JPH03280880A - 非水系高活性酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、医薬品工業、食品工業、農水産分野及び有機
中間原料製造分野等において、エステル類やペプチド類
等の生理活性物質、及び光学活性な有機中間原料等の製
造に使用する非水系高活性酵素に関するものである。

〔従来の技術〕

酵素の優れた特性を有機合成に、有効に利用するために
は、基質及び生成物の溶解度の点から有機溶媒の使用が
必須である。

従来、酵素を有機溶媒に懸濁させ反応させる不均一系の
反応（Ａ、Ｍ、に１ｉｂａｎｏｖ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃ
ＨＥＭＴＥＣＩ（ｌｆｉ、　３５４（１９８６）　）と
、酵素を有ｍ溶媒に完全に溶解させ反応させる均−系の
反応がある。

不均一系の反応としては、粗酵素が用いられるが、有機
溶媒に懸濁しているため、基質の酵素内部への拡散が低
く、反応性が低い。

均−系の反応としては、酵素をポリエチレングリコール
で修飾し、有機溶媒に可溶化する方法（Ｙ、Ｉｎａｄａ
　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、
Ｒｅｓ、Ｃｏ＋ｎｍｕｎ、＋−■ツ、　８４５　（１９
８４））があるが、調製方法が煩雑である。

また、酵素と脂質の複合体を形成させ、有機溶媒に可溶
化する方法（特開昭６４−８０２８２）があるが、複合
体中に含まれる酵素量が低い等の問題点かあ〔発明が解
決しようとする課題〕 本発明が解決しようとする課題は、非水系溶媒に均一に
可溶化し、かっ、エステル合成やペプチド合成等の反応
を高収率で行うことができる酵素を提供することである
。

（！１Ｂを解決するための手段〕 本発明は、酵素と界面活性剤を溶解した緩衝液に脂質を
分散させ、冷却して得られる酵素−界面活性剤−脂質複
合体からなる非水系高活性酵素である。

本発明に使用できる酵素としては、加水分解酵素、転移
酵素、酸化還元酵素、付加酵素及び異性化酵素等を挙げ
ることができる。

まず、加水分解酵素について、エステルを加水分解する
エステラーゼでは、リパーゼもしくはリパーゼを含有す
る生体組織を用いることができる。

それらは微生物により生産されたものでもよいし、動物
の臓器や植物の種子等から得られたものでもよい。

ペプチドを加水分解するペプチダーゼでは、動物由来の
ペプシン、キモトリプンン、カルボキシペプチダーゼ、
サーモライシン；植物由来のパパイン、プロメリン、ア
ミノペプチダーゼ；バクテリア由来のゲラチナーゼ、ジ
ペプチダーゼ等が挙げられる。

糟のグルコシド結合に作用するグリコシダーゼでは、α
−及びβ−グリコシダーゼ、α−及びβ−ガラクシダー
ゼ等のオリゴサンカラーゼ、α−及びβ−アミラーゼ、
セルラーゼ等のポリサッカラーゼ等が挙げられる。

リン酸結合の加水分解に関与するホスファターゼでは、
ホスホモノエステラーゼ、ホスホジェステラーゼ、ピロ
ホスファターゼ等が挙げられる。

アミド基を加水分解するアミダーゼでは、アルギナーゼ
、ウレアーゼ、グルタミナーゼ等が挙げられる。

その他の酵素としては、トランスペプチダーゼ、トラン
スグルコシダーゼ、トランスペプチダーゼ、トランスア
ミダーゼ、トランスグルタミナーゼ等の転移酵素；アル
コールデヒドロゲナーゼ、オキシゲナーゼ等の酸化還元
酵素；アコニターゼ、エノラーゼ、アスパルターゼ等の
付加酵素；イソメラーゼ等の異性化酵素等が挙げられる
。

本発明に用いられる界面活性剤は、非イオン系のものと
して、トリトンＸ−１００、ディスホームＣＡ−１１５
ｉノニオンＥ−２１５、ノニオンＰ〜２１０等のポリエ
チレングリコールモノアルキルエーテル；ノニオンＮＳ
−２１０、ノニオンＳ−２１０等のポリエチレングリコ
ール−Ｐ−アルキルフェニルエーテル；ノニオンし−４
、ノニオンＳ−６等のポリエチレングリコール脂肪酸；
スパン８０、スパン８５等のソルビタン脂肪酸；ツウィ
ーン２０、ノニオン５Ｔ−２２１等のソルビタンエステ
ルエーテル脂肪酸等が挙げられる。

ここで、ディスホームＣＡ−１１５、ノニオンＥ−２１
５、ノニオンＰ−２１０、ノニオンＮ　Ｓ−２１０、ノ
ニオンＭＳ−２０、ノニオンし−４、ノニオンＳ−６、
スパン８０、スパン８５、ツウィーン２０、ノニオン５
Ｔ−２２１は日本油脂味製の商品名である。

アニオン系のものとして、ラウリル酸、ミリスチン酸、
バルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等の脂肪酸と
その塩；オクチルマロン酸塩、ドデシルマロン酸塩等の
アルキルマロン酸塩；オクチル硫酸塩、デシル硫酸塩、
ドデシル硫酸塩等のアルカンスルホン酸塩；α−スルホ
ラウリン酸、α−スルホバルミチン酸等のα−スルホ脂
肪酸である。

カチオン系のものとして、Ｎ−ドデシルピリジニウム塩
等のＮ−アルキルピリジニウム塩、ドデシルアンモニウ
ムクロライド、セチルトリメチルアンモニウムクロライ
ド等のアルキルアンモニウム塩等が挙げられる。

本発明に用いることのできる脂質は、例えば、天然に存
在するものとしては、中性脂質では、七ツガラクトシル
ジグリセリド、ガラクトジルグルコシルジグリセリド等
のグリセロ糖脂質；モノグリコジルセラミド、セラミド
へキソシド、ガングリオシド等のスフィンゴ糖脂質；ス
テロール配糖体、カルデノリド配糖体、サポニン等のス
テロイド配糖体；ジアシルトレハロース、トリアシルグ
ルコース等の脂肪１ｆ１ｍ等を挙げることができる。

次に、アニオン性脂質では、ホスファチジルイノシトー
ル、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸等
のリン脂質、また、両性脂質では、ホスファチジルコリ
ン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジル
セリン等のリン脂質等を挙げることができる。

合成脂質としては、炭素数６〜３０の２本の炭化水素鎖
を疎水部分とし、糖等のポリヒドロキシ基、リン酸基、
スルホン酸基、アンモニウム塩等の官能基を親水部分と
して有する合成２分子膜形成化合物を用いることができ
る。

例えば、ジアルキルホスフェート、ジアルキル型ポリエ
チレングリコール、ジアルキルスルホコハク酸、ジアル
キル型糖脂質、ジアルキルアンモニウム塩等を挙げるこ
とができる。

本発明の非水系高活性酵素を得る方法としては、例えば
、酵素をｐＨ５，０〜９．０の緩衝液に溶解させておき
、これに、緩衝液に溶解させた界面活性剤を冷却下に滴
下し、混合させる。

脂質は少量のメタノール、エタノール、プロパツール、
アセトン、メチルエチルケトン、その他の親水性を機溶
媒に溶解し、または緩衝液に溶解し、またはそのまま用
いる。

脂質の分散方法は、攪拌羽根やマグネチ、クスタラー、
ホモミキサー等の攪拌装置を用いてもよいし、超音波を
かけて分散させてもよい。

脂質を十分に分散後、０〜３０’Ｃ１好ましくは、０〜
１０“Ｃにて冷却を行い、酵素−界面活性剤−脂質複合
体を析出し、沈澱させる。　この沈澱を遠心分離または
濾過等により分離した後、緩衝液、次いで蒸留水で洗浄
し、そのまま凍結乾燥や流動層乾燥し、または、少量の
蒸留水に分散させた後に、スプレー乾燥することにより
、粉末状の非水系高活性酵素を得ることができる。

界面活性剤と酵素のそれぞれの固体重量の混合比は、０
．００１〜１０００　（界面活性剤重量／酵素重量）で
あり、脂質と酵素のそれぞれの固体重量の混合比は、０
．２〜１００（脂質重量／酵素重りの範囲で行うことが
好ましい。

二発明の効果： 本発明により得ら２する非水系高活性酵素は、従来の酵
素で：よ酵素活性が著しく低下する有＠溶媒中の反応に
おいて、高い酵素活性を保持することができる。

また、水が存在する系では困難なエステル化やエステル
交換反応も、本発明の酵素では、逆反応が起こり得ない
ために、非水系で高収率を上げることが可能になった。

さらに、この酵素を得る方法も、混合、分離、乾燥と技
術的に非常に簡単な工程でよく、従来の方法よりも容易
に製造することができる。

また、従来の酵素−脂質複合体に比べ、複合体中の酵素
含有率が高くなるので、酵素の回収率を向上することが
できる。

その原因としては、界面活性剤が、酵素と脂質の結合を
促進するバインダーとして働き、酵素−界面活性剤−脂
質の３層構造を形成しているためであると推定される。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により、詳細に説明する。

実施例１ キャンディダ・ンリンドラセ（Ｃａｎｄｉｄ　Ｃｙｌｉ
ｎ−ｄｒａＣｅａ　）由来のリパーゼ５０＋ｎｇを酢ｃ
ｌｉｌ衝？ａ　（０，０１Ｍ、　ｐ　Ｈ６，０）　２５
ｄに溶解後、遠心沈降させて、不溶物を除いた（ａ液）
。　非イオン界面活性剤（ツウィーン２０：商品名、日
本油脂■製）５０■を酢酸緩衝液（０，ＯＩＭ、　ｐ　
Ｈ６，０）　２５ｍｆｌに溶解した（ｂ液）。　　ａ液
にｂｔＬを４°Ｃに冷却しながら滴下し、１時間攪拌し
た（Ｃ液）。

また、非イオン脂質（ショ糖ジステアリン酸エステル）
５０■をエタノール０．５ｍｆｔにン容解した（ｄ液）
。　　Ｃ液にｄ液を４°Ｃに冷却しながら滴下し、撹拌
して、滴下後、５℃で２４時間放置した。

放置後、白色沈澱が生成した溶液を遠心分離させ、上澄
液を取り除き、残った固体を酢酸緩衝液で２回、蒸留水
で１回洗浄した。その後、この固体を凍結乾燥させ、２
１．０ｍｇの粉末を得た。

得られた酵素−界面活性剤−脂質複合体は、し■スペク
トルと元素分析器こよって酵素を同定した。

この複合体は、水に不溶でベンゼン、クロロホルムの有
機溶媒に可溶であった。　この複合体に含有する酵素量
は２０．９重量％であった。

次に、この酵素−界面活性剤−脂質複合体１．６■をト
リブチリンＩＩｄに溶解させ、さらに、オクタツール１
．５２Ｍを溶解し、水分含量が１容量％になるように水
を添加した。その後、２２°Ｃにて３０分間攪拌した。

　生成した酢酸オクチルをガスクロマトグラフ分析によ
り測定した。

この値から次の式で合成率を求めた。

合成率（χ）＝ した　　オクチル　　　Ｍ×００ オクタツールの初期濃度（Ｍ） 第１表に、複合体の収量、複合体中の酵素含育量及び合
成率を示す。

比較例１ ｂ液を添加せずに実施例１と同様の操作を行った。得ら
れた酵素−脂質複合体の収量は１３．０ｍｇ、この複合
体に含有する酵素量は９．６重量％であり、また、合成
率は】１．７％であった。

実施例２ 実施例１で用いた界面活性剤に代えて、第１表に示す界
面活性剤５０■を酢酸ｌ！衝液（０，０１Ｍ、ｐ　Ｈ６
，０）　２５！ｄに溶解し、ｂ液とした。

以下、実施例１と同様の操作により白色の粉末を得た。

　その結果を第１表に示す。

実施例３ 実施例１で用いた界面活性剤に代えて、トリトンＸ−１
００（関東化学■製）１０■を酢酸緩衝液（０，０１Ｍ
、　ｐ　Ｈ６，０）　２５ｄに溶解し、ｂ液とした。

以下、実施例１と同様の操作により白色粉末を２２．０
■得た。　その結果を第２表に示す。

比較例２ ｂ液を添加せずに実施例２と同様の操作を行った。　そ
の結果を第２表に示す。

以上の結果より、明らかに、酵素−脂質複合体に比べ、
本発明による酵素−界面活性剤−脂質複合体の方が優れ
ていることがわかる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）、酵素と界面活性剤を溶解した緩衝液に脂質を分
   散させ、冷却して得られる酵素−界面活性剤−脂質複合
   体からなる非水系高活性酵素。
2. （２）、酵素の重量に対する界面活性剤の重量の比が、
   ０．００１〜１０００（界面活性剤重量／酵素重量）で
   あり、酵素の重量に対する脂質の重量の比が、０．２〜
   １００（脂質重量／酵素重量）である請求項１記載の非
   水系高活性酵素。