KR100243554B1

KR100243554B1 - 글리세로인산 유도체로부터 라이소인지질 제조방법

Info

Publication number: KR100243554B1
Application number: KR1019970051562A
Authority: KR
Inventors: 김병기; 김주한
Original assignee: 김병기; 김주한
Priority date: 1997-10-08
Filing date: 1997-10-08
Publication date: 2000-02-01
Also published as: KR19990031028A

Abstract

본 발명은 글리세로인산 유도체로부터 라이소인지질을 제조하는 방법에 관한 것으로, 리파제, 포스포리파제 또는 에스테라제 등의 효소를 이용하거나, 진공을 이용하여, 하기 화학식(1)의 글리세로인산 유도체를 카르복실산 함유 화합물로 에스테르화하여 라이소인지질을 제조하는 것을 특징으로 하고 있다:

[화학식 1]

(여기서, X는 -CH₂CH₂N⁺(CH₃)₃, -CH₂CH₂NH₂, -CH₂CH₂(NH₃ ⁺)CO₂-,

Description

[발명의 명칭]

글리세로인산 유도체로부터 라이소인지질 제조 방법

[발명의 상세한 설명]

[발명의 목적]

[발명이 속하는 기술분야 및 그 분야의 종래기술]

본 발명은 글리세로인산 유도체로부터 라이소인지질을 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 리파제나 포스포리파제, 에스테라제 등의 효소를 이용하거나, 진공을 이용하여, 글리세로포스파티딜콜린(Glicerophosphatidylcholine; GPC), 글리세로포스파티딜에탄올아민(Glicerophosphatidylethanolamine; GPE), 글리세로포스파티딜세린(Glicerophosphatidylserine; PS), 또는 글리세로포스파티딜이노시톨(Glicerophosphatidylinositol; PI) 등의 글리세로인산 유도체를 지방산이나 각종 에스테르기 함유 화합물로 에스테르화하여 라이소인지질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

생체막을 이루는 주요 구성성분인 인지질은 스스로 배열하여 막을 형성하는 성질을 가지고 있기 때문에, 일반적으로 리포좀을 이용한 약물전달이나 진단 등에 사용되어왔다. 이와같은 인지질은 주로 자연계에서 추출하여 개질하거나 인공적으로 합성한다. 인지질의 특성은 그의 글리세롤 주쇄(backbone)에 도입된 두 개의 sn-1, sn-2 아실기 및 sn-3 위치의 인산기에 부가된 관능기의 차이에 의해 결정된다. sn-1, sn-2 위치의 아실기로 도입할 수 있는 물질은 사슬의 포화도와 사슬길이에 따라 분류할 수 있는데, 이러한 사슬의 포화도와 길이는 인지질의 결합강도 및 리포좀의 크기 등과 같은 물리적 성질에 영향을 주며, 이러한 특성은 약물전달에 있어서 경구 투여법이나 혈관 투여법 등과 같이 사용 방법에 따라 특성이 다른 전달매체를 결정하는데 중요한 역할을 한다.

한편, 자연에서 추출·정제한 인지질은 핵산 및 단백질로 오염될 가능성이 있기 때문에 이러한 인지질을 사용할 시 상당한 주의를 기울여야 하며, 특히 지방산의 구성원이 원자재에 따라 한정되는 단점이 있는 반면에, 합성 인지질의 경우는 원하는 특성을 자유롭게 조절할 수 있는 장점이 있다.

종래 라이소인지질을 제조하는 방법은, 현재 일본의 아사히 덴카 고오교 가부시끼가이샤(Ashahi Denka Kogyo K. K.)에서 실시하고 있는 것으로, 포스포리파제-A2(phospholipase A2; PLA2)를 이용하여 대두 인지질의 sn-2의 아실기를 가수분해하는 방법이 있는데, 이 방법은 에멀젼 반응계 특성상 효소 수거가 안되므로 효소를 가성소다(NaOH)나 열로 불활성화시키거나, 또는 효과를 프로테아제로 분해시킨 후 상기 프로테아제를 가열하여 역시 불활성화시키는 방법을 사용하고 있다(E.Nakai, K. Suzuki, S. Sato and M. Kato, 일본 공개 특허공보 JP 63-44,893). 즉, 상기의 제조 방법은 촉매인 효소의 회수가 안되는 단점이 있다. 이에 상기와 같은 단점을 개선하기 위한 일환으로 1994년에 라파제의 에스테르치환반응을 이용한 방법이 소개되었다(D. B . Sarney, G. Fregapane and E. V. Vulfson, J. Am. Oil Chem. Soc. vol. 71, no. 1, pp. 93-96 (1994)). 이 방법은 리파제를 이용하여 대두 인지질의 sn-1 위치에 있는 아실기를 제거하고, sn-2-LPC(sn-2-lysophosphatidylcholine)를 회수한 후, 암모니아 증기를 주입하여 자발적인 아실기 이동을 통해 sn-1-LPC를 만드는 과정을 이용하였다. 그러나, 이러한 방법도 전술한 아사히 덴카 고오교 가부시끼가이샤의 방법과 마찬가지로 아실기의 구조를 완벽하게 조절할 수 있는 방법은 아니다. 그 이유는 주로 추출한 인지질을 재료로 이용하기 때문에 아직 붙어있는 지방산은 자연상태 그대로 지방산분포를 가지고 있기 때문이다.

한편, 아실기를 임의대로 조절하기 위해서는 글리세로인산 유도체를 활성 지방산으로 에스테르화하는 방법이 있으나(C.M. Gupta, R. Radharishnan and H. G. Khorana, Proc. Natl. Acad, Sci. USA, vol. 74, no. 10, pp. 4315-4319 (1997)), 이 방법으로는 글리세로인산 유도체의 sn-1과 sn-2 위치 모두가 에스테르화 되므로, 라이소인지질을 만들기 위해서는 다시 전술한 두가지 방법중 하나를 이용하여야 한다. 또한, 지금까지의 에스테르화는 모두 지방산의 무수물이나 피리딘계열의 물질로 활성화시킨 지방산을 사용하였으며, 이와같은 물질을 사용할 때 지방산 화합물과 글리세로인산 유도체의 상용성에 문제가 있어, 전환율을 높이기 위해 GPC의 카드뮴염을 사용하게 되는데, 의료용이나 개인 생활용품, 식품 등의 주첨가제로 사용될 인지질의 용도를 생각할 때, 인체에 해로운 중금속인 카드뮴의 사용은 결코 바람직한 방법이 아니다.

[발명이 이루고자 하는 기술적 과제]

지금까지 예로써 살펴본 상기 방법들 외에 최근 리파제를 이용하여 글리세로인산을 에스테르화하여 라이소글리세로인산을 제조하는 방법이 소개되기도 하였으나(J.J.Han and J.S.Rhee, Biotechnology Letters, vol.17, no.5, pp. 531-536 1995)), 인산계 인지질 이외의 다른 인지질을 제조하기 위해서는 콜린기를 도입하는 과정을 거쳐야하며, 이후 콜린기 이외의 친수성기는 포스포리파제-디(phospholipase D)를 이용한 트랜스포스파티딜레이션(transphospatidylation)을 사용해야 한다.

이에, 본 발명자는 상기와 같은 점을 고려하여 새로운 라이소인지질 제조방법을 제시하고자 하였으며, 결국 글리세로인산 유도체로부터 라이소인지질을 제조하는 방법을 완성하게 되었다.

[발명의 구성 및 작용]

본 발명은 하기 화학식(1)의 글리세로인산 유도체에서 sn-1 위치만을 특이적으로 직접 지방산 등으로 에스테르화하는 것으로, 리파제 등 효소의 위치 특이성을 이용하거나, 진공을 이용하는 방법이다:

이다).

상기 글리세로인산 유도체는 유지회사들에서 생산되는 대표적인 부산물로 현재 그 획득이 용이하다.

이하에서, 본 발명을 상세히 살펴보기로 한다.

본 발명에서는 인지질 합성의 전구체로 지방산 등의 카르복실산 함유 화합물을 활성화시키지 않고, 산의 형태로 그대로 이용한다. 본 발명의 반응계는 반응물인 카르복실산 함유 화합물과 글리세로인산 유도체를 포함하며, 여기에 반응을 촉진시키기 위하여, 바람직하게는 리파제, 포스포리파제 또는 에스테라제 등의 효소를 사용하거나, 10 토르 이하, 바람직하게는 1밀리토르∼3토르, 보다 바람직하게는 3밀리토르∼1토르의 진공을 사용한다. 상기 효소는 고정화 담체에 고정화하여 사용하거나, 또는 고정화 효소를 사용할 수 있다. 카르복실산 함유 화합물에는 카프릴산과 카프린산, 라우릴산, 미리스틸산, 팔미틴산, 스테아린산 등의 포화 지방산, DHA(docosahexanoic acid) 또는 EPA(eicosapentaenoic acid), 아라키돈산, 리놀산, 리놀렌산, 올레산 등의 불포화 지방산이 포함되며, 이밖에도 이소부틸산, 메타아크릴산, 메틸메타아크릴산 등의 카르복실산 함유 유기화합물과, 상기 지방산 및 유기화합물의 나트륨 염, 칼슘염 등의 각종 염이나, 메틸에스테르, 에틸에스테르 등의 에스테르 화합물에 포함된다. 보조용매로는 다양한 범위의 극성도를 갖는 유기용매, 바람직하게는 디메틸포름아미드, 포름아마이드, 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, 물 또는 완충액 등의 수용성 용매를 소량 첨가할 수도 있다. 분리는 흡착컬럼을 이용하며, 흡착물질로는 주로 실리카겔을 이용한다.

대부분의 반응은 70℃ 온도에서 수행되는데, 이러한 온도는 사용되는 카르복실산에 따라 조절될 수도 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 다양한 보조용매들 중에서 디메틸포름아미드를 사용하였을 때 상대적으로 높은 수율을 얻을 수 있으며, 최적농도는 5%(w/w)이다. 지방산과 글리세로인산 유도체가 에스테르 반응을 할 때 물이 생성되므로, 생성되는 물을 제거하기 위하여 반응기에 공기, 질소, 아르곤, 또는 헬륨 등의 기체를 불어넣어 줄 수도 있다. 또한, 반응이 비교적 고온인 70℃ 등에서 수행될 시, 불필요한 산화 등을 방지하기 위하여 질소, 아르곤, 또는 헬륨 등의 비활성 기체를 불어넣어 줄 수도 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 더 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나, 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

팔미틴산 30g을 반응조에 넣고 가열하여 녹인 후에, 반응기질로서 sn-글리세로포스파티딜콜린(GPC) 3g을 반응조에 넣었다. 다시 약 3g의 뮤코미헤(Mucor mihei) 유래의 리파제를 첨가한 후 반응을 시작하였다. 112시간 후에 반응을 종결하여 88%의 수율로 라이소팔미틴글리세로인산콜린을 얻을 수 있었다.

[실시예 2]

반응기질을 GPC가 아닌 sn-글리세로포스파티딜에탄올아민(GPE)을 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 에스테르화 하였다. 즉, 팔미틴산 30g을 반응조에 넣고 가열하여 녹인 후, GPE 3g을 상기 반응조에 넣어준 다음, 다시 약 3g의 뮤코미헤 유래의 리파제를 첨가한 후 반응을 시작하였다. 24시간 후에 반응을 종결하여 68%의 수율로 라이소팔미틴글리세로인산에탄올아민을 얻을 수 있었다.

[실시예 3]

효소를 사용하지 않고 3 밀리토르의 진공을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 에스테르화 하였다. 즉, 팔미틴산 30g을 반응조에 넣고 가열하여 녹인 후, GPC 3.03g을 반응조에 넣어준 다음, 3 밀리토르의 진공을 수행하였다. 16시간 경과후에 반응을 종결하여 87%의 수율로 라이소팔미틴글리세로인산콜린을 얻을 수 있었다.

[실시예 4]

반응기질로 라우릴산을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 에스테르화 하였다. 즉, 라우릴산 5g을 반응조에 넣고 가열하여 녹인 후, GPC 0.5g과 0.5g의 뮤코미헤 유래의 리파제를 첨가한 후 반응을 시작하였다. 24시간 경과후에 반응을 종결하여 78%의 수율로 라이소팔미틴글리세로인산콜린을 얻을 수 있었다.

[실시예 5]

보조용매로 디메틸포름아미드(DMF)를 사용한 것을 제외하는, 실시예 4와 동일한 방법으로 에스테르화 하였다. 즉, 라우릴산 5g을 반응조에 넣고 가열하여 녹인 후, 250 마이크로리터의 DMF와 GPC 0.5g, 뮤코미헤 유래의 리파제 0.5g을 첨가한 후 반응을 시작하였다. 9시간 경과후에 반응을 종결하여 85%의 수율로 라이소팔미틴글리세로인산콜린을 얻을 수 있었다.

[발명의 효과]

본 발명의 잇점은 반응기질인 글리세로인산 유도체로서 유지산업의 부산물을 이용하므로 반응기질의 획득이 용이하고, 지방산을 활성화하지 않고 사용할 수 있으며, 또한 효소의 위치특이성을 이용할 수 있어, 라이소인지질을 상대적으로 높은 수율로 얻을 수 있다는데 있다.

Claims

반응기 내에 질소, 아르곤, 또는 헬륨의 불활성 기체를 불어 넣어 에스테르화 반응과정 중 불필요한 산화를 방지하면서, 리파제, 포스포리파제 또는 에스테라제의 효소를 이용하여, 하기 화학식(1)의 글리세로인산 유도체를 카르복실산 함유화합물로 에스테르화하는 것을 특징으로 하는 라이소 인지질 제조방법:

[화학식 1]

(여기서 X는 -CH₂CH₂N⁺(CH₃)₃, -CH₂CH₂NH₂, -CH₂CH₂(NH₃ ⁺)CO₂-,
이다).
제1항에 있어서, 보조용매로, 디메틸포름아미드, 포름아마이드, 아세토니트릴, 메탄올, 물 또는 완충액의 수용성 용매를 추가적으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 라이소인지질 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 효소를 고정화 담체에 고정화하여 사용하거나, 또는 고정화 효소를 사용하는 것을 특징으로 하는 라이소 인지질 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 반응기 내에 공기, 질소, 아르곤 또는 헬륨의 기체를 불어넣어, 에스테르화 반응과정 중 생성되는 물을 제거하는 것을 특징으로 하는 라이소 인지질 제조방법.