JPS6328391A - 安定化酵素剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、安定化酵素剤、さらに詳しくは、酵素を含む
リン脂質（夏合膜、すなわち、酵素とリン脂質とを含む
単一層または多重層ベシクル（ｖｅｓｉｃｌｅ）、およ
びそれを固定化してなる固定化酵素に関し、酵素活性を
安定に推持し、酵素、とくに疎水性酵素を利用する各種
の反応に長期間安定に使用し得るものである。

［従来技術］ 酵素を利用する反応では、酵素を固定化する方法が一般
に採用されている。

親水性酵素の固定化利用に関しては担体結合法、架橋法
、包括法などの各種固定化法、反応装置など多数の研究
開発がおこなわれている。特に、寒天やアルギン酸、カ
ラギーナン、セルロース誘導体のような多糖類、コラー
ゲンなどのタンパク質などの天然高分子、ポリアクリル
アミドゲルなとを用いる包括法は、単一の酵素のみなら
ず複数の酵素の固定化も容易に行えることや微生物菌体
や細胞内小器官、さらには動植物細胞の固定化にも適用
が可能であるので精力的に検討され一部実用化らなされ
ている。しかしながら、生体中では呼吸鎖、タンパク質
の合成などに見られるように、疎水性酵素が生体膜と密
接な…互作用を持ちながらベクトル的な逐次反応などの
高度な機能を発現しているので、このような生物の持つ
高度な機能を巧みに利用するへには疎水性酵素の固定化
技術が必要となってくる。

このような観点から、疎水性酵素を固定化する方法に関
する検討が最近いくつかなされており、代表例としては
、光架橋性樹脂プレポリマー法（Ｓ、Ｆｕｋｕｉら、Ｆ
ＥＢＳ　　Ｌｅｔｔ、６６．１７９（１９７６）；　　
Ｔ、Ｏｍａｔａら、　　Ｅｕｒ、　　　Ｊ、　　ＡＩ）
ｌ）ＩＭ　１ｃｒｏｂｉａ１．　Ｂ　１ｏｔｅｃｈｎｏ
１．、６　、２０７　（１９７９）；特開昭５７−１１
８７９２〕やウレタンプレポリマー法（Ｓ　、　Ｆ　ｕ
ｋｕｓｈｉｍａら、Ｂ　１ｏｔｅｃｈｎｏｌ　、　　Ｂ
　ｉｏｅｎｇ、　。

２０．１４６５（１９７８）；　　Ｋ、Ｓｏｎｏｍｏｔ
ｏら、Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　４４
．Ｉ　ｌ　ｌ　９（１９８０）３などが挙げられる。

［発明が解決しようとする問題点］ しかしながら、生体内では水に不溶な化合物の変換は、
生体膜に結合した酵素あるいは生体膜中に組み込まれた
酵素によって疎水的な環境下で行なわれるので、生体膜
の構造とは著しく異なった材料で固定化するプレポリマ
ー法では生物の持つ高度な機能を充分発揮させ安定な酵
素活性を維持するのが困雅となる。そのため、生体膜に
類似した構造や機能を保持する固定化技術の開発が強く
望まれていた。

［発明の構成および効果コ 本発明首らは生体膜に類似しｆこ構造を内部に包含する
材料に関し鋭へ研究した結果、疎水性酵素と細胞膜の主
成分を構成するリン脂質により調製したベシクルにおい
ては疎水性酵素の特性が損なわれないことを知り、この
ベシクルを固定化することにより生体膜に類似した機能
を持続的に発揮しうろことを見出し、本発明を完成する
に至った。

本発明はリン脂質に酵素とくに疎水性酵素をｉｌＤえて
調製した多重層ベシクル（以降、ＭＬＶと呼ぶ）あるい
は単一層ベシクル（以降、ＳＵ■と呼ぶ）、お上びこれ
を常法により固定化した固定化ベシクルを提供するもの
である。

本発明に使用できるリン脂質としては、動物や微生物な
どの細胞膜に広く存在するリン脂質、例えばホスファチ
ノルアミノエタノール類、ホスファチノルコリン類、ホ
スファチノルセリン類、スフィンゴミエリン類などの各
種リン脂質が挙げられろ。

勿論、天然の卵黄、牛脳や大豆などからｉｌｌ　ｙ　Ｊ
＋　、Ｓホスファチノルコリンら適用できる。このよう
なリン脂質中の脂肪酸の種類は６種の飽和または不飽和
脂肪酸が含まれる。それらリン脂質としては、たとえば
ノヘプタノイルー、シカブロイル−、ジデカノイルー、
ノラウロイルー、ジヘブタデカノイルー、ノベヘノイル
ー、ノミリストイル−、ジパルミトイル−ホスファチジ
ルコリンなどが挙げられる。これらのうち、相転移温度
が通常の酵素反応条件内にあることから判断してシミリ
ストイルホスファチジルコリン（以下、ＤＭＰＣと呼ぶ
）とジパルミトイルホスファチノルコリン（以下、ＤＰ
ＰＣと呼ぶ）がより好ましい。

酵素としては、疎水性酵素および現水性酵素のいずれら
対象となり得ろが、面述したとおり、疎水性酵素がその
産業上の利用性、必要性の観点からとくに重要である。

これらの酵素は、精製品、粗製品のいずれも使用でき、
さらに単一または復改の酵素系でも利用できる。また、
池の生体成分を含む酵素複合体、たとえばマ（クロソー
ムなどの細胞質顆粒に組込まれたもの、マイクロソーム
から可溶化されたものなどら含まれろ。

疎水性酵素の具体例としては、アミノペプチダーゼ、ア
ルカリホスファターゼ、チトクロームｂ５、チトクロー
ムｂ、リダクターゼ、γ−グルタミルトランスペプチダ
ーゼ、グルコース−６−ホスファターゼ、ＣＤＰ−ジグ
リセライド　イノノトールトランスフエラーゼ、５°−
ヌクレオチダーゼ、フェニルアラニンハイトロンラーゼ
、アセチルコリンエステラーゼ、ロドプシン、グリコポ
リン、ンクロオキノゲナーゼ、ＰＣＩ、ンンテターゼ、
ＰＧＥ、合成酵素系、Ｄ−ラクテートデバイドロゲナー
ゼ、ニトレートリダクターゼ、ベニンリナーゼ、ＡＴＰ
アーゼ、ＮＡＤＨデバイトロゲナーゼ、Ｃ５ａ−イソプ
レノイド、アルコールキナーゼなどが挙げられろ。

親水性酵素としては、例えば、６種アミラーゼ、プロテ
アーゼ（トリプシンなど）、セルラーゼ、ヘミセルラー
ゼ、リパーゼ、ペクチナーゼ、リゾチーム、アミノアノ
ラーゼ、ウレアーゼ、インヘル゛ターゼ、デキストラナ
ーゼ、ペプチダーゼ、リポヌクレアーゼ、ラクターゼ、
溶菌酵素などの加水分解酵素、グルコースオキノダーゼ
、ウリカーゼ、カタラーゼ、ベルオキンダーゼ、チトク
ロムＣなどの酸化還元酵素、その他界性化酵素である各
種イソメラーゼ、トランスアミナーゼやグリコーゲン合
成酵素などの各種転移酵素、アスパルターゼ、ペクチン
エリミナーゼなどの各種脱離酵素など一般に使用される
酵素が含まれる。

ＭＬＶやＳＵＩ！］製法としては、従来公知のリポソー
ム作成法、例えば、（１）有機溶媒に溶かしたリン脂質
を容器に入れ減圧下にエバポレーターで溶媒を除去する
か、窒素ガスを吹きつけて除去し、薄い脂質薄膜を形成
させ、これに適当な塩類や蒸留水を加え、振とうする方
法〔例えば、ＡＤ　、　Ｂ　ａｎｇｈａｍら、Ｊ、Ｍｏ
１．Ｂｉｏｌ、、１３．２３８（１９６５）およびＤ　
、　Ｐ　ａｐａｐａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂ　ｉｏｃ
ｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　ｌ　３５．６３９（１
９６７））、ミキサーで撹はんする方法〔例えば、Ｋ、
　１ｎｏｕｅ。

Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、３３
９．３９０（１９７４）およびＳ、Ｃ，Ｋ１ｎ５ｋｙら
、Ｂ　１ｏｃｈｅａ＋１ｓｔｒｙ、　　８　。

４１＝１９（１９６９））、（２）上記（＋）の方法で
得たＭＬＶをさらに水浴形ソニケーターで超音波処理し
ＳＵＶを作成する方法〔例えば、Ｄ５Ｐ　ａｐａｈａｄ
　ｊｏｐｏｕ　ｌｏｓら、Ｂ　ｉｏｃｈｉｍ、　Ｂ　１
ｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ。

３１１．３　ｔｏ（１９７３））、（３）有機溶媒に溶
かしたリン脂質を急激に塩類溶液と混和さＵ゛る方法〔
例えば、Ｓ、Ｂａｔｚｒｉら、Ｂ　ｉｏｃｈｉｍ、　Ｂ
　１ｏｐｈｙｓＡｃｔａ、２９影、１０１５（＋９７３
）：ｌ、（４）界面活性剤とリン脂質の混合物を作った
後、透析によって界面活性剤を除く方法〔例えば、Ｊ　
、Ｒ，Ｓ　１ａｃｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　　Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、　　Ａｃｔａ、３２３．５４７（１９７３）Ｅ
などの種々の方法を利用することができる。いずれの方
法を用いる場合においてら、リン脂質と酵素とを適切な
条件下で何機溶媒や界面活性剤等の存在下で混合させれ
ば所望のＭＬＶやＳＵＶが容易に形成できる。例えば、
（１）を用いる場合、所定量のリン脂質をクロロホルム
に溶解した後、減圧下でクロロホルムを蒸発させて除去
すると、試験管内に脂質薄膜ができる。これに酵素を加
えて再度減圧下で溶媒を蒸発した後、相転移温度以上で
蒸留水を加え振とうすれば乳濁し、ＭＬＶが形成される
。まｒこ、（４）を用いる場合、酵素に界面活性剤、例
えばデオキンコール酸を加えて酵素を可溶化した後、リ
ン脂質を添加し、最後に界面活性剤を透析によって除去
すればＳＵＶが形成される。他の方法ら同様にして〜Ｉ
ＬＶやＳＵＶが容易に得られる。

このように′；Ａ製した〜ｉＬＶや５ＩＪＶは勿論その
ままの状態で各種の反応に適用できるが、さらにＭＬＶ
やＳＵＶを一般的に用いられる担体結合法、架橋法、包
括法なとの固定化法によって固定化すれば、酵素、とく
に疎水性酵素の活性が安定的に長く推持てきるので極め
て好席合である。例えば、担体結合法用の担体としては
、セルロース、デキストラン、アガロース、デンプンな
どの多糖類の誘導体、活性炭、多孔性ガラス、アルミナ
、セラミック、多孔性の合成樹脂、金属酸化物などの無
機物質など、また包括法としては、合成高分子物質のポ
リアクリルアミド、光硬化性樹ｔｌｉ？（ＥＮＴｎｒｔ
ど）、ウレタンプレポリマーおよび天然高分子物質のア
ルギン酸、カラギーナン、デンプン、ゼラチンなどが適
用てきろ。固定化物の彩状は、固定化法の種類によって
も異なるか薄膜状、ビーズ状あるいは他の杉状のものが
適用でさる。固定化を行うには、好ましい範囲の温度や
ｐ　＋−＋なとの条件下で回分法やカラムによる連続法
などの方法によって基質と接触させれば良い。このよう
な固定化法による酵素活性の安定化に関する理由は明ら
かではないが、固定化によってＭｌ、■やＳＵＶ内の酵
素が保護されるものと思われる。

このようにして得られた固定化ＭＬＶやＳＵＶは生体膜
に類似した構造を有したまま固定化されているため、生
物の持つ高度な機能を長期的、安定的に巧みに利用でき
、従って各種壮＊＃酵素反応の利用例えばリパーゼによ
るエステル交換反応、ステロイドの酸化、還元、水酸化
または脱水素反応、脂溶性ビタミン、プロスタフラノジ
ン等の生理活性物質を生成せしめる反応等や、リン指買
層の持つ物質移動特性と徂合わせた親水性酵素度合酵素
系の反応等に広く応用できる。

１実施例コ つぎに本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、
本発明はこれらに限られるものではない。

実施例１ 疎水性酵素はブタ生揚マイクロソーム中に含まれるアミ
ノペプチダーゼを用い以下のように調製して使用した。

小腸粘膜＋０９に５０ｍＭマンニトール、２ｍＭトリス
バッファー（ｐＨ７、１）ヲ加えて、ワーリングプレン
ダーで約２分間ホモノナイズした。これに塩化カルノウ
ムを加え約２０分開成はんした後、冷却遠心機（久保田
製作所製ＫＲ１８０Ｂ）で遠心分離した。この上澄みを
超遠心分離機（日立工機１ｆＪ５５−Ｐ７２）にかけて
分離しマイクロソームを沈降分離した。マイクロソーム
に１００ｍＭマンニトール、２０ｍ１ｖＩＨＥＰＥＳ−
トリスバッファー　（ｐＨ７、５’）を加え、テフロン
ホモンナイザ−（池水理化工業製）で懸濁し、再度超遠
心分離を行った後、沈澱に５０ｍＭマンニトール、２ｍ
Ｍトリスバッファー２籾を加えンリンノで懸濁してマイ
クロソーム懸箭液を得た。

所定量のノバルミトイルホスファチノルコリン（ＤＰＰ
Ｃ）とノミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ
）をクロロポルムに溶解した後、減圧下てクロロホルム
を蒸発させ試験管内壁に脂質薄膜を形成させた。これに
、上記疎水性酵素のマイクロソーム＠濁液を脂質１〜２
７＋９に対して０．　１Ｒｇの割合で加え、再度減圧下
で溶媒を除去した。

蒸留水を加えて相転移温度以上（Ｄ　Ｐ　Ｐ　Ｃに対し
ては４１Ｃ，ＤＭＰＣに対しては２３℃以上）で振とう
させることによってＭＬＶを形成させた。

このＭＬＶのアミノペプチダーゼ活性を第１図に示す。

このようにして得られた！ｖＩ　Ｌ　Ｖをさらにミリボ
ア膜とＥＮＴ膜に固定化した。ＭＬＶのｔ！濁液を細か
く切った（約５ｍｌ１１角）セルロース混合エステルの
ミリボア膜（日本ミリボアリミテッド製、孔径８μｍ１
形式５ＣＷＰ）に−晩の浸漬によって吸着させた。一方
、ＥＮＴ膜（関西ペイント製形式４０００＞２９と増感
剤のベンゾインエチルエーテル２０澱９を５０ｍＭリン
酸バッフ−ｒ−（ｐＨ７、０）２ｘＱに溶解させ、これ
にＭＬＶの＠濁液１．６＋Ｃを加えた。これをポリエス
テルプレート上に展開し、上面より５分間紫外線を照射
して薄膜を作成した後、約５　ｍｌ１Ｉｆｌ’Ｈに切っ
て使用に供した。

アミノペプチダーゼ活性は５０ｍＭリン酸バッファー（
ｐＨ７，０）に基質のし一ロイノンーｐ−ニトロアニリ
ドを１．５ｍＭ溶解させて店賃溶液とし、この溶液１．
２ｓＱに酵素試料を１０μＱ１１］え加水分解によりＭ
＃してくるｐ−ニトロアニリンの濃度を分光光度計（波
長４１０ｎｍ）で経時的に測定し活性を算出し１こ。酵
素活性は１分間に１μｆｆＩｏｌの基質を分解する酵素
活性をｌ　ｕｎｉｔとして表した。

孔径８μｍのミリボア膜に、Ｄ〜ｉＰＣおよびＤＰＰＣ
を添加して調整したＭ　１．、　Ｖを固定化した場合の
アミノペプチダーゼの酵素活性温度依存性を第２図にア
レニウスプロットで示す。また孔径８μｍのミリボア膜
およびＥＮＴｆｆｌに、Ｄ！ｖｌＰＣ−Ｍ　Ｌ　Ｖを固
定化した場合の経時変化を固定化しない場合と共に第３
図に示す。第２図から、リン脂質の相転移温度付近でア
レニウスプロブトに折れ点がみられ、ＭＬＶはほぼ原形
をとどめた状態でうまく膜に固定されていることがわか
り、また固定化したリン脂質の特性によく対応している
ことも示している。第３図から、膜に固定化した場合は
固定化しない場合と比べ酵素の活性が長く推持でき安定
性に優れていることを示している。

前記マイクロソーム＠濁液に同体積のデオキンコール酸
溶液（７ｍ９／ｘＱ）を加え、水冷して撹はん後、遠心
分離し上澄液を採取した（可溶化１．た酵素！：！Ｌ）
。一方、ＤＭＰＣにデオキシコール酸をＩ］［］え（デ
オキシコール酸；指質の重屯比−２，５：ｌ）、さらに
デオキンコール酸濃度が１　、５　ｍｇ／ｍＱとなるよ
うに蒸留水を加えた（脂質のデオキノコール酸溶、＆）
。このようにして得られた酵素液とデオキノコール酸溶
液とを混合し、６°Ｃで窒素ガスを吹込みながら透析し
デオキシコール酸を除去した。

これを遠心分離してＳＵＶを形成さＵ゛、リン酸バＪフ
ァーに懸濁して使用した。

このＳＵＶの試料２ｎ＋ｌあたりｌｏｎｇ／ｍｌのトリ
ブノン０　、　ｌ　ｍｌを加え約２０分間放置した。こ
れにトリプシンインヒビター０　、１　ｍｌを加えた後
、遠心分離を行ってＳＵＶの外側表面に位置した酵素を
ＳＵＶから切り離した。このようにトリプンン処理した
場合のアミノペプチダーゼ活性を第４図に示す。第４図
から、ＳＵＶの内側表面にのみ位置した酵素活性は、Ｍ
ＬＶと同様にリン指質膜の相耘移温度附とでアレニウス
プロットに折れ点がみられた。

γ薇鯉み ノミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）２０
ｍ９をクロロホルムに溶解した後、減圧下でクロロホル
ムを蒸発させｆこ。実施例１と同様に処理して得られた
マイクロソーム１１１Ｑを加え再び減圧下で溶媒を蒸発
させた後、トリプンン水溶液（ｌ　Ｏｘ９／ｕ□を２１
加えた。相転移温度以上の温度で＠盪した後、遠心分離
によって上清液を除去し、ＤＭＰＣにマイクロソームと
トリプシンが封入され几〜ＩＬＶを作製した。一方、Ｄ
ＭＰＣにマイクロソームを加えないでトリプシンのみが
封入されたＭ　Ｌ　Ｖら同様に作製した。

トリプシン活性は５０ｍＭリン酸バッファー（ｐｌ−１
７、０）に基質のα−Ｎ−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニ
ン−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩を１．５ｍＭ溶解させて
活質溶液とし、基質の分解によって遊離してくるｐ−ニ
トロアニリノを実施例１と同様に測定し、その活性を算
出した。

第５図にトリプシン活性の温度依存性の測定結果を示す
。

第５図から、トリプシンのみが封入されたＭＬＶでは相
転移温度を境に大きな活性変化がみられ、固定化したリ
ン脂質の特性によく対応していることがわかる。このこ
とから、親水性酵素に対してもリン脂質の特性をうまく
適用できることが示される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の多重１１ベノクル（ＭＬＶ）におけ
るアミノペプチダーゼ活性のアレニウスプロットを示す
。第２図は、ミリボア膜で固定化した上ＸａＭＬＶにお
けるアミノペプチダーゼ活性のアレニウスプロットを示
す。第３図は固定化！ｖＩＬＶと固定化しないＭ　Ｌ　
Ｖとのアミノペプチダーゼ活性の経時変化を示すグラフ
である。第４図は本発明の単一層ベノクル（ＳＵｖ）に
おけるアミノペプチダーゼ活性のアレニウスプロットを
示す。第５図はトリプシンの単一層ベノクルにおけるト
リプシン活性のアレニウスプロットを示す。 特許出願人　　鐘淵化学工業株式会社 代　理　人　弁理士　青　山　葆　他１名第　　　１　
　　図 １／Ｔ　Ｘ　　Ｉ　Ｏ’　　（Ｋ−’）第　　　２　　
　図 １／’ｒ　　ｘ　　１０’　　（Ｋ−霊）相対酵素活性
（％） 下４図 １／′ｌ’ＸｌＯ’（Ｋ’） 第　　　５　　　図

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）酵素とリン脂質とを含む単一層または多重層ベシ
   クル。
2. （２）酵素が疎水性酵素である特許請求の範囲第１項記
   載のベシクル。
3. （３）酵素とリン脂質とを含む単一層または多重層ベシ
   クルを固定化したことを特徴とする固定化酵素。