WO1995017504A1 - Verfahren zur erhöhung der aktivität von hydrolytischen enzymen - Google Patents

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Bernhard Hauer
Wolfgang Ladner
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    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase

Definitions

  • the present invention describes a method for increasing the activity of hydrolytic enzymes in organic solvents.
  • Akita et al. (Chem. Pharm. Bull. 41, 12-20, 1993 and older work cited there) describe the production, structure and use of phospholipid-lipase aggregates.
  • the phospholipid-lipase aggregate is produced by adding a phospholipid to a lipase solution in water and then working up, including lyophilization. Both in the case of enantioselective hydrolysis of an ester and in the case of enantioselective acylation of an alcohol, the reaction catalyzed by phospholipid-lipase aggregates is at most a factor of 2 faster than the reaction catalyzed by untreated lipase. Since these reactions are carried out with an enzyme to substrate weight ratio of 1: 1 (reaction time 3 days at 33 ° C.), they are completely unsuitable for a process on an industrial scale.
  • the object of the present invention was to provide a method for increasing the activity of hydrolytic enzymes in organic solvents.
  • the activity of hydrolytic enzymes in organic solvents can be increased by mixing the hydrolytic enzyme dissolved in an aqueous medium with a surface-active substance which does not consist of a phospholipid, and then dehydrating the mixture obtained and the enzyme preparation thus obtained is used as a catalyst in organic solvents.
  • the method according to the invention is suitable for all hydrolytic enzymes (hydrolases), in particular for proteases and esterases (lipases).
  • hydrolases hydrolytic enzymes
  • proteases and esterases lipases
  • Bacterial lipases for example those from Pseudomonads, are particularly suitable.
  • Such molecules have at least one group with affinity for substances of strong polarity - which generally causes solubility in water - and another group with lower affinity for water.
  • Such surface-active substances are also known to the person skilled in the art under the name surfactants and are defined, for example, in DIN 53900.
  • Suitable surface-active substances are anionic surfactants such as alkyl or alkylaryl carboxylates, sulfonates, in particular alkylbenzenesulfonates, sulfates, in particular ether sulfates and fatty alcohol (ether) sulfates, cationic surfactants such as straight-chain or cyclic ammonium compounds, nonionic surfactants such as polyethers, in particular alkylphenol polyoxylation, products of ethoxylates Fatty acids, fatty amines, fatty acid amides and fatty alcohols, also amine oxides and fatty acid esters of polyalcohols, ampholytic surfactants, which combine anion-active and cation-active hydrophilic groups as zwitterions. Mixtures of the abovementioned compounds are also suitable as surface-active substance according to the present invention.
  • Free fatty acids or salts of the fatty acids are particularly suitable as surface-active substances.
  • Suitable surfactants are fatty acids with a chain length of about 10 to 30 carbon atoms (C10-C30).
  • the fatty acids can be saturated or also one or more unsaturated. Both straight-chain and branched fatty acids are suitable.
  • the fatty acids occurring in natural fats, for example myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidonic acid, can be used with great success as a surface-active substance for the process according to the invention.
  • the sodium or potassium salts of such fatty acids are particularly suitable since they can be dissolved in the aqueous enzyme solution and thus an intimate mixing with the enzyme can easily be carried out.
  • Suitable surface-active substances are fatty acid derivatives, in particular esters from fatty acids and alkyl alcohols, preferably from alcohols with a chain length of one to four carbon atoms.
  • Mixtures of several fatty acids or their salts such as are obtained, for example, from the hydrolysis of natural fats or oils, can also be used as the surface-active substance for the process according to the invention.
  • the amount of surface-active substance added can be varied in wide ranges. An amount of 10-200% by weight of surface-active substance, based on the amount of enzyme, is preferred. If the addition is low, the enzyme activation is proportional to the amount of surface-active substance added. Enzyme activation reaches its maximum value at about 100-200% by weight. An amount of more than 200% by weight generally has no further effect on enzyme activation.
  • the hydrolytic enzyme is dissolved in an aqueous medium, usually in an aqueous buffer.
  • the surface-active substance is added to this solution.
  • the surface-active substance also dissolves in the aqueous medium, stirring the homogeneous solution is sufficient for mixing the enzyme with the surface-active substance.
  • the temperature in this reaction is usually room temperature. Depending on the thermal stability of the enzyme, however, higher or lower reaction temperatures are also indicated.
  • the surface-active substance cannot be dissolved in the aqueous medium, thorough mixing until the formation of an emulsion is advantageous. This can be achieved, for example, by vigorous shaking, beating, stirring, turbulent mixing, homogenization or generation of vibrations.
  • a dispersing device e.g. Ultra Turax.
  • the resulting mixture is dewatered. This can be carried out using all methods known to the person skilled in the art. Spray drying and freeze drying are particularly suitable for this. In hydrolytic enzymes that are easily thermally inactivated, freeze drying is recommended as a gentle drainage method.
  • the mixture of enzyme and surface-active substance which has been freed from the aqueous medium and is generally in the form of a dry powder, can then be used as a catalyst in organic solvents.
  • the method according to the invention is also suitable for use with immobilized enzymes.
  • the enzymes produced with this method according to the invention can also be recycled very well.
  • the enzymes can be easily, e.g. by filtration, isolate from the organic solvent. Using the process according to the invention, highly active catalysts can be produced again from the enzymes isolated in this way.
  • the invention further relates to compositions comprising a hydrolytic enzyme and one or more fatty acid derivatives which can be obtained by the process described above.
  • the agents according to the invention are outstandingly suitable as catalysts for chemical syntheses in organic solvents such as esterifications, transesterifications, amidations, hydrolysis of carboxylic acid derivatives and similar reactions.
  • lipase 50 mg was dissolved in 5 ml of water and the corresponding fatty acid (Tab. 1) was added. The mixture was then mixed thoroughly, frozen and lyophilized overnight.
  • the reaction was started by adding 10 or 100 mg of lipase.
  • the sales trend was determined by GC.
  • the activity of the enzyme preparation was determined from the initial reaction rate (conversion ⁇ 10% with enzyme saturation).
  • the unit 1U defines 1 ⁇ mol of ester formed per minute.
  • the enzymes activated by the method according to the invention have an activity in the range from 50 to 100 U / mg and are thus by a factor of 87 to 500 more active than the untreated enzymes.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Aktivität von hydrolytischen Enzymen in organischen Lösungsmitteln, dadurch gekennzeichnet, daß das in wässrigem Medium gelöste hydrolytische Enzym mit einer oberflächenaktiven Substanz, die nicht aus einem Phospholipid besteht, vermischt wird, die erhaltene Mischung anschließend entwässert wird und das so erhaltene Enzympräparat als Katalysator in organischen Lösungsmitteln eingesetzt wird, sowie Mittel enthaltend ein hydrolytisches Enzym und ein oder mehrere Fettsäurederivate.

Description

Verfahren zur Erhöhung der Aktivität von hydroly ischen Enzymen
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Erhöhung der Aktivität von hydrolytischen Enzymen in organischen Lösungs¬ mitteln.
Enzymkatalysierte Reaktionen in organischen Lösungsmitteln haben sich in den letzten Jahren zu einer Standardmethode der organi¬ schen Synthese entwickelt (K. Faber, Biotransformations in Organic Chemistry, Springer Verlag, 1992) . Verglichen mit den Reaktionen in wäßrigen Lösung bietet der Einsatz organischer Lösungsmittel einige Vorteile wie erhöhte Enzymstabilität, verän¬ derte Enzymselektivität, gute Substratlöslichkeit, leichte Ab¬ trennbarkeit des unlöslichen Enzyms oder Verschiebung von Reak- tionsgleichgewichten.
Ein bedeutender Nachteil beim Einsatz von Enzymen in organischen Lösungsmitteln ist, daß das Enzym eine um Größenordnungen gerin¬ gere Aktivität als in wäßriger Umgebung aufweist.
Monot et al. (Appl. Mirobiol. Biotechnol. 39, 483, 1993) berich- ten, daß sich die Aktivität einer Lipase in organischen Lösungs¬ mitteln steigern läßt, wenn man zu einer Lösung der Lipase in Wasser das entsprechende Substrat zusetzt und die Lösung an¬ schließend gefriertrocknet.
Dabulis und Klibanov (Biotechnology and Bioengineering
41,566-571, 1993) beschreiben die Erhöhung der Aktivität von Enzymen in organischen Lösungsmitteln durch Zusatz sogenannter Lyoprotectanten zur Lösung des Enzyms in Wasser vor der Gefrier¬ trocknung. Als Lyoprotectanten werden N-Actetyl-phenylalaninamid, Sorbitol, Zucker sowie Polyethylenglykol genannt.
Akita et al. (Chem. Pharm. Bull. 41, 12-20, 1993 sowie dort zitierte ältere Arbeiten) beschreiben die Herstellung, Struktur und Verwendung von Phospholipid-Lipase Aggregaten. Das Phospholi- pid-Lipase Aggregat wird hergestellt durch Zusatz eines Phospho- lipids zu einer Lipaselösung in Wasser und anschließende Aufar¬ beitung einschließlich Lyophilisation. Sowohl bei einer enantio- selektiven Hydrolyse eines Esters als auch bei der enantioselek- tiven Acylierung eines Alkohols ist die durch Phospholipid-Lipase Aggregate katalysierte Reaktion maximal um den Faktor 2 schneller gegenüber der durch unbehandelte Lipase katalysierten Reaktion. Da diese Reaktionen mit einem Enzym- zu Substratgewichtsverhält¬ nis von 1:1 (Reaktionszeit 3 Tage bei 33°C) durchgeführt werden, sind sie für einen Prozeß im technischen Maßstab völlig ungeeig¬ net.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein Verfahren zur Erhöhung der Aktivität von hydrolytischen Enzymen in organischen Lösungsmitteln bereitzustellen.
Demgemäß wurde gefunden, daß sich die Aktivität von hydrolyti¬ schen Enzymen in organischen Lösungsmitteln dadurch steigern läßt, daß das in wäßrigem Medium gelöste hydrolytische Enzym mit einer oberflächenaktiven Substanz, die nicht aus einem Phospholi¬ pid besteht, vermischt wird, die erhaltene Mischung anschließend entwässert wird und das so erhaltene Enzympräparat als Katalysa¬ tor in organischen Lösungsmitteln eingesetzt wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich für alle hydrolyti¬ schen Enzyme (Hydrolasen) , insbesondere für Proteasen und Esterasen (Lipasen) . Besonders geeignet sind bakterielle Lipasen, beispielsweise solche aus Pseudomonaden.
Als oberflächenaktive Substanz können für das erfindungsgemäße Verfahren solche Verbindungen eingesetzt werden, die in einer Flüssigkeit gelöst oder dispergiert, an einer Grenzfläche bevor¬ zugt adsorbiert werden. Solche Moleküle besitzen wenigstens eine Gruppe mit Affinität zu Substanzen starker Polarität - wodurch im allgemeinen die Löslichkeit in Wasser verursacht wird - und eine weitere Gruppe mit geringerer Affinität zu Wasser.
Solche oberflächenaktiven Substanzen sind dem Fachmann auch unter der Bezeichnung Tenside bekannt und sind beispielsweise in DIN 53900 definiert.
Geeignete oberflächenaktive Substanzen sind anionische Tenside wie Alkyl- oder Alkylarylcarboxylate, -sulfonate, insbesondere Alkylbenzolsulfonate, -sulfate, insbesondere Ethersulfate und Fettalkohol(ether) sulfate, kationische Tenside wie geradkettige oder cyclische Ammoniumverbindungen, nichtionische Tenside wie Polyether, insbesondere Alkylphenolpolyglykolether, Produkte der Ethoxylierung von Fettsäuren, Fettaminen, Fettsäureamiden und Fettalkoholen, ferner Aminoxide und Fettsäureester von Poly- alkoholen, ampholytische Tenside, die als Zwitterionen anionen- aktive und kationenaktive hydrophile Gruppen in sich vereinigen. Auch Mischungen der oben genannten Verbindungen sind als ober¬ flächenaktive Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet.
Als oberflächenaktive Substanz besonders geeignet sind freie Fettsäuren oder Salze der Fettsäuren, insbesondere Alkalimetall¬ salze.
Gut geeignete oberflächenaktive Substanzen sind Fettsäuren mit einer Kettenlänge von etwa 10 bis 30 Kohlenstoffatomen (C10-C30). Die Fettsäuren können gesättigt oder auch ein- oder mehrfach un¬ gesättigt sein. Geeignet sind sowohl geradkettige als auch ver¬ zweigte Fettsäuren. Die in natürlichen Fetten vorkommenden Fett¬ säuren beispielsweise Myristinsäure, Palmitins ure, Stearinsäure, Ölsäure, Linolsäure, Linolensäure, Arachidonsäure sind für das erfindungsgemäße Verfahren als oberflächenaktive Substanz mit gu¬ tem Erfolg einsetzbar.
Besonders geeignet sind die Natrium- oder Kaliumsalze solcher Fettsäuren, da sie sich in der wäßrigen Enzymlösung lösen lassen und somit eine innige Durchmischung mit dem Enzym leicht durch¬ führbar ist.
Weitere geeignete oberflächenaktive Substanzen sind Fettsäurede¬ rivate, insbesondere Ester aus Fettsäuren und Alkylalkoholen, be- vorzugt aus Alkoholen mit einer Kettenlänge von ein bis vier Kohlenstoffatomen.
Für das erfindungsgemäße Verfahren können als oberflächenaktive Substanz auch Mischungen von mehreren Fettsäuren bzw. deren Salze, wie sie beispielsweise bei der Hydrolyse natürlicher Fette oder Öle anfallen, eingesetzt werden.
Die zugesetzte Menge an oberflächenaktiver Substanz kann in wei¬ ten Bereichen variiert werden. Bevorzugt ist eine Menge von 10 - 200 Gew.% oberflächenaktiver Substanz bezogen auf Enzymmenge. Bei niedriger Zugabe ist die Enzymaktivierung proportional zur zuge¬ gebenen Menge an oberflächenaktiver Substanz. Die Enzymaktivie¬ rung erreicht bei etwa 100 - 200 Gew.% ihren Maximalwert. Eine Menge von mehr als 200 Gew.% hat in der Regel keinen darüber hin- ausgehenden Effekt auf die Enzymaktivierung.
Für das erfindungsgemäße Verfahren wird das hydrolytische Enzym in einem wäßrigen Medium, in der Regel in einem wäßrigen Puffer gelöst. Zu dieser Lösung wird die oberflächenaktive Substanz zu- gegeben. Löst sich die oberflächenaktive Substanz ebenfalls in dem wäßrigen Medium, so genügt für die Mischung des Enzyms mit der oberflächenaktiven Substanz Rühren der homogenen Lösung.
Die Temperatur bei dieser Reaktion ist in der Regel Raumtempera- tur. Je nach thermischer Stabilität des Enzyms sind jedoch auch höhere bzw. niedrigere Reaktionstemperaturen angezeigt.
Falls sich die oberflächenaktive Substanz nicht in dem wäßrigen Medium lösen läßt, ist eine starke Durchmischung bis zur Emul- sionsbildung vorteilhaft. Dies läßt sich beispielsweise durch starkes Schütteln, Schlagen, Rühren, turbulentes Mischen, Homoge¬ nisation oder Schwingungserzeugung erreichen. Hierfür gut geei¬ gnet ist die Verwendung eines Dispergiergeräts, z.B. Ultra-Tur- rax.
Nach dem Mischen des hydrolytischen Enzyms mit der oberflächen¬ aktiven Substanz wird die entstandene Mischung entwässert. Dies läßt sich mit allen dem Fachmann geläufigen Methoden durch¬ führen. Gut geeignet ist hierfür die Sprühtrocknung und die Ge- friertrocknung. Bei hydrolytischen Enzymen, die leicht thermisch inaktiviert werden, empfiehlt sich die Gefriertrocknung als scho¬ nende Entwässerungsmethode.
Die vom wäßrigen Medium befreite Mischung aus Enzym und ober- flächenaktiver Substanz, die in der Regel als trockenes Pulver vorliegt, ist anschließend als Katalysator in organischen Lösungsmitteln einsatzfähig.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich auch zur Verwendung bei immobilisierten Enzymen.
Die mit diesem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Enzyme lassen sich auch hervorragend rezyklisieren.
Nachdem die enzymkatalysierte Reaktion beendet ist, lassen sich die Enzyme leicht, z.B. durch Filtration, aus dem organischen Lösungsmittel isolieren. Aus den so isolierten Enzyme können mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens wieder hochaktive Katalysatoren hergestellt werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Mittel, enthaltend ein hydrolytisches Enzym und ein oder mehrere FettSäurederivate, die nach dem oben beschriebenen Verfahren erhältlich sind. Die erfindungsgemäßen Mittel eignen sich hervorragend als Katalysatoren für chemische Synthesen in organischen Lösungs¬ mitteln wie Veresterungen, Umesterungen, Amidierungen, Hydrolyse von Carbonsäurederivaten und ähnliche Reaktionen.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Veranschaulichung der Erfindung.
Beispiel 1
Lipase-katalysierte Acylierung eines Alkohols mit Vinylpropionat
Figure imgf000007_0001
(1 ) (2 )
0
Figure imgf000007_0002
10 mMol (1,57 g) Chlorhydrin (1) und 10 mMol (1,086 ml) Vinyl¬ propionat wurden in 30 ml Methyl-tert.-butylether (MTBE) gelöst. Durch Zusatz der Enzyπ räparation wurde die Reaktion gestartet. Der Fortschritt der Reaktion wurde per GC ermittelt.
Herstellung der Enzympräparation:
50 mg Lipase wurden in 5 ml Wasser gelöst und mit der entspre- chenden Fettsäure (Tab.l) versetzt. Anschließend wurde intensiv durchmischt, eingefroren und über Nacht lyophilisiert.
Als Lipasen wurden die kommerziell erhältliche Amano P® Lipase (Aktivität 100 U/mg) oder eine Lipase aus Pseudomonas spec. DSM 6535 verwendet (hergestellt und gereinigt wie in WO 93/00924 be¬ schrieben, Enzymgehalt ca. 60%, Aktivität 2000 U/mg) .
Die Ergebnisse der Umsetzungen sind in Tab.l aufgeführt. Exp. Nr. Lipase Fettsäure(-deriva ) Menge Umsatz nach 60 min (%)
1 Amano P* - - 0 *
2 Amano P® Ölsäure 50 mg 3,3
3 Ps. spec. - - 0 **
4 Ps. spec. Ölsäure 25 mg 37,2
5 Ps. spec. Linolsäure 25 mg 38,5
6 Ps. spec. Linolensäure 25 mg 44,2 0 7 Ps. spec. Linolsäure 5 mg 0
8 Ps. spec. Linolsäure 25 mg 2,4
9 Ps. spec. Linolsäure 100 mg 33,1
10 Ps. spec. Linolsäure 100 mg 44,2
15 11 Ps. spec. Ölsäure 50 mg 26,1
12 Ps. spec. Na-Oleat 50 mg 50,0
* Umsatz nach 24 h: 1,8 % ** Umsatz nach 24 h: 4 % 0 Beispiel 2
Verwendung einer weiter aufgereinigten Lipase aus Pseudomonas spec. DSM 6535 (Enzymgehalt ca. 90%, Aktivität 3000 U/mg) zur en- zymatischen Katalyse.
25
Die in Beispiel 1 beschriebene Reaktion wurde mit folgenden Ver¬ änderungen ausgeführt:
30 mMol (1)
30 30 mMol (2) 30 ml MTBE (Lösungsmittel)
Herstellung der Enzympräparation:
35 50 mg Lipase wurden in 5 ml Wasser gelöst und mit der entspre¬ chenden oberflächenaktiven Substanz (Tab.2) versetzt. Anschlie¬ ßend wurde intensiv durchmischt, eingefroren und über Nacht lyophilisiert.
40
45 ie Ergebnisse der Umsetzungen sind in Tab.2 aufgeführt.
Exp. Nr. oberflächenaktive Menge Umsatz nach Substanz 30 min (%)
13 - - 0 *
14 Na-Oleat 5 mg 0,7
15 Na-Oleat 10 mg 39,7
16 Na-Oleat 20 mg 41,7
17 Na-Oleat 30 mg 49,5
18 Na-Oleat 40 mg 49,3
19 Na-Oleat 50 mg 48,6
20 SDS 30 mg 3,8
21 Tween 80 30 mg 33,3
22 Span 60 30 mg 0
23 Triton X 100 30 mg 22,1
* Umsatz nach 24 h: 2 %
Beispiel 3
Lipase
<§r + ^\
OH ,Λ, MTBE RT
(3 ) ( 4 )
Figure imgf000009_0001
Bestimmung der Aktivierung des hydrolytischen Enzyms
Als Testreaktion zur Bestimmung der Aktivierung des hydrolyti¬ schen Enzyms wurde folgende Reaktion gewählt:
50 mMol Benzylalkohol (3) 50 mMol Vinylpropionat (4) 50 ml MTBE Durch Zusatz von 10 bzw. 100 mg Lipase wurde die Reaktion gestar¬ tet. Der Umsatzverlauf wurde per GC ermittelt. Aus der Anfangs¬ reaktionsgeschwindigkeit (Umsatz < 10% bei Enzymsättigung) wurde die Aktivität der Enzympräparation ermittelt. Als Einheit 1U wird lμMol gebildeter Ester pro Minute definiert.
Lipase Aktivität (U/mg)
Amano P® 0,57
P. spec. DSM 6535 0,50 (60 %)
P. spec. DSM 6535 0,20 (90 %)
P. spec. DSM 6535 50 ... 100
(aktiviert gem. Beispiel 1 und 2)
Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren aktivierten Enzyme weisen eine Aktivität im Bereich von 50 bis 100 U/mg auf und sind somit um den Faktor 87 bis 500 aktiver als die unbehandelten Enzyme.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Erhöhung der Aktivität von hydrolytischen Enzymen in organischen Lösungsmitteln, dadurch gekennzeich¬ net, daß das in wässrigem Medium gelöste hydrolytische Enzym mit einer oberflächenaktiven Substanz, die nicht aus einem Phospholipid besteht.vermischt wird, die erhaltene Mischung anschließend entwässert wird und das so erhaltene Enzymprä- parat als Katalysator in organischen Lösungmitteln eingesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß als oberflächenaktive Substanz ein Fettsäurederivat eingesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als oberflächenaktive Substanz ein Natriumsalz einer C10-C30 Fettsäure oder eines Gemisches solcher Fettsäuren eingesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als hydrolytisches Enzym eine Lipase eingesetzt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
Entwässerung durch Lyophilisieren oder Sprühtrocknen erfolgt.
6. Mittel, enthaltend ein hydrolytisches Enzym und ein oder mehrere FettSäurederivate, erhältlich nach einem Verfahren gemäß Anspruch 2.
7. Verwendung von Mitteln gemäß Anspruch 6 zur Katalyse in organischen Lösungsmitteln.
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