JPS63105685A - グリセロホスホリルコリンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は有機溶媒中で酵素活性を保持した修飾リパーゼ
によりホスファチジルコリン（以下、ＰＣと略す）のＳ
ｎ−１位および２位の脂肪酸エステル結合を加水分解し
てグリセロホスホリルコリン（以下、ＧＰＣと略す）を
製造する方法に関する。

〔従来の技術〕

リパーゼはトリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセ
リドなどのエステル結合を加水分解する酵素の総称であ
る。従来、すい臓リパーゼおよびリゾプスリパーゼによ
りＰＣのＳｎ−１位のエステル結合が加水分解できるこ
とが知られている（例えばＢｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　１０６巻、６３８ページ、１９
６５年、およびＣｈｅｍ、　Ｐｈｙｓ、　Ｌｉｐｉｄｓ
　４巻、１５ページ、１９７０）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、このような従来のリパーゼによるＰＣの
加水分解方法では、ＰＣのＳｎ−１位のエステル結合は
加水分解するが、Ｓｎ−２位のエステル結合は加水分解
できず、リパーゼによりＧＰＣを製造することはできな
かった。このためＰＣからＧＰＣを製造するにはリパー
ゼとは異なる高価なホスホリパーゼを使用する必要があ
った。

また一般にリパーゼは水溶性であり、有機溶媒との接触
により失活するため、水溶液で加水分解を行う必要があ
るが、基質であるＰＣは水に不溶であり、この加水分解
方法は必然的に２層の不均一系となる。したがって反応
中に攪拌装置が必要であり、またＰＣによる乳化より、
加水分解物の分離、精製工程が非常に困難であるという
問題点があった。

本発明は上記問題点を解決するためのもので、ＰＣのＳ
ｎ−１位および２位のエステル結合を加水分解してＧＰ
Ｃを得ることができるとともに、有機溶媒中で反応させ
ることにより均一系で反応させることができ、しかもＧ
ＰＣの分離精製が容易なＧＰＣの製造方法を提案するこ
とを目的としている。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、末端に疎水性基を有するポリアルキレングリ
コールの活性誘導体でリパーゼ分子が部分的に置換され
た修飾リパーゼにより、有機溶媒中でホスファチジルコ
リンのＳｎ−１位および２位の脂肪酸エステルを加水分
解し、グリセロホスホリルコリンを製造することを特徴
とするグリセロホスホリルコリンの製造方法である。

本発明で使用する修飾リパーゼは特開昭６０−１５６３
９５号公報に開示されているもので、疎水性と親水性の
両性質を有す、る置換ポリアルキレングリコールの活性
誘導体で修飾されたリパーゼであり、水および有機溶媒
に可溶であって、かつリパーゼ特有の高次構造が上記ポ
リアルキレングリコールの直鎖で保護され、有機溶媒と
の接触による失活が防止されている。

上記の修飾リパーゼの調製に使用されるリパーゼとして
は種々のものがあるが、市販されているものが産業上有
利であり、すい臓リパーゼ、シュードモナスリパーゼ、
キャンディダリパーゼ、リゾプスリパーゼなどを用いる
のが良く、中でもキャンディダリパーゼは活性が高く最
も好ましい。

ポリアルキレングリコールとしては、ポリエチレングリ
コール、ポリプロピレングリコールなどをあげることが
できるが、好ましくは分子量４０００以上のポリエチレ
ングリコールがある。また疎水性基としては例えばメチ
ル基、エチル基、ヘキシル基などのアルキル基、または
フェニル基、アルキル置換フェニル基などのアリール基
をあげることができる。これらの疎水性基はポリアルキ
レングリコールの一方の末端水酸基とエーテル結合して
いる。

ポリアルキレングリコールの他の末端をリパーゼ分子に
結合させるには、酵素を担体に固定化させる方法として
は、以下に詳述するように、公知の例えばアルキル化法
、酸アジド法、ジアゾ法、縮合法等によって活性誘導体
に導き、リパーゼ中ｆの遊離のアミノ基またはカルボキ
シル基と反応させ、結合させることができる。アルキル
化法としては、トリアジン誘導体またはアセチル誘導体
に導き、活性化する方法などがあげられる。なお、以下
の記述において、Ｐ−ＯＨは末端に疎水性基を有するポ
リアルキレングリコールを示し、Ｅはリパーゼ分子を示
し、Ｅに結合するアミノ基またはカルボキシル基はリパ
ーゼ分子中の遊離基を示す。

■　アルキル化法のうちトリアジン誘導体に導く方法と
しては、Ｐ−ＯＨと塩化シアヌルとを塩基の存在下、不
活性溶媒中で反応させ、Ｐ　−ＯＨ直鎖が１または２個
結合した活性誘導体を得る。活性誘導体は緩衝液中でリ
パーゼと反応させ、リパーゼ中の遊離アミノ基と結合さ
せる。

■　アルキル化法のうちアセチル誘導体に導く方法とし
ては、Ｐ−ＯＨとブロモアセチルプロミドをジブロム酢
酸−ジオキサン中で反応させてＰ−ブロモアセテートを
得る。このアセチル誘導体をリパーゼと反応させる。ジ
ブロモ無ホコハク酸を用いて製造されるＰ−ジブロモサ
クシネートもまたリパーゼと反応させ得る。

■　酸アジド法としては、Ｐ−ＯＨをクロル酢酸無水物
、次いでジアゾメタンと反応させてＰ−酢酸メチルエー
テルを得、これをヒドラジンで処理して相当するヒドラ
ジドを得、亜硝酸ナトリウムで処理して酸アジド誘導体
を得る。この活性誘導体をリパーゼと反応させて、リパ
ーゼ中の遊離アミノ基とアミド結合させる。

（ＣＥＨ２嘔　　　　　　　　　　ＣＨ２Ｎ。

Ｐ−ＯＨＰ−０−ＣＨ２ＣＯＯＨ−一−→ＮＨ２Ｎ１（
２ Ｐ−０−ＣＨ２ＣＯＯＣＨ３Ｐ−○−ＣＨ２ＣＯＮＨＮ
Ｈ２■　ジアゾ法としては、例えばＰ−ＯＨをイサト酸
無水物と反応させてアントラニル酸エステルを得、次い
で酸性で亜硝酸ナトリウムで処理してジアゾニウム誘導
体とし、これをリパーゼとジアゾカップリングさせる。

。 ■　Ｐ−ＯＨの末端水酸基はアミノ基に変え得る。この
方法は、例えばＰ−ＯＨにトシルクロリドを反応させて
Ｐ−ＯＨ−トシレートとし、次にフタルイミド塩と反応
させて、Ｎ−Ｐ置換フタルイミドを得、これをヒドラジ
ンで処理するとω−アミノＰ−ＯＨが得られる。このア
ミノ誘導体をカルボジイミド試薬やウッドワード試薬Ｋ
によってリパーゼ中のカルボキシル基と直接結合させる
。あるいはＰ−ＯＨ−トシレートまたはハロゲン化剤を
反応させて得られるＰ−ＯＨω−プロミドをナトリウム
アジドでＰ−ＯＨω−アシトとし、水素還元して　ω−
アミノＰ−ＯＨとすることもできる。

■　またＰ−ＯＨのカルボン酸誘導体は前記方法の外に
、カリウムｔ−ブトキシドの存在下にブロモ酢酸エステ
ルを反応させ、加水分解してＰ−カルボキシメチルエー
テルを得ることができる。このカルボン酸誘導体をカル
ボジイミド試薬を利用してＮ−ヒドロキシコハク酸と反
応させて相当するコハク酸イミドエステルを得、これを
リパーゼ中のアミノ基と反応させる。

Ｐ−０−ＣＨ２ＣＯＯＨ カルボジイミド試薬 上記のようにして製造した修飾リパーゼは常法により精
製され、凍結乾燥して保存される。修飾リパーゼ中のポ
リアルキレングリコールの付加率は、未反応のアミノ基
をトリニトロベンゼンスルホン酸を用いて測定すること
ができ、リパーゼ分子中のアミノ基の約５０〜７０％に
付加したものが最も好ましい。

このような修飾リパーゼにより加水分解を行うＰＣとし
ては、大豆レシチン、卵黄レシチン等の天然レシチン、
その精製物または合成品が使用できる。

ＰＣの加水分解反応は、基質としてのＰＣおよび修飾リ
パーゼを溶解する有機溶媒、例えばベンゼン、トルエン
、キシレン、クロルベンゼン等の芳香族炭化水素７ジク
ロルメタン、クロロホルム、ジクロルエタン等のハロゲ
ン化物などの溶媒中で行われる。加水分解反応における
ＰＣ１修飾リパーゼおよび有機溶媒の量は特に制限され
ないが、一般的には有機溶媒１０００＋＋＋Ｑに対して
ｐｃｉｏ〜３０ｇ、修飾リパーゼ１〜２ｇ程度とするの
が好ましい。

上記反応は加水分解反応であるので理論量の水の添加が
必要である。反応温度はそれぞれの酵素の最適温度に維
持するのが好ましく、一般的には２０〜３０℃程度であ
る。反応時間は修飾リパーゼの活性により異なるが、一
般的には２〜４時間程度である。

上記の反応によりＰＣのＳｎ−１位および２位のエステ
ル結合が加水分解され、ＧＰＣが得られる。

この反応では修飾リパーゼを使用することにより、リパ
ーゼを有機溶媒に溶解でき、これによりＰＣ＝１１− とリパーゼを均一系で反応させることができる。

そして分解生成物であるＧＰＣは非極性溶媒には不溶で
あるので、静置すれば分層し、容易に分離が可能である
。さらに修飾リパーゼは元のリパーゼに比較して安定で
あり、長時間の反応にも使用できる。

〔発明の効果〕

本発明によれば、修飾リパーゼを用いることにより、Ｐ
ＣのＳｎ−１位および２位のエステル結合を加水分解し
てＧＰＣを得ることができるとともに、有機溶媒中で反
応させることにより均一系で反応させて反応効率を上げ
ることができ、しかも生成したＧＰＣの分離精製が容易
である。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例について説明する。

実施例１ １）　　２．４−ビス（メトキシポリオキシエチレン）
−６−クロル−５−）リアジンの合成 Ｌｏｇの無水炭酸ナトリウムを含む１００＋＋＋Ｑの無
水ベンゼンにモノメトキシポリエチレングリコール（Ｐ
Ｅ０部分の分子量５０００）　２０　ｇを溶解し、８０
℃で３０分間還流して反応させた後、２，４．６−トリ
クロル−Ｓ−トリアジン３６５ｍｇを加え、２４時間８
０℃で還流不反応させた。反応残留物を濾去し１石油エ
ーテル３００ｍｆｌを加えて生じた沈澱を数回石油エー
テルで洗い、２，４−ビス（メトキシポリオキシエチレ
ン）−６−クロル−８−トリアジンを得た。

２）修飾リパーゼの製造 リパーゼＯＦ（多糖産業（株）製品、キャンディダ・シ
リンドラッセのリパーゼ）　１０ｍｇを含むリン酸緩衝
液（ｐＨ７，０）　２　＋＋＋Ｑに、１）で得た２、４
−ビス（メトキシポリオキシエチレン）−６−クロル−
５−１−リアジン２００ｍｇを加え、室温で１時間反応
させた後、常法により精製し、リパーゼ分子中のアミノ
基の８０〜９０％が上記トリアジン誘導体で修飾された
修飾リパーゼを得た。これを水に対して十分透析し、凍
結乾燥した。

３）　　Ｓｎ−１，２−シバルミＩ−イルホスファチジ
ルコリン（以下、ＤＰＰＣと略す）の加水分解上記２）
の修飾リパーゼ０．６ｇ、　Ｄ　Ｐ　Ｐ　Ｃ９，２ｇを
水飽和ベンゼン５００＋＋＋Ｑに溶解し２５℃で反応さ
せた。

３時間反応後５００ｍＱのメタノールを加えて反応を停
止させ、脱溶媒して分解生成物を得た。これを薄層クロ
マトグラフィにて分析した結果、ＤＰＰＣの存在は認め
られず、新たにＧＰＣとパルミチン酸の領域にスポット
が認められた。この分解生成物を高速液体クロマトグラ
フィにてＤＰＰＣｌＧＰＣ、パルミチン酸の領域を分取
し、質量分析法、核磁気共鳴吸収スペクトル法、赤外吸
収スペクトル法にて、それぞれの構造を確認した。また
ライネッケ塩法によりコリンを定量した結果、分解率は
９９％であった。

実施例２ １）　カルボジイミドを用いた活性化ポリエチレングリ
コール（以下、ＰＥＧと略す）の調製平均分子量４５０
０のα−カルボキシメチル−ω−メトキシポリ（オキシ
エチレン）２．５ｇとＮ−ヒドロキシサクシンイミド７
５ｍｇを無水のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ
）１２＋ｎＱに溶解し、Ｄ　Ｍ　Ｆ　０．６ｍＵに溶か
したジシクロヘキシルカルボジイミドＣ）　１３０ｍｇ
を０℃で攪拌しながら滴下する。室温で２４時間反応さ
せた後濾過し、濾液にベンゼン１００＋＋＋ＩＱを加え
、さらに冷却しながら石油エーテル２００ｍＱを加え、
活性化ＰＥＧを沈殿させる。この沈殿をガラス濾過器で
集め、粗活性化ＰＥＧを得る。

次に再びこの粗活性化ＰＥＧをベンゼンに溶がし、石油
エーテルで再活晶させる。この操作を迅速に３回繰り返
し、精製された活性化ＰＥＧを調製する。調製後はデシ
ケータ−に入れて真空にひき、−２０℃で保存する。

２）修飾リパーゼの製造 ｌ）の活性化ＰＥＧを用いて実施例１と同様に行った。

３）　　Ｓｎ−１．２−ジラウリルホスファチジルコリ
ン（以下、ＤＬＰＣと略す）の加水分解 実施例１におけるＤＰＰＣの代りにＤＬＰＣ７、８ｇを
用い、２）の修飾リパーゼを用いた以外は同様に行った
。３時間反応後ＤＬＰＣの存在は認められず、分解率は
９９％であった。

実施例３ 大豆ｐｃの加水分解 実施例１におけるＤＰＰＣの代りに大豆より抽出精製し
たＰＣｌｏｇを用いた以外は同様に行った。

３時間反応後のｐｃの存在は認められず、分解率は９９
％であった。

比較例 リパーゼＯＦをそのまま用いて実施例１と同様にＤＰＰ
Ｃを加水分解したところ，分解率は１０％と著しぐ低か
った。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）末端に疎水性基を有するポリアルキレングリコー
   ルの活性誘導体でリパーゼ分子が部分的に置換された修
   飾リパーゼにより、有機溶媒中でホスファチジルコリン
   のＳｎ−１位および２位の脂肪酸エステルを加水分解し
   、グリセロホスホリルコリンを製造することを特徴とす
   るグリセロホスホリルコリンの製造方法。
2. （２）ポリアルキレングリコールが分子量４０００以上
   のポリエチレングリコールである特許請求の範囲第１項
   記載の方法。
3. （３）ポリアルキレングリコールの活性誘導体の末端の
   疎水性基がアルキル基またはアリール基である特許請求
   の範囲第１項または第２項記載の方法。
4. （４）ポリアルキレングリコールの活性誘導体がトリア
   ジン誘導体、アセチル誘導体、ジアゾニウム誘導体、ア
   ミノ誘導体またはカルボン酸誘導体である特許請求の範
   囲第１項ないし第３項のいずれかに記載の方法。
5. （５）修飾リパーゼは式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｒは末端に疎水性基を有するポリアルキレングリ
   コール基を示す）を有する基でリパーゼ分子のアミノ基
   が部分的に置換されたものである特許請求の範囲第１項
   記載の方法。
6. （６）修飾リパーゼはポリオキシエチレン部分が分子量
   ５０００以上の２，４−ビス（メトキシポリオキシエチ
   レン）−６−トリアジンでリパーゼ分子のアミノ基が部
   分的に置換されたものである特許請求の範囲第１項記載
   の方法。