JPS63105686A - ホスフアチジルコリンのエステル交換方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は修飾リパーゼを用いたホスファチジルコリン（
以下、ＰＣと略す）のエステル交換反応に関し、さらに
詳しくは修飾リパーゼ存在下でＰＣのアシル基を任意の
脂肪酸とエステル交換する方法に関する。

〔従来の技術〕

従来のＰＣの製造法としては、グリセロホスホリルコリ
ンと脂肪酸から酸無水物法、酸クロリド法などによりＰ
Ｃを製造する方法が知られている。

一方、リパーゼはトリグリセリド、ジグリセリド、モノ
グリセリドなどのエステル結合を加水分解する酵素の総
称であるが、すい臓リパーゼおよびリゾプスリパーゼに
よりＰＣの５ｎ−１位のエステル結合が加水分解できる
ことが知られている（例えばＢｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　１０６巻、６３８ページ、１
９６５年、およびＣｈｅｍ、　Ｐｈｙｓ、　Ｌｉｐｉｄ
ｓ　４巻、１５ページ、１９７０）　。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、上記のグリセロホスホリルコリンと脂肪
酸からＰＣを製造する方法では、例えば高度不飽和脂肪
酸などの不安定な脂肪酸をｐｃに導入しようとする場合
、脱水、縮合剤、塩酸などの触媒による脂肪酸の劣化が
著しいという問題点があった。

一方、一般に加水分解酵素は転移酵素活性をも有してお
り、リパーゼについてもトリグリセリドに対するアシル
転移活性すなわちエステル交換能を有していることが古
くから知られているが、ＰＣに対しては単に加水分解能
のみが知られ、エステル交換はできなかった。これは一
般にリパーゼは水溶性であるため有機溶媒との接触によ
り失活し、また基質であるＰＣと脂肪酸はほとんどの場
合親油性で水に不溶となるので、反応系は不均一な２層
系となり、必要以上の水が存在すると、加水分解方向へ
の平衡が傾き、エステル交換が進行しないからである。

本発明は上記問題点を解決するためのもので、ＰＣにつ
いてエステル交換を行って任意のアシル基を有する別の
ＰＣを得ることができるとともに、有機溶媒中で反応さ
せることにより、均一系で反応させることができ、しか
も加水分解を抑制することが可能なｐｃのエステル交換
方法を提案することを目的としている。

［問題点を解決するための手段〕 本発明は、末端に疎水性基を有するポリアルキレングリ
コールの活性誘導体をリパーゼ分子中に部分的に置換し
た修飾リパーゼを用いて、ホスファチジルコリンのアシ
ル基を任意の脂肪酸とエステル交換することを特徴とす
るホスファチジルコリンのエステル交換方法である。

本発明で使用する修飾リパーゼは特開昭６０＝１５６３
９５号公報に開示されているもので、疎水性と親水性の
両性質を有する置換ポリアルキレングリコールの活性誘
導体で修飾されたリパーゼであり、水およ−び有機溶媒
に可溶であって、かつリパーゼ特有の高次構造が上記ポ
リアルキレングリコールの直鎖で保護され、有機溶媒と
の接触による失活が防止されている。

上記の修飾リパーゼの調製に使用されるリパーゼとして
は種々のものがあるが、市販されているものが産業上有
利であり、すい臓リパーゼ、シュードモナスリパーゼ、
キャンディダリパーゼ、リゾプスリパーゼなどを用いる
のが良く、中でもキヤンディダリパーゼは活性が高く最
も好ましい。

ポリアルキレングリコールとしては、ポリエチレングリ
コール、ポリプロピレングリコールなどをあげることが
できるが、好ましくは分子量５０００以上のポリエチレ
ングリコールがある。また疎水性基としては例えばメチ
ル基、エチル基、ヘキシル基などのアルキル基、または
フェニル基、アルキル置換フェニル基などのアリール基
をあげることができる。これらの疎水性基はポリアルキ
レングリコールの一方の末端水酸基とエーテル結合して
いる。

ポリアルキレングリコールの他の末端をリパーゼ分子に
結合させるには、酵素を担体に固定化させる方法として
は、以下に詳述するように、公知の例えばアルキル化法
、酸アジド法、ジアゾ法、縮合法等によって活性誘導体
に導き、リパーゼ中の遊離のアミノ基またはカルボキシ
ル基と反応させ、縮合させることができる。アルキル化
法としては、トリアジン誘導体またはアセチル誘導体に
導き、活性化する方法などがあげられる。なお以下の記
述において、Ｐ−ＯＨは末端に疎水性基を有するポリア
ルキレングリコールを示し、Ｅはリパーゼ分子を示し、
Ｅに結合するアミノ基またはカルボキシル基はリパーゼ
分子中の遊離基を示す。

■　アルキル化法のうちトリアジン誘導体に導く方法と
しては、Ｐ−０）１と塩化シアヌルとを塩基の存在下、
・不活性溶媒中で反応させ、Ｐ−０）１直鎖が１または
２個結合した活性誘導体を得る。活性誘導体は緩衝液中
でリパーゼと反応させ、リパーゼ中の遊離アミノ基と結
合させる。

■　アルキル化法のうちアセチル誘導体に導く方法とし
ては、Ｐ−ＯＨとブロモアセチルプロミドをジブロム酢
酸−ジオキサン中で反応させてＰ−ブロモアセテートを
得る。このアセチル誘導体をリパーゼと反応させる。ジ
ブロモ無水コハク酸を用いて製造されるＰ−ジブロモサ
クシネートもまたリパーゼと反応させ得る。

■　酸アジド法としては、Ｐ−ＯＨをクロル酢酸無水物
、次いでジアゾメタンと反応させてＰ−酢酸メチルエー
テルを得、これをヒドラジンで処理して相当するヒドラ
ジドを得、亜硝酸ナトリウムで処理して酸アジド誘導体
を得る。この活性誘導体をリパーゼと反応させて、リパ
ーゼ中の遊離アミノ基とアミド結合させる。

（ＣＱＣＩ（２（＆ＯＣＨ２Ｎ２ Ｐ−ＯＨＰ−○−ＣＨ２ＣＯＯＨ−一→ＮＩ（２ＮＨ２ Ｐ−０−ＣＨ２ＣＯＯＣＨ，−一→Ｐ−〇−ＣＨ，Ｃ０
ＮＨＮＨ。

ＮａＮ０□Ｅ−Ｎｌ２ 一→　Ｐ−０−ＣＨ，ＣＯＮ、　　−−−→　Ｐ−０−
ＣＨ，Ｃ０ＮＨ−Ｅ■　ジアゾ法としては、例えばＰ−
ＯＨをイサト酸無水物と反応させてアントラニル酸エス
テルを得、次いで酸性で亜硝酸ナトリウムで処理してジ
アゾニウム誘導体とし、これをリパーゼとジアゾカップ
リングさせる。

■　Ｐ−ＯＨの末端水酸基はアミノ基に変え得る。

この方法は、例えばＰ−ＯＨにトシルクロリドを反応さ
せてＰ−ＯＨ−トシレートとし、次にフタルイミド塩と
反応させて、Ｎ−Ｐ置換フタルイミドを得、これをヒド
ラジンで処理するとω−アミノＰ−０１（が得られる。

このアミノ誘導体をカルボジイミド試薬やウッドワード
試薬Ｋによってリパーゼ中のカルボキシル基と直接結合
させる。あるいはＰ−ＯＨ−トシレートまたはハロゲン
化剤を反応させて得られるＰ−ＯＨω−プロミドをナト
リウムアジドでＰ−ＯＨω−アジドとし、水素還元して
ω−アミノＰ−ＯＨとすることもできる。

■　またＰ−０１（のカルボン酸誘導体は前記方法の外
に、カリウムｔ−ブトキシドの存在下にブロモ酢酸エス
テルを反応させ、加水分解してＰ−カルボキシメチルエ
ーテルを得ることができる。このカルボン酸誘導体をカ
ルボジイミド試薬を利用してＮ−ヒドロキシコハク酸と
反応させて相当するコハク酸イミドエステルを得、これ
をリパーゼ中のアミノ基と反応させる。

Ｐ−０−ＣＨ，Ｃ０ＯＨ カルボジイミド試薬 す 上記のようにして製造した修飾リパーゼは常法により精
製され、凍結乾燥して保存される。修飾リパーゼ中のポ
リアルキレングリコールの付加率は、未反応のアミノ基
をトリニトロベンゼンスルホン酸を用いて測定すること
ができ、リパーゼ分子中の７ミノ基の約５０〜７０％に
付加したものが最も好ましい。

本発明は上記により得られた修飾リパーゼのアシル転移
活性を利用してｐｃと任意の脂肪酸とのエステル交換を
行い、特定の脂肪酸を含むＰＣを製造する方法である。

本発明においてエステル交換に供するＰＣとしては、大
豆レシチン、卵黄レシチン等の天然レシチン、その精製
物または合成品が使用できる。

またエステル交換を行う脂肪酸としては任意の脂肪酸が
あるが、炭素数１〜３ｏの直鎖のものが好ましい。この
ような脂肪酸としては、例えば酢酸、プロピオン酸、酪
酸、カプロン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パリミチ
ン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸等の飽和脂
肪酸；パルミトオレイン酸、オレイン酸、エライジン酸
、エルシン酸、リノール酸、リルン酸、エイコサペンタ
エン酸、ドコサヘキサエン酸、アラキドン酸、１０゜１
２−オクタデカジエン酸、２，４−オクタデカジエン酸
、１０．１２−へブタデカジイン酸、２，４−ナノデカ
ジイン酸等の不飽和脂肪酸などがあげられる。

これらの脂肪酸はエステル交換の目的によって任意に選
択される。例えば特定の構造のアシル基を有するＰＣを
得る場合はそれに応じた脂肪酸を使用し、生理活性の高
いＰＣを得るためにはリノール酸、リルン酸、エイコサ
ペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、アラキドン酸等の
高度不飽和脂肪酸を使用し、また重合性基を有するＰＣ
を得るためには１０．．１２−オクタデカジエン酸等の
重合性基を有する脂肪酸を使用する。

ＰＣのエステル交換反応は、基質としてのＰＣおよび修
飾リパーゼを溶解する有機溶媒、例えばベンゼン、トル
エン、キシレン、クロルベンゼン等の芳香族炭化水素；
ジクロルメタン、クロロホルム、ジクロルエタン等のハ
ロゲン化物などの溶媒中で行われる。エステル交換反応
におけるＰＣ１脂肪酸、修飾リパーゼおよび有機溶媒の
量は特に制限されないが、一般的には有機溶媒１０００
＋＋＋Ｑに対してＰＣＩＯ〜３０ｇ、修飾リパーゼ１〜
２ｇ程度とし、脂肪酸は反応当量以上とするのが好まし
い。

反応温度はそれぞれの酵素の最適温度に維持するのが好
ましく、一般的には２０〜３０℃程度である。

反応時間は修飾リパーゼの活性により異なるが、一般的
には１０〜３０時間程度である。

上記の反応により、ＰＣの５ｎ−１位および（または）
２位のエステル結合にエステル交換が起こり、別のＰＣ
が生成する。この場合、一般的にはＰＣの５ｎ−１位お
よび２位にエステル交換が起こるが、立体障害がある場
合にはいずれが一方のエステル交換のみが起こる。

上記反応では、修飾リパーゼを使用することにより、リ
パーゼを有機溶媒に溶解でき、これによりＰＣ１脂肪酸
およびリパーゼを均一系で反応させることができる。ま
た非極性溶媒を用いれば水の含量を微量に調製すること
ができるので、スムーズにエステル交換反応が進行する
。さらに修飾リパーゼは元のリパーゼに比較して安定で
あり、長時間の反応にも使用できる。

こうして得られるＰＣは天然のＰＣの構造をそのまま保
持し、アシル基のみが組み換えられた構造であるため、
組み換えられたアシル基に応じた目的に使用される。例
えばアシル基の鎖長、不飽和度、結合位置を明らかにす
る目的の場合には、それらが明らかなＰＣとして薬理効
果の確認等に用いられる。またアシル基に機能性を持た
せる目的の場合、例えばアシル基が生理活性を有する高
度不飽和脂肪酸の場合には、生活活性物質として用いら
れ、アシル基が重合性基である場合には、重合用の単量
体として用いられる。

上記の方法では、修飾リパーゼを使用することにより、
リパーゼを有機溶媒に溶解でき、これによりＰＣとリパ
ーゼを均一系で反応させることができる。そして分解生
成物であるＧＰＣは非極性溶媒には不溶であるので、静
置すれば分層し、容易に分離が可能である。さらに修飾
リパーゼは元のリパーゼに比較し安定であり、長時間の
反応にも使用できる。

〔発明の効果〕

本発明によれば、修飾リパーゼを用いることにより、Ｐ
Ｃについてエステル交換を行って任意のアシル基を有す
るＰＣを得ることができるとともに、有機溶媒中で反応
させることにより均一系で反応させて反応効率を上げる
ことができ、しかも加水分解を抑制することができる。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例について説明する。

実施例１ １）　　２．４−ビス（メトキシポリオキシエチレン）
−６−クロル−ｓ−トリアジンの合成 １０ｇの無水炭酸ナトリウムを含む１００ｍｆｌの無水
ベンゼンにモノメトキシポリエチレングリコール（ＰＥ
０部分の分子量５０００）　２０ｇを溶解し、８０’Ｃ
で３０分間還流して反応させた後、２，４．６−ドリク
ロルーｓ−トリアジン３６５ｍｇを加え、２４時間８０
℃で還流不反応させた。反応残留物を濾去し、石油エー
テル３００＋＋＋Ｑを加えて生じた沈澱を数回石油エー
テルで洗い、２，４−ビス（メトキシポリオキシエチレ
ン）−６−クロル−８−トリアジンを得た。

２）修飾されたリパーゼの製造 リパーゼＯＦ（多糖産業（株）製品、キャンディダ・シ
リンドラッセのリパーゼ）　１０ｍｇを含むリン酸緩衝
液（ｐＨ７，０）　２＋Ｊに、１）で得た２、４−ビス
（メトキシポリオキシエチレン）−６−クロル−ｓ−ト
リアジン２００ｍｇを加え、室温で１時間反応させた後
、常法により精製し、リパーゼ分子中のアミノ基の８０
〜９０％が上記トリアジン誘導体で修飾された修飾リパ
ーゼを得た。これを水に対して十分透析し、凍結乾燥し
た。

３）　ジパルミトイルホスファチジルコリン（Ｄｐｐｃ
）のエステル交換 上記２）の修飾リパーゼ０．６ｇ、ジパルミトイルホス
ファチジルコリン９．２ｇおよびエイコサペンタエン酸
３０．２ｇを水飽和ベンゼン５００ｍＱに溶解し、２５
℃で反応させた。２４時間反応後５００ｍｆｌのメタノ
ールを加え反応を停止させた後、脱溶媒して分解生成物
を得た。これを高速液体クロマトグラフによりジパルミ
トイルホスファチジルコリン、エイコサペンタエン酸お
よび未同定のピークに分画し、これらについて核磁気共
鳴吸収スペクトル法、質量分析法および赤外吸収スペク
トル法により構造を調べた結果、エイコサペンタエン酸
とパルミチン酸を１個づつ含むＰＣと、エイコサペンタ
エン酸１個を含むリゾホスファチジルコリンであると同
定された。またライネッケ塩法によりコリンの定量を行
った結果、エイコサペンタエン酸含有ＰＣの生成率は約
３０％であった。

実施例２ １）カルボジイミドを用いた活性化ポリエチレングリコ
ール（以下、ＰＥＧと略す）の調製平均分子量４５００
のα−カルボキシメチル−ω−メトキシポリ（オキシエ
チレン）２．５ｇとＮ−ヒドロキシサクシンイミド７５
ｍｇを無水のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
１２ｍＭに溶解し、Ｄ　Ｍ　Ｆ　０．６Ｊに溶かしたジ
シクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）　１３０ｍｇ
を０℃で攪拌しながら滴下する。室温で２４時間反応さ
せた後濾過し、濾液にベンゼン１００ｍΩを加え、さら
に冷却しながら石油エーテル２００ｍΩを加え、活性化
ＰＥＧを沈殿させる。この沈殿をガラス濾過器で集め、
粗活性化ＰＥＧを得る。

次に再びこの粗活性化ＰＥＧをベンゼンに溶かし、石油
エーテルで再活晶させる。この操作を迅速に３回繰り返
し、精製された活性化ＰＥＧを調製する。調製後はデシ
ケータ−に入れて真空にひき、−２０℃で保存する。

２）修飾リパーゼの製造 １）の活性化ＰＥＧを用いて実施例１と同様に行った・ ３）　エステル交換 実施例１において、エイコサペンタエン酸をリノール酸
２８ｇに変え、２）の修飾リパーゼを用いたほかは同様
に行った。リノール酸とパルミチン酸を１個づつ含むＰ
Ｃが生成しており、その生成率は約４０％であった。

実施例３ 実施例１において、エイコサペンタエン酸をリルン酸２
７．８　ｇに変えたほかは同様に行った。リルン酸とパ
ルミチン酸を１個づつ含むＰＣが生成しており、その生
成率は３３％であった。

比較例 リパーゼＯＦをそのまま用いて、実施例１と同様にＤＰ
ＰＣをエステル交換反応したところ、生成率は０．１％
とほとんど反応しなかった。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）末端に疎水性基を有するポリアルキレングリコー
   ルの活性誘導体をリパーゼ分子中に部分的に置換した修
   飾リパーゼを用いて、ホスファチジルコリンのアシル基
   を任意の脂肪酸とエステル交換することを特徴とするホ
   スファチジルコリンのエステル交換方法。
2. （２）ポリアルキレングリコールが分子量５０００以上
   のポリエチレングリコールである特許請求の範囲第１項
   記載の方法。
3. （３）ポリアルキレングリコールの活性誘導体の末端の
   疎水性基がアルキル基またはアリール基である特許請求
   の範囲第１項または第２項記載の方法。
4. （４）ポリアルキレングリコールの活性誘導体がトリア
   ジン誘導体、アセチル誘導体、ジアゾニウム誘導体、ア
   ミノ誘導体またはカルボン酸誘導体である特許請求の範
   囲第１項ないし第３項のいずれかに記載の方法。
5. （５）修飾リパーゼは式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｒは末端に疎水性基を有するポリアルキレングリ
   コール基を示す）を有する基でリパーゼ分子のアミノ基
   が部分的に置換されたものである特許請求の範囲第１項
   記載の方法。
6. （６）修飾リパーゼはポリオキシエチレン部分が分子量
   ５０００以上である２，４−ビス（メトキシポリオキシ
   エチレン）−６−トリアジンでリパーゼ分子のアミノ基
   が部分的に置換されたものである特許請求の範囲第１項
   記載の方法。