KR100293896B1 - 리파제를이용한라이소포스포리피드의제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 리파제를 이용하여 라이소포스포리피드를 제조하는 방법에 있어서, 글리세롤-3-포스페이트 유도체와 지방산 유도체를 혼합 용해하고 ; 리파제 M (뮤코 자바니쿠스 ;Mucor javanicus), 칸디다 실린드라시아 (Candida cylindracia) 리파제, 리파제 D (리조푸스 델레마 ;Rhizopus delemar), 리포자임(뮤코 미헤이 ;Mucor miehei) 으로 구성된 그룹에서 선택된 1종 이상의 리파제로 상기 혼합물과 반응시키고 ; 반응 혼합물에서 추출함을 특징으로 하는 라이소포스포리피드의 제조방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 라이소포스포리피드(lysophospholipid)의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 효소를 이용한 글리세롤-3-포스페이트(glycerol-3-phosphate) 유도체들의 에스테르화(esterification) 반응 및 트랜스에스테르화(transesterification) 반응을 통해 라이소포스포리피드를 합성하는 제조방법에 관한 것이다.
자연계에서 포스포리피드는 수종류의 지방산을 함유하고 있으며, 그들의 비율은 그 원료 및 분획 방법에 따라 달라진다. 이들을 실질적으로 적용하는 몇몇의 경우에 있어서는 특정 지방산을 함유하는 포스포리피드를 지니는 것이 요구된다. 이런 경우, 포스포리피드의 화학적 합성방법이 바람직하다. 그러나, 포스포리피드를 제조하기 위한 화학적 방법은 많은 약점을 지니고 있다. 특히 생성물이 식품이나 약품의 용도로써 이용된다면, 독성이 강하고 비싼 용매의 이용은 지양되어야 한다. 더 나아가 입체특이적 포스포리피드를 화학적으로 제조하기 위해 기질은 보호, 탈보호 및 변형이 요구된다.
라이소포스포리피드는 글리세롤 골격의 sn-1 또는 sn-2 위치에 있는 아실기가 제거된 포스포리피드이다. 라이소포스포리피드는 표면 활성 물질이고, 매우 안정적이어서 식품용 또는 화장품용 유화제로서 이용된다(Sarney, D.B., Fregapane, G., and Vulfson, E. NJ. Am. Oil. Chem. Soc.1994,71, 93; Palta, J.P. and Farag, K. M. 미합중국 특허 제5,126,155호, 1992). 또한 최근에는 이들의 생물학적 기능에 대한 연구가 활발해진데 따라 이들의 의약품 분야에 이용가능성이 확대되고 있다(Buckalew, J.V. and Rauch, A.L. 미합중국 특허 제4,746,652호, 1988).
라이소포스포리피드의 화학적 합성은 기질을 보호하기 위해 적지않은 단계를 요구한다. 슬랏붐 등(Slotboom, A.J., de Haas, G.H., 및 van Deenen, L.L.M.Chem. Phys. Lipids19671, 317)은 랙-1-스테아릴-2-벤질-3-요도도데옥시글리세롤(rac-1-stearyl-2-benzyl-3-iododeoxyglycerol)을 출발물질로 랙-1-스테아릴 라이소포스포리피드(rac-1-stearyl lysophospholipid)를 제조하였다. 그들은 글리세롤의 유리 하이드록실 그룹을 보호하기 위해 벤질 또는 트리틸(trityl) 그룹을 이용하였고 블록킹 그룹(blocking group)을 하이드로제놀라이시스(hydrogenolysis)에 의해 제거하였다. 그러나 이 방법은 매우 복잡하며 원하지 않는 부산물을 형성한다. 두 개의 하이드록실 그룹에 에스테르화된 두 개의 지방산을 지닌 포스포리피드도 부산물로서 제조된다. 그러므로, 생물학적인 방법으로 라이소포스포리피드를 제조하기 위한 많은 시도들이 행해지고 있다. 화학적 방법에 의한 합성 또는 자연계 포스포리피드의 분별에 의해 수득되어진 특이적 지방산을 지닌 원하는 포스포리피드는 포스포리파제 A2에 의해 해당 라이소포스포리피드로 가수분해된다.
라이소포스파티딕 산(lysophosphatidic acid ; LPA)의 합성인 경우에는 더 복잡하다. LPA는 포스포리파제 D에 의한 라이소포스포리피드의 가수분해 또는 포스파티딕 산 특이적 포스포리파제 A2에 의한 포스파티딕 산의 가수분해에 의해 효소학적으로 제조되어진다(Van Corven, E.J., Van Rijswijk, A., Jalink, K., Van Der Bend, R.L., Van Blitterijk, W.J., 및 Moolenaar, W.H.Biochem. J.1992,281. 163). 칼슘 이온이 보인자(cofactor)로서 필요하고 효율적인 반응조절이 포스포리파제 A2 반응을 위해 필요하다.
많은 리파제(EC-3.1.1.3)는 광범위한 기질 특이성을 지닌다. 비록 리파제의 자연계 기질이 트리글리세라이드라고 하더라도, 대부분의 이들 효소들은 다양한 화합물내에서 에스테르 결합을 파괴 및 형성하는데에 이용된다. 리파제에 의한 포스포리피드의 변형에 관련된 문헌들이 많이 있다. 스벤슨 등(Svensson, I., Adlercreutz, P., 및 Mattiasson, B.Applied Microbiol. Biotechnol.1990,33, 255)과 야기 등(Yagi, T., Nakanishi, T., Yoshizawa Y., 및 Fukui F. J.Ferment. Bioeng.1990,69, 23)은 리파제를 이용하여 포스파티딜콜린의 트랜스에스테르화 반응을 연구하였다. 트랜스에스테르화에 의한 연속적 반응기내에서의 리파제에 의한 라이소포스포리피드 합성은 사르니 등(Sarney et al. 1990)에 의해 보고되어져 있다. 라이소포스포리피드의 제조방법은 미생물, 식물 또는 동물 리파제에 의해 글리세로포스포리피드(glycerophospholipid)의 1-하이드록실 그룹의 에스테르화 반응에 의해 특정화 되어진다. 바람직하게는, 탄소수 12∼22의 포화 또는 불포화 지방산이 0.2∼5.0 몰 농도, 더욱 바람직하게는 1몰의 글리세로포스포리피드에 0.5∼2.0 몰이 이용되어진다. 양쪽 모두의 경우에서, 수분의 함량 조절은 합성 수율에 있어서 가장 중요한 요인중의 하나이다.
반응 시스템의 수분 함량은 에스테르화 반응의 평형에 영향을 주기 때문에 중요한 요인이 된다. 물은 생촉매적(biocatalytic) 에스테르화 반응동안 형성된다. 유기반응 혼합물은 수분함량 또는 농도 대신에 단일 수분 활성도(single water activity ; aw) 수치에 의해 특징되어질 수 있다. 물이 원하는 전환반응 또는 부반응에서 반응물이 되는 경우에, aw는 평형의 위치에 영향을 주는 수분 함량 활성을 결정한다. 많은 문헌들은 유기 반응계에서 생촉매화 과정 동안 aw의 연속적 조절이 수율과 반응율을 증가시킬 수 있다는 사실을 확인하였다.
칸 등(Kahn, S.A., Halling, J.P. 및 Bell, G.Enzyme Microb. Technol. 1990,12, 453)은 건조 칼럼을 통과한 빈공간(head space) 가스의 순환에 의해 반응계 빈공간의 aw를 조절하였다. 알루미늄 옥사이드 센서를 리파아제-촉매의 에스테르화 반응동안 aw를 연속적으로 모니터링하고 조절하는데 이용하였다. 그러나, 센서는 그 안정성, 민감도 및 측정 범위에 많은 제한을 지니고 있다. 또 다른 aw조절 방법은 기체 상을 통해 반응 혼합물과 접촉한 포화 염용액이 있는 용기에서 반응을 수행하는 것으로서, 그러한 포화 염용액은 수증기를 연속적으로 흡수 배출하는 것에 의해 일정한 aw를 유지할 수 있다. 스벤슨 등(Svensson et al. 1993)은 aw조절을 위한 특별한 방법을 개발하였다. 반응계에 접촉된 실리콘 튜브 안에서 포화된 염 수용액이 서서히 순환되고, 그 수증기는 튜브의 벽을 통해 이송되어지며, 따라서 반응계내의 aw는 연속적으로 조절가능해 진다. 그러나 이 시스템에서, 튜브를 통한 수분 이송율과 평형은 매우 느리고 그 장치도 다소 복잡하다.
연속적으로 aw를 조절하기 위한 또 다른 방법은 염 수화물 쌍을 이용하는 것이다. 반응동안 일정한 aw상태를 유지하기위해 염 수화물 쌍은 필요한 수분을 흡수 또는 방출함으로써 반응 혼합물 내에서의 수분 함량을 조절할 수 있다는 논문이 있다(Halling, J. P.Biothehnol. Tech.1992,6, 271). 각 종류의 염 수화물 쌍은 고유의 aw를 지닌다. 수화된 염과 그에 해당하는 저 수화물 또는 무수 형태가 함께 존재할 때에는, 그 두 가지형태의 상대량에 의해 평형 수증기압의 고정과 일정한 aw의 유지가 가능하게 된다.
본 발명자들은 종래의 방법에서 리파제를 이용하여 기질을 보호하지 않는라이소포스포리피드를 제조하기 위한 생합성 과정을 개발하였다. 또한 반응율과 그 수율을 증가시키기 위해 염 수화물 쌍을 이용하여 반응계의 aw를 조절하였다.
도 1은 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 라이소포스포리피드 생성물의 TLC 분석결과이다.
도 2는 라이소포스파티딜 콜린(LPC), 라이소포스파티딕 산(LPA) 및 라이소포스파티딜에탄올라민(LPE)의 표준품 (a)과 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 라이소포스파티딜에탄올라민(LPE) (b)의31P 스펙트럼이다.
본 발명의 목적은 리파제를 이용하여 라이소포스포리피드를 제조하기 위한 방법을 제공하는 것으로써 다음과 같은 단계를 포함하는데 ; 일반식(Ⅱ)로 표시된 글리세롤-3-포스페이트 유도체와 일반식(Ⅲ)으로 표시된 지방산 유도체를 혼합 용해하고 ; 리파제 M (뮤코 자바니쿠스 ;Mucor javanicus), 칸디다 실린드라시아 (Candida cylindracia) 리파제, 리파제 D (리조푸스 델레마 ;Rhizopus delemar), 리포자임(뮤코 미헤이 ;Mucor miehei) 으로 구성된 그룹에서 선택된 1종 이상의 리파제로 상기 혼합물과 반응시키고 ; 반응 혼합물을 추출하여 ; 일반식 (Ⅰ)로 표시된 라이소포스포리피드를 수득하는 것이다.
상기식에서,
R은 하나 또는 그 이상의 이중결합을 지닌 탄소수 6∼23의 알킬 또는
알케닐이고,
X는 콜린, 글리세롤, 세린 또는 에탄올아민이고,
Y는 수소원자, 탄소수 1∼6의 알킬, 탄소수 1∼6의 알케닐 또는
하기 일반식 (A)로 표현된 화합물이다.
상기식에서, R1과 R2는 각각 하나 또는 그 이상의 이중결합을 지닌 탄소수 6∼23의 알킬 또는 알케닐이다.
본 발명의 또 다른 목적은 더 나아가 용매, 특히 아세톤으로 추출하는 단계에서 반응 혼합물 내에서 형성된 라이소포스포리피드를 회수하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 반응 혼합물에 염 수화물 쌍을 첨가함을 특징으로 하는 방법을 제공하는 것으로 ; 상기 염 수화물 쌍은 NaB4O7·10H2O-NaB4O7·5H2O, Na4P2O7·10H2O-Na4P2O7무수물, NaBr·2H2O-NaBr 무수물, CH3COONa·3H2O-CH3COONa 무수물, NaI·2H2O-NaI 무수물, LiSO4·1H2O-LiSO4무수물로 구성된 그룹에서 선택된 1종 이상의 염 수화물 쌍이다.
본 발명의 또 다른 목적은 반응 혼합물에 유기 용매를 첨가함을 특징으로 하는 방법을 제공하는 것으로 ; 상기 유기용매는 아세토니트릴, N.N'-디메틸포름아미드, 디옥산, 2-부탄올, 디에틸에테르, 펜탄, 헥산, 사이클로헥산, 헵탄, 이소옥탄, 옥탄, 부틸아세테이트 및 에틸아세테트에서 선택된 1종 이상의 유기용매이다.
본 발명의 또 다른 목적은 반응 혼합물에 유기 용매와 염 수화물 쌍을 첨가함을 특징으로 하는 방법을 제공하는 것으로 ; 상기 유기용매는 아세토니트릴, N.N'-디메틸포름아미드, 디옥산, 2-부탄올, 디에틸에테르, 펜탄, 헥산, 사이클로헥산, 헵탄, 이소옥탄, 옥탄, 부틸아세테이트 및 에틸아세테트에서 선택된 1종 이상의 유기용매이고 ; 상기 염 수화물 쌍은 NaB4O7·10H2O-NaB4O7·5H2O, Na4P2O7·10H2O-Na4P2O7무수물, NaBr·2H2O-NaBr 무수물, CH3COONa·3H2O-CH3COONa 무수물, NaI·2H2O-NaI 무수물, LiSO4·1H2O-LiSO4무수물로 구성된 그룹에서 선택된 1종 이상의 염 수화물 쌍이다.
본 발명의 또 다른 목적은 반응 혼합물에 유기용매와 소량의 물을 첨가함을 특징으로 하는 방법을 제공하는 것으로 ; 상기 유기용매는 아세토니트릴, N.N'-디메틸포름아미드, 디옥산, 2-부탄올, 디에틸에테르, 펜탄, 헥산, 사이클로헥산, 헵탄, 이소옥탄, 옥탄, 부틸아세테이트 및 에틸아세테트에서 선택된 1종 이상의 유기용매이고 ; 물은 전체 반응 중량 대비 0.01∼20 중량%, 바람직하게는 0.1∼5 중량% 로 첨가한다.
라이소포스포리피드를 지방산을 지닌 글리세로포스포릴 골격의 리파제의 에스테르화 반응에 의해 합성한다. 이 반응은 글리세롤-3-포스페이트 유도체(Ⅱ)와 지방산 유도체 (Ⅲ)를 리파제와의 혼합 및 용해를 하여 시작한다. 리파제의 합성 활성은 물 활성, 기질의 수용성, 기질의 종류, 효소의 양 등에 영향을 받을 수 있다. 본 발명에서, 발명자들은 라이소포스포리피드를 합성하기 위한 리파제의 최적 반응 상태를 찾아내었다.
염 수화물 쌍은 반응 시스템에서 수분의 함량을 조절하는데 매우 유용하다. 반응 시스템에서 수분 함량의 조절이 중요한 이유는 다음과 같다. 물은 에스테르화 반응의 생성물 중의 하나이다. 그러므로, 반응을 진행시키기 위해서는 물을 제거해야만 한다. 그러나 낮은 수분함량은 효소활성의 저하를 가져온다. 상기 모순되는 문제를 해결하기 위한 방법으로, 반응계에 염 수화물 쌍을 직접 첨가하여 수분 함량(또는 수분 활성도, aw) 을 조절하게 한다. 염 수화물 쌍은 수분을 흡수 또는 방출함으로써 수분활성도를 조절가능하게하여 반응액 내에서의 수분 상태를 유지하게 한다. 만일 반응 혼합물내에서 염 수화물의 직접적인 첨가로 반응 생성물에 악영향을 주는 것과 같은 문제를 야기한다면, 직접적인 첨가는 바람직하지 않다. 이 경우, 염 수화물 쌍은 반응계의 빈공간에 놓아두어 반응 시스템의 최적 수분 활성도를 유도하며 염 수화물 쌍의 직접적인 접촉에 의한 독성화를 막는다. 바람직한 염 수화물 쌍은 NaB4O7·10H2O-NaB4O7·5H2O, Na4P2O7·10H2O-Na4P2O7무수물, NaBr·2H2O-NaBr 무수물, CH3COONa·3H2O-CH3COONa 무수물, NaI·2H2O-NaI 무수물, LiSO4·1H2O-LiSO4무수물로 구성된 그룹에서 선택된 1종 이상의 염 수화물 쌍이다.
몇 가지 유리 지방산 또는 그의 에스테르는 기질로서 뿐만 아니라 반응 용매로서의 기능도 할 수 있다. 이 경우 본 발명자들은 에스테르화 반응을 위해 용매를 첨가하지 않은 반응 시스템을 적용하였다. 유기 용매는 불용성 기질의 용해화에 이용되어 진다. 바람직한 유기 용매는 아세토니트릴, N.N'-디메틸포름아미드, 디옥산, 2-부탄올, 디에틸에테르, 펜탄, 헥산, 사이클로헥산, 헵탄, 이소옥탄, 옥탄, 부틸아세테이트 및 에틸아세테트에서 선택된 1종 이상의 유기용매이다.
다른 방법으로, 반응 시스템에 물을 첨가하는 것이 가능하다. 반응 시스템에 첨가되는 물의 양은 전체 반응 중량 대비 0.01∼20 중량%, 바람직하게는 0.1∼5 중량% 로 첨가한다. 반응 시스템에 물을 첨가하는 경우, 라이소포스포리피드는 염 수화물 쌍의 첨가 없이도 수득되어진다. 그러나 이 경우, 반응 시스템내의 수분 활성도를 조절하는 것은 쉽지 않다.
본 발명에 이용되는 리파제는 리파제 M (뮤코 자바니쿠스 ;Mucor javanicus), 칸디다 실린드라시아 (Candida cylindracia) 리파제, 리파제 D (리조푸스 델레마 ;Rhizopus delemar), 리포자임(뮤코 미헤이 ;Mucor miehei) 으로 구성된 그룹에서 선택된 1종 이상의 리파제이다. 이들 중 리포자임(Lipozyme, Novo Nordisk, 덴마크)이 바람직하다. 리포자임은 더 이상의 정제나 고정이 필요없이 시판품 그대로 사용할 수 있다.
반응의 최종 생성물인 고순도의 라이소포스포리피드를 수득하기 위해서는 클로로포름 : 메탄올 : 물을 용량대비 65 : 25 : 4인 수용액에서 추출한다. 여과법에 의해 모든 고형 성분들을 제거한 후, 용매상(solvent phase)을 진공상태에서 건조시킨다. 아세톤을 라이소포스포리피드로부터 미반응 지방산 유도체들을 제거하는 용도로 사용한다. 아세톤을 첨가하면 라이소포스포리피드는 용액에서 침전되고, 실리카 겔 크로마토그래피와 같은 표준방법으로 더욱 정제한다.
이하 실시예를 통해 본 발명의 구성을 보다 구체적으로 설명한다.
다음에 실시한 실시예들은 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[생성된 라이소포스포리피드의 분석]
1. TLC 분석
- TLC 판 : 가로세로 20cm 의 실리카겔 60 F254(머크사 제품) 박막크로마토
그래피판
- 전개액 : 클로로포름 : 아세톤 : 메탄올 : 초산 : 물 = 6 : 8 : 2 : 2 : 1
- 발색액 : molibdenum blue
2. HPLC 분석
(1) 라이소포스파티딜콜린(Lysophosphatidylcholine) 합성 분석
HPLC 분석기 : 펌프 : 영린 M930
검출기 : Alltech Varex MKⅢ ELSD Detector.
칼 럼 : YMC-NH2
(2) 라이소포스파티딜에탄올아민(Lysophosphatidylethanolamine) 합성
분석
HPLC 분석기 : 펌프 : 영린 M930
검출기 : Alltech Varex MKⅢ ELSD Detector.
칼 럼 : Hypersil silica column (250 x 4.6 mm)
(실시예 1) 열린계(open system)에서 라이소포스포리피드의 합성
하기 표 1에 나타낸 양의 글리세롤-3-포스페이트(glycerol-3-phoaphate) 유도체 (Ⅱ)와 지방산 유도체 (Ⅲ)를 열린계에서 마그테틱 교반기로 격렬히 혼합한다. 0.1g의 리포자임(Lipozyme, Novo 사)을 첨가하여 50℃, 300rpm에서 48시간동안 반응을 시켰다. 생성된 라이소포스포리피드를 HPLC로 분석하였다. 반응물질의 양과 생성물인 라이소포스포리피드 및 수율등을 표 1에 나타내었다.
| 기질 | 생성물 | 수율(%) | |||
| 글리세롤-3-포스페이트 유도체 (Ⅱ) | 지방산 유도체 (Ⅲ) | ||||
| 물질 | 양(밀리몰) | 물질 | 양(밀리몰) | ||
| G-3-PC | 1.5 | 카프릭산 | 10 | lyso-PC | 28.4 |
| G-3-PC | 1.5 | 트리올레인 | 3 | lyso-PC | 20.4 |
| G-3-PC | 1.5 | 카프릴 메틸 에스터 | 10 | lyso-PC | 12.1 |
| G-3-PE | 1.5 | 카프릭산 | 10 | lyso-PE | 5 |
| G-3-PE | 1.5 | 트리올레인 | 3 | lyso-PE | 3.2 |
| G-3-PE | 1.5 | 카프릴 메틸 에스터 | 10 | lyso-PE | 4.2 |
약어 : G-3-PC : 글리세롤-3-포스포릴콜린
G-3-PE : 글리세롤-3-포스포릴에탄올아민
lyso-PC : 라이소포스파티딜콜린
lyso-PE : 라이소포스파티딜에탄올아민
(실시예 2) 폐쇄계(closed system)에서 라이소포스포리피드의 합성
하기 표 2에 나타낸 양의 글리세롤-3-포스페이트(glycerol-3-phoaphate) 유도체 (Ⅱ)와 지방산 유도체 (Ⅲ)를 20ml의 아세토니트릴과 함께 폐쇄계에서 마그네틱 교반기로 격렬히 혼합한다. 0.1g의 리포자임(Lipozyme, Novo 사)을 첨가하여 50℃, 300rpm에서 48시간동안 반응을 시켰다. 생성된 라이소포스포리피드를 HPLC로 분석하였다. 반응물질의 양과 생성물인 라이소포스포리피드 및 수율등을 표 2에 나타내었다.
| 기질 | 생성물 | 수율(%) | |||
| 글리세롤-3-포스페이트 유도체 (Ⅱ) | 지방산 유도체 (Ⅲ) | ||||
| 물질 | 양(밀리몰) | 물질 | 양(밀리몰) | ||
| G-3-PC | 1.5 | 카프릴 메틸 에스터 | 10 | lyso-PC | 12.1 |
| G-3-PE | 1.5 | 트리카프린 | 3 | lyso-PE | 4.1 |
| G-3-PE | 1.5 | 대두유 | 3g | lyso-PE | 2.5 |
약어 : G-3-PC : 글리세롤-3-포스포릴콜린
G-3-PE : 글리세롤-3-포스포릴에탄올아민
lyso-PC : 라이소포스파티딜콜린
lyso-PE : 라이소포스파티딜에탄올아민
(실시예 3) 수분활성도 조절로 폐쇄계에서 라이소포스파티딜콜린의 합성
1.5 밀리몰의 글리세롤-3-포스포릴콜린(G-3-PC)과 3.0 밀리몰의 카프릭 산을 폐쇄계에서 마그테틱 교반기로 격렬히 혼합한다. 0.1g의 리포자임(Lipozyme, Novo 사)에 수분활성도 조절을 위한 염 수화물 쌍을 함께 첨가하여 50℃, 300rpm에서 48시간동안 반응을 시켰다. 본 실시예에 사용되는 염 수화물 쌍은 NaB4O7·10H2O-NaB4O7·5H2O, Na4P2O7·10H2O-Na4P2O7무수물, NaBr·2H2O-NaBr 무수물, CH3COONa·3H2O-CH3COONa 무수물, NaI·2H2O-NaI 무수물, LiSO4·1H2O-LiSO4무수물로 구성된 그룹에서 선택된 1종 이상의 염 수화물 쌍으로 각 염 수화물 쌍에 같은 양의 수화물 형태를 첨가한다. 생성된 라이소포스파티딜콜린을 HPLC로 분석하였다. 생성된 라이소포스파티딜콜린의 수율은 표 3에 개시된 바와 같다.
| 수분활성도 | 염 수화물 | 라이소포스파티딜콜린의 수율(%) |
| 0.12 | LiSO4·1H2O-LiSO4 | 5.2 |
| 0.17 | NaI·2H2O-NaI | 7.4 |
| 0.37 | CH3COONa·3H2O-CH3COONa | 14.2 |
| 0.46 | NaBr·2H2O-NaBr | 13.2 |
| 0.60 | Na4P2O7·10H2O-Na4P2O7 | 36.2 |
| 0.80 | NaB4O7·10H2O-NaB4O7·5H2O | 5.0 |
(실시예 4) 수분활성도 조절로 폐쇄계에서 라이소포스파티딜콜린의 합성
1.5 밀리몰의 글리세롤-3-포스포릴에탄올아민(G-3-PE)과 3.0 밀리몰의 카프릭 산을 폐쇄계에서 마그테틱 교반기로 격렬히 혼합한다. 0.1g의 리포자임(Lipozyme, Novo 사)에 수분활성도 조절을 위한 염 수화물 쌍을 함께 첨가하여 50℃, 300rpm에서 48시간동안 반응을 시켰다. 본 실시예에 사용되는 염 수화물 쌍은 NaB4O7·10H2O-NaB4O7·5H2O, Na4P2O7·10H2O-Na4P2O7무수물, NaBr·2H2O-NaBr 무수물, CH3COONa·3H2O-CH3COONa 무수물, NaI·2H2O-NaI 무수물, LiSO4·1H2O-LiSO4무수물로 구성된 그룹에서 선택된 1종 이상의 염 수화물 쌍으로 각 염 수화물 쌍에 같은 양의 수화물 형태를 첨가한다. 생성된 라이소포스파티딜에탄올아민을 HPLC로 분석하였다. 생성된 라이소포스파티딜에탄올아민의 수율은 표 4에 개시된 바와 같다.
| 수분활성도 | 염 수화물 | 라이소포스파티딜에탄올아민의 수율(%) |
| 0.12 | LiSO4·1H2O-LiSO4 | 2.1 |
| 0.17 | NaI·2H2O-NaI | 1.9 |
| 0.37 | CH3COONa·3H2O-CH3COONa | 22.9 |
| 0.46 | NaBr·2H2O-NaBr | 8.7 |
| 0.60 | Na4P2O7·10H2O-Na4P2O7 | 9.8 |
| 0.80 | NaB4O7·10H2O-NaB4O7·5H2O | 2.1 |
(실시예 5) 폐쇄계에서 물과 유기용매를 함께 첨가하여 라이소포스파티딜콜린의 합성
1.5 밀리몰의 글리세롤-3-포스파티딜콜린과 3.0 밀리몰의 카프릭 산을 20ml의 아세토니트릴과 함께 폐쇄계에서 마그테틱 교반기로 격렬히 혼합한다. 0.1g의 리포자임(Lipozyme, Novo 사)에 0.1ml의 물을 함께 첨가하여 50℃, 300rpm에서 48시간동안 반응을 시켰다. 생성된 라이소포스파티딜콜린을 HPLC로 분석하였다. 라이소포스파티딜콜린의 수율은 15.9% 로 합성되었다.
(실시예 6) 폐쇄계에서 염 수화물 쌍과 유기용매를 함께 첨가하여 라이소포스파티딜콜린의 합성
1.5 밀리몰의 글리세롤-3-포스파티딜콜린과 3.0 밀리몰의 카프릭 산을 20ml의 아세토니트릴과 함께 폐쇄계에서 혼합 용해하였다. 0.1g의 리포자임(Lipozyme, Nivo 사)에 염 수화물 쌍을 함께 첨가하여 50℃에서 48시간동안 반응을 시켰다. 본 실시예에 사용되는 염 수화물 쌍은 NaB4O7·10H2O-NaB4O7·5H2O, Na4P2O7·10H2O-Na4P2O7무수물, NaBr·2H2O-NaBr 무수물, CH3COONa·3H2O-CH3COONa 무수물, NaI·2H2O-NaI 무수물, LiSO4·1H2O-LiSO4무수물로 구성된 그룹에서 선택된 1종 이상의 염 수화물 쌍으로 각 염 수화물 쌍에 같은 양의 수화물 형태를 첨가한다. 생성된 라이소포스파티딜콜린을 HPLC로 분석하였다. Na4P2O7·10H2O-Na4P2O7무수물에서 생성된 라이소포스파티딜콜린의 수율은 18.9% 로 합성되었다.
본 발명의 효과는 라이소포스포리피드를 합성하는데 있어서 기질들 자체를 가지고 유기용매 시스템과 비용매시스템에서 합성하는 것 이외에 수분활성도(water activity)의 개념을 도입하여, 즉 효소활성에 필요한 수분함량을 유지시켜 줄 수 있으며 동시에 합성반응이 우세할 수 있도록 계의 수분함량을 제한 할 수 있는 적절한 수분활성도를 선정함으로써 반응효율을 극대화 할 수 있게 된 것이다.
Claims (5)
- 리파제를 이용하여 라이소포스포리피드를 제조하는 방법에 있어서, 일반식(II)로 표시된 글리세롤-3-포스페이트 유도체와 일반식(III)으로 표시된 지방산 유도체에 NaB4O7·10H20-NaB4O7·5H20, NaP2O7·10H20-Na4P2O7무수물, NaBr·2H2O-NaBr 무수물, CH3COONa·3H2O-CH3COONa 무수물, NaI·2H2O-NaI 무수물, LiSO4-1H2O-LiSO4무수물로 구성된 그룹에서 선택된 1종 이상의 염 수화물 쌍을 첨가 혼합 용해하고; 리파제 M (뮤코 자바니쿠스; Mucor javanicus), 칸디다 실린드라시아(Candiad cylindracia) 리파제, 리파제 D(리조푸스 델레마; Rhizopus delemar), 리포자임(뮤코 미헤이; Mucor miehei) 으로 구성된 그룹에서 선택된 1종 이상의 리파제로 상기 혼합물과 반응시키고; 반응 혼합물에서 추출함을 특징으로 하는 일반식(I)로 표시된 라이소포스포리피드의 제조방법상기식에서, R은 하나 또는 그 이상의 이중결합을 지닌 탄소수 6~23의 알킬 또는 알켄닐이고,X는 콜린, 글리세롤, 세린 또는 에탄올아민이고,Y는 수소원자, 탄소수 1~6의 알킬, 탄소수 1~6의 알케닐 또는 하기 일반식(A)로 표현된 화합물이다.상기식에서, R1과 R2는 각각 하나 또는 그 이상의 이중결합을 지닌 탄소수 6~23의 알킬 또는 알케닐이다.
- 제1항에 있어서, 반응 혼합물에 아세토니트릴, N,N'-디메틸포름아미드, 디옥산, 2-부탄올, 디에틸에테르, 펜탄, 헥산, 사이클로헥산, 헵탄, 이소옥탄, 옥탄, 부틸아세테이트 및 에틸아세테트에서 선택된 1종 이상의 유기용매를 첨가, 반응 혼합물을 용해시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 라이소포스포리피드의 제조방법.
- 제2항에 있어서, 반응 혼합물에 물을 전체 반응물 중량 대비 0.01~20중량%로 첨가하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 라이소포스포리피드의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 아세톤과 같은 유기용매로 반응 혼합물 내에서 형성된 라이소포스포리피드를 추출 정제하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 라이소포스포리피드의 제조방법.
- 제1항의 방법에 따라 제조된 라이소포스포리피드.
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