ES2105999T5 - Un procedimiento de preparación industrial de fosfatidilserina - Google Patents

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Description

imagen1
DESCRIPCIÓN
Un procedimiento de preparación industrial de fosfatidilserina
La presente invención se refiere a un procedimiento de preparación de fosfatidilserinas de fórmula (I), denominadas en lo que sigue PS, mediante la reacción de serina racémica o enantioméricamente pura, preferiblemente (L)-serina, con fosfatidas naturales, tales como lecitina de soja o huevo, o con fosfatidas sintéticas de fórmula (II), en presencia de una fosfolipasa D, denominada en lo que sigue PLD, con actividad transfosfatidilante, en un sistema bifásico acuoso/orgánico.
Los compuestos de la invención tienen las fórmulas generales (I) y (II):
imagen2
imagen3
10 en las que
R1 y R2, que son iguales o diferentes, están seleccionados de un acilo C10-C30 saturado, mono o poliinsaturado; X = OH u OM, en la que M es un metal alcalino, alcalinotérreo, amonio o alquilamonio;
R3 = CH2CH2NH2 o CH2CH2N+(CH3)3.
La importancia de los compuestos (I) es diversa, particularmente en la preparación de composiciones farmacéuticas
15 para la terapia de síndromes degenerativos cerebrales de diferente origen, tales como patologías vasculares de base aterosclerótica o no y/o decadencia senil; para la preparación de formulaciones liposomales, y más recientemente para composiciones dietéticas que comprenden lecitinas naturales, particularmente lecitina de soja enriquecida con fosfatidil-L-serina, representada en lo sucesivo como PS(L), que contiene ácidos grasos poliinsaturados como residuos acilo.
20 La creciente demanda de cantidades industriales de PS(L) a un coste razonable impulsó al solicitante a llevar a cabo una completa investigación para satisfacer dicha necesidad.
Ya es conocida la preparación de fosfatidas (I) mediante PLD como catalizador enzimático de la reacción de transfosfatidilación. Sin embargo, los procedimientos conocidos se refieren a la preparación a escala de laboratorio (algunos gramos), y sufren una serie de desventajas, especificadas a continuación, que dificultan su traslado a escala
25 industrial.
Se sabe también que no se consigue fácilmente la reproducibilidad industrial de procedimientos de laboratorio de reacciones enzimáticas, especialmente cuando se utilizan enzimas brutas.
Por otra parte, es importante indicar que las enzimas PLD son capaces de catalizar también la hidrólisis acuosa de fosfatidas, proporcionando ácido fosfatídico, representado en lo sucesivo como PA, en competición con la reacción de
30 transfosfatidilación, estando la cinética de las dos reacciones altamente afectada por las condiciones de reacción y por el origen de la citada enzima.
Por ejemplo, Comfurius P. et al., en Biochim. Biophys. Acta 488, 36 (1977) divulga en primer lugar la producción de una mezcla de aproximadamente 1/1 de PS(L) y PA, haciendo reaccionar a presión, a 45ºC de temperatura y a pH 5,6, en un sistema bifásico éter etílico/agua, lecitina de huevo o fosfatidilcolinas sintéticas con L-serina en presencia de enzima
35 PLD parcialmente purificada (de repollo).
Se purifica entonces la PS(L) mediante cromatografía sobre celulosa utilizando una mezcla de cloroformo/metanol como eluyente. Resulta evidente que dicho procedimiento no es adecuado para una producción industrial, debido tanto al uso de éter etílico como a la baja selectividad.
Se han comunicado resultados más interesantes por Yamane T. et al., en Biochim. Biophys Acta 1003, 277 (1989), en el que se compararon enzimas PLD de diferente origen (de repollo y de cepas de Streptomyces) con diferentes actividades transfosfatidilantes en la conversión de PC con (D)-y (L)-serina; se llevó a cabo también un estudio de diferentes parámetros de reacción tales como pH, disolvente, temperatura, reactivos y concentraciones de enzima (estudiado también después de inmovilización).
imagen4
5 El pH considerado estaba en el intervalo entre 5,5 y 7,0, siendo el sistema bifásico de disolventes más eficaz para la enzima libre, éter-agua o acetato de etilo-agua, mientras que disolventes tales como benceno, tolueno o cloroformo son menos eficaces; por otro lado el acetato de etilo no es adecuado para la enzima inmovilizada. La temperatura está en el intervalo entre 20 y 40ºC y los ensayos se llevaron a cabo preferiblemente a 30ºC de temperatura, aunque la velocidad de reacción aumenta con la temperatura; los ensayos se llevaron a cabo a una concentración de serina 3,4 M
10 que corresponde con su solubilidad a pH 5,6 a 30ºC de temperatura, mientras que se mantiene la concentración de PC muy baja (<53,4 mM, habitualmente 17,8 mM) y la concentración de enzima es 0,2-0,8 U/ml (se define una unidad como la cantidad de enzima que hidroliza en 1 minuto 1 µmol de PC pura a PA a 30º±0,5ºC).
Utilizando una fosfatifilcolina altamente purificada, denominada en lo que sigue PC, se obtendría una conversión casi completa de la PS en las condiciones de reacción óptimas. Contrariamente a la PLD de repollo, las PLD bacterianas
15 catalizan de forma similar la transfosfatidilación con (D) y (L)-serina.
Independientemente de las ventajas con respecto al procedimiento utilizado anteriormente, incluso este procedimiento no puede considerarse todavía industrialmente aplicable, puesto que el estudio se dirigía a encontrar las condiciones óptimas utilizando enzimas purificadas y PC altamente pura, mientras que no se decía nada acerca del uso de lecitinas de bajo coste y baja pureza y del uso de enzimas no purificadas.
20 El documento JP-A-63.036.791 divulga el uso de carbón activado o de otros vehículos en grandes cantidades como adsorbente para serina y PLD, suspendiendo el citado material en un disolvente de bajo contenido en agua (preferiblemente <0,2%) en el que se disuelve el fosfolípido, de modo que se reduzca la formación competitiva de PA. Como alternativa, se carga el citado disolvente en una columna y se eluye el disolvente orgánico a través de la columna. Este procedimiento es difícil de aplicar industrialmente puesto que la enzima y el sustrato deberían atraparse
25 en el mismo vehículo y se requiere un contenido bajo en agua.
El documento JP-B-63.036.792 divulga el uso de PLD de repollo en un sistema bifásico de agua/éter diisopropílico como disolvente, operando en condiciones micelares. Se obtiene una conversión muy baja a partir de una lecitina de soja parcialmente purificada, con un contenido en PC de aproximadamente el 68%, siendo el contenido de PS(L) al final de la reacción del 24%.
30 Se comunicaron mejores resultados en el documento JP-B-02.079.996, en el que se utiliza una PLD de Streptomyces en acetato de etilo; sin embargo, incluso utilizando una fosfatidilcolina pura sintética como material de partida, el rendimiento de la PS(L) correspondiente es de aproximadamente el 68%, similar al comunicado en el documento JP-B63.123.389, en el que se convirtió PC de huevo en éter etílico en PS(D) mediante una PLD de Nocardiopsis o Actinomadura.
35 Finalmente, en Okahata Y. et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 919 (1995) se divulga el uso de PLD de Streptomyces recubierta con lípidos, preparados separadamente, capaz de ejercer actividad catalítica en un disolvente orgánico a pH 5,5. Esta enzima debería ser mucho más activa que la enzima bruta con la que la reacción a menudo no se completa. A pesar de la indicación en el artículo de que la velocidad máxima de reacción de la enzima bruta se alcanza a valores de pH más ácidos de aproximadamente 4, la velocidad de reacción es sin embargo <2% de la de la enzima recubierta
40 con lípido.
Utilizando un sistema bifásico agua/benceno como disolvente, PC de huevo a 40ºC de temperatura en 24 horas con la enzima recubierta con lípido, se obtendría una PS(L) con un rendimiento de aproximadamente el 75%.
A partir de las enseñanzas de la técnica anterior anteriormente discutida, los expertos en la técnica podrán concluir que:
45 -el uso de lecitinas en bruto no es conveniente ni posible;
-es necesario el uso de una enzima purificada o al menos no en estado bruto, y por lo tanto cara;
-los disolventes industrialmente aceptables, no tóxicos y compatibles con el medio ambiente son difíciles de utilizar;
-es necesario un exceso notable de serina, implicando por lo tanto la necesidad de recuperar o reciclar la 50 serina. Por otra parte, los procedimientos cromatográficos descritos en los procedimientos anteriores son razones adicionales contra la aplicabilidad industrial de los citados procedimientos.
imagen5
Sorprendentemente, la presente invención proporciona un procedimiento que permite superar las desventajas e inhibiciones de la técnica anterior, utilizando caldos de fermentación de cepas de microorganismos productores de PLD extracelular, opcionalmente dializados a través de membranas con un corte adecuado, en un sistema bifásico de disolventes agua/disolvente orgánico, en el que el disolvente orgánico es tolueno o el pH de la reacción varía de 4 a
5 4,5.
La invención proporciona por lo tanto un procedimiento para la preparación de compuestos (I) que comprende la reacción de fosfatidas (II) con serina racémica o enantioméricamente pura, preferiblemente con L-serina, en presencia de fosfolipasa D bruta de caldos de fermentación centrifugados de cepas de microorganismos productores de PLD extracelular con alta actividad de transfosfatidilación.
10 El procedimiento de la invención puede llevarse a cabo eficazmente también con cepas conocidas adecuadas.
El disolvente orgánico preferido, tolueno, proporciona una serie de ventajas tales como bajo coste, baja toxicidad, compatibilidad medioambiental, alta solubilidad de la fosfatida (II) y particularmente de las lecitinas y PS brutas, baja solubilidad de la serina, permitiendo la retirada y recuperación de este aminoácido, presente en un gran exceso, de la PS producida; compatibilidad con la actividad enzimática de la PLD, proporcionando una reacción de
15 transfosfatidilación suficientemente rápida y altamente selectiva (relación PS a PA).
Por otra parte, el tolueno permite, mediante repetidas solubilizaciones y concentraciones, retirar completamente de la lecitina utilizada los alcoholes primarios, particularmente etanol, que están presentes hasta un 0,5% en la lecitina comercial. Estos alcoholes son extremadamente reactivos como competidores de la serina en la reacción de transfosfatidilación y podrían proporcionar fosfatidas indeseadas tales como fosfatidiletanol, en hasta un 8%, con la
20 consiguiente reducción de la calidad y el rendimiento de la PS.
La reacción se lleva a cabo preferiblemente a 25º ± 5ºC a valores de pH en el intervalo entre 4 y 4,5, mientras que en los procedimientos de la técnica anterior el pH era superior a 5. Además, en contraposición con los resultados anteriormente comunicados, se ha observado una reducción de la selectividad cuando la temperatura de la reacción era ≥40ºC. Las demás condiciones de reacción, tales como los procedimientos de agitación y adición, así como la
25 presencia de aditivos tales como iones de metal alcalino o alcalinotérreo, son convencionales y pueden determinarse fácilmente por los expertos en la técnica.
Sorprendentemente, el procedimiento de la invención puede aplicarse ventajosamente tanto a lecitinas de alta pureza, tal como Epikuron 200® (PC de soja al 95%, disponible en Lucas Meyer), como a lecitinas de bajo coste y baja pureza, tal como Epikuron® 135 (Lucas Meyer) constituida por una mezcla de PC (35%), PE (8%) y triglicéridos (50%); lo
30 mismo se aplica para la PC de huevo tal como Ovothin® (PC de huevo al 60%, Lucas Meyer) o fosfatidas sintéticas de fórmula (II).
Es posible aumentar, con un rendimiento del 90%, la pureza de una PS(L) obtenida de Epikuron 200® del 88% al 95% gracias a su reparto preferencial en la fase heptano; de forma similar, se aumentó la pureza de una PS(L) obtenida de Epikuron 135® del 58% a aproximadamente el 80%. Finalmente, puede obtenerse una purificación adicional de la PS
35 mediante cristalización con heptano/acetona en forma de la sal de calcio y la posterior conversión en cualquier otra sal, según técnicas convencionales.
La serina puede recuperarse según procedimientos diferentes. Un primer procedimiento comprende la concentración parcial a presión reducida de la solución acuosa de la reacción de transfosfatidilación, después la separación de la fase tolueno y después el tratamiento con carbón activo, y la cristalización de serina de la citada solución. Como alternativa, 40 es posible reciclar la fase acuosa de la reacción completada en una carga posterior, evitando el aislamiento de la serina contenida. Esto se lleva a cabo tratando la fase acuosa con carbón activo, retirando las sales inorgánicas y de colina mediante electrodiálisis a pH 5,7, que es el pH isoeléctrico de la serina, en un dispositivo de electrodiálisis de flujo tangencial, manteniendo el valor del pH constante durante la electrodiálisis; la solución acuosa resultante puede utilizarse como tal o después de una concentración opcional de la solución acuosa a vacío o mediante ósmosis inversa.
45 Puede llevarse a cabo también un procedimiento similar utilizando, en lugar de electrodiálisis, resinas de intercambio iónico para retirar las sales inorgánicas y de colina y después concentrando la solución acuosa con los procedimientos indicados anteriormente.
Puede aplicarse convenientemente el procedimiento de la invención para la preparación de fosfatidil-(L)-serinas en las que R1 y R2 son cadenas acilo de ácido palmítico, esteárico, oleico o linoleico en proporciones similares a las de la
50 lecitina de soja o en las que R1 y R2 son cadenas acilo de ácido palmítico, esteárico, palmitoleico, oleico, linoleico, araquidónico en proporciones similares a las de la lecitina de huevo.
El procedimiento comunicado a continuación ilustra adicionalmente la invención.
imagen6
Ejemplo 1
Preparación del catalizador PLD. Procedimiento general
Se hicieron crecer con agitación durante 24 horas las diferentes cepas de Streptomyces utilizadas en matraces de 1 l que contenían 200 ml de un medio que consiste en glucosa (10 g/l), extracto de levadura (20 g/l), peptona (5 g/l),
5 K2HPO4 (2 g/l), MgSO4 heptahidratado (0,5 g/l), a pH 7 por adición de HCl 1 M. Se utilizaron los cultivos para inocular fermentadores de 10 l que contenían 5 l del mismo medio nutriente, y un agente antiespumante si es necesario, y se continuó la fermentación durante 24 horas a 30ºC de temperatura en corriente de aire con agitación a 500 rpm, manteniendo un valor de pH constante de 7 mediante la adición automática de NaOH 0,1 M o de HCl 0,1 M. Al final, se centrifugó el caldo y se almacenó a 4ºC de temperatura.
10 Se llevó a cabo la fermentación industrial con procedimientos similares en un reactor de 2.000 l, alcanzando después de 23 horas una actividad final del caldo de 2-3 Ku/l de PLD, determinada mediante el ensayo descrito en la bibliografía [Biotechn. Techn., 7, 795 (1993)]. Se centrifugó el caldo de fermentación resultante y se utilizó como tal o después de concentración hasta aproximadamente 1/10 del material de partida, a un pH tamponado a un valor de 5,6 utilizando acetato de sodio 0,1 M, mediante ultrafiltración a través de membranas Millipore con un corte de 10.000 dalton.
15 Ejemplo 2
Preparación de PS(L) a partir de Epikuron 200 de lecitina de soja
Se colocan 20 g de Epikuron 200® (Lucas Meyer) y 100 ml de tolueno en un reactor de 1.000 ml, en atmósfera de nitrógeno, y se concentra la solución a vacío destilando aproximadamente 80 ml del disolvente. Se añade tolueno nuevo y se concentra la solución de nuevo a presión reducida. Se repite el procedimiento hasta alcanzar un contenido 20 en etanol u otros alcoholes C1-C4, que están habitualmente presentes en la lecitina comercial, inferior a 20 ppm. Se suspende el residuo en tolueno nuevo hasta un volumen de 400 ml y se añaden 94,5 g de (L)-serina. Se añade a la suspensión resultante una solución acuosa (300 ml) que contiene PLD de ATCC 55717, preparada según los procedimientos del ejemplo 1 y con una actividad enzimática de 2 U/ml, se añaden a 10ºC de temperatura 3,34 g de cloruro de calcio, 4,08 g de acetato de sodio trihidratado y aproximadamente 3 g de ácido acético glacial, obteniendo un 25 pH de aproximadamente 4,5. Se calienta el sistema bifásico resultante hasta una temperatura de 25 ± 2ºC y se mantiene bajo fuerte agitación durante aproximadamente 6 horas. Se filtra entonces la muestra sobre decalita, que se lava adicionalmente con 2x100 ml de tolueno; se separa la fase orgánica de la fase acuosa que contiene el exceso de serina, y se concentra a presión reducida, proporcionando un residuo (22,3 g) que se suspende en 525 ml de nheptano y 171 ml de metanol. Se desecha la fase inferior de metanol, mientras que se extrae adicionalmente la
30 superior con 220 ml de metanol. Después de la separación, se concentra la fase superior a vacío hasta un volumen pequeño, se añaden, con agitación a –5ºC de temperatura, 400 ml de acetona, se filtra y se seca a vacío, proporcionando 15 g de sal de calcio de PS(L) a un 97% (HPLC) (contenido en PA <3%).
Se trata la fase acuosa que contiene serina con 16 g de carbón activo y se filtra sobre decalita; posteriormente se concentra a vacío (4 kPa), destilándose aproximadamente el 70% del disolvente; después se enfrían se filtra y se seca
35 a 50ºC de temperatura, proporcionando aproximadamente 52 g de (L)-serina pura. Se añaden las aguas madre que contienen el exceso de serina (aproximadamente 43 g) a la fase acuosa que deriva de una síntesis adicional de PS para una recuperación posterior.
Ejemplo 3
Preparación de PS(L) a partir de lecitina de soja Epikuron 135.
40 Se colocan 400 kg de Epikuron 135® (Lucas Meyer), 3.000 l de tolueno y 100 l de agua en un reactor de acero inoxidable de 5.000 l en atmósfera de nitrógeno, y se concentra la mezcla a vacío, destilando a 45ºC de temperatura aproximadamente 1.000 l de disolventes. Se carga otro reactor de acero inoxidable de 6.000 l con 1.355 l de caldo de fermentación de ATCC 55717, que contiene aproximadamente 3 KU/l de PLD, 22,7 kg de cloruro de calcio, 27,6 kg de acetato de sodio trihidratado y, a 10ºC de temperatura, 22 l de ácido acético al 80% y 625 kg de L-serina (pH final 4,2).
45 Se reúnen las dos soluciones, se calienta la mezcla resultante y se mantiene a 25ºC de temperatura con fuerte agitación durante 8 horas. El análisis HPLC muestra un contenido en PS(L) de aproximadamente el 75% de los fosfolípidos totales. Se añade entonces a la mezcla una suspensión de 36 kg de decalita en 500 l de tolueno y se filtra, lavando el filtro con 400 l de tolueno/agua (3/1, v/v). Se separa entonces la fase acuosa y se trata para recuperar la (L)serina de forma análoga a la descrita en el ejemplo 6 posterior, mientras que la fase orgánica, después de filtración
50 adicional sobre decalita, se concentra a vacío hasta un residuo de aproximadamente 440 kg, que se suspende en
5.000 l de acetona y se agita durante aproximadamente 6 horas a temperatura ambiente. Después de enfriar la mezcla hasta 0ºC de temperatura, se filtra el producto proporcionando aproximadamente 323 kg de la sal de calcio húmeda de PS(L) (50%).
imagen7
Se purifica adicionalmente el producto mediante tratamiento con 2.000 l de acetona y secado, proporcionando aproximadamente 273 kg de sal de calcio de PS(L) (58%).
Se purificó una muestra de 20 g mediante extracción con heptano/metanol, de forma análoga a la descrita en el ejemplo 2, proporcionando 11,6 g de sal de calcio de PS(L) (80%).
5 Ejemplo 4 Preparación de PS(L) a partir de lecitina de huevo
Se colocan 13 g de Ovothin 160® (PC al 60%, Lucas Meyer), 158 ml de tolueno y 38 g de (L)-serina en un reactor de 500 ml en atmósfera de nitrógeno. Se añade a la suspensión resultante una solución acuosa (300 ml) que contiene PLD de ATCC 55717, preparada según el procedimiento del ejemplo 1 y con una actividad enzimática de 2 U/ml, se 10 añaden a 10ºC de temperatura 1,4 g de cloruro de calcio, 1,7 g de acetato de sodio trihidratado y el ácido acético glacial necesario para obtener un pH de aproximadamente 4,1. Se calienta el sistema bifásico resultante hasta una temperatura de 25º ± 2ºC de temperatura y se mantiene bajo fuerte agitación durante aproximadamente 6 horas. Se filtra entonces la mezcla sobre decalita, que se lava adicionalmente con 2 x100 ml de tolueno; se separa la fase orgánica de la fase acuosa que contiene el exceso de serina, y se concentra a presión reducida, proporcionando un
15 residuo que se suspende en 320 ml de n-heptano y 100 ml de metanol. Se desecha la fase inferior de metanol, mientras que se diluye la superior con 35 ml de heptano y se extrae adicionalmente con 95 ml de metanol. Se separa la fase superior, se concentra a vacío hasta un volumen pequeño, se añaden, con agitación a –5ºC de temperatura, 250 ml de acetona, proporcionando, con filtrado y secado a vacío, 7,3 g de sal de calcio de PS(L) al 84% (HPLC).
Ejemplo 5
20 Preparación de DLPS(L) a partir de DLPC
Repitiendo el procedimiento descrito en el ejemplo 2, pero utilizando 20 g de L-dilinoleoilfosfatidilcolina, representada como DLPC, en lugar de 20 g de Epikuron 200, se obtienen 15,1 g de L-α-dilinoleoilfosfatidil-L-serina, representada como DLPS(L), en forma de sal de calcio (pureza del 96% HPLC).
Ejemplo 6
25 Recuperación y reciclado de L-serina
Se trató una solución acuosa (10 l), obtenida al final de una reacción de transfosfatidilación según el procedimiento del ejemplo 3, después de la separación de la solución de tolueno y la filtración sobre decalita, con 0,3 kg de carbón activo y se ajustó el pH a 5,7 añadiendo una solución acuosa de NaOH al 30%. Se mantuvo la solución resultante durante 4 horas en un dispositivo de electrodiálisis de flujo tangencial, manteniendo el pH de la cámara de alimentación a 5,7 ±
30 0,5.
La conductividad en la cámara de alimentación durante el citado tiempo se redujo desde el valor de partida de 12,700 µsiemens/cm a un valor final de 480 µsiemens/cm. Se utilizó de nuevo la solución acuosa de L-serina (recuperación del 97% del aminoácido), adecuadamente concentrada mediante ósmosis inversa, en lugar de L-serina nueva sólida, en una reacción de transfosfatidilación posterior con resultados similares.
35

Claims (13)

  1. imagen1
    REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento de preparación de los compuestos de fórmula (I)
    imagen2
    10
    en la que: R1 y R2 , que poliinsaturado;
    son iguales o diferentes, están seleccionados de un grupo acilo C10-C30 saturado, mono o
    X = OH u OM, en la que M es un metal alcalino, alcalinotérreo, amonio o alquilamonio;
    15
    comprendiendo dicho procedimiento hacer reaccionar fosfatidas de fórmula general (II)
    imagen3
    1 2 3+
    25 en la que R, Ry X tienen los significados anteriormente definidos y R= CH2-CH2NH2 o CH2-CH2N(CH3)3,
    con serina racémica o enantioméricamente pura, en un sistema bifásico agua/disolvente orgánico, en presencia de fosfolipasa D en bruto procedente de caldos de fermentación centrifugados de cepas de microorganismos productores de PLD extracelular, en el que las fosfatidas de fórmula general (II) son mezclas de fosfatidil-colina y/o –etanolamina de origen natural, seleccionadas de lecitinas de soja o de huevo, que presentan un contenido en
    30 fosfolípidos que varía de 20% a 95% y en el que el pH de la reacción varía de 4 a 4,5.
  2. 2.
    Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el disolvente orgánico es tolueno.
  3. 3.
    Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la temperatura de reacción es de 25º C ± 5º C.
  4. 4.
    Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la fosfolipasa D en bruto está producida por la cepa de Streptomyces ATCC 55717.
    35 5. Un procedimiento según la reivindicación 1, de preparación de fosfatidil-(L)-serina en el que R1 y R2 son cadenas de acilo de ácidos palmítico, esteárico, oleico, linoleico o linolénico en proporciones similares a las de la lecitina de soja.
  5. 6. Un procedimiento según la reivindicación 1 de preparación de fosfatidil-(L)-serina en el que R1 y R2 son cadenas de
    acilo de ácidos palmítico, esteárico, palmitoleico, oleico, linoleico o araquidónico en proporciones similares a las de 40 la lecitina de huevo.
    7
    imagen4
  6. 7. Un procedimiento de recuperación de L-serina, como un sólido cristalino, a partir de disoluciones acuosas de una reacción de transfosfatidilación llevada a cabo según la reivindicación 1; y en dicho procedimiento, tras la separación de la fase orgánica citada, la fase acuosa se concentra parcialmente a vacío para precipitar la L-serina cristalina.
    5 8. Un procedimiento de recuperación de L-serina, en forma de una disolución acuosa exenta de sales inorgánicas y de sales de colina, a partir de disoluciones acuosas de una reacción de transfosfatidilación llevada a cabo según la reivindicación 1; y en dicho procedimiento, tras la filtración y separación de la fase orgánica, la citada fase acuosa se somete a electrodiálisis a un valor de pH de 5,7 ± 0,5 o, como alternativa, a tratamiento con resinas intercambiadoras de iones.
    10 9. Un procedimiento de preparación de los compuestos de fórmula (I)
    imagen2
    en la que:
    R1 y R2, que son iguales o diferentes, están seleccionados de un grupo acilo C10-C30 saturado, mono o poliinsaturado;
    X = OH u OM, en la que M es un metal alcalino, alcalinotérreo, amonio o alquilamonio;
    comprendiendo dicho procedimiento hacer reaccionar fosfatidas de fórmula general (II)
    25
    30
    imagen3
    1 2 3+
    en la que R, Ry X tienen los significados anteriormente definidos y R= CH2-CH2NH2 o CH2-CH2N(CH3)3,
    con serina racémica o enantioméricamente pura, en un sistema bifásico agua/disolvente orgánico, en presencia de 35 fosfolipasa D en bruto procedente de caldos de fermentación centrifugados de cepas de microorganismos productores de PLD extracelular, y donde el disolvente orgánico es tolueno.
  7. 10. Un procedimiento según la reivindicación, en el que las fosfatidas de fórmula general (II) son mezclas de fosfatidilcolina y/o –etanolamina de origen natural, seleccionadas de lecitinas de soja o huevo, que presentan un contenido en fosfolípicos que varía de 20% a 95%
    40 11. Un procedimiento según la reivindicación 9, en el que el pH de la reacción varía de 4 a 4,5.
  8. 12.
    Un procedimiento según la reivindicación 9, en el que la temperatura de reacción es de 25º C ± 5º C.
  9. 13.
    Un procedimiento según la reivindicación 9, en el que la fosfolipasa D en bruto está producida por la cepa de Streptomyces ATCC 55717.
  10. 14.
    Un procedimiento según la reivindicación 9, de preparación de fosfatidil-(L)-serina en el que R1 y R2 son cadenas de
    8
    imagen5
    acilo de ácidos palmítico, esteárico, oleico, linoleico o linolénico en proporciones similares a las de la lecitina de 5 soja.
  11. 15.
    Un procedimiento según la reivindicación 9 de preparación de fosfatidil-(L)-serina en el que R1 y R2 son cadenas de acilo de ácidos palmítico, esteárico, palmitoleico, oleico, linoleico o araquidónico en proporciones similares a las de la lecitina de huevo.
  12. 16.
    Un procedimiento de recuperación de L-serina, como un sólido cristalino, a partir de disoluciones acuosas de una
    10 reacción de transfosfatidilación llevada a cabo según la reivindicación 9; y en dicho procedimiento, tras la separación de la fase orgánica citada, la fase acuosa se concentra parcialmente a vacío para precipitar la L-serina cristalina.
  13. 17. Un procedimiento de recuperación de L-serina, en forma de una disolución acuosa exenta de sales inorgánicas y de sales de colina, a partir de disoluciones acuosas de una reacción de transfosfatidilación llevada a cabo según la
    15 reivindicación 9; y en dicho procedimiento, tras la filtración y separación de la fase orgánica, la citada fase acuosa se somete a electrodiálisis a un valor de pH de 5,7 ± 0,5 o, como alternativa, a tratamiento con resinas intercambiadoras de iones.
    9
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