CZ295329B6

CZ295329B6 - Použití fosfolipidů nebo směsí lipidů obsahujících fosfolipidy jako stabilizujících přísad pro farmaceutické přípravky směsí zažívacích enzymů

Info

Publication number: CZ295329B6
Application number: CZ19972184A
Authority: CZ
Inventors: Manfred Galle
Original assignee: Solvay Pharmaceuticals Gmbh
Priority date: 1996-08-28
Filing date: 1997-07-09
Publication date: 2005-07-13
Also published as: US5993806A; SK115997A3; BR9704554B1; BR9704554A; NO973940L; AU722151B2; CA2213151A1; JPH1077236A; EP0826375A2; AR008807A1; PL190140B1; PT826375E; EE04179B1; NZ328616A; AU3530997A; TR199700872A2; SK284639B6; CZ218497A3; HK1005224A1; CN1199694C

Abstract

Je popsáno použití fosfolipidů nebo směsí lipidů obsahujících fosfolipidy jako stabilizujících přísad proti vlhkostí způsobenému poklesu lipolytické aktivity ve vodě rozpustných farmaceutických přípravků na bázi směsí zažívacích enzymů obsahujících lipázy a proteázy, přičemž tyto přípravky jsou vhodné pro přípravu vodných roztoků pro kontinuální zavádění do gastrointestinálního traktu pomocí sond. Je popsán ve vodě rozpustný farmaceutický přípravek na bázi směsí zažívacích enzymů obsahujících lipázy a proteázy, a souprava pro přípravu stabilizovaných roztoků.ŕ

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká použití fosfolipidů nebo směsí lipidů obsahujících fosfolipidy jako stabilizujících přísad proti vlhkosti způsobovanému poklesu lypolytické aktivity ve vodě rozpustných farmaceutických přípravků směsí zažívacích enzymů, přičemž tyto přípravky obsahují proteázo/lipázové směsi, zejména pankreatin a které jsou vhodné pro přípravu vodných roztoků pro kontinuální zavádění do gastrointestinálního traktu pomocí sond. Dále se vynález týká ve vodě rozpustných farmaceutických přípravků z lipázy a proteázy obsahujících směsí zažívacích enzymů, zejména z pankreatin obsahujících směsí zažívacích enzymů, které jsou stabilizované fosfolipidy nebo směsemi lipidů obsahujícími fosfolipidy proti vlhkostí způsobovanému poklesu lipolytické aktivity a které jsou vhodné pro přípravu vodných roztoků, zaváditelných do gastrointestinálního traktu savců nebo lidí pomocí sond.

Dosavadní stav techniky

U savců, zejména lidí, může nastat nedostatek zažívacích enzymů například vyvoláním chorobnými změnami pankreatu na základě chronické pankreatidy, zažívací nedostatečnosti po operaci žaludku, onemocněních jater nebo žlučníku. Je již známo, že takovéto nedostatkové jevy je možno léčit podáváním pakreatin obsahujících směsí zažívacích enzymů, který nejsou tělu vlastní, např. pankreasových enzymů, zejména pankreatinu, které případně ještě mohou obsahovat lipázové přísady. Pankreasové enzymy se obvykle podávají orálně ve formě pevných přípravků. Aby se při orálním podávání podané směsi enzymů nežádoucím způsobem nevratně neznehodnotily již v žaludku tam přítomnými žaludečními kyselinami a proteolytickými enzymy jako je pepsin, je třeba směsi enzymů opatřit povlakem, který je odolný vůči žaludečním šťávám. Takovýto povlak umožňuje průchod intaktních směsí enzymů žaludkem až do místa jejich působení, do dvanáctemíku, kde se tam panujícími neutrálními až lehce alkalickými podmínkami enzymy uvolní. Tak jako tělu vlastní pankreasové enzymy zdravého člověka, mohou i orálně podané enzymy projevit svůj enzymatický účinek, zejména amylolytickou, lipolytickou a proteolytickou aktivitu.

Takovéto, proti žaludečním šťávám odolným filmem potažitelné, pevné pankreatinové formulace ve formě mikropilulek, popisuje např. dokument DOS 42 27 385.4.

Pro pacienty se zažívací nedostatečností, zejména pro pacienty upoutané na lůžko s déle trvající zažívací nedostatečností jako například chronickou nedostatečností pankreatu, by bylo žádoucí místo pevných podávačích forem podávat tělu nevlastní zažívací enzymy i po delší dobu v tekuté formě, například kontinuální aplikací pomocí sondy.

Kapalné podávači formy pankreatin obsahujících směsí zažívacích enzymů, zejména pankreatinu, nebyly dosud dány k dispozici, neboť kapalné vodné přípravky takovýchto enzymových směsí nejsou dlouhodobě stabilní. Ukazuje se, že zejména aktivita ve směsi obsažených lipáz v přítomnosti vody rychle klesá následkem proteolytického napadení ve směsi rovněž obsažených proteáz jako je trypsin nebo chymotrypsin. Tak může, v závislosti na vnějších podmínkách (teplotě, hodnotě pH), ve vodných pankreatinových přípravcích během krátké doby dojít k dalekosáhlé ztrátě lipázové aktivity.

-1 CZ 295329 B6

Podstata vynálezu

Aby byly vhodné pro kontinuální zavádění do gastrointestinálního traktu aplikací pomocí sondy, musí vodné roztoky lipázy a proteázy obsahujících směsí zažívacích enzymů, zejména pankreatin obsahujících směsí zažívacích enzymů, být stabilní po dobu několika hodin, například 8 hodin. Zejména v roztocích nesmějí vznikat nebo být obsaženy žádné částečky, které ucpávají sondu. Podstatným požadavkem na takovéto roztoky je, aby zůstala po celou dobu podávání zachována pokud možno vysoká trvalá aktivita všech tam obsažených zažívacích enzymů. Dále je pro roztoky vhodné pro kontinuální gastrointestinální aplikaci nutné, aby byly k dispozici bez růstu zárodků, tedy například byly konzervované proti růstu zárodků, výhodně aby byly sterilní.

Úkolem vynálezu tedy bylo dát k dispozici proti vlhkosti způsobovanému poklesu lipolytické aktivity stabilizované, lipázy a proteázy obsahující, ve vodě rozpustné farmaceutické přípravky ze směsí zažívacích enzymů, které, rozpouštěny ve vodném médiu, zůstávají stabilní po delší dobu.

Předmětem vynálezu je použití fosfolipidů nebo směsí lipidů obsahujících fosfolipidy jako stabilizujících přísad proti vlhkostí způsobovanému poklesu lipolytické aktivity ve vodě rozpustných farmaceutických přípravků z lipázy a proteázy obsahujících směsí zažívacích enzymů, zejména z pankreatin obsahujících směsí zažívacích enzymů, které jsou vhodné pro přípravu vodných roztoků pro kontinuální zavádění do gastrointestinálního traktu pomocí sond. Předmětem vynálezu jsou dále takovéto stabilizované, ve vodě rozpustné farmaceutické přípravky ze směsí zažívacích enzymů. Rovněž předmětem vynálezu jsou soupravy pro přípravu pro kontinuální sondovou aplikaci vhodných roztoků směsí zažívacích enzymů.

Fosfolipidy nebo směsi lipidů obsahujících fosfolipidy, které jsou podle vynálezu vhodné jako stabilizační přísady, jsou zpravidla nerozpustné v acetonu. Patří k nim zejména fosfor obsahující a bezuhlohydrátové fosfolipidy, uhlohydráty obsahující a bezfosfátové glykolipidy a jejich směsi. Účelně se používají jenom fosfolipidy nebo směsi s obsahem fosfolipidů a glykolipidů.

Jako fosfolipidy, které mohou být použity podle vynálezu jako stabilizační přísady k směsím zažívacích enzymů s obsahem lipáz a proteáz, zejména k pankreatin obsahujícím směsím zažívacích enzym, jsou zejména vhodné soli aniontů obecného vzorce I

	Θ O	Θ
R¹ i	R² i	O—P—OŘ³
l o 1	1 A \|	i o i
1 C--	1 —c—	1 --C—-H
1	1	1
R⁴	H	H

kde

R¹ znamená vodík nebo alkanoylový zbytek s 10 až 25 uhlíkovými atomy, jehož uhlovodíkový zbytek případně obsahuje 1 až 4 dvojné vazby,

R² znamená vodík nebo alkanoylový zbytek s 10 až 25 uhlíkovými atomy, jehož uhlíkový zbytek případně obsahuje 1 až 4 dvojné vazby, nebo, jestliže R¹ neznamená vodík, také může znamenat vodík,

R³ znamená vodík nebo alkylovou skupinu, která je případně substituovaná aminoskupinou, tri(Ci_4alkyl)amoniovou skupinou, karboxylovou skupinou vázanou na uhlíkový atom nesoucí aminovou funkční skupinu nebo C₃_₆ cykloalkylovou skupinou, jejíž uhlíkové atomy jsou případně jednoduše hydroxy substituované,

R⁴ znamená vodík nebo uhlovodíkový řetězec s 10 až 25 uhlíkovými atomy, který případně obsahuje 1 až 4 dvojné vazby,

A znamená kyslík nebo NH, s fyziologicky snesitelnými kationty nebo jejich směsmi.

Jako fyziologicky snesitelné kationty jsou vhodné ionty amonné, kationty alkalického kovu nebo prvku alkalických zemin, výhodně sodíku, draslíku nebo vápníku, jakož i další fyziologicky snesitelné jedno- nebo vícemocné kationty. Pokud R³ obsahuje dusíkový atom, může tento tvořit kvartémí amonný iont který může rovněž sloužit jako kationt, takže se vytvoří na vnějšek nenabité vnitřní soli.

Pokud ve sloučeninách obecného vzorce I zastupují R¹ a/nebo R² alkanoylové zbytky, pak tyto mohou mít řetězec nerozvětvený nebo rozvětvený, zpravidla je nerozvětvený a obsahuje 10 až 25, výhodně 16 až 20 uhlíkových atomů. Případně může alkanoylový zbytek obsahovat až 4 dvojné vazby. Jako alkanoylové zbytky se mohou vyskytovat zejména zbytky mastných kyselin s dlouhým řetězcem jako je kyselina nervonová, kyselina lignocerová, kyselina palmitová, kyselina palmitoleinová, kyselina stearová, kyselina olejová, kyselina linolová, kyselina linolenová, kyselina arachinová nebo kyselina arachidonová.

Pokud je substituent R³ Ci_4 alkylovou skupina nebojí obsahuje, může mít řetězec nerozvětvený nebo rozvětvený a obsahovat výhodně 1 až 2 uhlíkové atomy. Pokud R³ znamená skupinou hydroxy substituovanou C₃_₆ cykloalkylovou skupinu, tak tato může být jedno- nebo vícenásobně substituována hydroxy. Výhodně obsahuje cykloalkylová skupina 5 až 6 uhlíkových atomů, které mohou být případně substituované hydroxy.

Zbytek R³O představuje výhodně hydroxy nebo alkoxyzbytek, vzniklý esterifikací jedno- nebo vícemocného alkoholu fosfátovou skupinou, přičemž jedno- nebo vícemocný alkohol je vybraný ze skupiny která se skládá z ethanolaminu, cholinu, šeřinu, glycerinu a myo-inusitolu.

Pokud zbytek R⁴ je uhlovodíkový řetězec s 10 až 15 uhlíkovými atomy, tak tento může být nerozvětvený nebo rozvětvený a zpravidla je nerozvětvený a obsahuje výhodně 12 až 20, ještě výhodněji 15 uhlíkových atomů. Případně může uhlovodíkový řetězec obsahovat až 4, výhodně 2, ještě výhodněji 1 dvojnou vazbu.

Zbytek A znamená kyslík nebo NH-skupinu.

Výhodně přichází jako fosfolipidy v úvahu kyselina fosfatidová (kyselina 1,2-diacyl-sn-glycerol-3-fosforečná), fosfatidylcholin (l,2-diacyl-sn-glycerol-3-fosforylcholin), fosfatidylethanolamin (l,2-diacyl-sn-glycerol-3-fosforylethanolamin), fosfatidylserin (1,2-diacyl-sn-glycerol3-fosforylserin) a fosfatidylinosit (l,2-diacyl-sn-glycerol-3-fosforylinosit) a v případě, že fosfolipidy jsou živočišného původu jako například slepičí vejce, tak také sfíngomyelin, jakož i směsi těchto sloučenin. Řečené 1,2-diacylfosfolipidy mohou být za určitých podmínek, třeba enzymatickým vlivem fosfolipázy, částečně hydrolyzovány. Podle povahy fosfolipázy mohou být přitom zbytky R¹, R², R³ nebo také [R³OPO₂]“ 1,2-di-acylfosfolipidu nahrazeny vodíkem.

-3CZ 295329 B6

Jestliže nejméně jeden ze jmenovaných molekulových zbytků na fosfolipidové molekule je hydrolyzován, tak vzniknou takzvané lysofosfolipidy, zejména lysofosfatidylcholin, lysofosfatidylethanolamim, lysofosfati-dilinosit, lysofosfatidylserin a kyselina lysofosfatidová. Také tyto lysofosfolipidy jsou vhodné jako stabilizační přísady klipázy a proteázy obsahujícím směsím zažívacích enzymů, zejména kpankreatin obsahujícím směsím zažívacích enzymů, ve smyslu tohoto vynálezu.

Jako glykolipidy mohou být použity především v rostlinách se vyskytující takzvané fotoglykolipidy obecného vzorce II

R⁵ 1	R^e 1	R⁷
1 O i	1 O 1	O 1	(11),

H—C--CC—H

I II

Η ΗH kde

R⁵ a R⁶ znamená na sobě nezávisle vždy alkanoylový zbytek s 10 až 25 uhlíkovými atomy, jehož uhlovodíkový zbytek může mít případně 1 až 4 dvojné vazby nebo je to vodík, přičemž ale R⁵a R⁶ nemohou oba současně znamenat vodík a

R⁷ znamená mono- nebo disacharidový zbytek, jehož sacharidové stavení kameny jsou vybrány ze skupiny, skládající se z d-fruktosylu, d-galaktosylu, d-glykosylu a d-mannosylu, a jakož i jejich směsi.

Pokud ve sloučeninách obecného vzorce II představují R⁵ a R⁶ alkanoylový zbytek, tak je tento rozvětvený nebo nerozvětvený a zpravidla je nerozvětvený a obsahuje 10 až 25, výhodně 16 až 20 uhlíkových atomů. Případně může alkanoylový zbytek obsahovat až 4 dvojné vazby. Jako alkanoylové zbytky přicházejí v úvahu zejména zbytky mastných kyselin s dlouhými řetězci jako je kyselina palmitová, kyselina palmitoleinová, kyselina stearová, kyselina olejová, kyselina linolová, kyselina linolenová nebo kyselina arachinová.

Zbytek R⁷ představují mono- nebo disacharidové zbytky, které je možno vytvořit z molekul cukrů d-galaktózy, d-glukózy, d-manózy nebo d-fruktózy. Zvláště výhodně má jako R⁷ význam d-galaktóza (potom se jedná o monogalaktosyl-diglycerid, MGDG) nebo digalaktóza (potom se jedná o digalaktosyl-diglycerid, DGDG; l,2-diacyl-[a-D-galaktosyl-(l->6)-P-d-galaktosyl)(1 ->3)]-sn-glycerin).

Fosfolipidy obecného vzorce I a glykolipidy obecného vzorce II mají na středním uhlíkovém atomu glycerinové kostry vždy centrum chirality a mohou mít konfiguraci R- nebo S-. Pro účel vynálezu mohou být použity jednotlivé stereoizomemí formy sloučenin obecného vzorce I a/nebo obecného vzorce II, jehož i odpovídající směsi.

Pro stabilizaci podle vynálezu farmaceutických přípravků z lipázy a proteázy obsahujících směsí zažívacích enzymů, zejména zpankreatin obsahujících směsí zažívacích enzymů se osvědčily jako prospěšné takové lipidové směsi, jak jsou získávány z přírodních zdrojů a které představují směsi různých fosfolipidů a případně různých glykolipidů. Jako výhodné příklady takovýchto přírodních lipidových směsí jsou jmenovány lecithiny. Zdroje takovýchto přírodních lecithinů mohou být zejména rostliny jako sojové boby, slunečnice, řepka, kukuřice nebo arašídy, jakož

-4CZ 295329 B6 i živočiši nebo živočišné produkty jako je vaječný žloutek nebo mozková substance, ale také mikroorganismy. Lecithiny přírodního původu dodávají komerčně různí dodavatelé.

Z přírodně získaných lecithinů je pro účely podle vynálezu zejména vhodný sojový lecithin, zejména o fosfolipidy obohacený sojový lecithin jako například sojový lecithin s obsahem fosfolipidů 98 % hmotnostních. Neopracované, neobohacené rostlinné lecithiny obsahují zpravidla určitý podíl fytoglykolipidů. Přírodně získávané lecithiny jsou směsi různých fosfolipidů a v případě rostlinného původu také glykolipidů, jejichž sloužení není jednotné, nýbrž kolísá v závislosti na jejich původu. Tak vedle shora jmenovaných součástí se v podružném množství mohou vyskytovat ještě další fosfolipidy. Tabulka 1 slouží k tomu, aby znázornila průměrná složení některých neopracovaných, neobohacených komerčních lecithinů přírodního původu.

Tabulka 1

I---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------! I I | Složení některých lecithinů (% hmotnostní) I

I------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 1 1 I	\|so j ový \|lecithir 1	1------- \|řepkový i\| lecithin 1	1----------------------------------\|-------------------------------1 \|arašídový[vaječný \|
[lecithin I	\| lecithin\|
1 \|fosfatidylcholin 1	1 \| 22 1	1 1 37 I	1 1 23 1	τ 1 1 73 \| I 1
1 \|fosfatidylethanolamin \|..............	I \| 23 1	1 \| 29 I	l 1 ⁸ I	Ί1 1 17 \| \| 1
1 \|fosfatidylserin 1	1 1 2 I	1 1 - I	1 1 - I	Ί\| 1 - I \| 1
r \|fosfatidylinosit 1	1 1 20 ..........	1 1 14 J.........-i	1 1 17 I	Ί------------------1 1 1 1
I \|kyselina fosfatidová \|	1 1 5 I	.1 1 - i 1 I	1 1 2	1 1 1 - 1
1 \|sfingomyelin 1	1 1 -	I 1 1 - 1 I I	1 -	i 1 1 3 \| 1 1
1 \|fytoglykolipid I__________________________________________________________________________________________________	1 1 13 I	1 1 1 20 1 I 1	38	1 —í I ⁰ I i i
1 (jiné fosfolipidy 1	1 1 12 1	1 1 1 - 1 r i	12	τ : 1 1 - 1 J-----------—1

Podle vynálezu stabilizované farmaceutické přípravky obsahují směsi zažívacích enzymů obsahující výhodně pankreatin.

V rámci předloženého vynálezu se pod termínem pankreatin rozumí pankreatin izolovaný z pankreatu savců, jehož obsah aktivních proteáz byl případně zvýšen autolytickým štěpením tam původně obsažených proteázových zymogenů. Výhodně se může jednat u směsí zažívacích enzymů obsahujících pankreatin obsažených ve farmaceutických prostředcích stabilizovaných podle vynálezu o pankreatin získaný z pankreatu savců, zejména o pankreatin z vepřů, který představuje směs různých zažívacích enzymů. Pankreatin ze savců, který se jako pomocný zažívací přípravek hodí pro humánní výživu, zejména pankreatin z pankreatu vepřů, neobsahuje lipázy pro lidské potřeby vždy v dostatečném množství. Proto je možno takovýmto pankreatinovým preparátům přidat dodatečně lipázy získané například z mikroorganismů. Také takto získané pankreatin/lipázové směsi představují vhodné enzymové směsi.

V pankreatinu, který je izolován ze savců, jsou obvykle proteázy, nebyl-li pankreatin podroben žádné další předpravě, z větší části ve formě proteolytického neaktivního předstupně - zymogenu. Proto může být účelné podrobit surový pankreatin pro farmaceutické účely, který jako takový byl získán známým způsobem vhodnými porážkovými procesy z pankreatu, ještě hydrolytickému ošetření (autolýze). Při tomto ošetření se zymogeny převedou na aktivní proteázy.

V tomto autolyticky ošetřeném pankreatinu (v následujícím zkráceně označovaném jako Fpankreatin) je zvláště vysoký obsah aktivních proteáz, takže tyto F-pankreatiny jsou co do jejich lipolytické aktivity obzvláště obsaženy. Vynálezu odpovídající použití fosfolipidů nebo směsí lipidů obsahujících fosfolipidy je zejména dobře vhodné pro stabilizaci lipolytické aktivity ve farmaceutických přípravcích s obsahem F-pankreatinu. Přitom je překvapující, že stabilizace lipázové aktivity se neděje desaktivací ve směsi obsažených aktivních proteáz a tyto takto stabilizované enzymové směsi vykazují proto jak amylolytickou a lipolytickou, tak také proteolytickou aktivitu.

Pankreatin obsahující směsi zažívacích enzymů ve farmaceutických přípravcích chráněných podle vynálezu mohou kromě pankreatinu nádavkem obsahovat takové lipázy, které jsou obsažené v rostlinách nebo v mikroorganismech. Lipázy z mikroorganismů to mohou být ty, které jsou získávané z bakterií nebo houbových kultur jako jsou plísně, například kmene Rhizopus.

Jako přídavné proteázové podíly mohou být k pankreatin obsahujícím směsím zažívacích enzymů ve farmaceutických přípravcích chráněných podle vynálezu přidány ještě jiné živočišné a rostlinné proteázy, jakož i zejména z mikroorganismů jako jsou bakterie nebo houbové kultury jako jsou plísně, například kmene Aspergillus, získatelné proteázy.

Směsi zažívacích enzymů bez obsahu pankreatinu mohou jako lipázy obsahovat lipázy z rostlin a mikroorganismů. Lipázy z mikroorganismů mohou být ty, které jsou získávány z bakterií nebo houbových kultur jako jsou plísně, například kmene Rhizopus. Jako proteázy ve směsích zažívacích enzymů bez obsahu pankreatinu přicházejí v úvahu živočišné nebo rostlinné proteázy, jakož i zejména z mikroorganismů jako jsou bakterie nebo houbové kultury jako jsou plísně, například kmene Aspergillus, získatelné proteázy.

Farmaceutické přípravky podle vynálezu mohou kromě směsí zažívacích enzymů a fosfolipidů nebo směsí lipidů obsahujících fosfolipidy doplňkově obsahovat ve vodě rozpustné farmaceutické pomocné látky a/nebo přídavné látky. Například mohou být obsaženy nosiče jako uhlohydráty, například mannit nebo rozpustné proteiny, jakož i konzervační přípravky.

Farmaceutické přípravky z pankreatin obsahujících směsi zažívacích enzymů ve smyslu vynálezu mohou být ve vodě rozpustné prášky, které kromě pankreatinu obsahují zejména F-pankreatin, fosfolipidy nebo směsi lipidů obsahujících fosfolipidy v množství vystačujícím pro stabilizaci lipolytické aktivity za vlhka a případně přídavné, v technice známé, ve vodě rozpustné pomocné a/nebo přídavné látky. Pro přípravu ve vodě rozpustných prášků mohou být enzymové směsi dalekosáhle zbaveny ve vodě nerozpustných prášků mohou být enzymové směsi dalekosáhle zbaveny ve vodě nerozpustných podílů. Za tímto účelem může být vodní přípravek F-pankreatinu pomocí vhodného, v technice známého postupu pro oddělování pevných látek, například odstřeďováním nebo filtrací, zbaven nerozpuštěných pevných látek a získaný roztok, případně po přídavku dalších pomocných a/nebo přídavných látek, známými metodami, například filtrační sterilizací, sterilizován. V návaznosti mohou být obsažené látky získaného čirého, případně sterilního roztoku známým sušicím postupem, například vymrazovacím sušením, opět získány jako pevné

-6CZ 295329 B6 látky. Takto získané přípravky jsou vhodné pro přípravu po více hodin, například až osmi hodin, stabilních roztoků, prostých zárodků, které jsou vhodné pro kontinuální, rovnoměrnou gastrointestinální aplikaci pacientovi, například sondou.

Termínem „kontinuální aplikace“ se rozumí v podstatě nepřerušené podávání vodných, případně sterilních roztoků s obsahem farmaceutických přípravků podle vynálezu po dobu jedné až více hodin, například osmi hodin nebo přes noc. Kontinuální aplikace roztoků může být výhodně uskutečňována zažívacím traktem, například do žaludku nebo do tenkého střeva vloženou sondou.

Účinnost lecithinových přísad je dalekosáhle nezávislá na relativním poměru lipáza/proteáza v enzymové směsi. Vhodné jsou například enzymové směsi, ve kterých poměr lipáza/celková proteáza - měřeno poměrem příslušných aktivit, které byly stanoveny podle ustanovení instituce „Federation Intemationale Pharmaceutique“ (nadále označováno zkratkou FIP) (viz R. Ruyssen a A. Lauwers, Pharmaceutical Enzymes, Scientifíc Publishing Company, gent 1978, s. 74-82, nadále citováno jako „Lauwers“) a v následujícím bude udáváno v relativních jednotkách aktivity pod zkratkou FJP-E/g - může být 5:1 až 30:1.

Zásadně dosahuje přísada fosfolipidů nebo směsí lipidů obsahujících fosfolipidy podle vynálezu u farmaceutické přípravky na bázi směsí zažívacích enzymů obsahujících lipázy a proteázy, zejména směsí, zažívacích enzymů obsahujících pakreatin, stabilizaci proti vlhkostí způsobovanému poklesu lipolytické aktivity. Termínem „vlhkost“ se má rozumět v podstatě vodná vlhkost, která může být v rozmezí od velmi nepatrného obsahu vlhkosti v prášku směsi zažívacích enzymů až po vodné přípravky z tohoto prášku.

Přísada fosfolipidů nebo směsí lipidů obsahujících fosfolipidy podle vynálezu se prokazuje jako účelná již při získávání a zpracování ve farmaceutických přípravcích použitých směsí zažívacích enzymů obsahujících pankreatin pro stabilizaci lipolytické aktivity při takových procesních krocích výrobního nebo získávacího způsobu, při nichž může dojít kinaktivaci lipázy, jako například při zpracování enzymové směsi za vlhka.

Ve vodném roztoku farmaceutického přípravku obsahujícího směs zažívacích enzymů je stabilizující účinek přidaných fosfolipidů nebo směsí lipidů obsahujících fosfolipidy, zejména lecithinů, mimo jiné také závislý na hodnotě pH přípravku. Podle vynálezu se prokázaly jako příznivé hodnoty pH v rozmezí pH 3,5 až 9,0, výhodně v oblasti pH 4,0 až 7,0 a ještě výhodněji v oblasti pH 5,0 až 6,5.

Pro docílení patrné stabilizace lipolytické aktivity ve vodných farmaceutických přípravcích ze směsí zažívacích enzymů a z těchto přípravků připravených vodných roztoků pro sondovou aplikaci, je nutné přidat určité minimální množství fosfolipidů nebo směsí lipidů obsahujících fosfolipidy. Obvykle mohou použité směsi zažívacích enzymů v přípravcích podle vynálezu vykazovat obsah lipázy, vyjádřený v jednotkách aktivity, například 2000 až 200 000 FIP-E/g, jestliže obsahují jen lipázy ze sekretu pankreatu savců a od 2000 do 500 000 FIP-E/g, jestliže obsahují lipázy z mikroorganismů, buď samotné, nebo v kombinaci s lipázy z pankreatu. Množství nejméně 1 % hmotnostního fosfolipidů nebo směsí lipidů obsahujících fosfolipidy, vztaženo na nanesené množství pevné směsi zažívacích enzymů s obsahem pankreatinu, například množství od 1 do 10 % hmotnostních, je potom vhodné pro dosažení patrné stabilizace. Přídavek větších množství fosfolipidů nebo směsí lipidů obsahujících fosfolipidy je rovněž možný, nezpůsobuje však už žádné, za zmínku stojící, zlepšení stabilizace lipolytické aktivity. Tak je například pro stabilizaci směsí obsahujících pankreatin nebo pankreatin a přídavné lipázy s fosfolipidy nebo směsemi lipidů obsahujících fosfolipidy zejména vhodný lecithin, přísada nejméně 1 % hmotnostního, výhodně 2 až 5 % hmotnostních a ještě výhodněji 3 % hmotnostní lecithinů.

S pomocí použití podle vynálezu fosfolipidů nebo směsí lipidů obsahujících fosfolipidy je možno takové vodné roztoky farmaceutických přípravků z pankreatin obsahujících směsí zažívacích

-7 CZ 295329 B6 enzymů, které mají sklon k rychlému poklesu lipolytické aktivity, stabilizovat do té míry, že lipolytická aktivita ve směsi obsažených lipáz v delším časovém úseku klesá jen nepatrně. Tak vykazuje vodný roztok přísadou lecithinu stabilizovaného F-pankreatinu po osmihodinové inkubační době při teplotě místnosti lipolytickou zbytkovou aktivitu ve výši 85 % původní výchozí aktivity. Ve vodném roztoku F-pankreatinu stabilizovaném fosfolipidy nebo směsemi lipidů obsahujících fosfolipidy bylo ještě po 24 hodinové inkubační době dokazatelné 50 % lipolytické výchozí aktivity. Naproti tomu ve srovnávacím roztoku, který nebyl stabilizován, klesá za jinak stejných podmínek lipolytická aktivita po osmi hodinách pod 20 % výchozí aktivity.

Stabilizace podle vynálezu vodných farmaceutických přípravků z lipázy a proteázy obsahujících směsí zažívacích enzymů proti poklesu lipolytické aktivity ve vodném médiu otevírá možnost podávat pacientům směsi zažívacích enzymů takovéhoto druhu ve formě vodných roztoků kontinuálně zaváděním do gastrointestinálního traktu. K tomuto účelu používané vodné roztoky by přirozeně měly být prosté zárodků, výhodně by dokonce měly být sterilní. Roztoky prosté růstu zárodků mohou být například roztoky, v nichž přísada konzervačních činidel zabraňuje množství samomnožitelných zárodků.

Podle vynálezu je dávána k dispozici souprava pro přípravu proti poklesu lipolytické aktivity stabilizovaných, zárodečného růstu prostých vodných roztoků směsí zažívacích enzymů, vhodných ke kontinuálnímu zavádění do gastrointestinálního traktu pomocí sond, která obsahuje následující složky:

a) ve vodě rozpustný pevný, zárodečného růstu prostý farmaceutický přípravek na bázi směsí zažívacích enzymů obsahujících lipázy a proteázy, které případně obsahuje dostačující množství fosfolipidů nebo směsi lipidů obsahující fosfolipidy ke stabilizaci připravovaných vodných roztoků proti poklesu lipolytické aktivity a

b) dostačující množství zárodečného růstu prostého vodného rozpouštědla pro přípravu vodných roztoků, které kromě vody případně obsahuje fyziologicky snesitelné soli a pomocné látky, a pokud pevný farmaceutický přípravek uvedený v odstavci a) neobsahuje dostačující množství fosfolipidů nebo směsí lipidů obsahující fosfolipidy ke stabilizaci připravovaných vodných roztoků proti poklesu lipolytické aktivity, doplňkově obsahuje dostačující množství fosfolipidů nebo směsí lipidů obsahující fosfolipidy ke stabilizování připravovaných vodných roztoků proti poklesu lipolytické aktivity.

Zejména může v soupravě použitý pevný přípravek a) být vymrazováním usušená, lipázy a proteázy obsahující směs zažívacích enzymů, která případně obsahuje fosfolipidy nebo směsi lipidů obsahujících fosfolipidy. Výhodně se u směsi zažívacích enzymů jedná o pankreatin obsahující směs zažívacích enzymů. Vodné roztoky, které jsou prosté růstu zárodků, mohou být uchovány přísadou v technice známých konzervační prostředků, například parabenu. Sterilní roztoky, které rovněž jsou roztoky prosté růstu zárodků, mohou být uchovány sterilizačními postupy, které jsou v technice známé, například filtrační sterilizací.

Lipidy v soupravě obsažené se mohou výhodně vyskytovat jako ve směsi zažívacích enzymů (součást a)) již obsažené přísady. Pro výrobu prášků směsi zažívacích enzymů, který obsahuje již fosfolipidy nebo směsi lipidů obsahujících fosfolipidy, je například možno smísit roztok fosfolipidů nebo směsí lipidů obsahujících fosfolipidy, případně prostý zárodečného růstu, s roztokem, případně prostým zárodečného růstu, směsi zažívacích enzymů a v návaznosti postupem v technice známým, například vymrazovacím sušením, usušit. Aby se z tohoto získal sondou aplikovatelný roztok, musí fosfolipidy nebo směsi lipidů obsahujících fosfolipidy, jakož i směs zažívacích enzymů obsahující prášek být smíseny se spolu v soupravě rovněž obsažených rozpouštědel, případě v podmínkách chudých na zárodky nebo v podmínkách zárodkůprostých. Fosfolipidy nebo směsi lipidů obsahujících fosfolipidy se mohou ale také již vyskytovat v rozpouštědlu (součást b)), například rozpuštěné jako koloid. Aby se získaly sondou aplikovatelné roztoky, musí být v tomto případě vodný roztok nebo koloid obsahující fosfolipidy nebo směsi

-8CZ 295329 B6 lipidů obsahujících fosfolipidy, případně za sterilních podmínek, smísen se směsí zažívacích enzymů (součást a)).

Příklady provedení vynálezu

1. Stabilizování lipolytické aktivity vodných pankreatin obsahujících roztoků sojovým lecithinem.

Pro stanovení různých změn lipolytické aktivity s přísadou a bez přísady fosfolipidů nebo směsí lipidů obsahujících fosfolipidy ve vodných pankreatin obsahujících přípravcích byly připraveny příslušné vzorky a inkubovány při 30 °C. Z inkubačních vzorků byly stanoveny časové změny lipázové aktivity pod metody „Fédération Intemationale Pharmaceutique/European Pharmacopeia“ (nadále označováno zkratkou FIP/Ph,. Eur. viz Leuwers, s. 74-82). Při této standardní metodě stanovení se nechá vzorek, zkoušený na lipázovou aktivitu, působit na triglycerid olivového oleje a uvolněné karboxylové kyseliny se titrují hydroxidem sodným na hodnotu pH 9. Lipázová aktivita vzorku se při tom stanoví srovnáním rychlosti, jakou vzorek hydrolyzuje emulzi olivového oleje s rychlostí, jakou suspenze pankreasového referenčního prášku hydrolyzuje stejný substrát za stejných podmínek.

1.1 Zjišťování lipázové stability bez přísady lecithinu

79,35 mg ve vodě rozpustného vymrazení usušeného F-pankreatinu s lipolytickou aktivitou 50473 FIP-E/g bylo rozpuštěno ve 4,0 ml ledově chladné vody nejvyšší čistoty (Nanopu/^R) firmy bemstead), hodnota pH byla IN HC1 nastavena na 6,2 a šarže potom doplněna vodou nejvyšší čistoty na 5,0 ml. Z této šarže byl okamžitě odebrán vzorek pro stanovení lipolytické výchozí aktivity („vzorek nulté minuty“). Zbývající šarže byla inkubována na vodní lázni o teplotě 30. Pro odběr vzorku byla šarže dobře promíchána, vzorek odebrán vhodnou pipetou a ihned zředěn ledově chladným lipázovým rozpouštědlem, tak, aby stanovení lipázy bylo k dispozici mezi 0,5 a 1,5 ml zkoušeného vzorku s lipolytickou aktivitou od 8 do 16FIP-E. Jako lipázové rozpouštědlo byl použit podle FIP/Ph.Eur. roztok 10,0 ml NaCl, 6,06 g tris-(hydroxymethyl)-aminomethanu (v následujícím označován zkratkou „TRIS“) a 4,9 g anhydridu kyseliny maleinové v 900 ml vody nejvyšší čistoty, jehož hodnota pH byla 4 N hydroxidem sodným nastavena na pH 7 a potom byla doplněna vodou nejvyšší čistoty na 1000 ml.

Pro stanovení časového průběhu lipázové aktivity byl po 15, 30, 60, 120 a 180 minutách odebrány z termostatované šarže další vzorky a v nich vždy během 30 minut stanovena lipázová aktivita metodou FIP/Ph. Eur. (Lauwers, s. 78).

Zjištěná lipázová aktivita „vzorku nulté minuty“ v jednotkách FIP-E/ml byla vzata jako hodnota 100 % a hodnoty aktivity naměřené během dalších inkubačních dob byly vztaženy procentuálně na tuto hodnotu. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2.

1.2 Zjišťování lipázové stability s přísadou lecithinu

Pro přípravu lecithinového roztoku bylo 100 mg sojového lecithinu (obsah fosfolipidů 98% hmotnostních od firmy Roth) při teplotě místnosti uhněteno nejprve s trochou vody nejvyšší čistoty a potom doplněno na 20,0 ml. Na směs bylo za míchání po 2 minuty až do dosažení homogenního, koloidního roztoku působeno ultrazvukem. Potom bylo rozpuštěno 80,0 mg ve vodě rozpustného, vymrazením vysušeného F-pankreatinu s lipolytickou aktivitou 54694 FIP-E/g ve 4 ml vody nejvyšší čistoty a hodnota pH roztoku nastavena 1 N HC1 na 6,2. Bylo přidáno 0,4 ml lecithinového roztoku (2,5 % hmotnostních lecithinu, vztaženo na nasazený práškový F-pankreatin) a šarže byla při dobrém promíchávání doplněna ledově chladnou vodou nejvyšší čistoty na 5,0 ml.

-9CZ 295329 B6

Odběr vzorku a stanovení lipolytických aktivit při příslušných inkubačních dobách se provádělo tak, jak je popsáno v době 1.1. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2.

Tabulka 2

I------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 1 1 \| Změny lipolytických aktivit ve vodných pankreatinových \| \| roztocích s přísadou a bez přísady lecithinu \| 1 í 1 . ___1
1 PH 1 1 1 I	1 j přísada \| lecithinu 1 \| [% hmotnostní! 1	1 1 \| % lipolytické aktivity po čase t \| \| [min] [
1 o I	Π 1 1 15 1 1 1	Ί 30 \|	1 1 60 \| 120 \| ] I 1	1 L80 \| \|
1 \| 6,2 1	1 1	1 \| íoo 1	1 1 1 69 1 1 1	51 \| 1	I 1 41 \| 26 \| I I	1 21 \| I
1 1 6,2 1	—[ \| 2,5 ......1..........—---------	1 \| 103 1	1 1 1 93 I 1 1	1 90 \| 1	1 1 86 \| 80 \| 1 1	1 75 1 1

2. Stabilizování lipolytické aktivity vodných pankreatin obsahujících přípravků v časovém průběhu 8 hodin

Ve vodných pakreatinových přípravcích nastávají, v závislosti na různých faktorech jako je teplota, hodnota pH a proteolytická aktivita obsažených proteáz, ztráty lipolytické aktivity. Přísadou fosfolipidů nebo směsí lipidů obsahujících fosfolipidy jako je lecithin může být aktivita lipázy během osmihodinové inkubace při 25 °C znatelně stabilizována. V následujícím pokusu byly proto v průběhu 8 hodin srovnávány lipolytické aktivity ve vodných suspenzích a roztocích Fpankreatinu vždy s přísadou a bez přísady fosfolipidů nebo směsí lipidů obsahujících fosfolipidy.

2.1 Příprava inkubační šarže

Pro porovnání byly zkoumány čiré pankreatinové roztoky a pankreatinové suspenze z F-pankreatinu vždy s přísadu a bez přísady lecithinu.

Byly připraveny následující vodné přípravky:

a) Pakreatinový roztok bez lecithinu

V ledově chladné vodě nejvyšší čistoty bylo rozpuštěno

77,5 mg ve vodě rozpustného, vymrazením vysušeného F-pankreatinového prášku jako je popsáno pod bodem 1.1, přičemž hodnota pH byla nastavena IN HC1 na 6,2.

b) Pankreatinový roztok s lecithinem

-10CZ 295329 B6

81,0 mg ve vodě rozpustného, vymrazením vysušeného F-pankreatinového prášku bylo jako je popsáno v bodě 1.2 po nastavení hodnoty pH na 6,2 předmíseno s 0,94 ml lecithinového roztoku a doplněno ledově studenou vodou nejvyšší čistoty na 5,0 ml.

c) Pankreatinová suspenze bez lecithinu

2,0 g F-pankreatinu bylo 30 minut mícháno ve 100 ml ledově chladné vody nejvyšší čistoty, získána kalná suspenze.

d) Pankreatinová suspenze s lecithinem

2,0 g F-pankreatinu bylo přemíseno se 100 mg sojového lecithinu (firmy Roth) a mícháno 30 minut ve 100 ml ledově chladné vody nejvyšší čistoty. Byla získána kalná suspenze.

2.2 Provedení pokusu

Z ledově chladných roztoku respektive suspenzí, připravených podle postupů z bodu 2.1, byly ihned po jejich přípravě odebrány vzorky pro stanovení lipolytické výchozí aktivity („vzorky nulté minuty“). Potom byl zbytek šarže ve zkumavkách inkubován 8 hodin při 25 °C. Během této doby byly odebrány další vzorky po 30 minutách a následně v hodinových intervalech. Odběr vzorků, zředění a stanovení lipázové aktivity bylo prováděno jak je popsáno v bodu 1.1, pokusná teplota ale nyní byla, na rozdíl od horního předpisu, 25 °C.

Lipázová aktivita (udávaná na FIP-E/ml) „vzorky nulté minuty“ určité inkubační šarže byla stanovena jako hodnota 100 % a během dalších inkubačních časů naměřené aktivity byly procentuálně vztaženy na tuto hodnotu. Výsledky jsou zachyceny v následujících tabulkách 3 a 4.

Tabulka 3

1 ^!'^:1 1 1 \| Průběh lipolytické stability během 8 hodin v pankreatiiiových\| \| roztocích s přísadou a bez přísady lecithinu \| 1 1 1_________________________________________________________________________________________________________________________________,_______________________________________________________________________________________________________________________ . _____1
I 1 \| šarže\|	1 1 1 obsah \| pH\| % lipolytické aktivity po čase t [h]	1 1
1 I		I				1
1 1		1 1 1	!	1	1 , -]—₍ ----_r	—1
1 1 I 1	1% hmot.]\| \|	1 0 \|0,5\| 1 1 1	1\| I	2\| 1	3 \| 41 51 61 71 I I 1 1 I	8\| 1
1 1 1 a) \| I . 1	1 \|6,2 1 -	1 1 1 \| 100I 72 I 1 1 1	1 64 j	1 47 \| I	lilii 36I 30\| 27\| 24\| 21\| I ( 1 1 1	1 19\| 1
1 1 1 b) 1 1 l	1 5,8 \|6,2 1	t 1 1 \| 100I 97I J J L.	1 98 \| 1	1 96 \| l	1 1 1 I I 98\| 94\| 92\| 89\| 85\| ----------J------------1------------1 1 L.	-—1 85 \| ______________1

-11 CZ 295329 B6

Tabulka 4 i ~~ ........................................~i

II | Průběh lipolytické stability během 8 hodin v pankreatinových| | suspenzích s přísadou a bez přísady lecithinuI

\| šarže	\| obsah \| pH\|	% lipolytické	: aktivity	po čase t	[h]	1
I									1
1 1	\| [% hmot.]\| \|	1 1 0 \|0,5\|	1	1 2\|	1 3\| 4	1 1 1 5\|	1 6\|	⁷I	-------------------1 8\|
\|------------------------------	1----------------------1--------l·	----μ	-4-	-4“	-4—	Ί—μ	-4-	-4-	-4
1 c) I	1 -- \|7,T\| 1 1 1	100[ 72[ I \|	56 \| I	43 I I	34 \| 29 I	i 25\| 1 1	21) I	18 \| I	16\| 1
1 1 d) 1	1 5 \|7,1\| J 1 L.	1 1 100\| 97 j 1 L.	1 97 \| 1	1 92 \| l	1 84 \| 77 1	t 1 1 72 \| 1 L	1 69 \| 1	l 64 \| l	1 60 \| ____________1

3. Stabilizování mikrobiální lipázy vůči mikrobiální proteáze přísadou fosfolipidů nebo směsí lipidů obsahujících fosfolipidy

V následujícím pokusu bylo ukázáno, že také aktivitu mikrobiálních lipáz v přítomnosti aktivních mikrobiálních proteáz je možno stabilizovat přísadou fosfolipidů nebo směsí lipidů obsahujících fosfolipidy. Pro tento účel byly připraveny tři zkušební roztoky, které obsahovaly mikrobiální lipázy, mikrobiální lipázy plus mikrobiální proteázy, jakož i mikrobiální lipázy s přísadou lecithinu plus mikrobiální proteázy. V návaznosti byly stanoveny lipolytické aktivity v těchto zkušebních roztocích a výsledky pro srovnání uspořádány do tabulek.

3.1 Příprava zkušebních roztoků

Byly připraveny následující roztoky:

a) Lipázový roztok

245 mg lipázy z Rhizopus oryzae (Lipáze 7-AP 15, Amano Pharmaceutical Co., LTD, Nagoya, Japonsko) s aktivitou 170 000 FIP-E/g bylo rozpuštěno v 50 ml ledově chladného roztoku chloridu sodného o koncentraci 1 % hmotnostního.

b) Proteázový roztok

390 mg Aspargillus-proteázy (Prozyme 6; Amano Pharmaceutical Co., LTD, Nagoya, Japonsko) s aktivitou 7 600 FIP-E/g bylo rozpuštěno ve 25 ml ledově chladného roztoku chloridu sodného o koncentraci 1 % hmotnostního.

c) Lecithinový roztok g lecithinu (čistý sojový lecithin s obsahem fosfolipidů 98 % hmotnostních od firmy Roth) byl předložen do 40 ml vody nejvyšší čistoty („Nanopure^(R)“ od firmy Bamstead) a za přelévání po dobu 2 minut dispergován ultrazvukem na koloid. Z těchto roztoků byly v ledové lázni připraveny následující inkubační roztoky o celkovém objemu 5 ml:

-12CZ 295329 B6

Tabulka 5

1-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------1 1 1 \| Inkubační roztoky pro stanovení Rhizopus-lipasové aktivity \| 1 1
\| inkubační \| roztok i	1 1 \| lipasový \| \| roztok \| 1 I	1 proteasový \| roztok j I	r lecithinovýj roztok \| I	1 roztok ) NaCl \| i
i 1 I \| . ..........	1 1 \| 3 ml \|	1 1 I	1 - i I	1 2 ml \| 1
1 1 ii I	1 1 \| 3 ml \| 1 1	1 1 ml \| I	1 -- 1 I	1 1 ml \| I
1 1 ni 1_________________________________________________	1 1 \| 3 ml [ 1 L,	1 1 ml 1 L.	1 1 ml \| L	1 - 1 __________________________________________1

Hodnota pH všech inkubačních roztoku činila po přípravě 6,5 při 37 °C.

3.2 Provedení pokusů

Z ledově chladných inkubačních roztoků I, II, III byly okamžitě po jejich přípravě odebrány vzorky pro stanovení výchozí aktivity („vzorky nulté minuty“), zbytek těchto třech šarží byl 10 inkubován ve vodní lázni při 37 °C.

Pro odběr vzorků byla šarže dobře promíchána, vzorek byl odebrán vhodnou pipetou a okamžitě rozdělen ledově chladným lipázovým roztokem, tak jak bylo popsáno v bodu 1.1. Z těchto vzorků byla odebráno vždy určitá množství (v tabulce 6 označeno „X“) a zředěno 1% roztokem 15 chloridu sodného na 5 ml. Z těchto zkušebních roztoků bylo vždy nasazeno 0,5 ml v testu lipázové aktivity.

-13CZ 295329 B6

Tabulka 6

I----------------------------—

I | Odebrané množství vzorku pro přípravu zkušebního roztoku zkušební roztok | X ψΐ zkušebního roztoku odebraného ) po čase t = minut | 30 minut | 60 minut [

3.3 Stanovení rhizopus-lipázové aktivity

Katalytická aktivita rhizopus-lipázy byla měřena stanovením množství volných mastných kyselin, které se vytvořily během definované doby při pH 7,0 a 37 °C z emulze olivového oleje v přítomnosti taurocholanu sodného o koncentraci 0,025 % hmotnostních. Aby bylo zaručeno, že budou podchyceny všechny mastné kyseliny, následovala potom titrace až na pH 9,0. Slepý titrační pokus substrátové emulze sloužil pro podchycení titrovatelných substancí, které nevznikly lipázovou aktivitou. Rhizopus-lipázová aktivita pokusné substance byla stanovena porovnání rychlosti, kterou suspenze substance hydrolyzovala emulzi olivového oleje s rychlostí, kterou suspenze rhizopus-lipázového referenčního standardu hydrolyzovala stejnou emulzi olivového oleje za stejných podmínek.

Chemikálie

1. Voda:

Používána byla voda nejvyšší čistoty „Nanupore^(R)“ od firmy Bamstead. V následujícím bude označována jako „voda nejvyšší čistoty“.

2. Roztok arabské gumy:

IlOg arabské gumy a 12,5 g chloridu vápenatého bylo za míchání rozpouštěno (3 hodiny) ve vodě nejvyšší čistoty, doplněno na 1000 ml a odstředěno. Roztok byl naplněn do 250 ml plastikových nádob a skladován při -20 °C.

Arabská guma (Acaciae-Gumi, DAB 10/Ph.Eur.), chlorid vápenatý p.a.

-14CZ 295329 B6

3. Substrátová emulze:

130 ml olivového oleje a 400 ml roztoku arabské gumy (viz chemikálie ad 2) bylo emulgováno po dobu 15 minut ve vhodné míchačce s vysokým počtem otáček. Teplota byla udržována pod 30 °C. Nejméně 90 % kapek v emulzi mělo průměr menší než 3 μηι a žádná nebyla větší než 10 μιη. Emulze byla připravována denně nová.

Olivový olej (skladovaný v chladničce), jakosti DAB.

4. Roztok taurocholanu sodného 0,5 % (m/V):

0,5 g taurocholanu sodného (lipázově aktivní směs, směs konjugovaných kyselin žlučových, mj. tuarocholanu sodného) bylo rozpuštěno vodou nejvyšší Čistoty na 100,0 ml.

Roztok byl připravován denně čerstvý.

Taurocholan sodný (lipázově aktivní směs), FIP.

5. Roztok chloridu sodného 1 % (m/V) ve vodě nejvyšší čistoty

6. Ustojný roztok pH 4,5:

g chloridu sodného a 9,2 g dihydrogenfosforečnanu sodného bylo rozpuštěno v 950 ml vody nejvyšší čistoty, nastaveno kyselinou solnou na pH 4,5 a doplněno vodou nejvyšší čistoty na 1000 ml.

Chlorid sodný p.a., dihydrogenfosforečnan sodný, NaH₂PO₄ x H₂O.

7. Hydroxid sodný 0,1 N

Referenční suspenze:

Rhizopus-lipázový referenční standard byl zamíchán do ústojného roztoku (chemikálie ad 6) atak zředěn roztokem chloridu sodného (chemikálie ad 5), až enzymový roztok měl 12 až 18 jednotek rhizopus-lipázové aktivity FIP-E/ml. Při standardu 55 000 FIP-E na 1 g bylo rozpuštěno 63 mg ve 20 ml ústojného roztoku (chemikálie ad 6) během 15 minut v ledové lázni. 10 ml tohoto roztoku bylo zředěno v ledové lázni roztokem chloridu sodného (chemikálie ad 5) na 100 ml. K testu bylo nasazeno 0,5 ml tohoto roztoku.

Rhizopus-lipázový referenční standard FIP (fungi-lipáza, FlP-standard).

Zkušební roztoky:

Byly použity zkušební roztoky I, II a III:

Provedení pokusů:

Na autotitrátoru titračního systému „pH-Stat“ od firmy Radiometer byla koncový bod pro pH-Stat-titraci nastaven na pH 7,0. Do reakční nádoby bylo vloženo:

12,0 ml emulze olivového oleje, FIP (chemikálie ad 3)

6,5 ml vody nejvyšší čistoty (chemikálie ad 1)

1,0 ml roztoku taurocholanu sodného (chemikálie ad 4)

-15 CZ 295329 B6

Směs byla zahřáta na 37,0 °C. Hodnota pH byla 0,1 N hydroxidem sodným (chemikálie ad 7) nastavena na pH 7,0. Potom byla byreta nastavena na „0“. Reakce byla nastartována přídavkem 0,5 ml referenční suspenze, když měla být měřena referenční hodnota, nebo 0,5 ml zkoušeného vzorku, jestliže měla být měřena lipázová aktivita ve zkoušeném vzorku. Po 10 minutách byl koncový bod pro pH-Stat-titraci nastaven na pH 9.0. Když byla hodnota pH 9,0 dosažena (tento proces trval méně než 30 sekund), byla titrace přerušena a byla odečtena spotřeba 0,1 N hydroxidu sodného.

Pro stanovení slepé hodnoty byl pro referenční suspenzi a pro zkoušený vzorek koncový bod titrace na titrátoru nastaven ihned na pH 9,0. Po ručním nastavení hodnoty pH v reakční šarži na pH 7,0 a po přídavku 0,5 ml referenční suspenze nebo zkoušeného roztoku bylo okamžitě titrováno na pH 9,0. Z odečtené spotřeby 0,1 N hydroxidu sodného byla vypočítána rhizopus-lipázová aktivita ve FIP-E/ml. Ve zkoušených roztocích I, II a III zjištěné výchozí lipázové aktivity v jednotkách FEP-E/ml byly vzaty jako hodnoty 100%. Během následující inkubační doby v délce 1 hodiny naměření hodnoty aktivity byly potom vždy procentuálně vztaženy na tuto výchozí hodnotu a jsou uvedeny v tabulce 7.

Tabulka 7 i-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------^-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------'---------------------------------------------------------------------------------------1

4. Příklady farmaceutického přípravku

A) Vezme se 20,0 g F-pankreatinu ve 400 ml vody a hodnota pH se rychle nastaví přídavkem

N HC1 na 6,2. Za těchto podmínek se extrahuje 1 hodinu při 4 °C. Čirý, pankreatinový extrakt obsahující produkt se odstředí při 53 000 g a následně se steriluje filtrací filtrem s velikostí pórů pm.

B) 1,0 g sojového lecithinu (98 % hmotnostních fosfatidylcholinu) se rozpustí v 50 ml vody a v zatavené skleněné ampuli se 45 minut sterilizuje při 140 °C.

-16CZ 295329 B6

C) 400 ml pod bodem A) připraveného pankreatinového extraktu se v chladu a za sterilních podmínek smísí s 25 ml pod bodem B) připraveného lecithinového roztoku. Směs se vymrazením usuší, přičemž se získá 16 g prášku, který se za sterilních podmínek naplní v dávkách po 2,5 g do infuzních láhví.

5. Příklady pro soupravy pro farmaceutické použití

5.1 Souprava 1

A) 40,0 g F-pankreatinu se vloží do 400 ml vody a hodnota pH se rychle přídavkem 1 N HC1 nastaví na 6,2. Za těchto podmínek se extrahuje 1 hodinu při 4 °C. Čirý, pakreatinový extrakt obsahující produkt se odstředí při 53 000 a následně se sterilně přefiltruje přes s velikostí pórů 2 pm. Extrakt se za sterilních podmínek naplní po 25 ml dávkách do 100 ml infuzních láhví a usuší se vymrazením.

B) 2,0 g sojového lecithinu (98 % hmotnostních fosfatidylcholinu) se rozpustí ve 20 ml vody a homogenizuje se ultrazvukem. Koloidní roztok se v zatavené skleněné ampuli sterilizuje 45 minut při 140 °C. Z toho se odebere dávka o velikosti 12,5 ml, která se smísí s 1600 ml sterilizované vody a v dávkách po 100 ml se naplní do infuzních lahví.

Pro použití se obsah jedné láhve s obsahem pevných látek z bodu A) smísí s obsahem roztoku jedné láhve z bodu B).

5.2 Souprava 2

A) 40,0 g F-pankreatinu se vloží do 800 ml vody a hodnota pH se rychle přídavkem 1 N HC1 nastaví na 6,2. Za těchto podmínek se extrahuje 1 hodinu při 4 °C. Čirý, pakreatinový extrakt obsahující produkt se odstředí při 53 000 g a usazenina se zahodí.

B) 32,0 g mannitu se rozpustí ve 200 ml vody, smísí se pankreatinovým extraktem získaným v bodu A) a spojené roztoky se filtračně sterilizují.

C) 5,0 g sojového lecithinu (98 % hmotnostních fosfatidylcholinu) se rozpustí ve 50 ml vody a homogenizuje se ultrazvukem. Tento koloidní roztok se v zatavené skleněné ampuli sterilizuje 45 minut při 140 °C.

D) 1000 ml podle bodu B) získaného pankreatinového extraktu se za sterilních podmínek smísí se 16 ml lecithinového roztoku, který byl připraven podle bodu C) a usuší se vymrazením. Získaný prášek se v dávkách po 10,0 g sterilně naplní do 200 ml láhví.

E) Deionozovaná a filtračně sterilizovaná voda se naplní za sterilních podmínek do 200 ml láhví.

Pro použití se obsah jedné láhve s práškem podle bodu D) rozpustí v obsahu láhve naplněné vodou podle bodu E.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití fosfolipidů nebo směsí lipidů obsahujících fosfolipidy jako stabilizujících přísad proti vlhkostí způsobenému poklesu lipolytické aktivity ve vodě rozpustných farmaceutických přípravků na bázi směsí zažívacích enzymů obsahujících lipázy a proteázy, přičemž tyto přípravky jsou vhodné pro přípravu vodných roztoků pro kontinuální zavádění do gastrointestinálního traktu pomocí sond.
2. Použití fosfolipidů nebo směsí lipidů obsahujících fosfolipidy jako stabilizujících přísad proti vlhkostí způsobenému poklesu lipolytické aktivity ve vodě rozpustných farmaceutických přípravků na bázi směsí zažívacích enzymů obsahujících lipázy a proteázy, přičemž tyto přípravky jsou vhodné pro přípravu vodných roztoků pro kontinuální zavádění do gastrointestinálního traktu pomocí sond, přičemž směsi zažívacích enzymů obsahujících lipázy a proteázy jsou směsi zažívacích enzymů, které obsahují pankreatin.
3. Použití fosfolipidů nebo směsí lipidů obsahujících fosfolipidy jako stabilizujících přísad proti vlhkostí způsobenému poklesu lipolytické aktivity ve vodě rozpustných farmaceutických přípravků na bázi směsí zažívacích enzymů obsahujících lipázy a proteázy, přičemž tyto přípravky jsou vhodné pro přípravu vodných roztoků pro kontinuální zavádění do gastrointestinálního traktu pomocí sond, přičemž farmaceutické přípravky na bázi směsí zažívacích enzymů obsahujících pakreatin obsahující vedle pankreatinu přídavné lipázy vybrané ze skupiny sestávající z rostlinných lipáz, bakteriálních lipáz a lipáz z houbových kultur.
4. Použití fosfolipidů nebo směsí lipidů obsahujících fosfolipidy jako stabilizujících přísad proti vlhkostí způsobenému poklesu lipolytické aktivity ve vodě rozpustných farmaceutických přípravků na bázi směsí zažívacích enzymů obsahujících lipázy a proteázy, přičemž tyto přípravky jsou vhodné pro přípravu vodných roztoků pro kontinuální zavádění do gastrointestinálního traktu pomocí sond, přičemž jako fosfolipidy se používají soli aniontů obecného vzorce I

Θ Θ O R¹ R² | O=P—OR³ 1 1 1 o 1 A | o i 1 c-— 1 í O- | I --C—H 4 R⁴ 1 H I H

W, kde

R¹ znamená vodík nebo alkanoylový zbytek s 10 až 25 uhlíkovými atomy, jehož uhlovodíkový zbytek případně obsahuje 1 až 4 dvojné vazby,

R² znamená vodík nebo alkanoylový zbytek s 10 až 25 uhlíkovými atomy, jehož uhlíkový zbytek případně obsahuje 1 až 4 dvojné vazby, nebo, jestliže R¹ neznamená vodík, také může znamenat vodík,

-18CZ 295329 B6

R³ znamená vodík nebo alkylovou skupinu, která je případně substituovaná aminoskupinou, tri(Ci_4alkyl)amoniovou skupinou, karboxylovou skupinou vázanou na uhlíkový atom nesoucí aminovou funkční skupinu nebo C₃_₆ cykloalkylovou skupinou, jejíž uhlíkové atomy jsou případně jednoduše hydroxy substituované,

R⁴ znamená vodík nebo uhlovodíkový řetězec s 10 až 25 uhlíkovými atomy, který případně obsahuje 1 až 4 dvojné vazby,

A znamená kyslík nebo NH, s fyziologicky snesitelnými kationty nebo jejich směsmi.
5. Použití fosfolipidů nebo směsí lipidů obsahujících fosfolipidy jako stabilizujících přísad proti vlhkostí způsobenému poklesu lipolytické aktivity ve vodě rozpustných farmaceutických přípravků na bázi směsí zažívacích enzymů obsahujících lipázy a proteázy, přičemž tyto přípravky jsou vhodné pro přípravu vodných roztoků pro kontinuální zavádění do gastrointestinálního traktu pomocí sond, přičemž vaniontech obecného vzorce I definovaného v nároku 4 je zbytek R³ vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, aminoethylu, cholylu, serylu, glycerylu nebo myo-inositylu.
6. Použití fosfolipidů nebo směsí lipidů obsahujících fosfolipidy jako stabilizujících přísad proti vlhkostí způsobenému poklesu lipolytické aktivity ve vodě rozpustných farmaceutických přípravků na bázi směsí zažívacích enzymů obsahujících lipázy a proteázy, přičemž tyto přípravky jsou vhodné pro přípravu vodných roztoků pro kontinuální zavádění do gastrointestinálního traktu pomocí sond, přičemž fosfolipidy jsou zvoleny ze skupiny sestávající z kyseliny fosfatidové, fosfatidylcholinu, fosfatidylserinu, fosfatidylethanolaminu, fosfatidylinositu a sfingomyelinu nebo směsí lipidů obsahujících tyto látky.
7. Použití fosfolipidů nebo směsí lipidů obsahujících fosfolipidy jako stabilizujících přísad proti vlhkostí způsobenému poklesu lipolytické aktivity ve vodě rozpustných farmaceutických přípravků na bázi směsí zažívacích enzymů obsahujících lipázy a proteázy, přičemž tyto přípravky jsou vhodné pro přípravu vodných roztoků pro kontinuální zavádění do gastrointestinálního traktu pomocí sond, přičemž směsi lipidů obsahující fosfolipidy obsahují také glykolipidy.
8. Použití fosfolipidů nebo směsí lipidů obsahujících fosfolipidy jako stabilizujících přísad proti vlhkostí způsobenému poklesu lipolytické aktivity ve vodě rozpustných farmaceutických přípravků na bázi směsí zažívacích enzymů obsahujících lipázy a proteázy, přičemž tyto přípravky jsou vhodné pro přípravu vodných roztoků pro kontinuální zavádění do gastrointestinálního traktu pomocí sond, přičemž jako směsi lipidů obsahující fosfolipidy jsou zvoleny lecitiny ze sojových bobů, řepky, kukuřice, slunečnic, arašídů, slepičích vajec nebo mikroorganismů.
9. Použití fosfolipidů nebo směsí lipidů obsahujících fosfolipidy jako stabilizujících přísad proti vlhkostí způsobenému poklesu lipolytické aktivity ve vodě rozpustných farmaceutických přípravků na bázi směsí zažívacích enzymů obsahujících lipázy a proteázy, přičemž tyto přípravky jsou vhodné pro přípravu vodných roztoků pro kontinuální zavádění do gastrointestinálního traktu pomocí sond, přičemž jako směsi lipidů obsahující fosfolipidy jsou zvoleny lecitiny ze sojových bobů.
10. Farmaceutický ve vodě rozpustný přípravek na bázi směsí zažívacích enzymů obsahujících lipázy a proteázy, které jsou vhodné pro přípravu vodných roztoků pro kontinuální zavádění do gastrointestinálního traktu pomocí sondové aplikace, vyznačující se tím, že obsahuje fosfolipidy nebo směsi lipidů obsahující fosfolipidy pro stabilizování proti vlhkostí způsobenému poklesu lipolytické aktivity v koncentraci 1 % až 10 % hmotn., výhodně 2 % až 5 % hmotn., vztaženo na směs zažívacích enzymů.

-19CZ 295329 B6
11. Farmaceutický přípravek podle nároku 10, vyznačující se tím, žeseu směsí zažívacích enzymů obsahujících lipázy a proteázy jedná o směsi zažívacích enzymů obsahujících pankreatin.
12. Farmaceutický přípravek podle nároku 11,vyznačující se tím, že směsi zažívacích enzymů obsahují kromě pankreatinu přídavné lipázy vybrané ze skupiny skládající se z rostlinných lipáz, bakteriálních lipáz a lipáz z houbových kultur.
13. Farmaceutický přípravek podle nároků 11 a 12, vyznačující se tím, že pankreatin, který je v něm obsažen, je autolyticky upravený pankreatin.
14. Způsob výroby farmaceutického ve vodě rozpustného přípravku na bázi směsí zažívacích enzymů obsahujících lipázy a proteázy, které jsou vhodné pro přípravu vodných roztoků pro kontinuální zavádění do gastrointestinálního traktu pomocí sondové aplikace, podle nároku 11, vyznačující se tím, že se fosfolipidy nebo směsi lipidů obsahující fosfolipidy přidávají k pankreatinu obsaženému ve farmaceutických přípravcích již při jeho získávání nebo zpracování.
15. Souprava pro přípravu proti poklesu lipolytické aktivity stabilizovaných zárodečného růstu prostých vodných roztoků směsí zažívacích enzymů, vhodných ke kontinuálnímu zavádění do gastrointestinálního traktu pomocí sond, vyznačující se tím, že obsahuje následující složky:

a) ve vodě rozpustný pevný, zárodečného růstu prostý farmaceutický přípravek na bázi směsí zažívacích enzymů obsahujících lipázy a proteázy, který případně obsahuje dostačující množství fosfolipidů nebo směsi lipidů obsahující fosfolipidy podle nároku 10 ke stabilizaci připravovaných vodných roztoků proti poklesu lipolytické aktivity a

b) dostačující množství zárodečného růstu prosté vodného rozpouštědla pro přípravu vodných roztoků, které kromě vody případně obsahuje fyziologicky snesitelné soli a pomocné látky, pokud pevný farmaceutický přípravek uvedený v odstavci a) neobsahuje dostačující množství fosfolipidů nebo směsí lipidů obsahující fosfolipidy ke stabilizaci připravovaných vodných roztoků proti poklesu lipolytické aktivity, doplňkově obsahuje dostačující množství fosfolipidů nebo směsí lipidů obsahující fosfolipidy podle nároku 10 ke stabilizování připravovaných vodných roztoků proti poklesu lipolytické aktivity.
16. Souprava podle nároku 15,vyznačující se tím, že pevným přípravkem uvedeným v odstavci a) je vymrazováním sušená směs zažívacích enzymů obsahující lipázy a proteázy, která případně obsahuje fosfolipidy nebo směsi lipidů obsahujících fosfolipidy.
17. Souprava podle nároku 16, vyznačující se tím, že směs zažívacích enzymů sušená vymrazováním obsahuje pakreatin.