Zhang J, Yang J, Roy SK, Tininini S, Hu J, Bromberg JF. et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2003;100:93429347), 타이로신(tyrosin)과 세린(serine) 잔기의 인산화를 억제하거나 DNA 결합을 방해하지 않으면서 STAT3에 의해 유도되는 전사를 억제하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Chung CD, Liao J, Liu B, Rao X, Jay P, Berta P. et al. Science. 1997;278:18031805). 하지만, GRIM19는 C형 간염 바이러스와 관련하여 어떠한 내용도 알려진 바가 없다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 HCV에 의해 만성 간질환이 유발된 환자의 간 조직 및 HCV 감염된 세포에서 GRIM19의 발현이 감소하는 것을 확인하였고, 또한 GRIM19를 과발현시키는 경우 HCV 복제 저해 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 GRIM19 단백질 또는 이의 단편; 및 상기 단백질 또는 단백질 단편을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, C형 간염 바이러스(hepatitis C virus) 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 GRIM19 단백질 또는 이의 단편; 및 상기 단백질 또는 단백질 단편을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, C형 간염 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은, GRIM19 단백질 또는 단백질 단편; 및 상기 단백질 또는 단백질 단편을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, C형 간염 바이러스(hepatitis C virus) 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서 본 발명은, GRIM19 단백질 또는 단백질 단편; 및 상기 단백질 또는 단백질 단편을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, C형 간염 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물에 관한 것이다.

상기 GRIM19 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

또한 상기 GRIM19 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

상기 GRIM19 단백질 단편은 서열번호 2 내의 1 내지 36번째 아미노산 서열을 포함하는 단백질 단편; 서열번호 2 내의 37 내지 72번째 아미노산 서열을 포함하는 단백질 단편; 서열번호 2 내의 73 내지 101번째 아미노산 서열을 포함하는 단백질 단편; 및 서열번호 2 내의 102 내지 144번째 아미노산 서열을 포함하는 단백질 단편으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

예를 들어, 상기 GRIM19 단백질의 단편은 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10 및 서열번호 12으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

또한, 상기 GRIM19 단백질의 단편을 코딩하는 유전자는, 서열번호 1 내의 3 내지 108번째 염기서열을 포함하는 유전자; 서열번호 1 내의 109 내지 216번째 염기서열을 포함하는 유전자; 서열번호 1 내의 217 내지 303번째 염기서열을 포함하는 유전자; 및 서열번호 1 내의 304 내지 432번째 염기서열을 포함하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

예를 들어, 상기 GRIM19 단백질의 단편을 코딩하는 유전자는 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11 및 서열번호 13으로 이루어진 군에서 선택된 염기 서열로 이루어진 것일 수 있다.

상기 GRIM19 단백질 또는 이의 단편은 N-말단, C-말단, 또는 양 말단에 세포 투과성 펩타이드를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

예를 들어, 상기 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

상기 GRIM19 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 유전자는 재조합 벡터에 포함된 형태로 제공될 수 있다.

상기 조성물은 DGAT-1(diacyl-glycerol acyltransferase-1)의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 추가로 포함하는 것일 수 있다.

예를 들어, 상기 DGAT-1의 발현 또는 활성을 억제하는 물질은 DGAT-1에 대한 siRNA, shRNA 또는 안티센스 핵산일 수 있다.

예를 들어, 상기 DGAT-1의 발현 또는 활성을 억제하는 물질은 항체, 압타머 또는 화학식 1의 화합물 또는 이의 염일 수 있다.

[화학식 1]

또한, 상기 조성물은 RNA의존성 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA polymerase)의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 추가로 포함하는 것일 수 있다.

예를 들어, 상기 RNA의존성 RNA 중합효소의 발현 또는 활성을 억제하는 물질은 화학식 2의 화합물 또는 이의 염일 수 있다.

[화학식 2]

또한, 상기 조성물은 AMP-activated protein kinase(AMPK)를 활성화하는 물질을 추가로 포함하는 것일 수 있다.

예를 들어, 상기 AMP-activated protein kinase(AMPK)를 활성화하는 물질은 메트포르민(metformin)일 수 있다.

상기 C형 간염 바이러스 감염 질환은 C형 간염, C형 간염 바이러스에 의한 간섬유화, C형 간염 바이러스에 의한 간경화 및 C형 간염 바이러스에 의한 간암일 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 HCV에 의해 만성 간질환이 유발된 환자의 간 조직 및 HCV 감염된 세포에서 GRIM19의 발현이 감소하는 것을 기초로, GRIM19를 과발현시키는 경우 HCV 복제 저해 효과가 있음을 확인한 것으로, GRIM19 단백질 또는 단백질 단편, 및 상기 단백질 또는 단백질 단편을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 C형 간염 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 C형 간염 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물을 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, HCV에 의해 만성 간질환이 유발된 환자의 간 조직 및 HCV 감염된 세포에서의 GRIM19의 발현 정도를 웨스턴 블랏을 이용하여 측정하였다.

그 결과, HCV에 의해 만성 간질환이 유발된 환자의 조직 및 HCVcc(Hepatitis C Virus cell culture)(in vitro 세포배양으로 확립된 HCV 감염모델을 통해 배양된 세포에서 얻어진 HCV)가 감염된 세포에서 특이적으로 GRIM19의 발현이 감소되어 있는 것을 확인하였다(실시예 1 및 2).

또 다른 실시예에서는, GRIM19의 발현을 인위적으로 증가시켰을 경우 HCV 복제에 대한 효과를 알아보기 위해, GRIM19 과발현 벡터를 제작하여 HCV를 감염시킨 세포에 형질도입시켰다.

그 결과, HCV를 감염시킨 세포에서 약 60~70%의 HCV RNA가 감소하는 것을 확인하였다(실시예 3).

또 다른 실시예에서는 GRIM19 과발현에 의한 HCV 복제 저해와 세포 내 지질 축적과 관련 있는지 확인하기 위하여, GRIM19가 과발현된 세포에 지질을 처리한 후 HCV RNA 수준을 확인하였다.

그 결과, GRIM19가 과발현되는 경우 HCV RNA 수준이 감소하고 Huh7 세포 내의 지질 축적 정도가 감소하였으나, 지질이 처리되는 경우 HCV RNA 수준이 다시 복원되는 것을 확인하였다(실시예 4).

또한, GRIM19가 과발현되는 경우 세포 내의 지질 축적 정도가 감소하는 메커니즘을 확인하기 위하여, 지방산 합성(fatty acid synthesis)을 촉진시키는 효소(enzyme)인 acetyl-CoA carbosylase (Acc)의 발현 변화를 확인하였다.

그 결과, GRIM19가 과발현되는 경우 acetyl-CoA carbosylase의 발현이 감소되는 것을 확인하였다(실시예 5).

또한, GRIM19를 과발현시킨 세포에 acetyl-CoA carbosylase의 활성을 억제시키는 물질을 처리한 경우, HCV RNA 수준을 확인하였다.

그 결과, acetyl-CoA carbosylase의 활성을 억제시키는 물질을 처리한 경우 HCV 억제에 대한 상승적 효과가 나타나는 것을 확인하였다(실시예 6).

또한, GRIM19를 과발현시킨 세포에 DGAT-1의 저해제(inhibitor)를 동시에 처리한 경우, HCV RNA 수준을 quantitative Real-time RT PCR을 통해 확인하였다.

그 결과, DGAT-1의 저해제를 처리한 경우 HCV 억제에 대한 상승적 효과가 나타나는 것을 확인하였다(실시예 7).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, GRIM19를 과발현시킨 세포에 RNA-dependent RNA polymerase의 활성을 억제시키는 물질을 처리한 경우, HCV RNA 수준을 확인하였다.

그 결과, GRIM19를 과발현시킨 경우 및 RNA-dependent RNA polymerase의 활성을 억제시키는 물질을 각각 단독으로 처리한 경우에 비하여, GRIM19를 과발현시키고 RNA-dependent RNA polymerase의 활성을 억제시키는 물질을 동시에 처리한 경우 HCV 억제에 대한 상승적 효과가 나타나는 것을 확인하였다(실시예 8).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, GRIM19 단백질을 4개의 도메인으로 구분하여 항-HCV 효과가 있는 도메인 확인하였다.

그 결과, 본 발명에서 구분한 4개의 도메인 각각이 HCV 감염된 Huh7 세포에 형질되입되는 경우 모두가 HCV RNA 수준을 의미있게 감소시킬 수 있음을 확인하였다(실시예 9).

또한, GRIM19 단백질의 각 도메인 자체를 세포 내로 투과시키는 경우에도 항-HCV 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, 각 도메인에 세포 투과성이 있는 펩타이드 서열(Cell permeable peptide sequence, CP)을 합성하여 HCV 감염 모델에서 효과를 확인하였다.

그 결과, GRIM19 단백질의 각 도메인이 직접 세포 내로 투과되는 경우에도 HCV가 감염된 세포에서 HCV RNA 수준을 현저히 감소시킬 수 있음을 확인하였다(실시예 10).

따라서, 본 발명에서는 GRIM19 단백질 또는 단백질 단편을 직접 처리하거나, GRIM19 단백질 또는 단백질 단편을 과발현시키거나, GRIM19 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하여, 세포 내에서 GRIM19의 발현이 증가하는 경우 C형 간염 바이러스의 복제를 억제하여 C형 간염 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료에 이용할 수 있음을 입증하였다.

본 발명에서 용어, "GRIM19"는 인터페론/레티노이드(IFN/retinoid) 처리 시 발생되는 세포자살(apopotosis) 과정에 관여하는 단백질로 규명되었으며 미토콘드리아 호흡 복합체 1(mitochondiral respiratory complex 1)의 구성 요소인 NDUFA13(NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 13)으로도 알려져 있다. 또한, GRIM19은 HCV와 관련된 어떠한 내용도 알려진 바가 없다. 서열번호 1의 GRIM19 유전자 서열은 유전자 은행 등록번호 AF286697으로, 서열번호 2의 GRIM19 단백질 아미노산 서열은 AAG28167(NCBI)로 각각 알려져 있다.

서열번호 1

atggcggcgtcaaaggtgaagcaggacatgcctccgccggggggctatgggcccatcgactacaaacggaacttgccgcgtcgaggactgtcgggctacagcatgctggccatagggattggaaccctgatctacgggcactggagcataatgaagtggaaccgtgagcgcaggcgcctacaaatcgaggacttcgaggctcgcatcgcgctgttgccactgttacaggcagaaaccgaccggaggaccttgcagatgcttcgggagaacctggaggaggaggccatcatcatgaaggacgtgcccgactggaaggtgggggagtctgtgttccacacaacccgctgggtgccccccttgatcggggagctgtacgggctgcgcaccacagaggaggctctccatgccagccacggcttcatgtggtacacgtag

서열번호 2

MAASKVKQDMPPPGGYGPIDYKRNLPRRGLSGYSMLAIGIGTLIYGHWSIMKWNRERRRLQIEDFEARIALLPLLQAETDRRTLQMLRENLEEEAIIMKDVPDWKVGESVFHTTRWVPPLIGELYGLRTTEEALHASHGFMWYT

하나의 양태로, 본 발명은 GRIM19 단백질 또는 단백질 단편, 및 상기 단백질 또는 단백질 단편을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, C형 간염 바이러스(hepatitis C virus) 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

상기 GRIM19 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 본 발명에서 GRIM19 단백질은 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 범위에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 변형된 형태도 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화 (phosphorylation), 황화 (sulfation), 아세틸화 (acetylation), 당화 (glycosylation), 메틸화 (methylation), 파렌실화 (farnesylation) 등으로 수식 (modification)될 수도 있다.

또한, 본 발명은 GRIM19 단백질 활성을 유지하는 한, GRIM19의 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 본 발명의 범위에 포함한다.

또한, 상기 단백질 단편은, GRIM19 단백질 전체 서열 중 연속하는 일부 서열을 의미하는 것으로, 예를 들어, GRIM19 단백질 내의 연속하는 29개 내지 144개의 아미노산을 포함하는 단백질 단편; GRIM19 단백질 전체 서열 내의 연속하는 30개 내지 144개의 아미노산을 포함하는 단백질 단편; GRIM19 단백질 전체 서열 내의 연속하는 36개 내지 144개의 아미노산을 포함하는 단백질 단편; GRIM19 단백질 전체 서열 내의 연속하는 37개 내지 144개의 아미노산을 포함하는 단백질 단편; GRIM19 단백질 전체 서열 내의 연속하는 43개 내지 144개의 아미노산을 포함하는 단백질 단편 등일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

또 다른 예로, 상기 단백질 단편은, 서열번호 2 내의 1 내지 36번째 아미노산 서열을 포함하는 단백질 단편; 서열번호 2 내의 37 내지 72번째 아미노산 서열을 포함하는 단백질 단편; 서열번호 2 내의 73 내지 101번째 아미노산 서열을 포함하는 단백질 단편; 서열번호 2 내의 102 내지 144번째 아미노산 서열을 포함하는 포함하는 단백질 단편 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또 다른 예로, 상기 단백질 단편은 서열번호 6, 8, 10 또는 12일 수 있으나, GRIM19 단백질 단편의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 범위에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 변형된 형태도 포함할 수 있다. 또한, GRIM19 단백질 단편의 활성을 유지하는 한, GRIM19 단백질 단편의 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 본 발명의 범위에 포함한다.

상기 단백질을 코딩하는 유전자는, GRIM19 단백질을 코딩하는 유전자에 해당하는 한 본 발명의 범위에 포함되고, 일예로, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 GRIM19 단백질 활성을 유지하는 한, 상기 GRIM19 단백질을 코딩하는 유전자 서열과 70% 이상, 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 DNA 서열을 갖는 유전자를 본 발명의 범위에 포함한다.

상기 단백질 단편을 코딩하는 유전자는, GRIM19 단백질 단편을 코딩하는 유전자에 해당하는 한 본 발명의 범위에 포함되고, 일예로, 서열번호 1 내의 3 내지 108번째 염기서열을 포함하는 유전자; 서열번호 1 내의 109 내지 216번째 염기서열을 포함하는 유전자; 서열번호 1 내의 217 내지 303번째 염기서열을 포함하는 유전자; 서열번호 1 내의 304 내지 432번째 염기서열을 포함하는 유전자 등 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또 다른 예로, 상기 단백질 단편을 코딩하는 유전자는, 서열번호 7, 9, 11 또는 13의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 GRIM19 단백질 단편의 활성을 유지하는 한, 상기 GRIM19 단백질 단편을 코딩하는 유전자 서열과 70% 이상, 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 DNA 서열을 갖는 유전자를 본 발명의 범위에 포함한다.

본 발명의 일예로, 상기 단백질 또는 단백질 단편은 N-말단, C-말단, 또는 양 말단에 세포 투과성 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 상기 단백질 또는 단백질 단편이 세포 투과성 펩타이드를 포함함으로써 HCV가 감염된 세포 내로 효과적으로 들어가 우수한 항-HCV 활성을 나타낼 수 있다.

상기 세포 투과성 펩타이드는 예를 들어, R9 펩타이드(RRRRRRRRR, 서열번호 19), 페너트라틴(Penetratin) 펩타이드(RQIKIWFQNRRMKWKK, 서열번호 20), TAT 펩타이드(GRKKRRQRRRPPQ, 서열번호 21), MTS 펩타이드(AAVALLPAVLLALLAP, 서열번호 22) 일 수 있으나, 세포를 투과할 수 있는 활성이 있는 펩타이드에 해당하는 한 제한없이 본 발명의 범위에 포함된다.

상기 GRIM19 단백질 또는 단백질 단편의 수득 방법은 특별히 제한되지 않는데, 예를 들면 천연에서 추출하거나 합성(Merrifleld, J. Amer. chem. Soc..85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다 (Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).

본 발명에서 GRIM19 단백질 또는 단백질 단편을 코딩하는 유전자는, GRIM19 단백질 또는 단백질 단편의 아미노산 정보를 암호화하는 핵산 분자를 의미하며 이들은 자연에서 분리되거나 인위적으로 합성 변형된 것일 수 있다. 즉, 천연형 DNA에 한정되는 것은 아니며, GRIM19 단백질 또는 단백질 단편을 발현하는 활성을 유지하는 범위 내에서 적절한 변형이 가해지거나 발현 조절을 위한 요소가 부가되거나, 유전공학적 방법 혹은 화학적 방법에 의해 얻어지는지 여부를 불문하고 본 발명의 목적에 적합하게 사용될 수 있는 것을 의미한다.

또한, 본 발명의 GRIM19 단백질 또는 단백질 단편을 코딩하는 유전자는 세포 내 전달을 위한 발현 벡터에 포함되어 제공될 수 있다. 이 경우, GRIM19 단백질 또는 단백질 단편을 코딩하는 유전자는 발현 벡터 내에서 프로모터/인핸서 서열과 같은 발현 조절 서열 및 기타 전사, 해독 또는 프로세싱에 필요한 서열들과 함께 결합될 수 있다. 조절 서열은 뉴클레오타이드의 구성적 발현 (constitutive expression)을 지시하는 것뿐만이 아니라 조직-특이적 조절 및/또는 유도성 서열을 포함할 수 있으며, 발현 벡터의 설계는 형질전환시킬 숙주 세포, 목적하는 발현 수준 등과 같은 요소에 의해 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물에서 GRIM19 단백질 또는 단백질 단편을 코딩하는 유전자를 삽입할 수 있는 벡터로는 레트로바이러스 (retrovirus) 벡터, 아데노바이러스 (adenovirus) 벡터, 아데노 관련 바이러스 (adeno-associated virus) 벡터 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 (herpes simplex virus) 벡터와 같은 바이러스 유래 벡터와, 동물의 체내에서 발현될 수 있는 플라스미드 및 이들의 변형 벡터 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 일예로, 본 발명에 따른 조성물은 DGAT-1의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 추가로 포함할 수 있는데, 이를 통해 본 발명에 따른 조성물을 단독으로 처리한 경우보다 C형 간염 바이러스 복제 억제 효과가 상승할 수 있다. DGAT-1은 디아실글리세롤(diacylglycerol) 및 아실-CoA(Acyl-CoA)로부터 트리글리세리드(triglycerides)를 생성하는 효소로 알려져 있으며, 서열번호 17의 DGAT 유전자 서열은 유전자 은행 등록번호 NM_012079.5, GI:525342626 (NCBI)으로, 서열번호 18의 DGAT 단백질 아미노산 서열은 NP_036211.2 (NCBI)로 각각 알려져 있다.

DGAT-1 발현 또는 활성을 억제하는 물질은 DGAT-1의 합성경로, 반응경로 등을 차단하는 물질을 의미한다. 예를 들어, DGAT-1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합(hybridization)할 수 있는 siRNA, shRNA 또는 안티센스 핵산(antisense oligonucleotide) 등이 될 수 있다. 상기 siRNA, shRNA 또는 안티센스 핵산은 DGAT-1유전자의 mRNA 염기 서열에 특이적으로 결합하고 다른 핵산물질의 염기 서열에는 특이적 결합을 하지 않는 것이 바람직하나, DGAT-1의 합성경로, 반응경로 등을 차단하는 물질에 해당하면 이에 제한되지 않는다.

이때, 상보적으로 결합한다는 것은, 소정의 혼성화 또는 어닐링(annealing) 조건, 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 안티센스 핵산이 DGAT-1 유전자의 mRNA 타겟에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포함하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.

일예로, 본원의 DGAT-1 유전자의 mRNA 타겟에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것은 siRNA일 수 있다. 용어, "siRNA"는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knockdown) 방법으로서 또는 유전자 치료의 방법으로 제공될 수 있다.

siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70염기이다. siRNA 말단 구조는 표적 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의해 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 또는 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3' 말단 돌출한 구조와 5' 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 또한 siRNA는 표적 유전자의 발현 억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA 분자 또는 인공의 RNA 분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단 구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중 사슬 RNA 일반의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스텝 루프형 구조일 수도 있다.

본 발명에서 사용되는 siRNA는 그 자체로 폴리뉴클레오타이드 페어링을 갖는 완전한 형태, 즉 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 두 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입되는 형태이거나, 생체 내에 투여된 후 이러한 형태를 갖도록 하나의 단일쇄 올리고뉴클레오타이드 단편과 이의 역방향(reverse) 상보물이 스페이서에 의해 분리된 단일쇄 폴리뉴클레오타이드로부터 유도될 수 있는 형태, 예를 들어 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유도된 siRNA 발현 카세트를 형질전환 또는 감염(infection) 과정을 거쳐 세포 안으로 도입되는 형태일 수 있다. siRNA를 제조하고 세포 또는 동물로 도입하는 방법의 결정은 목적 및 표적 유전자 산물의 세포 생물학적 기능에 따라 달라질 수 있다.

다른 일예로, 본원의 DGAT-1 유전자의 mRNA 타겟에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것은 shRNA일 수 있다. 용어 "shRNA"는 siRNA의 고가의 생합성 비용, 낮은 세포 형질감염 효율로 인한 RNA 간섭 효과의 단시간 유지 등의 단점을 극복하기 위한 것으로 RNA 중합효소 Ⅲ의 프로모터로부터 아데노 바이러스, 렌티 바이러스 및 플라스미드 발현 벡터 시스템을 이용하여 이를 세포 내로 도입하여 발현시킬 수 있으며, 이러한 shRNA는 세포 내에 존재하는 siRNA 프로세싱 효소(Dicer or Rnase Ⅲ)에 의해 정확한 구조를 갖는 siRNA로 전환되어 목적 유전자의 사일런싱을 유도함이 널리 알려져 있다.

또 다른 일예로, 본원의 DGAT-1 유전자의 mRNA 타겟에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것은 안티센스 핵산일 수 있다. 용어 "안티센스 핵산"이란 특정 mRNA 의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 특징이 있다. 본 발명의 안티센스 서열은 DGAT-1 유전자의 mRNA에 상보적이고 DGAT-1 유전자의 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, DGAT-1 유전자의 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6 내지 100 염기이고, 바람직하게는 8 내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기이다.

안티센스 RNA의 경우 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나, 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 RNA를 합성하는 한 예는 RNA 폴리머라제Ⅰ를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물은 DGAT-1의 siRNA, shRNA 또는 DGAT-1 안티센스 핵산의 1종 이상을 추가로 포함하는 외에, 환자의 C형 간염 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료를 위한 추가의 물질을 포함할 수 있으며, 또는 siRNA 또는 안티센스 핵산 분자의 유입을 촉진시키는 제제, 예를 들어 리포좀(미국 특허 제4,897,355호, 제4,394,448호, 제4,23,871호, 제4,231,877호, 제4,224,179호, 제4,753,788호, 제4,673,567호, 제4,247,411호, 제4,814,270호)을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류 중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수도 있다. 또한 안티센스 핵산은 세포에 의해 흡수되는 펩티드에 접합시킬 수도 있다. 유용한 펩타이드의 예로는 펩타이드 호르몬, 항원 또는 항체 및 펩타이드 독소 등이 있다.

상기 DGAT-1 발현 또는 활성을 억제하는 물질의 또 다른 예는, DGAT-1에 대한 항체; 압타머; 또는 화학식 1(A922500, MERK)의 화합물 또는 이의 염 일 수 있다.

[화학식 1]

용어 "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 DGAT-1 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, DGAT-1 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝(cloning)하여 상기 DGAT-1 유전자에 의해 코딩되는 DGAT-1 단백질을 얻고, 얻어진 DGAT-1 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 DGAT-1 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 다클론 항체, 단클론 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.

본 발명의 DGAT-1의 발현 또는 활성을 억제하는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

용어 "압타머"는, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 압타머는, 소정의 표적 분자에 대하여 결합함으로써, 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 압타머는, RNA, DNA, 수식 핵산 또는 이들의 혼합물 등의 직쇄상 또는 환상의 형태의 핵산일 수 있다. 압타머는, 파지 디스플레이(phage display) 또는 단일 클론 항체(monoclonal antibodies, "MAbs")에 의해 생성되는 펩티드와 같은 것으로서, 선택된 표적에 특이적으로 결합할 수 있고 표적의 활성을 조절할 수 있으며, 예컨대, 결합을 통해 압타머가 기능에 대한 표적의 능력을 차단할 수 있다. 불규칙 서열 올리고뉴클레오티드의 풀(pool)로부터 시험관내 선택 프로세스에 의해 생성된 것으로서, 압타머는 성장 인자, 전사 인자, 효소, 면역글로불린, 및 수용체를 포함하는 100 이상의 단백질에 걸쳐 생성된 것이다. 전형적인 압타머는 크기가 10-15 kDa(30-45개의 뉴클레오티드)이며, 나노몰 이하(sub-nanomolar)의 친화성으로 그 표적에 결합하며, 그리고 밀접하게 관련된 표적들로부터 구분된다(예컨대, 압타머는 동일한 유전자 패밀리로부터의 다른 단백질과는 전형적으로 결합하지 않는다). 압타머가 갖는 친화성을 유도하는 동일한 유형의 결합 상호작용(예컨대, 수소 결합, 정전기적 상보성, 소수성 접촉, 입체적 배제(steric exclusion))과 항체-항원 복합체에서의 특이성을 통하여 선택된 표적에 특이적으로 결합할 수 있고 표적의 활성을 조절할 수 있으며 표적의 능력을 차단할 수 있다.

본 발명의 "압타머"는 DGAT-1에 대하여 결합 활성을 갖는 압타머이다. 바람직하게, 본 발명의 압타머는 DGAT-1에 결합하여, HCV 입자(particle) 형성을 저해할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일예로, 본 발명에 따른 조성물은 RNA의존성 RNA 중합효소의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 추가로 포함할 수 있는데, 이를 통해 본 발명에 따른 조성물을 단독으로 처리한 경우보다 C형 간염 바이러스 복제 억제 효과가 상승할 수 있다.

RNA의존성 RNA 중합효소의 발현 또는 활성을 억제하는 물질은 RNA의존성 RNA 중합효소의 합성경로, 반응경로 등을 차단하는 물질을 의미한다. 예를 들어, 화학식 2의 화합물 또는 이의 염일 수 있다.

[화학식 2]

또한, RNA-dependent RNA polymerase의 발현 또는 활성을 억제하는 물질과 관련된 용어의 설명은 상기 DGAT-1 발현 또는 활성을 억제하는 물질에 대한 내용이 적용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일예로, 본 발명에 따른 조성물은 AMP-activated protein kinase(AMPK)를 활성화하는 물질을 추가로 포함할 수 있는데, 이를 통해 본 발명에 따른 조성물을 단독으로 처리한 경우보다 C형 간염 바이러스 복제 억제 효과가 상승할 수 있다.

AMP-activated protein kinase를 활성화하는 물질은 AMP-activated protein kinase의 합성경로, 반응경로 등을 활성화 또는 촉진하는 물질을 의미한다. 예를 들어, 메트포르민(metformin)일 수 있다.

본 발명에서 C형 간염 바이러스 감염 질환이란, C형 간염 바이러스가 감염되어 발생할 수 있는 질환을 말한다. 구체적으로, C형 간염 바이러스에 의해 발생한 C형 간염, 이러한 C형 간염 상태가 만성화 되어 발생될 수 있는 C형 간염 바이러스에 의한 간섬유화, 간경화 및 간암일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, C형 간염 바이러스가 감염되어 발생하는 모든 질병일 수 있다.

또 다른 양태로 본 발명은, GRIM19 단백질 또는 이의 단편, 및 상기 단백질 또는 단백질 단편을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, C형 간염 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물에 관한 것이다.

항바이러스용 조성물과 관련된 용어의 설명은 상기 C형 간염 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 대한 내용이 적용될 수 있다.

일 구현예로, 본 발명의 조성물은 단독으로 사용할 수 있지만, 치료 효율을 증가시키기 위해 C형 간염 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료에 사용되는 다른 치료법과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있고, 경구 투여시에는 결합체, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 조성물의 유효 투여량의 범위는 성별, 체표면적, 질환의 종류 및 중증도, 연령, 약물에 대한 민감도, 투여경로 및 배출비율, 투여시간, 치료기간, 표적세포, 발현 수준 등 기타 의학 분야에 잘 알려진 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명은 GRIM19 단백질 또는 단백질 단편, 및 상기 단백질 또는 단백질 단편을 코딩하는 유전자를 포함하는, C형 간염 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 C형 간염 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물을 제공하며, 이를 이용하면, HCV 표준치료법이 듣지 않는 환자들에 대해 치료가 가능하며, 유전자형에 제한없이 C형 간염 바이러스의 복제를 저해하여 C형 간염 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료가 가능하다.

도 1은 HCV에 의해 만성 간질환이 유발된 환자의 간 조직에서 GRIM19의 발현을 분석한 웨스턴 블랏 결과이다. "HCV-infected patients"는 C형 간염 바이러스에 감염된 환자, "HBV-infected patients"는 B형 간염 바이러스에 감염된 환자, "CHC"는 만성 C형 간염(Chronic Hepatitis C virus) 환자의 간 조직, "CHB"는 만성 B형 간염(Chronic Hepatitis B virus)환자의 간 조직, "LC"는 간경화(liver cirrhosis, LC)환자의 간 조직, "HCC"는 간암(Hepatocelluar carcinoma, HCC)환자의 간 조직, "GRIM19"는 GRIM19 단백질의 발현, "β-actin"은 β-actin 단백질의 발현을 나타낸다.
도 2는 HCV에 의해 만성 간질환이 유발된 환자의 간 조직에서 GRIM19의 발현을 상대적으로 비교한 그래프이다. "Normal"은 정상 대조군, "HCV-CLD"는 C형 간염 바이러스에 감염된 만성 C형 간염 환자, "HBV-CLD"는 B형 간염 바이러스에 감염된 만성 B형 간염 환자를 나타낸다.
도 3은 In vitro HCV 감염 모델(infection model)에서 GRIM19의 발현을 분석한 웨스턴 블랏 결과이다. "Huh7"은 HCV에 감염되기 전의 결과, "HCVcc(Days)"는 HCV에 감염된 일 수를 나타낸다.
도 4는 GRIM19를 발현하는 벡터를 형질도입(transfection)시킨 후 GRIM19의 과발현을 확인한 웨스턴 블랏 결과이다. "Mock"은 아무런 처리도 하지 않은 세포, "pcDNA3"은 GRIM19를 발현하지 않는 벡터를 형질도입시킨 세포, "pcDNA3_GRIM19"는 GRIM19를 발현하는 벡터를 도입시킨 세포에서의 단백질 발현 결과를 나타낸다.
도 5a는 Huh7 세포를 HCVcc로 감염시킨 후, pcDNA3_GRIM19을 형질도입하고 48시간 후 HCV RNA 수준 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 5b는 GRIM19 과발현에 따른 HCV RNA 수준 변화를 보여준다. "Mock"은 아무런 처리도 하지 않은 세포, "pcDNA3_GRIM19"는 GRIM19를 발현하는 벡터를 도입시킨 세포에서의 결과를 나타낸다.
도 6a는 GRIM19를 발현하는 벡터를 형질도입(transfection)시켜 GRIM19가 과발현되는 경우 Huh7 세포 내의 지질 축적 정도의 변화를 나타낸 것이다. "BSA"는 대조군으로 bovine serum albumin을 첨가한 경우, "OA"는 지질(oleic acid)을 첨가한 경우를 나타낸다.
도 6b는 GRIM19를 발현하는 벡터를 형질도입시켜 GRIM19가 과발현되어 감소된 Huh7 세포 내의 감소된 HCV RNA 수준이 지질의 처리를 통하여 복원되는 것을 나타낸 것이다.
도 7a는 pcDNA3_GRIM19가 도입되어 GRIM19가 과발현되는 경우 지방산 합성에 관여하는 단백질들의 발현 변화를 나타낸 것이다. "SIRT"는 sirtuin protein, "p-Acc"는 phospho-acetyl-CoA carboxylase, "Acc"는 acetyl-CoA carboxylase, "p-AMPK"는 phospho- AMP-activated protein kinase, "AMPK"는 AMP-activated protein kinase, "Actin"은 actin 단백질을 의미한다.
도 7b는 pcDNA3_GRIM19가 도입되어 GRIM19가 과발현되는 경우 acetyl-CoA carbosylase (Acc)의 발현 변화를 나타낸 것이다.
도 8은 pcDNA3_GRIM19을 형질도입하여 GRIM19를 과발현시키고 메트포르민을 처리한 경우의 HCV RNA 수준 변화를 나타낸다. "Mock"은 아무런 처리도 하지 않은 세포, "pcDNA3_GRIM19"는 GRIM19를 발현하는 벡터를 형질도입시킨 세포에서의 결과를 나타낸다.
도 9은 pcDNA3_GRIM19가 도입된 세포에 화학식 1의 화합물(DGAT-1 저해제)을 병용 처리한 경우에 HCV RNA 수준 변화를 나타낸다. "DMSO"는 화학식 1의 화합물 대신 DMSO(dimethyl sulfooxide)를 처리한 대조군, "Mock"은 아무런 처리도 하지 않은 세포, "pcDNA3_GRIM19"는 GRIM19를 발현하는 벡터를 형질도입시킨 세포에서의 결과를 나타낸다.
도 10은 pcDNA3_GRIM19가 도입된 세포에 화학식 2의 화합물(RNA-dependent RNA polymerase의 활성 억제제)을 처리한 경우에 HCV RNA 수준 변화를 나타낸다. "Sofosbuvir"는 화학식 2의 화합물을 나타낸다.
도 11a는 본 발명에서 GRIM19 단백질을 4개의 도메인으로 구분한 모식도를 나타낸다.
도 11b는 In vitro HCV 감염 모델에서 GRIM19 단백질 및 본 발명에서 구분한 GRIM19 단백질의 4개 도메인을 각각 형질도입시킨 경우의 HCV RNA 수준 변화를 나타낸다.
도 12는 In vitro HCV 감염 모델에 본 발명에서 구분한 GRIM19 단백질의 4개 도메인에 세포 투과성이 있는 펩타이드 서열(CP)이 결합된 펩타이드를 직접 처리한 경우 HCV RNA 수준 변화를 나타낸다.
도 13은 pJFH-1의 구조를 알 수 있는 개열지도를 나타낸다.
도 14은 pcDNA3를 이용하여 제조된 GRIM19 과발현 벡터의 구조를 나타낸다.
도 15는 pCMV-3Tag-3A 벡터의 구조를 알 수 있는 개열지도를 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. HCV 에 의해 만성 간질환이 유발된 환자의 간 조직에서의 GRIM19 발현 감소 확인

만성 간염을 유발하는 주요 바이러스인 HBV와 HCV에 감염되어 만성 간질환이 유발된 환자(chronic liver disease, CLD)의 조직에서 GRIM19의 발현 정도를 알아보기 위해 anti-GRIM19 antibody를 이용한 웨스턴 블랏 분석(western blot anlaysis)을 실시하였다.

서울 성모병원 내원 환자 중 임상시험심사위원회(Institutional Review Board, IRB)에서 승인된 환자에서 HBV 또는 HCV에 감염되어 만성 간염(CHB, CHC), 간경화 (LC) 그리고 간암 (HCC)가 유발된 환자를 선별하고, 그로부터 생체검사(Biopsy)된 간 조직을 얻었다. 상기 얻은 간 조직(C형 간염 환자의 경우 CHC n=4, LC n=3, HCC n=2, B형 간염 환자의 경우 CHB n=3, LC n=3, HCC n=3)을 20 mg을 PROPREP reaget (INTRON BIOTECHNOLOGY)를 이용하여 용해(lysis)시킨 후 20ug의 용해물(lysates)을 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. Anti-GRIM19 monoclonal antibody는 Abcam사 제품을 사용하였으며 anti-β-actin monoclonal antibody는 Sigma 사 제품을 사용하였다.

실험 결과 HBV에 감염된 환자의 간 조직과 달리 HCV에 의해 만성 간질환이 유발된 환자의 조직에서 특이적으로 GRIM19의 발현이 감소되어 있는 것을 확인하였다(도 1 및 도 2).

실시예 2. In vitro HCV 감염 모델( infection model )에서 GRIM19 의 발현 감소 확인

HCV는 마우스(mouse)와 같은 소동물에 감염되지 않고, 유일한 동물 모델이 침팬지(chimpanzee)이기 때문에, 현재 HCV 연구의 대부분은 in vitro 감염 모델(infection model)을 통해 이루어지고 있다.

JFH-1 주(strain)을 이용하여 HCVcc(Hepatitis C Virus cell culture) 시스템을 구축한 일본 국립 전염병 연구소(National Institute of Infectious Diseases) 소속의 타카지 와키타(Takaji Wakita) 교수 연구진으로부터 감염 클론(infectious clone)인 JFH-1 클론을 포함하는 벡터(vector)인 pJFH-1(도 13)을 제공받아 HCVcc 시스템을 구축하였다.

재조합 HCV 감염 모델(Recombinant infectious HCV model)을 구축하기 위하여 in vitro 전사(transcription)을 통해 합성된 감염성 있는(infectious) HCV 게놈(genome)을 전기천공법(electroporation)을 통해 Huh7 세포(한국세포주은행) 에 유입시켰으며 3일 마다 계대하여 세포를 배양하였다.

전기천공 이후 Huh7 세포 내의 HCV RNA는 quantitative Real-time RT PCR를 통해 확인하였다. Trizol LS reagents(Invitrogen)를 이용하여 총 RNA(total RNA)를 추출하고 추출된 RNA 2ug을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA, Lightcycler 480 probe master(Roche), HCV 5'-UTR 특이적 형광 probe(서열번호 3)및 프라이머(primers)(서열번호 4 및 5)를 이용하여 quantitative realtime RT PCR을 수행하였다.

	유전자 이름	서열(5'→ 3')
서열번호 3	HCV 5'UTR probe	CTGCGGAACCGGTGAGTACAC
서열번호 4	HCV 5'UTR Forward Primer	GCGCCTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGTC
서열번호 5	HCV 5'UTR Reverse Primer	ACCACAAGGCCTTTCGCAACCCAACGCTAC

전기천공(Electroporation) 수행 3일 이후 총 RNA(total RNA) 1ug 당 약 1x10⁶ 개(copies)이상이 검출되었으며 세포 배양액으로 배출된 HCVcc의 양을 HCV RNA 수준을 통해 확인해 본 결과 HCV RNA가 배양액 1ml 당 RNA 1ug당 약 1x10⁷ 개 수준으로 유지되는 것을 확인하였다. 이를 통해 HCV 연구의 실험적 토대가 되는 in vitro HCV 감염 시스템(infectious system)이 구축된 것을 확인하였다.

in vitro HCV 감염 시스템을 이용하여 HCV 감염에 따른 GRIM19의 발현 변화를 확인하였다. 10-cm 배양접시(culture dish)에 1.5x10⁶개의 Huh7 세포를 식종(seeding)한 후 다음날 HCVcc를 감염시켰다. 이후 3일에 한 번씩 세포와 배양액은 1:4 비율로 계대배양 하였다.

HCVcc 감염 시킨 Huh7 세포를 3, 6, 9 그리고 12일 째 수확(harvest)하여 GRIM19의 발현 수준을 웨스턴 블랏 분석을 통해 확인하였다. 세포는 PROPREP reaget(INTRON BIOTECHNOLOGY)를 이용하여 용해(lysis) 시킨 후 20ug의 용해물(lysates)를 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. Anti-GRIM19 monoclonal antibody는 Abcam사 제품을 사용하였으며 anti-β-actin monoclonal antibody는 Sigma 사 제품을 사용하였다.

실시예 1의 HCV-CLD 조직(C형 간염 바이러스에 감염된 만성 C형 간염 환자)에서와 마찬가지로 HCVcc가 감염된 Huh7에서 GRM19 수준이 감소되는 현상을 확인하였다. 감염 3일 후에는 약 80 %, 6일 이후 약 60% 수준으로 감소하였다(도 3).

실시예 3. GRIM19 과발현에 의한 HCV RNA 수준 감소

실시예 1 및 2를 통하여, HCV 감염된 조직과 세포에서 GRIM19의 발현 감소는 HCV복제에 유리한 환경을 형성하기 위해 바이러스에 의해 조절된 것이라 추론하여, 이에 근거하여 GRIM19의 발현을 인위적으로 증가시켰을 경우 HCV 복제 저해 효과를 확인하였다.

GRIM19의 과발현을 통한 HCV 복제 저해 효과를 확인하기 위하여 GRIM19 과발현 벡터를 제작하였다. GRIM19의 유전자는 Huh7 세포의 mRNA로부터 RT PCR를 통해 확보하였으며 제한효소 BglII와 HindIII를 이용하여 pcDNA3 벡터(invitrogen)(도 14)에 클로닝(cloning) 하였다. GRIM19의 과발현 여부는 웨스턴 블랏 분석을 통해 확인하였다(도 4).

10-cm 배양접시(culture dish)에 1.5x10⁶ Huh7 세포를 식종(seeding)한 후 다음날 HCVcc를 감염시켰다. 이후 3일에 한 번씩 세포와 배양액은 1:4 비율로 계대배양 하였다. 감염 1일째, 4일째, 7일째와 10일째 계대배양 한 세포들은 다음 날 5ug의 pcDNA3_GRIM19을 FUGENE HD(Promega)를 이용하여 형질도입(transfection)하였다. 형질도입 후 48시간 후에 세포를 수확(harvest)하여 HCV RNA 수준을 quantitative Real-time RT PCR을 통해 확인하였다.

도 5a는 Huh7 세포를 HCVcc로 감염시킨 후, pcDNA3_GRIM19을 형질도입하고 48시간 후 HCV RNA 수준을 확인한 것인데, Huh7 세포를 HCVcc로 감염되더라도 GRIM 19 단백질이 발현되는 경우 HCV RNA가 감소하는 것을 확인하였다.

또한, 도 5b에서 알 수 있는 바와 같이, HCVcc 감염된 Huh7 세포의 경우 3일 째 총 RNA(total RNA) 1ug당 약 9.5x10⁵ HCV RNA 개(copies), 6일 째 총 RNA(total RNA) 1ug당 약 6.9.5x10⁶ HCV RNA 개(copies), 9일 째 총 RNA(total RNA) 1ug당 약 5.0x10⁷ HCV RNA 개(copies),12일 째 총 RNA 1ug당 약 1.9x10⁸ HCV RNA 개가 검출되었으며, pcDNA3_GRIM19을 도입시켜 GRIM19를 과발현 시킨 결과 각각 약 5.7x10⁵ HCV RNA 개, 3.5x10⁶ HCV RNA 개, 1.8x10⁷ HCV RNA 개, 3.8x10⁷ HCV RNA 개로 HCV RNA 수준이 감소하였다. 이를 통하여, HCV 감염시킨 Huh7 세포에 GRIM19을 과발현 시킨 결과 약 40~80% HCV RNA가 감소하는 것을 확인하였다.

따라서, HCV가 감염된 세포에 GRIM 19 단백질이 발현되는 경우 항-HCV 활성이 있음을 명확하게 입증하였다.

실시예 4. HCV RNA 수준과 세포 내 지질 축적과의 관계 확인

HCV의 복제는 세포 내 지질(lipid)에 많은 영향을 받는 것으로 알려져 있음을 근거로, GRIM19 과발현에 의한 HCV RNA 감소 효과가 세포 내 지질 축적과 관련 있는지 확인하기 위하여 pcDNA3_GRIM19가 도입된 Huh7 세포에 지질(oleic acid(OA))을 처리 한 후, HCV RNA 수준을 확인하였다.

세포 내 축적되는 지질의 정도는 Nile Red staining 후 fluorescence의 정도를 측정하여 확인하였다. 구체적으로, 6 well plate에 2x10⁵ Huh7 세포를 식종(seeding)한 후 24 시간 후에 pcDNA3_GRIM19을 형질도입시켰다. pcDNA3_GRIM19 형질도입 후 serum free DMEM media를 이용하여 세포를 배양하였다. 24시간 후 pcDNA3_GRIM19이 형질도입된 세포에 1% BSA가 포함된 serum free DMEM media를 이용하여 100 μM의 oleic acid(OA)를 처리하였다. 24 시간 후, OA 처리에 의해 증가된 세포 내 지질 양을 Nile Red staining을 통해 확인하였다. pcDNA3_GRIM19이 과발현 및 OA가 처리가 완료된 세포를 3.7% paraformaldehyde를 이용하여 고정시키고 1 μg/mL의 Nile Red가 포함된 PBS 용액을 이용하여 세포 내 지질을 형광염색하였다. 세포의 개수에 대한 지질 축적의 정도를 예측하기 위하여 0.2 μg/mL 의 DAPY를 이용하여 핵을 염색하였다. 세포 내 지질 축적 정도를 microplate reader를 통해 측정된 형광의 세기를 통해 확인하였으며 DAPI의 정도를 통해 지질 축적의 정도를 상대적으로 비교 분석하였다.

결과, 도 6a에서 알 수 있는 바와 같이, pcDNA3_GRIM19가 도입되어 GRIM19가 과발현되는 경우 Huh7 세포 내의 지질 축적 정도가 감소하는 것을 확인하였다.

또한, 도 6b에서 확인할 수 있는 바와 같이 pcDNA3_GRIM19가 도입되어 GRIM19가 과발현됨에 따라 감소한 HCV RNA 수준(실시예 3)이 지질(oleic acid(OA))의 처리를 통하여 복원되는 것을 확인하였다. 이를 통하여, GRIM19의 과발현에 의한 HCV RNA 수준 감소는 세포 내 지질 축적과 관련되어 있음을 입증하였다.

실시예 5. GRIM19 과발현에 의한 세포 내 지질 감소 메커니즘 확인

상기 실시예 6에서 알 수 있는 바와 같이, pcDNA3_GRIM19가 도입되어 GRIM19가 과발현되는 경우 Huh7 세포 내의 지질 축적 정도가 감소하는데, 그 메커니즘을 확인하기 위하여 지방산 합성 과정에서 지방산 합성을 촉진시키는 효소인 acetyl-CoA carbosylase (Acc) 를 비롯한 지방산 합성 관련 단백질들의 발현 변화를 확인하였다.

10-cm 배양접시(culture dish)에 1.5x10⁶ Huh7 세포를 식종(seeding)한 후 serum free DMEM을 이용하여 배양하였다. 24시간 이후 pcDNA3_GRIM19을 형질도입시켰으며, 48 시간 후 세포를 수확하여 웨스턴블랏을 수행하였다. 수확된 세포에 iNtRON BIOTECHNOLOGY사의 PRO-PREP^TM Protein Extraction Solution 제품을 처리하여 protein lysates를 얻었다. 30 μg의 protein lysates를 8% SDS-PAGE를 통하여 size별로 분리한 후, nitrocellulose membrane으로 transfer 시킨 후, ACC 특이적 antibody를 이용하여 ACC의 발현 정도를 확인하였다. Anti-ACC antibody는 Cell Signaling 사에서 구매하여 사용하였다. 단백질의 발현 정도는 chemiluminescence system (Amersham Pharmacia Biotech)을 통하여 가시화시켰으며 가시화된 ACC proteins bands 및 loading control인 β-actin band의 density를 분석을 통하여 ACC 발현 정도를 상대적으로 비교하였다.

도 7a 및 도 7b에서 확인할 수 있는 바와 같이, pcDNA3_GRIM19가 도입되어 GRIM19가 과발현되는 경우 acetyl-CoA carbosylase의 발현이 감소되는 것을 확인하였다.

C형 간염 바이러스에 감염된 경우, 세포 내 지질이 축적되는 현상이 나타나며, 이러한 경우, SIRT1의 활성이 감소되며, 이에 따라 AMPK의 활성도 감소되는 현상이 나타나고 그에 따라 ACC의 활성이 높아져 세포 내 지질 생산이 촉진되는 것으로 보고되어 있는데, 도 7a에서 알 수 있는 바와 같이, SIRT1 및 AMPK의 활성이 감소하였음에도 불구하고 ACC의 활성도 감소하였음을 확인할 수 있으며, 이는 GRIM19의 과발현에 의해 감소되는 것이라는 것을 확인할 수 있었다.

이를 통하여, HCV에 의해 세포 내 지질 대사 과정에 관여하는 주요 효소 중 ACC 의 발현 수준이 GRIM19의 과발현에 의해 감소되고, 그에 따라 세포 내 지질이 감소되는 것임을 입증하였다.

실시예 6. GRIM19 과발현과 Acc 활성 억제 물질의 병용 처리를 통한 HCV 에 대한 상승적 억제 효과

상기 실시예 5에서 GRIM19가 과발현되는 경우 acetyl-CoA carbosylase(Acc)의 발현이 감소되는 것을 확인하였으므로, ACC의 활성을 억제시키는 AMP-activated protein kinase(AMPK)의 활성제(activator)인 메트포르민(metformin)(Sigama Aldrich, Cat. D150959)을 병용 투여하는 경우의 HCV RNA 카피 변화를 확인하였다

도 8에서 알 수 있는 바와 같이, pcDNA3_GRIM19을 형질도입하여 GRIM19를 과발현시키고 메트포르민을 처리한 경우가 메트포르민을 단독으로 투여한 경우에 비하여 HCV RNA 증가 수준이 현저히 낮아 HCV에 대하여 상승적 억제 효과가 있음을 확인하였다.

이를 통하여, GRIM19 과발현에 의한 HCV RNA 수준 감소 메커니즘에 AMPK와Acc 단백질을 포함하는 지방산 합성 과정의 조절이 관여되어 있음을 입증하였다.

실시예 7. GRIM19 과발현과 DGAT -1 inhibitor 병용 처리를 통한 HCV 에 대한 상승적 억제 효과

HCV의 복제 복합체 형성은 지질막(lipid membrane)에 의존적으로 일어나며 HCV 입자(particle) 형성 역시 지방 방울(lipid droplet)이 중요한 역할을 담당하고 있다는 것을 근거로, HCVcc 감염된 Huh7 세포에서 GRIM19를 과발현시킨 세포에 DGAT-1의 저해제인 화학식 1의 화합물(A922500, MERK) 40uM를 동시에 처리한 결과, HCV 복제 억제에 대한 상승적 효과가 나타나는 것을 확인하였다(도 9).

[화학식 1]

실시예 8. In vitro HCV 감염 모델에서 RNA - dependent RNA polymerase 활성 억제 화합물 처리를 통한 통한 HCV 에 대한 상승적 억제 효과

상기 실시예 3에서와 같이 HCCcc 감염된 Huh7 세포에, pcDNA3_GRIM19을 FUGENE HD를 이용하여 형질도입하거나, HCV의 RNA-dependent RNA polymerase의 활성을 억제시키는 화합물인 소포스부비르(sofosbuvir)(PharmaBLOCK R&D Co. Ltd.)(화학식 2)를 처리하거나, pcDNA3_GRIM19을 형질도입하고 소포스부비르를 처리하고, HCV RNA 카피의 변화를 확인하였다

[화학식 2]

도 10에서 알 수 있는 바와 같이, DMSO(dimethyl sulfoxide)를 처리한 대조군을 제외하고 모두 3일째까지 HCV RNA 카피 수준이 감소되었다가 다시 증가되는 양상을 확인하였다. 또한, pcDNA3_GRIM19을 형질도입하고 소포스부비르를 처리한 경우, 소포스부비르를 단독으로 처리한 경우에 비하여 HCV RNA 증가 수준이 낮아 HCV에 대하여 상승적 억제 효과가 있음을 확인하였고, 9일째에는 약 45% 이상 현저히 낮게 나타나는 것을 확인하였다.

실시예 9. GRIM19 단백질에서 항- HCV 효과가 있는 도메인 확인

GRIM19 단백질은 144개의 아미노산으로 이루어져 있는데, 아래 표 1과 같이 4개의 도메인(domain)으로 구분하여 항-HCV 효과가 있는 도메인을 확인하였다(도 11a).

도메인	아미노산 서열	유전자 서열 (5'→3')
GRIM19 - D1 ( aa 1-36)	MAASKVKQDMPPPGGYGPIDYKRNLPRRGLSGYSML (서열번호 6)	atggcggcgtcaaaggtgaagcaggacatgcctccgccggggggctatgggcccatcgactacaaacggaacttgccgcgtcgaggactgtcgggctacagcatgctg (서열번호 7)
GRIM19 - D2 ( aa 37-72)	MAIGIGTLIYGHWSIMKWNRERRRLQIEDFEARIALL (서열번호 8)	atggccatagggattggaaccctgatctacgggcactggagcataatgaagtggaaccgtgagcgcaggcgcctacaaatcgaggacttcgaggctcgcatcgcgctgttg (서열번호 9)
GRIM19 - D3 ( aa 73-101)	MPLLQAETDRRTLQMLRENLEEEAIIMKDV (서열번호 10)	atgccactgttacaggcagaaaccgaccggaggaccttgcagatgcttcgggagaacctggaggaggaggccatcatcatgaaggacgtg (서열번호 11)
GRIM19 - D4 (aa 102-144)	MDWKVGESVFHTTRWVPPLIGELYGLRTTEEALHASHGFMWYT (서열번호 12)	atgcccgactggaaggtgggggagtctgtgttccacacaacccgctgggtgccccccttgatcggggagctgtacgggctgcgcaccacagaggaggctctccatgccagccacggcttcatgtggtacacg (서열번호 13)

상기 GRIM19-D1 (aa 1-36), GRIM19-D2 (aa 37-72), GRIM19-D3 (aa 73-101), GRIM19-D4 (aa 102-144)를 발현시킬 수 있는 발현 벡터를 제작하였으며, 실시예 2의 In vitro HCV 감염 모델에서 각 도메인의 효과를 확인하였다.

상기발현 벡터의 제작을 위해, GRIM19의 각 도메인에 대한 유전자는 pcDNA3_GRIM19 발현 vector를 template로 한 PCR을 통해 확보하였으며, EcoRI과 SalI 제한효소 절단위치(restriction site)를 이용하여 각 도메인을 pCMV-3Tag-3A 벡터(Agilent Technologies, Inc.)에 subcloning하였다. GRIM19-D2, GRIM19-D3, GRIM19-D4의 경우 벡터 내에서 발현을 위하여 실제 대응하는 GRIM19 유전자 서열의 5'앞에 개시코돈이 추가되었으며, 그에 따라 각 단백질 단편은 실제 대응하는 GRIM19 아미노산 서열의 N 말단 앞에 메티오닌이 추가되었다.

도 11b에서 알 수 있는 바와 같이, In vitro HCV 감염 모델에서 상기 제작한 각 도메인을 발현시킬 수 있는 발현 벡터를 형질도입시켜 GRIM19-D1, GRIM19-D2, GRIM19-D3, GRIM19-D4 도메인을 과발현시키는 경우, 모든 도메인에서 HCV RNA 수준이 의미있게 감소되는 것을 확인하였다. 또한, GRIM19 단백질을 발현시킨 경우보다 상기 각 도메인을 과발현시키는 경우에 HCV RNA 수준이 현저히 낮게 감소하는 것을 확인하였다.

따라서, GRIM19 단백질뿐 아니라 상기 GRIM19의 4가지 도메인을 각각 발현하는 경우에도 항-HCV 활성이 우수하게 나타나는 것을 입증하였다.

실시예 10. GRIM19 단백질 각 도메인의 항- HCV 효과 확인

GRIM19 단백질의 각 도메인 자체를 세포 내로 투과시키는 경우에도 항-HCV 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, 실시예 8의 GRIM19의 각 도메인의 N 말단 쪽에 세포 투과성이 있는 펩타이드 서열(CP)이 결합된 펩타이드를 합성하여 In vitro HCV 감염 모델에서 효과를 확인하였다. 합성한 세포 투과성이 있는 펩타이드 서열을 포함하는 GRIM19 각 도메인 서열은 하기 표 2에 정리하였다.

	아미노산 서열
CP - GRIM19 - D1	RRRRRRRRRMAASKVKQDMPPPGGYGPIDYKRNLPRRGLSGYSML (서열번호 14)
CP - GRIM19 - D2	RRRRRRRRRAIGIGTLIYGHWSIMKWNRERRRLQIEDFEARIALL (서열번호 15)
CP - GRIM19 - D3	RRRRRRRRRPLLQAETDRRTLQMLRENLEEEAIIMKDV (서열번호 16)

실시예 2의 In vitro HCV 감염 모델을 통하여 HCVcc 감염시킨 Huh7 세포에 CP-GRIM19-D1, CP-GRIM19-D2 및 CP-GRIM19-D3 10uM을 48 시간 처리 후, HCV의 RNA 수준을 조사하였다.

도 12에서 확인할 수 있는 바와 같이, CP-GRIM19-D1, CP-GRIM19-D2 및 CP-GRIM19-D3를 처리하는 경우 HCV가 감염된 세포에서 HCV RNA 수준이 현저히 감소되는 것을 확인하였다.

따라서, GRIM19 단백질 또는 GRIM19 단백질의 도메인이 형질도입되어 세포 내에서 직접 발현되는 경우 외에, 세포 밖에서 GRIM19 단백질 또는 GRIM19 단백질의 도메인이 직접 처리되는 경우에도 우수한 항-HCV 효과가 있음을 입증하였다.

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating hepatitis C virus infectious disease <130> DPP20145381KR <150> KR10-2013-0129139 <151> 2013-10-29 <160> 22 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 435 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(435) <223> GRIM 19 gene <400> 1 atggcggcgt caaaggtgaa gcaggacatg cctccgccgg ggggctatgg gcccatcgac 60 tacaaacgga acttgccgcg tcgaggactg tcgggctaca gcatgctggc catagggatt 120 ggaaccctga tctacgggca ctggagcata atgaagtgga accgtgagcg caggcgccta 180 caaatcgagg acttcgaggc tcgcatcgcg ctgttgccac tgttacaggc agaaaccgac 240 cggaggacct tgcagatgct tcgggagaac ctggaggagg aggccatcat catgaaggac 300 gtgcccgact ggaaggtggg ggagtctgtg ttccacacaa cccgctgggt gccccccttg 360 atcggggagc tgtacgggct gcgcaccaca gaggaggctc tccatgccag ccacggcttc 420 atgtggtaca cgtag 435 <210> 2 <211> 144 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(144) <223> GRIM19 peptide <400> 2 Met Ala Ala Ser Lys Val Lys Gln Asp Met Pro Pro Pro Gly Gly Tyr 1 5 10 15 Gly Pro Ile Asp Tyr Lys Arg Asn Leu Pro Arg Arg Gly Leu Ser Gly 20 25 30 Tyr Ser Met Leu Ala Ile Gly Ile Gly Thr Leu Ile Tyr Gly His Trp 35 40 45 Ser Ile Met Lys Trp Asn Arg Glu Arg Arg Arg Leu Gln Ile Glu Asp 50 55 60 Phe Glu Ala Arg Ile Ala Leu Leu Pro Leu Leu Gln Ala Glu Thr Asp 65 70 75 80 Arg Arg Thr Leu Gln Met Leu Arg Glu Asn Leu Glu Glu Glu Ala Ile 85 90 95 Ile Met Lys Asp Val Pro Asp Trp Lys Val Gly Glu Ser Val Phe His 100 105 110 Thr Thr Arg Trp Val Pro Pro Leu Ile Gly Glu Leu Tyr Gly Leu Arg 115 120 125 Thr Thr Glu Glu Ala Leu His Ala Ser His Gly Phe Met Trp Tyr Thr 130 135 140 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV 5' UTR probe <400> 3 ctgcggaacc ggtgagtaca c 21 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV 5'UTR Forward Primer <400> 4 gcgcctagcc atggcgttag tatgagtgtc 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV 5'UTR Reverse Primer <400> 5 accacaaggc ctttcgcaac ccaacgctac 30 <210> 6 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRIM19-D1 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(36) <223> Fragment of GRIM19 (comprising amino acid from 1st to 36th of GRIM19 protein) <400> 6 Met Ala Ala Ser Lys Val Lys Gln Asp Met Pro Pro Pro Gly Gly Tyr 1 5 10 15 Gly Pro Ile Asp Tyr Lys Arg Asn Leu Pro Arg Arg Gly Leu Ser Gly 20 25 30 Tyr Ser Met Leu 35 <210> 7 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GRIM19-D1 gene <220> <221> gene <222> (1)..(108) <223> GRIM19-D1 coding gene <400> 7 atggcggcgt caaaggtgaa gcaggacatg cctccgccgg ggggctatgg gcccatcgac 60 tacaaacgga acttgccgcg tcgaggactg tcgggctaca gcatgctg 108 <210> 8 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRIM19-D2 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(37) <223> Fragment of GRIM19 (comprising amino acid from 37th to 72nd of GRIM19 protein) <400> 8 Met Ala Ile Gly Ile Gly Thr Leu Ile Tyr Gly His Trp Ser Ile Met 1 5 10 15 Lys Trp Asn Arg Glu Arg Arg Arg Leu Gln Ile Glu Asp Phe Glu Ala 20 25 30 Arg Ile Ala Leu Leu 35 <210> 9 <211> 111 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GRIM19-D2 gene <400> 9 atggccatag ggattggaac cctgatctac gggcactgga gcataatgaa gtggaaccgt 60 gagcgcaggc gcctacaaat cgaggacttc gaggctcgca tcgcgctgtt g 111 <210> 10 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRIM19-D3 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(30) <223> Fragment of GRIM19 (comprising amino acid from 73rd to 101st of GRIM19 protein) <400> 10 Met Pro Leu Leu Gln Ala Glu Thr Asp Arg Arg Thr Leu Gln Met Leu 1 5 10 15 Arg Glu Asn Leu Glu Glu Glu Ala Ile Ile Met Lys Asp Val 20 25 30 <210> 11 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GRIM19-D3 <400> 11 atgccactgt tacaggcaga aaccgaccgg aggaccttgc agatgcttcg ggagaacctg 60 gaggaggagg ccatcatcat gaaggacgtg 90 <210> 12 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GRIM19-D4 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(43) <223> Fragment of GRIM19 (comprising amino acid from 102nd to 144th of GRIM19 protein) <400> 12 Met Asp Trp Lys Val Gly Glu Ser Val Phe His Thr Thr Arg Trp Val 1 5 10 15 Pro Pro Leu Ile Gly Glu Leu Tyr Gly Leu Arg Thr Thr Glu Glu Ala 20 25 30 Leu His Ala Ser His Gly Phe Met Trp Tyr Thr 35 40 <210> 13 <211> 132 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GRIM19-D4 gene <400> 13 atgcccgact ggaaggtggg ggagtctgtg ttccacacaa cccgctgggt gccccccttg 60 atcggggagc tgtacgggct gcgcaccaca gaggaggctc tccatgccag ccacggcttc 120 atgtggtaca cg 132 <210> 14 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CP-GRIM19-D1 <400> 14 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Met Ala Ala Ser Lys Val Lys 1 5 10 15 Gln Asp Met Pro Pro Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Ile Asp Tyr Lys Arg 20 25 30 Asn Leu Pro Arg Arg Gly Leu Ser Gly Tyr Ser Met Leu 35 40 45 <210> 15 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CP-GRIM19-D2 <400> 15 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ala Ile Gly Ile Gly Thr Leu 1 5 10 15 Ile Tyr Gly His Trp Ser Ile Met Lys Trp Asn Arg Glu Arg Arg Arg 20 25 30 Leu Gln Ile Glu Asp Phe Glu Ala Arg Ile Ala Leu Leu 35 40 45 <210> 16 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CP-GRIM19-D3 <400> 16 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Pro Leu Leu Gln Ala Glu Thr 1 5 10 15 Asp Arg Arg Thr Leu Gln Met Leu Arg Glu Asn Leu Glu Glu Glu Ala 20 25 30 Ile Ile Met Lys Asp Val 35 <210> 17 <211> 1467 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(1467) <223> DGAT-1 gene <400> 17 atgggcgacc gcggcagctc ccggcgccgg aggacagggt cgcggccctc gagccacggc 60 ggcggcgggc ctgcggcggc ggaagaggag gtgcgggacg ccgctgcggg ccccgacgtg 120 ggagccgcgg gggacgcgcc agccccggcc cccaacaagg acggagacgc cggcgtgggc 180 agcggccact gggagctgag gtgccatcgc ctgcaggatt ctttattcag ctctgacagt 240 ggcttcagca actaccgtgg catcctgaac tggtgtgtgg tgatgctgat cttgagcaat 300 gcccggttat ttctggagaa cctcatcaag tatggcatcc tggtggaccc catccaggtg 360 gtttctctgt tcctgaagga tccctatagc tggcccgccc catgcctggt tattgcggcc 420 aatgtctttg ctgtggctgc attccaggtt gagaagcgcc tggcggtggg tgccctgacg 480 gagcaggcgg gactgctgct gcacgtggcc aacctggcca ccattctgtg tttcccagcg 540 gctgtggtct tactggttga gtctatcact ccagtgggct ccctgctggc gctgatggcg 600 cacaccatcc tcttcctcaa gctcttctcc taccgcgacg tcaactcatg gtgccgcagg 660 gccagggcca aggctgcctc tgcagggaag aaggccagca gtgctgctgc cccgcacacc 720 gtgagctacc cggacaatct gacctaccgc gatctctact acttcctctt cgcccccacc 780 ttgtgctacg agctcaactt tccccgctct ccccgcatcc ggaagcgctt tctgctgcga 840 cggatccttg agatgctgtt cttcacccag ctccaggtgg ggctgatcca gcagtggatg 900 gtccccacca tccagaactc catgaagccc ttcaaggaca tggactactc acgcatcatc 960 gagcgcctcc tgaagctggc ggtccccaat cacctcatct ggctcatctt cttctactgg 1020 ctcttccact cctgcctgaa tgccgtggct gagctcatgc agtttggaga ccgggagttc 1080 taccgggact ggtggaactc cgagtctgtc acctacttct ggcagaactg gaacatccct 1140 gtgcacaagt ggtgcatcag acacttctac aagcccatgc ttcgacgggg cagcagcaag 1200 tggatggcca ggacaggggt gttcctggcc tcggccttct tccacgagta cctggtgagc 1260 gtccctctgc gaatgttccg cctctgggcg ttcacgggca tgatggctca gatcccactg 1320 gcctggttcg tgggccgctt tttccagggc aactatggca acgcagctgt gtggctgtcg 1380 ctcatcatcg gacagccaat agccgtcctc atgtacgtcc acgactacta cgtgctcaac 1440 tatgaggccc cagcggcaga ggcctga 1467 <210> 18 <211> 488 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(488) <223> DGAT-1 peptide <400> 18 Met Gly Asp Arg Gly Ser Ser Arg Arg Arg Arg Thr Gly Ser Arg Pro 1 5 10 15 Ser Ser His Gly Gly Gly Gly Pro Ala Ala Ala Glu Glu Glu Val Arg 20 25 30 Asp Ala Ala Ala Gly Pro Asp Val Gly Ala Ala Gly Asp Ala Pro Ala 35 40 45 Pro Ala Pro Asn Lys Asp Gly Asp Ala Gly Val Gly Ser Gly His Trp 50 55 60 Glu Leu Arg Cys His Arg Leu Gln Asp Ser Leu Phe Ser Ser Asp Ser 65 70 75 80 Gly Phe Ser Asn Tyr Arg Gly Ile Leu Asn Trp Cys Val Val Met Leu 85 90 95 Ile Leu Ser Asn Ala Arg Leu Phe Leu Glu Asn Leu Ile Lys Tyr Gly 100 105 110 Ile Leu Val Asp Pro Ile Gln Val Val Ser Leu Phe Leu Lys Asp Pro 115 120 125 Tyr Ser Trp Pro Ala Pro Cys Leu Val Ile Ala Ala Asn Val Phe Ala 130 135 140 Val Ala Ala Phe Gln Val Glu Lys Arg Leu Ala Val Gly Ala Leu Thr 145 150 155 160 Glu Gln Ala Gly Leu Leu Leu His Val Ala Asn Leu Ala Thr Ile Leu 165 170 175 Cys Phe Pro Ala Ala Val Val Leu Leu Val Glu Ser Ile Thr Pro Val 180 185 190 Gly Ser Leu Leu Ala Leu Met Ala His Thr Ile Leu Phe Leu Lys Leu 195 200 205 Phe Ser Tyr Arg Asp Val Asn Ser Trp Cys Arg Arg Ala Arg Ala Lys 210 215 220 Ala Ala Ser Ala Gly Lys Lys Ala Ser Ser Ala Ala Ala Pro His Thr 225 230 235 240 Val Ser Tyr Pro Asp Asn Leu Thr Tyr Arg Asp Leu Tyr Tyr Phe Leu 245 250 255 Phe Ala Pro Thr Leu Cys Tyr Glu Leu Asn Phe Pro Arg Ser Pro Arg 260 265 270 Ile Arg Lys Arg Phe Leu Leu Arg Arg Ile Leu Glu Met Leu Phe Phe 275 280 285 Thr Gln Leu Gln Val Gly Leu Ile Gln Gln Trp Met Val Pro Thr Ile 290 295 300 Gln Asn Ser Met Lys Pro Phe Lys Asp Met Asp Tyr Ser Arg Ile Ile 305 310 315 320 Glu Arg Leu Leu Lys Leu Ala Val Pro Asn His Leu Ile Trp Leu Ile 325 330 335 Phe Phe Tyr Trp Leu Phe His Ser Cys Leu Asn Ala Val Ala Glu Leu 340 345 350 Met Gln Phe Gly Asp Arg Glu Phe Tyr Arg Asp Trp Trp Asn Ser Glu 355 360 365 Ser Val Thr Tyr Phe Trp Gln Asn Trp Asn Ile Pro Val His Lys Trp 370 375 380 Cys Ile Arg His Phe Tyr Lys Pro Met Leu Arg Arg Gly Ser Ser Lys 385 390 395 400 Trp Met Ala Arg Thr Gly Val Phe Leu Ala Ser Ala Phe Phe His Glu 405 410 415 Tyr Leu Val Ser Val Pro Leu Arg Met Phe Arg Leu Trp Ala Phe Thr 420 425 430 Gly Met Met Ala Gln Ile Pro Leu Ala Trp Phe Val Gly Arg Phe Phe 435 440 445 Gln Gly Asn Tyr Gly Asn Ala Ala Val Trp Leu Ser Leu Ile Ile Gly 450 455 460 Gln Pro Ile Ala Val Leu Met Tyr Val His Asp Tyr Tyr Val Leu Asn 465 470 475 480 Tyr Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala 485 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R9 peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> Cell Penetrating Peptide <400> 19 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 20 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Penetratin peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> Cell Penetrating Peptide <400> 20 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 21 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAT peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(13) <223> Cell Penetrating Peptide <400> 21 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 10 <210> 22 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MTS peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> Cell Penetrating Peptide <400> 22 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 1 5 10 15

Claims

GRIM19(Genes-associated with Reinoid-Interferon induced Morality 19) 단백질 또는 이의 단편, 및 상기 단백질 또는 단백질 단편을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하며,
상기 GRIM19 단백질의 단편은
서열번호 2 내의 1 내지 36번째 아미노산 서열을 포함하는 단백질 단편;
서열번호 2 내의 37 내지 72번째 아미노산 서열을 포함하는 단백질 단편;
서열번호 2 내의 73 내지 101번째 아미노산 서열을 포함하는 단백질 단편; 및
서열번호 2 내의 102 내지 144번째 아미노산 서열을 포함하는 단백질 단편으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인,
C형 간염, C형 간염 바이러스에 의한 간섬유화 및 C형 간염 바이러스에 의한 간경화로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 C형 간염 바이러스(hepatitis C virus) 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 GRIM19 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 GRIM19 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것인, 약학 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 GRIM19 단백질의 단편은 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10 및 서열번호 12으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것인, 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 GRIM19 단백질의 단편을 코딩하는 유전자는
서열번호 1 내의 3 내지 108번째 염기서열을 포함하는 유전자;
서열번호 1 내의 109 내지 216번째 염기서열을 포함하는 유전자;
서열번호 1 내의 217 내지 303번째 염기서열을 포함하는 유전자; 및
서열번호 1 내의 304 내지 432번째 염기서열을 포함하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인,
약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 GRIM19 단백질의 단편을 코딩하는 유전자는 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11 및 서열번호 13으로 이루어진 군에서 선택된 염기 서열로 이루어진 것인, 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 GRIM19 단백질 또는 이의 단편은 N-말단, C-말단, 또는 양 말단에 세포 투과성 펩타이드를 추가로 포함하며,
상기 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것인, 약학 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 GRIM19 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 유전자는 재조합 벡터에 포함된 형태로 제공되는 것인, 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 DGAT-1(diacyl-glycerol acyltransferase-1)의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 추가로 포함하며,
상기 DGAT-1의 발현 또는 활성을 억제하는 물질은 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 염인, 약학 조성물.
[화학식 1]
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 조성물은 RNA의존성 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA polymerase)의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 추가로 포함하며,
상기 RNA의존성 RNA 중합효소의 발현 또는 활성을 억제하는 물질은 하기 화학식 2의 화합물 또는 이의 염인, 약학 조성물.
[화학식 2]
삭제
제1항에 있어서, 상기 조성물은 AMP-activated protein kinase(AMPK)를 활성화하는 물질을 추가로 포함하며,
상기 AMP-activated protein kinase(AMPK)를 활성화하는 물질은 메트포르민(metformin)인, 약학 조성물.
삭제
삭제
GRIM19 단백질 또는 이의 단편, 및 상기 단백질 또는 단백질 단편을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하며,
상기 GRIM19 단백질의 단편은
서열번호 2 내의 1 내지 36번째 아미노산 서열을 포함하는 단백질 단편;
서열번호 2 내의 37 내지 72번째 아미노산 서열을 포함하는 단백질 단편;
서열번호 2 내의 73 내지 101번째 아미노산 서열을 포함하는 단백질 단편; 및
서열번호 2 내의 102 내지 144번째 아미노산 서열을 포함하는 단백질 단편으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인,
C형 간염 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물.
제19항에 있어서, 상기 GRIM19 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 항바이러스용 조성물.
제19항에 있어서, 상기 GRIM19 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것인, 항바이러스용 조성물.
삭제
제19항에 있어서, 상기 GRIM19 단백질의 단편은 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10 및 서열번호 12으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것인, 항바이러스용 조성물.
제19항에 있어서, 상기 GRIM19 단백질의 단편을 코딩하는 유전자는
서열번호 1 내의 3 내지 108번째 염기서열을 포함하는 유전자;
서열번호 1 내의 109 내지 216번째 염기서열을 포함하는 유전자;
서열번호 1 내의 217 내지 303번째 염기서열을 포함하는 유전자; 및
서열번호 1 내의 304 내지 432번째 염기서열을 포함하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인,
항바이러스용 조성물.
제19항에 있어서, 상기 GRIM19 단백질의 단편을 코딩하는 유전자는 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11 및 서열번호 13으로 이루어진 군에서 선택된 염기 서열로 이루어진 것인, 항바이러스용 조성물.
제19항에 있어서, 상기 GRIM19 단백질 또는 이의 단편은 N-말단, C-말단, 또는 양 말단에 세포 투과성 펩타이드를 추가로 포함하며,
상기 세포 투과성 펩타이드는 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것인, 항바이러스용 조성물.
삭제
제19항에 있어서, 상기 GRIM19 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 유전자는 재조합 벡터에 포함된 형태로 제공되는 것인, 항바이러스용 조성물.
제19항에 있어서, 상기 조성물은 DGAT-1(diacyl-glycerol acyltransferase-1)의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 추가로 포함하며,
상기 DGAT-1의 발현 또는 활성을 억제하는 물질은 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 염인, 항바이러스용 조성물.
[화학식 1]
삭제
삭제
제19항에 있어서, 상기 조성물은 RNA의존성 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA polymerase)의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 추가로 포함하며,
상기 RNA의존성 RNA 중합효소의 발현 또는 활성을 억제하는 물질은 하기 화학식 2의 화합물 또는 이의 염인, 항바이러스용 조성물.
[화학식 2]
삭제
제19항에 있어서, 상기 조성물은 AMP-activated protein kinase(AMPK)를 활성화하는 물질을 추가로 포함하며,
상기 AMP-activated protein kinase(AMPK)를 활성화하는 물질은 메트포르민(metformin)인, 항바이러스용 조성물.
삭제