SK284639B6

SK284639B6 - Použitie komplexných lipidov ako stabilizujúcich prísad do farmaceutických prípravkov zmesí zažívacích enzýmov

Info

Publication number: SK284639B6
Application number: SK1159-97A
Authority: SK
Inventors: Manfred Galle
Original assignee: Solvay Pharmaceuticals Gmbh
Priority date: 1996-08-28
Filing date: 1997-08-22
Publication date: 2005-08-04
Also published as: US5993806A; SK115997A3; BR9704554B1; BR9704554A; NO973940L; AU722151B2; CA2213151A1; JPH1077236A; EP0826375A2; AR008807A1; PL190140B1; PT826375E; EE04179B1; NZ328616A; AU3530997A; TR199700872A2; CZ218497A3; CZ295329B6; HK1005224A1; CN1199694C

Abstract

Použitie komplexných lipidov, najmä lecitínu, proti vplyvom vlhkosti spôsobenému poklesu lipolytickej aktivity vo vodných farmaceutických prípravkoch z lipázy a proteázy obsahujúcich zmesí zažívacích enzýmov, ktoré sú vhodné na prípravu vodných roztokov na kontinuálne zavádzanie do gastrointestinálneho traktu pomocou sond.ŕ

Description

Predložený vynález sa týka použitia komplexných lipidov ako stabilizujúcich prísad proti vlhkosťou spôsobovanému poklesu lipolytickej aktivity vo vode rozpustných farmaceutických prípravkov zmesí zažívacích enzýmov. Ďalej sa vynález týka vo vode rozpustných farmaceutických prípravkov z lipázy a proteázy obsahujúcich zmesí zažívacích enzýmov, ktoré sú vhodné na prípravu vodných roztokov, zavádzateľných do gastrointestinálneho traktu cicavcov alebo ľudí pomocou sond.

Doterajší stav techniky

Pri cicavcoch, najmä ľuďoch, môže nastať nedostatok zažívacích enzýmov, napríklad vyvolaním chorobnými zmenami pankreatu na základe chronickej pankreatídy, zažívacej nedostatočnosti po operácii žalúdka, ochorení pečene alebo žlčníka. Je už známe, že takéto nedostatkové javy je možné liečiť podávaním pankreatin obsahujúcich zmesí zažívacích enzýmov, ktoré nie sú telu vlastné, napr. pankreasových enzýmov, najmä pankreatínu, ktoré pripadne ešte môžu obsahovať lipázové prísady. Pankreasové enzýmy sa obvykle podávajú orálne vo forme pevných prípravkov. Aby sa pri orálnom podávaní podanej zmesi enzýmov nežiaducim spôsobom nevratne nezhodnotili už v žalúdku tam prítomnými žalúdočnými kyselinami a proteolytickými enzýmami, ako je pepsín, je potrebné zmes enzýmov vybaviť povlakom, ktorý je odolný proti žalúdočným šťavám. Takýto povlak umožňuje priechod intaktných zmesí enzýmov žalúdkom až do miesta ich pôsobenia, do dvanástnika, kde sa tam pri neutrálnych až ľahko alkalických podmienkach uvoľní. Tak ako telu vlastné pankreasové enzýmy zdravého človeka môžu i orálne podané enzýmy prejaviť svoj enzymatický účinok, najmä amylolytickú, lipolytickú a proteolytickú aktivitu.

Takéto, proti žalúdočným šťavám odolným filmom potiahnuteľné, pevné pankreatinové formulácie vo forme mikropiluliek, opisuje napr. dokument DOS 42 27 385.4.

Dokument JP 59169491 A opisuje povrstvenie enzýmu fosfolipidom na ochranu, enzýmu proti oxidácii.

Pre pacientov so zažívacou nedostatočnosťou, najmä pre pacientov upútaných na lôžko s dlhšie trvajúcou zažívacou nedostatočnosťou ako napríklad chronickou nedostatočnosťou pankreatu, by bolo žiaduce namiesto pevných podávacích foriem podávať telu nevlastné zažívacie enzýmy i počas dlhšieho času v tekutej forme, napríklad kontinuálnou aplikáciou pomocou sondy.

Patent US 5,374,657 ukazuje prípravky, ktoré obsahujú mikrobiálne oleje a ich použitie ako doplnkové výživové prostriedky.

Kvapalné podávacie formy pankreatin obsahujúcich zmesí zažívacích enzýmov, najmä pankreatínu, neboli doteraz dané k dispozícii, pretože kvapalné vodné prípravky takýchto enzýmových zmesi nie sú dlhodobo stabilné. Ukazuje sa, že najmä aktivita v zmesi obsiahnutých lipáz v prítomnosti vody rýchlo klesá následkom proteolytického napadnutia v zmesi takisto obsiahnutých proteáz, ako je trypsín alebo chymotrypsín. Tak môže, v závislosti od vonkajších podmienkach (teploty, hodnoty pH), vo vodných pankreatinových prípravkoch počas krátkeho času dôjsť k ďalekosiahlej strate lipázovej aktivity.

Podstata vynálezu

Aby boli vhodné na kontinuálne zavádzanie do gastrointestinálneho traktu aplikáciou pomocou sondy, musia vodné roztoky lipázy a proteázy obsahujúcich zmesi zažívacích enzýmov, najmä pankreatin obsahujúcich zmesí zažívacích enzýmov, byť stabilné počas niekoľkých hodín, napríklad 8 hodín. Najmä v roztokoch nesmú vznikať alebo byť obsiahnuté žiadne čiastočky, ktoré upchávajú sondu. Podstatnou požiadavkou na takéto roztoky je, aby zostala počas celého bdobia podávania zachovaná pokiaľ možno vysoká a trvalá aktivita všetkých tam obsiahnutých zažívacích enzýmov. Ďalej je pre roztoky vhodné na kontinuálnu gastroíntestinálnu aplikáciu nutné, aby boli k dispozícii bez rastu zárodkov, teda napríklad boli konzervované proti rastu zárodkov, výhodne aby boli sterilné.

Úlohou vynálezu teda bolo dať k dispozícii proti vlhkosťou spôsobovanému poklesu lipolytickej aktivity stabilizované, lipázy a proteázy obsahujúce, vo vode rozpustné farmaceutické prípravky zo zmesí zažívacích enzýmov, ktoré, rozpustené vo vodnom médiu, zostávajú stabilné počas dlhšieho času.

Predmetom vynálezu je použitie komplexných lipidov ako stabilizujúcich prísad proti vlhkosťou spôsobovanému poklesu lipolytickej aktivity vo vode rozpustných farmaceutických prípravkov z lipázy a proteázy obsahujúcich zmesí zažívacích enzýmov, najmä z pankreatin obsahujúcich zmesí zažívacích enzýmov, ktoré sú vhodné na prípravu vodných roztokov na kontinuálne zavádzanie do gastrointestinálneho traktu pomocou sond. Predmetom vynálezu sú ďalej takéto stabilizované, vo vode rozpustné farmaceutické prípravky zo zmesi zažívacích enzýmov. Takisto predmetom vynálezu sú súpravy na prípravu na kontinuálnu sondovú aplikáciu vhodných vodných roztokov zmesí zažívacích enzýmov.

Komplexné lipidy, ktoré sú podľa vynálezu vhodné ako stabilizačné prísady, sú spravidla nerozpustné v acetóne. Patria k nim najmä fosfor obsahujúce a bezuhľohydrátové fosfolipidy, uhľohydráty obsahujúce a bezfosforové glykolipidy a ich zmesi. Účelne sa používajú iba fosfolipidy alebo zmesi s obsahom fosfolipidov a glykolipidov.

Ako fosfolipidy, ktoré môžu byť použité podľa vynálezu ako stabilizačné prísady k zmesiam zažívacích enzýmov s obsahom lipáz a proteáz, najmä k pankreatínu obsahujúcim zmesiam zažívacích enzýmov, sú najmä vhodné soli aniónov všeobecného vzorca (I),

-o O _______________________________1	©
R^x I	R²O= \|	=P—OR³I
1 0 \|	l A I	1 0 \|	(I)
1 H—C— I	1 -c-- 1	1 -C—H 1
1 R*	1 H	1 H

kde

R¹ znamená vodík alebo alkanoylový zvyšok s 10 až 25 uhlíkovými atómami, ktorého uhľovodíkový zvyšok môže prípadne obsahovať 1 až 4 dvojné väzby,

R² znamená vodík alebo alkanoylový zvyšok s 10 až 25 uhlíkovými atómami, ktorého uhlíkový zvyšok môže prípadne obsahovať 1 až 4 dvojné väzby, alebo, ak R¹ nezastupuje vodík, tak môže znamenať, vodík,

R³ znamená vodík, nižšiu alkylovú skupinu, ktorá môže byť substituovaná skupinou amino, nižšou trialkylamonio, karboxylovou skupinou, viazanou na uhlíkový atóm nesúci aminofunkciu alebo hydroxy substituovanou cykloalkylskupinou

R⁴ znamená vodík alebo uhľovodíkový reťazec s 10 až 25 uhlíkovými atómami, ktorý môže prípadne obsahovať 1 až 4 dvojné väzby,

A zastupuje kyslík alebo NH, s fyziologicky znesiteľným katiónom.

Ako fyziologicky znesiteľné katióny sú vhodné ióny amónne, katióny alkalického kovu alebo prvku alkalických zemín, výhodne sodíka, draslíka alebo vápnika, ako i ďalšie fyziologicky znesiteľné jedno- alebo viacmocné katióny. Pokiaľ R³ obsahuje dusíkový atóm, môže tento tvoriť kvartémy amónny ión, ktorý môže takisto slúžiť ako katión, takže sa vytvorí na vonkajšok nenabitej vnútornej soli.

Pokiaľ v zlúčeninách všeobecného vzorca (I) zastupujú R¹ a/alebo R² alkanoylové zvyšky, tak tieto môžu mať reťazec nerozvetvený alebo rozvetvený, spravidla je nerozvetvený a obsahuje 10 až 25, výhodne 16 až 20 uhlíkových atómov. Prípadne môže alkanoylový zvyšok obsahovať až 4 dvojité väzby. Ako alkanoylové zvyšky sa môžu vyskytovať najmä zvyšky mastných kyselín s dlhým reťazcom, ako je kyselina nervonová, kyselina lignocerová, kyselina palmitová, kyselina palmitoleinová, kyselina stearová, kyselina olejová, kyselina linolová, kyselina linolenová, kyselina arachová alebo kyselina arachidonová.

Pokiaľ je substituent R³ nižšia alkylová skupina alebo ju obsahuje, môže mať reťazec nerozvetvený alebo rozvetvený a obsahovať najmä 1 až 4, výhodne 1 až 2 uhlíkové atómy.

Pokiaľ R³ znamená skupinu hydroxy substituovanú cykloalkylovú skupinu, tak táto môže obsahovať 3 až 6 uhlíkových atómov a byť jedno- alebo viacnásobne substituovaná hydroxy. Výhodne obsahuje cykloalkylová skupina 5 až 6 uhlíkových atómov, ktoré pripadne môžu byť substituované hydroxy.

Zvyšok R³O predstavuje výhodne hydroxy alebo alkoxyzvyšok, vzniknutý cstcrifikáciou jedno- alebo viacmocného alkoholu fosfátovou skupinou, pričom jedno- alebo viacmocný alkohol je vybratý zo skupiny, ktorá sa skladá z ethanolaminu, cholínu, serínu, glycerínu a myo-inositolu.

Pokiaľ zvyšok R⁴ je uhľovodíkový reťazec, tak tento môže byť nerozvetvený alebo rozvetvený a spravidla je nerozvetvený a obsahuje 10 až 25, výhodne 12 až 20, ešte výhodnejšie 15 uhlíkových atómov. Prípadne môže uhľovodíkový reťazec obsahovať, až 4, výhodne 2, ešte výhodnejšie 1 dvojnú väzbu.

Zvyšok A môže byť kyslík alebo NH-skupina.

Výhodne prichádzajú ako fosfolipidy do úvahy kyselina fosfatidová (kyselina l,2,-diacyl-sn-glycerol-3-fosforečná), fosfatidylcholín (l,2-diacyl-sn-glycerol-3-fosforylcholín), fosfatidylethanolamin (l,2-diacyl-sn-glycerol-3-fosforylethanolamin), fosfatidylserín (1,2-diacyl-sn-glycerol-3-osforylserín) a fosfatidylinosit (1,2-diacyl-sn-glycerol-3-fosforylinosit) a v prípade, že fosfolipidy sú živočíšneho pôvodu ako napríklad slepačie vajce, tak tiež sfingomyelin, ako i zmesi týchto zlúčenín.

Zmienené 1,2-diacylfosfolipidy môžu byť za určitých podmienok, napríklad enzymatickým vplyvom fosfolipázy, čiastočne hydrolyzované. Podľa povahy fosfolipázy môžu byť pritom zvyšky R¹, R², R³ alebo tiež [R³OPO2.]-1,2-diacylfosfolipidu nahradené vodíkom. Ak najmenej jeden z uvedených molekulových zvyškov na fosfolipidovej molekule je hydrolyzovaný, tak vzniknú takzvané lysofosfolipidy, najmä lysofosfayidylcholín, lysofosfatidylethanola min, lysofosfatidylinosit, lysofosfatidylserín a kyselina lysofosfatidová. Tiež tieto lysofosfolipidy sú vhodné ako stabilizačné prísady k lipázy a proteázy obsahujúcim zmesiam zažívacích enzýmov, najmä k pankreatin obsahujúcim zmesiam zažívacích enzýmov, v zmysle tohto vynálezu.

Ako glykolipidy môžu byť použité predovšetkým v rastlinách sa vyskytujúce takzvané fotoglykolipidy všeobecného vzorca (II), r= R“ R^v

I II

O o o(II)

I II

H—C---CC—H

I II

H HH kde

R⁵ a R⁶ znamená nezávisle od seba podľa okolnosti alkanoylový zvyšok s 10 až 25 uhlíkovými atómami, ktorého uhľovodíkový zvyšok môže mať prípadne 1 až 4 dvojné väzby alebo to je vodík, pričom ale R⁵ a R⁶ nemôžu obidva súčasne znamenať vodík a

R⁷ znamená mono- alebo disacharidový zvyšok, ktorého sacharidové stavebné kamene sú vybraté zo skupiny, skladajúcej sa z d-fŕuktosylu, d-galaktosylu a d-mannosylu, ako ich zmesi.

Pokiaľ v zlúčeninách obecného vzorca (II) predstavujú R⁵ a R⁶ alkanoylový zvyšok, tak je tento rozvetvený alebo nerozvetvený a spravidla je nerozvetvený a obsahuje 10 až 25, výhodne 16 až 20 uhlíkových atómov. Prípadne môže alkanoylový zvyšok obsahovať až 4 dvojité väzby. Ako alkanoylové zvyšky prichádzajú do úvahy najmä zvyšky mastných kyselín s dlhými reťazcami, ako je kyselina palmitová, kyselina palmitoleinová, kyselina stearová, kyselina olejová, kyselina linolová, kyselina linolenová alebo kyselina arachová.

Zvyšky R⁷ predstavujú mono- a disacharidovč zvyšky, ktoré je možné vytvoriť z molekúl cukrov d-galaktosy, d-glukózy, d mannózy alebo d-fruktózy. Zvlášť výhodne má ako R⁷ význam d-galaktóza (potom ide o monogalaktosyldiglycerid, MGDG) alebo digalaktóza (potom ide o digalaktosyl-diglycerid, DGDG; l,2-diacyl-[a-D-ga-laktosyl-(l -> 6)-B-d-galaktosyl-(l -> 3)]-sn-glycerín).

Fosfolipidy všeobecného vzorca (I) a glykolipidy všeobecného vzorca (II) majú na strednom uhlíkovom atóme glycerínovej kostry vždy centrum chirality a môžu mať konfiguráciu R- alebo S-. Na účel vynálezu môžu byť použité jednotlivé stereoizomemé formy zlúčenín všeobecného vzorca (I) a/alebo všeobecného vzorca (II), ako i zodpovedajúce zmesi.

Na stabilizáciu podľa vynálezu farmaceutických prípravkov z lipázy a proteázy obsahujúcich zmesí zažívacích enzýmov, najmä z pankreatin obsahujúcich zmesí zažívacích enzýmov sa osvedčili ako prospešné také lipidové zmesi, ako sú získavané z prírodných zdrojov, a ktoré predstavujú zmesi rôznych fosfolipidov a prípadne rôznych glykolipidov. Ako výhodné príklady takých prírodných lipidových zmesi sú uvedené lecitíny. Zdrojmi takýchto prírodných Iccitínov môžu byť najmä rastliny ako sójové boby, slnečnica, repka, kukurica alebo arašidy, ako aj živočíchy alebo živočíšne produkty, ako je vaječný žĺtok alebo mozgová substancia, ale tiež mikroorganizmy. Lecitíny prírodného pôvodu dodávajú komerčne rôzni dodávatelia.

Z prírodné získaných lecitínov je na účely podľa vynálezu najmä vhodný sójový lecitín, najmä o fosfolipidy obohatený sójový lecitín ako napríklad sójový lecitín s obsahom fosfolipidov 98 % hmotnostných. Neopracované, neo bohatené rastlinné lecitíny obsahujú spravidla určitý podiel fotoglykolipidov. Prírodné získavané lecitíny sú zmesi rôznych fosfolipidov a v prípade rastlinného pôvodu tiež glykolipidov, ktorých zloženie nie je jednotné, ale kolíše v závislosti od ich pôvodu. Tak vedľa zhora uvedených súčastí sa v podružnom množstve môžu vyskytovať ešte ďalšie fosfolipidy. Tabuľka 1 slúži na to, aby znázornila priemerné zloženia niektorých neopracovaných, neobohatených komerčných lecitínov prírodného pôvodu.

Tabulka 1

\| Zloženie niektorých lecitínov (% hmotnostné) \|
1 1 1	\|sójový \|lecitín 1	n \|repkový jlecitín 1	-] \|arašidový \|lecitín 1	T 1 (vaječný \| (lecitín \|
1 \|fosfatidylcholín 1	1 f 22 t	1 i 37 1	1 1 23 1	1 23 I J I
1 \|fosfatidylethanol\|amin 1	1 \| 23 1 1	1 25 1 j	1 1 8 1 1	1 1 1 17 1 1 1 J I
1 \|foefatidylserín	1 2 1	1 - 1	1 1 -- 1	1 - 1
\|fosfatidylinosit 1	1 \| 20 1	1 1 14 \|	1 1 I? 1	1 1 1 1 1 J I
\| J kyselina \|foefatidová 1	1 1 5 1	1	1 1 2 1 1	1 - 1 1 1
\|------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ \| sfingomyeLin 1	1 -- 1	1 -	1 1 - \|	1 3 1 I 1
1 \|fytoglykolipid 1	1 1 13 I	\| 20 \|	1 \| 38 1	1 0 1 i 1
\| \|iné fosfolipidy	1 1 12 J	1 1 -	1 1 12	1 -- 1 J 1

Podľa vynálezu stabilizované farmaceutické prípravky obsahujú výhodne pankreatin obsahujúce zmesi zažívacích enzýmov.

V rámci predloženého vynálezu sa pod termínom pankreatin rozumie pankreatin izolovaný z pankreatu cicavcov, ktorého obsah aktívnych proteáz bol pripadne zvýšený autolytickým štepením tam pôvodne obsiahnutých proteázových zymogénov.

Výhodne môže isť u pankreatin obsahujúcich zmesi zažívacích enzýmov vo farmaceutických prostriedkoch stabilizovaných podľa vynálezu o pankreatin získaný z pankreatu cicavcov, najmä o pankreatin z bravov, ktorý predstavuje zmes rôznych zažívacích enzýmov. Pankreatin z cicavcov, ktorý sa ako pomocný zažívací prostriedok hodí na humánnu výživu, najmä pankreatin z pankreatu bravov, neobsahuje lipázy na ľudské potreby vždy v dostatočnom množstve. Preto je možné takýmto pankreatovým preparátom pridať dodatočne lipázy získané napríklad z mikroorganizmov. Tiež takto získané pankreatin/lipázové zmesi predstavujú vhodné enzýmové zmesi.

V pankreatine, ktorý je izolovaný z cicavcov, sú obvykle proteázy, ak nebol pankreatin podrobený žiadnej ďalšej predúprave, z väčšej časti vo forme proteolytického neaktívneho predstupňa - zymogénu. Preto môže byť účelné podrobiť, surový pankreatin na farmaceutické účely, ktorý sám osebe bol získaný známym spôsobom vhodnými porážkovými procesmi z pankreatu, ešte hydrolytickému ošetreniu (autolýze). Pri tomto ošetrení sa zymogény prevedú na aktívne proteázy. V tomto autolyticky ošetrenom pankreatinu (v nasledujúcom skrátene označovanom ako Fpan-kreatin je zvlášť vysoký obsah aktívnych proteáz, takže tieto F-pankreatiny sú čo do ich lipolytickej aktivity obzvlášť ohrozené. Vynálezu zodpovedajúce použitie komplexných lipidov je najmä dobre vhodné na stabilizáciu lipolytickej aktivity vo farmaceutických prípravkoch s obsa hom F-pankreatinu. Pritom je prekvapujúce, že stabilizácia lipázovej aktivity sa neuskutočňuje dezaktiváciou v zmesi obsiahnutých aktívnych proteáz a tieto takto stabilizované enzýmové zmesi majú preto tak amylolytickú a lipolytickú, ako tiež proteolytickú aktivitu.

Pankreatin obsahujúce zmesi zažívacích enzýmov vo farmaceutických prípravkoch chránených podľa vynálezu môžu okrem pankreatinu navyše obsahovať také lipázy, ktoré sú obsiahnuté v rastlinách alebo mikroorganizmoch. Lipázy z mikroorganizmov to môžu byť tie, ktoré sú získavané z baktérií alebo hubových kultúr, ako sú plesne, napríklad kmeňa Rhizopus.

Ako prídavné proteázové podiely môžu byť k pankreatin obsahujúcim zmesiam zažívacích enzýmov vo farmaceutických prípravkoch chránených podľa vynálezu pridané ešte iné živočíšne a rastlinné proteázy, ako i najmä z mikroorganizmov, ako sú baktérie alebo hubové kultúry, ako sú plesne, napríklad kmeňa Aspergillus, získateľné proteázy.

Zmesi zažívacích enzýmov bez obsahu pankreatinu môžu ako lipázy obsahovať, lipázy z rastlín a mikroorganizmov. Lipázy z mikroorganizmov môžu byť tie, ktoré sú získavané z baktérií alebo hubových kultúr, ako sú plesne, napríklad kmeňa Rhizopus. Ako proteázy v zmesiach zažívacích enzýmov bez obsahu pankreatinu prichádzajú do úvahy živočíšne alebo rastlinné proteázy, ako i najmä z mikroorganizmov, ako sú baktérie alebo hubové kultúry, ako sú plesne, napríklad kmeňa Aspergillus, získateľné proteázy.

Farmaceutické prípravky podľa vynálezu môžu okrem zmesí zažívacích enzýmov a komplexných lipidov doplnkovo obsahovať, vo vode rozpustné farmaceutické pomocné látky a/alebo prídavné látky. Napríklad môžu byť obsiahnuté nosiče ako uhľohydráty, napríklad mannit alebo rozpustné proteíny, ako i konzervačné prostriedky.

Farmaceutické prípravky z pankreatin obsahujúcich zmesi zažívacích enzýmov v zmysle vynálezu môžu byť vo vode rozpustné prášky, ktoré okrem pankreatinu obsahujú najmä F-pankreatin, komplexné lipidy v množstve dostačujúcom na stabilizáciu lipolytickej aktivity za vlhka a prípadne prídavné, v technike známe, vo vode rozpustné pomocné a/alebo prídavné látky.

Na prípravu vo vode rozpustných práškov môžu byť enzýmové zmesi ďalekosiahle zbavené vo vode nerozpustných podielov. S týmto cieľom môže byť vodný prípravok F-pankreatinu pomocou vhodného, v technike známeho postupu na oddeľovanie pevných látok, napríklad odstreďovaním alebo filtráciou, zbavený nerozpustených pevných látok a získaný roztok, prípadne po prídavku ďalších pomocných a/alebo prídavných látok, známymi metódami, napríklad filtračnou sterilizáciou, sterilizovaný. V nadväznosti môžu byť obsiahnuté látky získaného číreho, prípadne sterilného roztoku známym sušiacim postupom, napríklad vymrazovacím sušením, opäť získané ako pevné látky. Takto získané prípravky sú vhodné na prípravu počas viac hodín, napríklad až ôsmich hodín, stabilných roztokov, bez zárodkov, ktoré sú vhodné na kontinuálnu, rovnomernú gastrointestinálnu aplikáciu pacientovi, napríklad sondou.

Termínom „kontinuálnu aplikácia“ sa rozumie v podstate neprerušované podávanie vodných, prípadne sterilných roztokov s obsahom farmaceutických prípravkov podľa vynálezu počas jednej až viac hodín, napríklad ôsmich hodín alebo cez noc. Kontinuálna aplikácia roztokov môže byť výhodne uskutočňovaná zažívacím traktom, napríklad do žalúdka alebo do tenkého čreva vloženou sondou.

Účinnosť lecitínových prísad je ďalekosiahle nezávislá od relatívneho pomeru lipáza/proteáza v enzýmovej zmesi. Vhodné sú napríklad enzýmové zmesi, v ktorých pomer lipáza/celková proteáza - merané pomerom príslušných akti vít, ktoré boli stanovené podľa ustanovenia inštitúcie „Fedaratio Intemationale Pharmaceutique“ (ďalej označované skratkou FIP) (pozri R. Ruyssen a A Lauwers, Pharmaceutical Enzymes, Scientific Publishing Company, Gent 1978, s. 74 - 82, ďalej citované ako „Lauwers“) a a v nasledujúcom bude udávané v relatívnych jednotkách aktivity pod skratkou FIP-E/g - môže byť 5 : 1 až 30 : 1.

Zásadne pôsobí prísada komplexných lipidov podľa vynálezu k farmaceutickým prípravkom z lipázy a proteázy obsahujúcich zmesí zažívacích enzýmov, najmä z pankreatin obsahujúcich zmesí zažívacích enzýmov, stabilizáciu proti vlhkosťou spôsobovanému poklesu lipolytickej aktivity. Termínom „vlhkosť“ sa má rozumieť v podstate vhodná vlhkosť, ktorá môže byť v rozmedzí od veľmi malého obsahu vlhkosti v prášku zmesi zažívacích enzýmov až po vodné prípravky z tohto prášku.

Prísada komplexných lipidov podľa vynálezu sa preukazuje ako účelná pri získavaní a podávaní farmaceutických prípravkov z pankreatin obsahujúcich zmesí zažívacích enzýmov na stabilizáciu lipolytickej aktivity už pri výrobných alebo získavacích postupoch počas takých procesných krokov, pri ktorých môže dôjsť k inaktivácii lipázy, ako napríklad pri spracovaní enzýmovej zmesi za vlhka.

Vo vodnom roztoku farmaceutického prípravku obsahujúceho zmes zažívacích enzýmov je stabilizujúci účinok pridaných komplexných lipidov, najmä lecitinov, mimo iné tiež závislý od hodnoty pH prípravku. Podľa vynálezu sa preukázali ako priaznivé hodnoty pH v rozmedzí pH 3,5 až 9,0, výhodne v oblasti pH 4,0 až 7,0 a ešte výhodnejšie v oblasti pH 5,0 až 6,5.

Na docielenie znateľnej stabilizácie lipolytickej aktivity vo vodných farmaceutických prípravkoch zo zmesí zažívacích enzýmov a z týchto prípravkov pripraviteľných vodných roztokov na sondovú aplikáciu, je nutné pridať určité minimálne množstvo komplexných lipidov. Obvykle môže použite zmesi zažívacích enzýmov v prípravkoch podľa vynálezu mať obsah lipázy, vyjadrený v jednotkách aktivity, napríklad 2.000 až 200.000 FIP-E/g, ak obsahujú iba lipázy zo sekrétu pankreatu cicavcov a od 2.000 do 500.000 FIP-E/g, ak obsahujú lipázy z mikroorganizmov, buď samotnej alebo v kombinácii s lipázy z pankreatu. Množstvo najmenej 1 % hmotnostného komplexných lipidov, vztiahnuté na nasadené množstvo pevnej zmesi zažívacích enzýmov s obsahom pankreatinu, napríklad množstvo od 1 do 10 % hmotnostných, jc potom vhodné na dosiahnutie znateľnej stabilizácie. Prídavok väčších množstiev komplexných lipidov je takisto možný, nespôsobuje však už žiadne, čo stojí za zmienku, zlepšenie stabilizácie lipolytickej aktivity. Tak je napríklad na stabilizáciu zmesí s obsahom pankreatinu a prídavných lipáz s komplexnými lipidmi najmä vhodný lecitín, prísada najmenej 1 % hmotnostného, výhodne 2 až 5 % hmotnostných a ešte výhodnejšie 3 % hmotnostné lecitínu.

Pomocou použitia podľa vynálezu komplexných lipidov je možné takéto vodné roztoky farmaceutických prípravkov z pankreatin obsahujúcich zmesí zažívacích enzýmov, ktoré majú sklon k rýchlemu poklesu lipolytickej aktivity, stabilizovať do tej miery, že lipolytická aktivita v zmesi obsiahnutých lipáz v dlhšom časovom úseku klesá len málo. Tak má vodný roztok prísadou lecitínu stabilizovaného F-pankreatinu po osemhodinovej inkubačnej dobe pri teplote miestnosti lipolytickú zvyškovú aktivitu vo výške 85 % pôvodnej východiskovej aktivity. V komplexnými lipidmi stabilizovanom vodnom roztoku F-pankreatinu bolo ešte po 24 hodinovej inkubačnej dobe dokázateľných 50 % lipolytickej východiskovej aktivity. Naproti tomu v porovnávacom roztoku, ktorý nebol stabilizovaný, klesla za inak rovnakých podmienok lipolytická aktivita po ôsmich hodinách pod 20 % východiskovej aktivity.

Stabilizácia podľa vynálezu vodných farmaceutických prípravkov z lipázy a proteázy obsahujúcich zmesí zažívacích enzýmov proti poklesu lipolytickej aktivity vo vodnom médiu otvára možnosť podávač pacientom zmesi zažívacích enzýmov takého druhu vo forme vodných roztokov kontinuálne zavádzaním do gastrointestinálneho traktu. Na tento účel používané vodné roztoky by prirodzene mali byť bez zárodkov, výhodne by dokonca mali byť sterilné. Roztoky bez rastu zárodkov môžu byť napríklad roztoky, v ktorých prísada konzervačných činidiel zabraňuje množeniu samomnožiteľných zárodkov.

Podľa vynálezu je dávaná k dispozícii súprava na prípravu na kontinuálne zavádzanie do gastrointestinálneho traktu pomocou sondy vhodných vodných, proti poklesu lipolytickej aktivity stabilizovaných roztokov bez zárodkov zmesí zažívacích enzýmov, vyznačujúca sa tým, že ako súčasti obsahuje:

a) vo vode rozpustný, pevný, bezzárodočný farmaceutický prípravok z lipázy a proteázy obsahujúcich zmesí zažívacích enzýmov, ktorý prípadne môže obsahovať dostatočné množstvo komplexných lipidov na stabilizáciu vodných roztokov, ktoré majú byť pripravované, proti poklesu lipolytickej aktivity, a

b) na prípravu vodných roztokov dostatočné množstvo bez zárodočného rastu vodného rozpúšťadla, ktoré okrem vody môže obsahovať fyziologicky znesiteľné soli a pomocné látky a, ak v ad a) uvedených pevných farmaceutických prípravkoch nie je obsiahnuté dostatočné množstvo komplexných lipidov proti poklesu lipolytickej aktivity na stabilizáciu vodných roztokov, ktoré majú byť pripravované, doplnkovo obsahuje dostatočné množstvo komplexných lipidov na stabilizovanie proti poklesu lipolytickej aktivity vodných roztokov, ktoré majú byť pripravované.

Najmä môže v súprave použitý pevný prípravok a) byť vymrazovaním usušená, lipázy a proteázy obsahujúca zmes zažívacích enzýmov, ktorá prípadne obsahuje komplexné lipidy. Výhodne v zmesi zažívacích enzýmov ide o pankreatin obsahujúcu zmes zažívacích enzýmov.

Vodné roztoky, ktoré sú bez rastu zárodkov, môžu byť uchované prísadou v technike známych konzervačných prostriedkov, napríklad parabenu. Sterilné roztoky, ktoré takisto sú roztokmi bez rastu zárodkov, môžu byť uchované sterilizačnými postupmi, ktoré sú v technike známe, napríklad filtračnou sterilizáciou.

Lipidy v súprave obsiahnuté sa môžu výhodne vyskytovať ako v zmesi zažívacích enzýmov (súčasť a)) už obsiahnuté prísady. Na výrobu prášku zmesi zažívacích enzýmov, ktorý obsahuje už komplexné lipidy, je napríklad možné zmiesiť roztok komplexných lipidov, prípadne bez zárodočného rastu, s roztokom, prípadne bez zárodočného rastu, zmesi zažívacích enzýmov a v nadväznosti postupom v technike známym, napríklad vymrazovacím sušením, usušiť. Aby sa z toho získal sondou aplikovateľný roztok, musia komplexné lipidy, ako i zmes zažívacích enzýmov obsahujúci prášok byť zmiešané so spolu v súprave takisto obsiahnutým rozpúšťadlom, pripadne v podmienkach chudobných na zárodky alebo v podmienkach bezzárodkových. Komplexné lipidy sa môžu ale tiež už vyskytovať v rozpúšťadle (súčasť b)), napríklad rozpustené ako koloid. Aby sa získali sondou aplikovateľné roztoky, musí byť v tomto prípade komplexné lipidy obsahujúci vodný roztok alebo koloid, prípadne za sterilných podmienok, zmiešaný so zmesou zažívacích enzýmov (súčasť a)).

Príklady uskutočnenia vynálezu

1. Stabilizovanie lipolytickej aktivity vodných pankreatin obsahujúcich roztokov sójovým lecitínom

Na stanovenie rôznych zmien lipolytickej aktivity s prísadou a bez prísady komplexných lipidov vo vodných pankreatin obsahujúcich prípravkoch boli pripravené príslušné vzorky a inkubované pri 30 °C. Z inkubačných vzoriek boli stanovené časové zmeny lipázovej aktivity podľa metódy „Fédération Intemationale Pharmaceutíque/Euro-pean Pharmacopeia“ (ďalej označované skratkou FIP/Ph.EUR., pozri Lauwers, s. 74 82). Pri tejto štandardnej metóde stanovenia sa nechá vzorka, skúšaná na lipázovú aktivitu, pôsobiť na triglycerid olivového oleja a uvoľnené karboxylové kyseliny sa titrujú hydroxidom sodným na hodnotu pH 9. Lipázová aktivita vzorky sa pritom stanoví porovnaním rýchlosti, akou vzorka hydrolyzuje emulziu olivového oleja s rýchlosťou, akou suspenzia pankreasového referenčného prášku hydrolyzuje rovnaký substrát za rovnakých podmienok.

1.1 Zisťovanie lipázovej stability bez prísad lecitínu

79,35 mg vo vode rozpustného vymrazením usušeného F-pankreatinu s lipolytickou aktivitou 50473 FIP-E/g bolo rozpustených v 4,0 ml ľadovo chladnej vody najvyššej čistoty (Nanopur^(R) firmy Bemstead), hodnota pH bola 1 N HC1 nastavená na 6,2 a šarža potom doplnená vodou najvyššej čistoty na 5,0 ml. Z tejto šarže bola okamžite odobraná vzorka na stanovenie lipolytickej východiskovej aktivity (vzorka nultej minúty). Ostatná šarža bola inkubovaná na 30 °C vodnom kúpeli. Na odber vzorky bola šarža dobre premiešaná, vzorka odobraná vhodnou pipetou a ihneď zriedená ľadovo chladným lipázových rozpúšťadlom tak, aby stanovenie lipázy bolo k dispozícii medzi 0,5 a 1,5 ml skúšanej vzorky s lipolytickou aktivitou od 8 do 16 FIP-E. Ako lipázové rozpúšťadlo bol použitý podľa FIP/Ph.Eur. roztok 10,0 ml NaCl, 6,06 g tris-(hydroxymethyl)-aminometánu (v nasledujúcom označovaný skratkou „TRIS“) a 4/9 g anhydridu kyseliny maleínovej v 900 ml vody najvyššej čistoty, ktorého hodnota pH bola 4 N hydroxidom sodným nastavená na pH 7 a potom bol doplnený vodou najvyššej čistoty na 1.000 ml.

Na stanovenie časového priebehu lipázovej aktivity boli po 15, 30, 60, 120 minútach odobrané z termostatovej šarže ďalšie vzorky a v ktorých vždy počas 30 minút stanovená lipázová aktivita metódou FIP/Ph.Eur. (Lauwers, s. 78).

Zistená lipázová aktivita „vzorky nultej minúty“ v jednotkách FIP-E/ml bola vzatá ako hodnota 100 % a hodnoty aktivity namerané počas ďalších inkubačných dôb boli vztiahnuté percentuálne na túto hodnotu. Výsledky sú uvedené v tabuľke 2.

1.2 Zisťovanie lipázovej stability s prísadou lecitínu

Na prípravu lecitínového roztoku bolo 100 mg sójového lecitínu (obsah fosfolipidu 98 % hmotnostných od firmy Roth) pri teplote miestnosti umiesené najskôr s trochou vody najvyššej čistoty a potom doplnené na 20,0 ml. Na zmes bolo za miešania počas 2 minút až do dosiahnutia homogénneho, koloidného roztoku pôsobené ultrazvukom. Potom bolo rozpustené 80,0 mg vo vode rozpustného, vymrazením vysušeného F-pankreatinu s lipolytickou aktivitou 54694 FIP-E/g v 4 ml vody najvyššej hustoty a hodnota pH roztoku nastavená 1 N HC1 na 6,2. Bolo pridané 0,4 ml lecitínového roztoku (2,5 % hmotnostných lecitínu, vztiahnuté na nasadený práškový F-pankreatin) a šarža bola pri dobrom premiešavaní doplnená ľadovo chladnou vodou najvyššej čistoty na 5,0 ml.

Odber vzorky a stanovenie lipolytických aktivít pri príslušných inkubačných dobách s uskutočňovalo tak, ako jc opísané v bode 1.1. Výsledky sú uvedené v tabuľke 2.

Tabuľka 2
) Zmeny lipolytických aktivít vo	1 vodných pankreatinových \|
1	roztokoch s prísadou	a bez prísady lecitínu	1 1
1 \|pH	1 1 1 1 \| prísada \| %	lipolytickej aktivity po	1 čase t \|
1	\| lecitínu \| I t		[min]		1
1 1	1 1 \| (¾ hmotnostné] \| 0 1 1	1 15	T-------1 1— \| 30 I 60 I 1 1 1	120	1 ιβο \| _\|_________________I
1 \|6,2	1 1 \| - \|100 1 1	] 69	1 1 1 \| 51 I 41 I 1 1 1	26	1 21 1
1 1 \|6,2	1 1 \|103 1 1	1 \| 93 t	1 1 1 \| 90 1 86 j J 1 1	80	1 75 \| 1 1

2. Stabilizovanie lipolytickej aktivity vodných pankreatin obsahujúcich prípravkov v časovom priebehu 8 hodín

Vo vodných pankreatinových prípravkoch nastávajú, v závislosti od rôznych faktorov, ako je teplota, hodnota pH a proteolytická aktivita obsiahnutých proteáz, straty lipolytickej aktivity. Prísadou komplexných lipidov, ako je lecitín môže byť aktivita lipázy počas osemhodinovej inkubácie pri 25 “C znateľne stabilizovaná. V nasledujúcom pokuse boli preto počas 8 hodín porovnávané lipolytické aktivity vo vodných suspenziách a roztokoch F-pankreatinu vždy s prísadou a bez prísady komplexných lipidov.

2.1 Príprava inkubačnej šarže

Na porovnanie boli skúmané číre pankreatinové roztoky a pankreatinové suspenzie z F-pankreatinu vždy s prísadou a bez prísady lecitínu.

Boli pripravené nasledujúce vodné prípravky:

a) Pankreatinový roztok bez lecitínu

V ľadovo chladnej vode najvyššej čistoty bolo rozpustené

77,5 mg vo vode rozpustného, vymrazením vysušeného F-pankreatinového prášku, ako je opísané pod bodom 1.1, pričom hodnota pH bola nastavená IN HC1 na 6,2.

b) Pankreatinový roztok s lecitínom

81,0 mg vo vode rozpustného, vymrazením vysušeného F-pankreatinového prášku bolo, ako je opísané v bode 1.2, po nastavení hodnoty pH na 6,2 predmiesené s 0,94 ml lecitínového roztoku a doplnené ľadovo studenou vodou najvyššej čistoty na 5,0 ml.

c) Pankreatinová suspenzia bez lecitínu

2,0 g F-pankreatinu boli 30 minút miešané v 100 ml ľadovo chladnej vody najvyššej čistoty. Bola získaná kalná suspenzia.

d) Pankreatinová suspenzia s lecitínom

2.0 g F-pankreatinu boli predmiesené so 100 mg sójového lecitínu (firmy Roth) a miešané 30 minút v 100 ml ľadovo chladnej vody najvyššej čistoty. Bola získaná kalná suspenzia.

2.2 Uskutočnenie pokusu

Z ľadovo chladných roztokov respektíve suspenzií, pripravených podľa postupov v bode 2.1, boli hneď po ich príprave odobrané vzorky na stanovenie lipolytickej východiskovej aktivity („vzorku nultej minúty“). Potom bol zvyšok šarže v skúmavkách inkubovaný 8 hodín pri 25 °C. Počas tohto času boli odobrané ďalšie vzorky po 30 minútach a následne v hodinových intervaloch. Odber vzoriek, zriedenie a stanovenie lipázovej aktivity bolo uskutočňované, ako je opísané v bode 1.1, pokusná teplota ale teraz nebola, na rozdiel od horného predpisu, 25 °C.

Lipázová aktivita (udávaná vo FIP-E/ml) „vzorky nultej minúty“ určitej inkubačnej šarže bola stanovená ako hodnota 100 % a počas ďalších inkubačných časov namerané aktivity boli percentuálne vztiahnuté na túto hodnotu. Výsledky sú zachytené v nasledujúcich tabuľkách 3 a 4.

Tabuľka 3

\| Priebeh lipolytickej stability počas 8 hodín \| \| v pankreatinových roztokoch s prísadou a bez \| \| prísady lecitínu \|
\|šarža !	\| obsah \|lecitínu \|[1 hmôt.] j	I,----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------] \|pH \|% lipolytickej aktivity po čase t [h] \| I I................. _J
t 1 II u 1 U 1 o \|O,5\| I \| 2 1 II 1 < 1 1	1111 3 \| 4 \| S \| 6 \| 1 1 1 1	7 1	1 « 1
! a)	1 1 - 1	II 1 1 1 1 \|6,2\| 100\| 72 \| 64] 47\| II 1 1 1 I	1 1 1 1 36\| 30\| 27] 24\| 1 1 1 1	---r 2I\|	—1 19\|
1 b)	1 1 5,8	Ί 1 i—1 i—1 \|6,2\| 100\| 971 98\| 96\| i i i i i t	-----------------1-----------------1-----------------1----------------- 981 941 921 89) 1 l 1 L	- 851 L	—1 85\| ______________1

Tabuľka 4 | Priebeh lipolytickej stability počas 8 hodín| | v pankreatinových suspenziách s prísadou a bez| | prísady lecitínu| |--------------------------,--------------------------------------------j-----------------,1 |6arža| obsah |pH [V lipolytickej aktivity po čase t [h]| | I lecitínu I |-------, ,-----,-----,——, ,-----,-----, i1 | |[% hmot.j] | O |0,5| 1|2|3|4|S|6|7|8|

I-----1---------1—I----1—I---1---I 1—I---1---1—I1 | a) | -- |7,1| 100| 72| S6| 43] 34 | 29| 2S| 21| 1S|161

I---1-----1—I--1—I—I—I—I—I—I—I—I—I | b) | S |7,1| 100| 97| 97I 92] 64 | 77| 72| 69| 64| 60 | I__________________________I____________________________________________1 I______________________I I I I I 1 I I I I

3. Stabilizovanie mikrobiálnej lipázy proti mikrobiálnej proteáze prísadou komplexných lipidov

V nasledujúcom pokuse bolo ukázané, že tiež aktivitu mikrobiálnych lipáz v prítomnosti aktívnych mikrobiálnych proteáz je možné stabilizovať, prísadou komplexných lipidov. Na tento účel boli pripravené tri skúšobné roztoky, ktoré obsahovali mikrobiálne lipázy, mikrobiálne lipázy plus mikrobiálne proteázy, ako i mikrobiálne lipázy s prísadou lecitínu plus mikrobiálne proteázy. V nadväznosti boli stanovené lipolytické aktivity v týchto skúšobných roztokoch a výsledky na porovnanie usporiadané do tabuliek.

3.1 Príprava skúšobných roztokov

Boli pripravené nasledujúce roztoky

a) Lipázový roztok

245 mg lipázy z Rhizopus oryzae (Lipase 7-Ap 15, Amano Pharmaceutical Co., LTD, Nagoya, Japonsko) s aktivitou 170.000 FIP-E/g bolo rozpustené v 50 ml ľadovo chladného roztoku chloridu sodného s koncentráciou 1 % hmotnostného.

b) Proteázový roztok

390 mg Aspergillus-proteázy (Prozyme 6; Amano Pharmaceutical Co., LTD, Nagoya, Japonsko) s aktivitou 7.600 FIP-E/g bolo rozpustené v 25 ml ľadovo chladného roztoku chloridu sodného s koncentráciou 1 % hmotnostného.

c) Lecitínový roztok g lecitínu (čistý sójový lecitín s obsahom fosfolipidu 98 % hmotnostných od firmy Roth) bol predložený do 40 ml vody najvyššej čistoty f.,Nanopurc^(R)“ od firmy Ber nstead) a za prelievania počas 2 minút dispergovaný ultrazvukom na koloid.

Z týchto roztokov boli v ľadovom kúpeli pripravené nasledujúce inkubačné roztoky s celkovým objemom 5 ml:

Tabuľka S

í 1 j Inkubačné roztoky pre stanovenie Rhizopus-lipázovej aktivity \| i i 1....................................................................................................................................................................................................................................... i
\| inkubačný \| roztok I	I \| lipázový \| roztok j	1 1------------------------------------------------------------1 1 \| proteázový \| lecitínový \| roztok \| \| roztok \| roztok \| NaCl J 1 1 II
1 I I	\| 3 ml 1	-j \|------------------------------1---------------------1 \| -- \| - ] 2 ml \| i 1 II
1 n \|	1 \| 3 ml j	1\|---------------------------------------------1--------------------------------1 \| 1 ml \| -- \| i ml \| 1 1 II
1 III	1 \| 3 ml 1	-ή \| \|---------------------j \| 1 ml [ 1 ml 1 I -1------------------------------1 t 1

Hodnota pH všetkých inkubačných roztokov činila po príprave 6,5 pri 37 °C.

3.2 Uskutočnenie pokusov

Z ľadovo chladných inkubačných roztokov I, II, III boli okamžite po ich príprave odobrané vzorky na stanovenie východiskovej aktivity („vzorky nultej minúty“), zvyšok týchto troch šarží bol inkubovaný vo vodnom kúpeli pri 37 °C.

Na odber vzoriek boli šarže dobre premiešané, vzorka bola odobraná vhodnou pipetou a okamžite rozriedená ľadovo chladným lipolázovým roztokom tak, ako bolo opísané v bode 1.1. z týchto vzoriek boli odobrané vždy určité množstvá (v tabuľke 6 označené „X“) a zriedené 1 %-ným roztokom chloridu sodného na 5 ml. Z týchto skúšobných roztokov bolo vždy nasadené 0,5 ml v teste lipázovej aktivity.

Tabuľka 6

\| Odobrané množstvo vzorky pr prípravu skúšobného roztoku \| 1_________________________________________________________.________________________________ ..... . 1
\| skúÄobný roztok \| 1 1 1 H 1 1	X μΐ skúšobného roztoku odobraného \| po čase t = \|
0 minút \| t	30 minút \| 1	1 60 minút \|
1 i 1	r 150 \| I	r 1 1	160 \| 1
1 II 1	1 160 \|	1 500 \| 1	----------------------------------------------------------------------------------------1 1000 I 1
\| III I	160 \|	1 250 \|	1 250 \|

3.3 Stanovenie rhizopus-lipázovej aktivity

Katalitycká aktivita rhizopus-lipázy bola meraná stanovením množstva voľných mastných kyselín, ktoré sa vytvorili počas definovaného času pri pH 7,0 a 37 °C z emulzie olivového oleja v prítomnosti taurocholanu sodného o koncentrácii 0,025 % hmotnostných. Aby bolo zaručené, že budú podchytené všetky mastné kyseliny, nasledovala potom titrácia až na pH 9,0. Slepý titračný pokus substrátovej emulzie slúžil na podchytenie titrovateľných substancií, ktoré nevznikli lipázovou aktivitou.

Rhizopus-lipázová aktivita pokusnej substancie bola stanovená porovnaním rýchlosti, ktorou suspenzia substancie hydrolyzovala emulziu olivového oleja s rýchlosťou, ktorou suspenzia rhizopus-lipázového referenčného štandardu hydrolyzovala rovnakú emulziu olivového oleja za rovnakých podmienok.

Chemikálie

1. Voda

Používaná bola voda najvyššej čistoty „Nanopure^(R)“ od firmy Bemstead. V nasledujúcom bude označovaná ako „voda najvyššej čistoty“.

2. Roztok arabskej gumy

110 g arabskej gumy a 12,5 g chloridu vápenatého bolo za miešania rozpustené (3 hodiny) vo vode najvyššej čistoty, doplnené na 1.000 ml a odstredené. Roztok bol naplnený do 250 ml plastikových nádob a skladovaný pri -20 °C.

Arabská guma (Acaciae-Gumi, DAB 10/Ph.Eur.)., chlorid vápenatý p. a.

3. Substrátová emulzia

130 ml olivového oleja a 400 ml roztoku arabskej gumy (pozri chemikálie ad 2) bolo emulgované počas 15 minút vo vhodnej miešačke s vysokým počtom otáčok. Teplota bola udržovaná pod 30 °C. Najmenej 90 % kvapiek v emulzii malo priemer menší ako 3 pm a žiadna nebola väčšia ako 10 pm. Emulzia bola denne pripravovaná nová.

Olivový olej (skladovaný v chladničke), akosti DAB.

4. Roztok taurocholanu sodného 0,5 % (m/V):

0,5 g taurocholanu sodného (lipázovo aktívna zmes, zmes konjugovaných kyselín žlčových, mj. tuarocholanu sodného) bolo rozpustené vodou najvyššej čistoty na 100,0 ml. Roztok bol pripravovaný denne čerstvý.

Tuarocholan sodný (lipázovo aktívna zmes), FIP.

5. Roztok chloridu sodného 1 % (m/V) vo vode najvyššej čistoty

6. Ústojný roztok pH 4,5:

chloridu sodného a 9,2 g dihydrogenfosforečňanu sodného bolo rozpustené v 950 ml vody najvyššej čistoty, nastavené kyselinou soľnou na pH 4,5 a doplnené vodou najvyššej čistoty na 1,000 ml.

Chlorid sodný p. a., dihydrogenfosforečňan sodný, NaH₂PO₄ x H₂O.

7. Hydroxid sodný 0,1 N Referenčná suspenzia:

Rhizopus-lipázový referenčný štandard bol zamiešaný do ustojného roztoku (chemikália ad 6) a tak zriedený roztokom chloridu sodného (chemikália ad 5), až enzýmový roztok mal 12 až 18 jednotiek rhizopus-lipázovej aktivity FlP-E/ml. Pri štandarde 55.000 FIP-E na 1 g bolo rozpustené 63 mg v 20 ml ústojného roztoku (chemikália ad 6) počas 15 minút v ľadovom kúpeli. 10 ml tohto roztoku bolo zriedené v ľadovom kúpeli roztokom chloridu sodného (chemikália ad 5) na 100 ml.

K testu bolo nasadené 0,5 ml tohto roztoku.

Rhizopus-lipázový referenčný štandard FIP (fungi-lipasa, FlP-štandard).

Skúšobné roztoky:

Boli použité skúšobné roztoky 1, II, III.

Uskutočnenie pokusov

Na autototrátore titračného systému „pH-Stat“ od firmy Rádiometer bol koncový bod pre pH-Stat-titráciu nastavený na pH 7,0. Do reakčnej nádoby bolo vložené: 12,0 ml emulzie olivového oleja, FIP (chemikália ad 3)

6,5 ml vody najvyššej čistoty (chemikália ad 1) 1,0 ml roztoku taurocholanu sodného (chemikália ad 4)

Zmes bola zahriata na 37,0 °C. Hodnota pH bola 0,1 N hydroxidom sodným (chemikália ad 7) nastavená na pH 7,0. Potom bola byreta nastavená na „0“.

Reakcia bola naštartovaná prídavkom 0,5 ml referenčnej suspenzie, keď mala byť meraná referenčná hodnota, alebo 0,5 ml skúšanej vzorky, ak mala byť meraná lipázová aktivita v skúšanej vzorke. Po 10 minútach bol koncový bod pre pH-Stat-titráciu nastavený na pH 9,0. Keď bola hodnota pH 9,0 dosiahnutá (tento proces trval menej ako 30 sekúnd), bola titrácia prerušená a bola odčítaná spotreba 0,1 N hydroxidu sodného.

Na stanovenie slepej hodnoty bol pre referenčnú suspenziu a pre skúšanú vzorku koncový bod titrácie na titrátore nastavený ihneď na pH 9,0. Po ručnom nastavení hodnoty pH v reakčnej šarži na pH 7,0 a po prídavku 0,5 ml referenčnej suspenzie alebo skúšaného roztoku bolo okamžite titrované na pH 9,0. Z odčítanej spotreby 0,1 N hydroxidu sodného bola vypočítaná rhizopus-lipázová aktivita v FIP-E/ml.

V skúšaných roztokoch I, II a 111 zistené východiskové lipázové aktivity v jednotkách FIP-E/ml boli vzaté ako hodnoty 100 %. Počas nasledujúcej inkubačnej doby v dĺžke jednej hodiny namerania hodnoty aktivity boli potom vždy percentuálne vztiahnuté na túto východiskovú hodnotu a sú uvedené v tabuľke 7.

Tabuľka 7 |Stabilizácia aktivity rhihozopus-lipázy sójovým lecitínom

1------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------; j skúšaný roztok 1 1 1 1	i----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------1 \| % lipolytickej aktivity ] 1 po t - 1
1 1— \| 0 min \| 1 1	30 min	—1 1 \| 60 min \| 1 1
1 \|l roztok lipázy 1 1	1 1 1 100 1 1 1	100	\| \| ) 95 \|
1 1 \|II roztok lipázy + proteá2y	1 1 1 100 \| 1 1	17	1 1 1 6 1
\|----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------1 \|III roztok lipázy \| s lecitínom + pxoteázou t 1	1 1 1 100 \| 1 1 1 1	94	1 1 1 8« 1 1 1 1 1

4. Príklady farmaceutického prípravku

A) Vezme sa 20,0 g F-pankreatinu v 400 ml vody a hodnota pH sa rýchle nastaví prídavkom 1 N HC1 na 6,2. Za týchto podmienok sa extrahuje 1 hodinu pri 4°. Číry, pankreatinový extrakt obsahujúci produkt sa odstredí pri 53,000 g a následne sa sterilizuje filtráciou filtrom s veľkosťou pórov 2 pm.

B) 1,0 sójového lecitínu (98 % hmotnostných fosfatidyleholínu) sa rozpustí v 50 ml vody a v zatavenej sklenenej ampule sa 40 minút sterilizuje pri 140 °C.

C) 400 ml pod bodom A) pripraveného pankreatinového extraktu sa v chlade a za sterilných podmienok zmiesi s 25 ml pod bodom B) pripraveného lecitínového roztoku. Zmes sa vymrazením usuší, pričom sa získa 16 g prášku, ktorý sa za sterilných podmienok naplní v dávkach po 2,5 g do infúznych fliaš.

5. Príklady pre súpravu na farmaceutické použitie

5.1 Súprava 1

A) 40,0 g F-pankreatinu sa vloží do 400 ml vody a hodnota pH sa rýchlo prídavkom 1 N HC1 nastaví na 6,2. Za týchto podmienok sa extrahuje 1 hodinu pri 4 °C. Číry, pankreatinový extrakt obsahujúci produkt sa odstredí pri 53.000 g a následne sa sterilné prefiltruje s veľkosťou pórov 2 pm.

Extrakt sa za sterilných podmienok naplní po 25 ml dávkach do 100 ml infúznych fliaš a usuší sa vymrazením.

B) 2.0 g sójového lecitínu (98 % hmotnostných fosfatidylcholínu) sa rozpusti v 20 ml vody a homogenizuje sa ultrazvukom. Koloidný roztok sa v zatavenej sklenenej ampule sterilizuje 45 minút pri 140 °C. Z toho sa odoberie dávka s veľkosťou 12,5 ml, ktorá sa zmiesi s 1600 ml sterilizovanej vody a v dávkach po 100 ml sa naplní do infúznych fliaš.

Na použitie sa obsah jednej fľaše s obsahom pevných látok z bodu A) zmiesi s obsahom roztoku jednej fľaše z bodu B).

5.2 Súprava 2

A) 40,0 g F-pankreatinu sa vloží do 800 ml vody a hodnota pH sa rýchlo prídavkom 1 N HC1 nastaví na 6,2. Za týchto podmienok sa extrahuje 1 hodinu pri 4 °C. Číry, pankreatinový extrakt obsahujúci produkt sa odstredí pri 53.000 g a usadenina sa zahodí.

B) 32,0 g mannitu sa rozpustí v 200 ml vody, zmiesi sa s pankreatinovým extraktom získaným v bode A) a spojené roztoky sa filtračné sterilizujú.

C) 5,0 g sójového lecitínu (98 % hmotnostných fosfatidylcholínu) sa rozpustí v 50 ml vody a homogenizuje sa ultrazvukom, tento koloidný roztok sa v zatavenej sklenenej ampule sterilizuje 45 minút pri 140 °C.

D) 1000 ml podľa bodu B) získaného pankreatinového extraktu sa za sterilných podmienok zmiesi s 16 ml lecitínového roztoku, ktorý bol pripravený podľa bodu C) a usuší sa vymrazením. Získaný prášok sa v dávkach po 10,0 g sterilné naplní do 200 ml fliaš.

E) Deiónizovaná a filtračné sterilizovaná voda sa naplní za sterilných podmienok do 200 ml fliaš.

Na použitie sa obsah jednej fľaše s práškom podľa bodu D) rozpustní v obsahu fľaše naplnenej vodou podľa bodu E.

Claims

1. Použitie komplexných lipidov ako stabilizujúcich prísad proti vlhkosťou spôsobovanému poklesu lipolytickej aktivity vo vode rozpustných farmaceutických prípravkov z lipázy a proteázy obsahujúcich zmesí zažívacích enzýmov, ktoré sú vhodné na prípravu vodných roztokov na kontinuálne zavádzanie do gastrointestinálneho traktu pomocou sond, v ktorom sa ako komplexné lipidy používajú fosfolipidy, glykolipidy alebo ich zmesi.

2. Použitie komplexných lipidov podľa nároku 1, v ktorom lipázy a proteázy obsahujúce zmesi zažívacích enzýmov sú pankreatin obsahujúce zmesi zažívacích enzýmov.

3. Použitie komplexných lipidov podľa nároku 2, ktoré sú nasadené ako stabilizujúce prísady k farmaceutickým prípravkom z pankreatin obsahujúcich zmesí zažívacích enzýmov, ktoré vedľa pankreatinu obsahujú prídavné lipázy, vybrané zo skupiny, ktorá sa skladá z rastlinných lipáz, bakteriálnych lipáz a lipáz z hubových kultúr.

4. Použitie komplexných lipidov podľa nároku 1, v ktorom sa ako komplexné lipidy používajú fosfolipidy alebo tieto fosfolipidy obsahujúce lipidové zmesi.

5. Použitie komplexných lipidov podľa nároku 4, v ktorom sa ako fosfolipidy používajú soli aniónov všeobecného vzorca (I),

kde

R¹ znamená vodík alebo alkanoylový zvyšok s 10 až 25 uhlíkovými atómami, ktorého uhľovodíkový zvyšok prípadne obsahuje 1 až 4 dvojité väzby,

R² znamená vodík alebo alkanoylový zvyšok s 10 až 25 uhlíkovými atómami, ktorého uhlíkový zvyšok prípadne obsahuje 1 až 4 dvojité väzby, alebo ak R^] nepredstavuje vodík, tak môže znamenať vodík,

R³ znamená vodík, nižšiu alkylovú skupinu, ktorá je prípadne substituovaná skupinou amino, nižšou trialkylamonio, karboxylovou skupinou viazanou na uhlíkový atóm nesúci aminofunkciu alebo hydroxy substituovanou cykloalkylskupinou,

R⁴ znamená vodík alebo uhľovodíkový reťazec s 10 až 25 uhlíkovými atómami, ktorý prípadne obsahuje 1 až 4 dvojité väzby,

A zastupuje kyslík alebo NH, s fyziologicky prijateľnými katiónmi alebo ich zmesami.

6. Použitie komplexných lipidov podľa nároku 5, v ktorom je vo fosfolipidoch všeobecného vzorca (I) zvyšok R³vybratý zo skupiny, ktorá pozostáva z vodíka, aminoetylu, cholylu, serylu, glycerylu alebo myo-inositylu.

7. Použitie komplexných lipidov podľa nároku 6, v ktorom sú fosfolipidy vybraté zo skupiny, ktorá pozostáva z kyseliny fosfatidovej, fosfatidylcholínu, fosfatidylserínu, fosfatidyletanolamínu, fosfatidylinostiu a sfingomyelinu alebo zmesí s obsahom týchto látok.

8. Použitie komplexných lipidov podľa nároku 1, v ktorom sa ako komplexné lipidy používajú lecitiny zo sójových bôbov, repky, kukurice, slnečníc, arašidov, slepačích vajec alebo mikroorgnizmov.

9. Použitie komplexných lipidov podľa nároku 8, v ktorom sa ako komplexné lipidy používajú lecitiny zo sójových bôbov.

10. Použitie komplexných lipidov podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov 2 až 9, v ktorom sa lipidy pridávajú k pankreatinu nasadenému vo farmaceutických prípravkoch už pri jeho získavaní alebo spracovaní na stabilizovanie proti poklesu lipolytickej aktivity počas procesných krokov, ktoré sú spojené so spracovaním za vlhka.

11. Vo vode rozpustné farmaceutické prípravky z lipázy a proteázy obsahujúcich zmesí zažívacích enzýmov, ktoré sú vhodné na prípravu vodných roztokov na kontinuálne zavádzanie do gastrointestinálneho traktu pomocou sondovej aplikácie, vyznačujúce sa t ý m, že obsahujú dostatočné množstvo komplexných lipidov podľa nárokov 1 až 9 na stabilizovanie proti vlhkosťou spôsobovanému poklesu lipolytickej aktivity.

12. Farmaceutické prípravky podľa nároku 11, vyznačujúce sa tým, že u lipázy a proteázy obsahujúcich zmesí zažívacích enzýmov ide o pankreatin obsahujúce zmesi zažívacích enzýmov.

13. Farmaceutické prípravky podľa nároku 12, vyznačujúce sa tým, že zmesi zažívacích enzýmov obsahujú okrem pankreatinu prídavné lipázy, vybrané zo skupiny pozostávajúcej z rastlinných lipáz, bakteriálnych lipáz a lipáz z hubových kultúr.

14. Farmaceutické prípravky podľa nároku 11 až 13, vyznačujúce sa tým, že obsahujú také množstvo komplexných lipidov, že lipolytická aktivita je stabilizovaná vodnými roztokmi prípravkov tak, že lipolytická východisková aktivita vodného roztoku počas 8 hodín poklesne najviac o 20 %.

15. Farmaceutické prípravky podľa nároku 14, vyznačujúce sa tým, že obsahujú také množstvo komplexných lipidov, aby lipolytická východisková aktivita vodných roztokov prípravkov počas 24 hodín poklesla najviac o 50 %.

16. Farmaceutické prípravky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13, vyznačujúce sa tým, že obsahujú komplexné lipidy na stabilizáciu proti poklesu lipolytickej aktivity v koncentrácii od 1 do 10 % hmotnostných, výhodne od 2 do 5 % hmotnostných, vztiahnuté na zmes zažívacích enzýmov.

17. Farmaceutické prípravky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 ažl 6, vyznačujúce sa tým, obsiahnutý pankreatin je autolyticky upravený pankreatin.

18. Súprava na prípravu a kontinuálne zavádzanie do gastrointestinálneho traktu pomocou sond, proti poklesu lipolytickej aktivity stabilizovaným, bez zárodočného rastu, vhodných roztokov zmesí zažívacích enzýmov, vyznačujúca sa tým, že ako súčasti obsahuje: a) vo vode rozpustný, pevný, bezzárodkový farmaceutický prípravok lipázy a proteázy obsahujúcich zmesí zažívacích enzýmov, ktorý prípadne môže obsahovať dostatočné množstvo komplexných lipidov podľa niektorého z nárokov 1 až 9 na stabilizáciu vodných roztokov, ktoré majú byť pripravované, proti poklesu lipolytickej aktivity, a b) na prípravu vodných roztokov dostatočné množstvo bez zárodočného rastu vodného rozpúšťadla, ktoré okrem vody prípadne obsahuje fyziologicky znesiteľné soli a pomocné látky a, ak v ad a) uvedených pevných farmaceutických prípravkoch nie je obsiahnuté dostatočné množstvo komplexných lipidov na stabilizáciu vodných roztokov, ktoré majú byť pripravované, proti poklesu lipolytickej aktivity, doplnkovo obsahuje dostatočné množstvo komplexných lipidov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9, na stabilizovanie vodných roztokov, ktoré majú byť pripravované, proti poklesu lipolytickej aktivity.

19. Súprava podľa nároku 18, vyznačujúca sa t ý m , že pevný prípravok a) predstavuje vymrazením usušenú, lipázy a proteázy obsahujúcu zmes zažívacích enzýmov, ktorá prípadne obsahuje komplexné lipidy.

20. Súprava podľa nároku 19, vyznačujúca sa t ý m , že vymrazením usušená zmes zažívacích enzýmov obsahuje pankreatin.