JPH09173092A - ホスファチジルセリンの工業的製造方法 - Google Patents

ホスファチジルセリンの工業的製造方法

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JPH09173092A
JPH09173092A JP8326787A JP32678796A JPH09173092A JP H09173092 A JPH09173092 A JP H09173092A JP 8326787 A JP8326787 A JP 8326787A JP 32678796 A JP32678796 A JP 32678796A JP H09173092 A JPH09173092 A JP H09173092A
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phosphatidyl
acid
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phosphatide
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デ フェッラ ロレンゾ
Pietro Massardo
マッサルド ピエトロ
Oreste Piccolo
ピッコロ オレステ
Stefano Servi
セルヴィ ステファノ
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ITARUFUARUMAKO SUUDE SpA
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ホスファチジルセリンの工業的製造方法 【解決手段】 水系／有機系の二相系中で、ホスファチ
ジル基転移活性を有するホスホリパーゼＤの存在下に、
ラセミ体もしくはエナンチオマー的に純粋なセリン、好
ましくは（Ｌ）−セリンと、大豆レシチンもしくは卵レ
シチンなどの天然ホスファチドまたは合成ホスファチド
とを反応させることによってホスファチジルセリン類を
製造する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、水系／有機系の二
相系で、ホスファチジル基転移活性を有するホスホリパ
ーゼＤ（以下、ＰＬＤと称する）の存在下に、ラセミ体
もしくはエナンチオマー的に純粋なセリン、好ましくは
（Ｌ）−セリンと、大豆レシチンもしくは卵レシチンな
どの天然ホスファチドあるいは下記式（ＩＩ）の合成ホ
スファチドとを反応させることによって下記式（Ｉ）の
ホスファチドセリン類（以下、ＰＳと称する）を製造す
る方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】本発明に関わる化合物は以下の一般式
（Ｉ）および（ＩＩ）の構造を有する。
【０００３】
【化３】 式中、Ｒ1およびＲ2は同一もしくは異なっており、モノ
不飽和もしくは多価不飽和であっても良いＣ10〜Ｃ30ア
シルであり；ＸはＯＨもしくはＯＭであって、Ｍはアル
カリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウムまたはアル
キルアンモニウム（分子内塩を含む）であり；Ｒ3はＣ
Ｈ2ＣＨ2ＮＨ2またはＣＨ2ＣＨ2Ｎ+（ＣＨ3）3である。
【０００４】化合物（Ｉ）は各種分野で重要であり、ア
テローム性動脈硬化症に基づいたまたはそれ以外のもの
および／または老衰に基づく血管病理などの各種起源の
退行性脳症候群の治療用；リポソーム製剤の製造用なら
びに最近では天然レシチン、特にはアシル残基などの多
価不飽和脂肪酸を含有するホスファチジル−Ｌ−セリン
（以下、ＰＳ（Ｌ）と称する）豊富な大豆レシチンのよ
うな天然レシチン類を有してなる食事療法組成物用の医
薬組成物の製造において特に重要である。
【０００５】妥当なコストで工業的量のＰＳ（Ｌ）を得
ることへの需要が次第に大きくなっていることから、本
願出願人は、そのような要求を満足すべく徹底した検討
を行った。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】ホスファチジル基転移
反応で酵素触媒としてＰＬＤを使用してホスファチド
（Ｉ）を製造する技術は公知である。しかしながら、公
知の方法は実験室規模の製造（数グラム）に関するもの
であり、それらの方法には以下に説明するように、一連
の欠点があって、それが工業的大量化の妨げとなってい
る。
【０００７】さらに、特には不純な酵素を使用すると、
酵素反応の実験室的方法を工業的に再現することが困難
であることもわかっている。
【０００８】さらに言及しておくべき重要な点として、
ＰＬＤ酵素は、ホスファチジル基転移反応と競合して、
ホスファチドの水系加水分解をも触媒してホスファチジ
ル酸（以下、ＰＡと称する）を与え、その２つの反応の
速度は反応条件および当該酵素の起源によってかなり影
響される。
【０００９】例えば、コンフリウスら（Comfurius P. e
t al., Biochim. Biophys. Acta 488, 36(1977)）は、
加圧下に４５℃、ｐＨ５．６にて、酢酸エチル／水の二
相系で、ある程度精製したＰＬＤ酵素（キャベツから）
の存在下に卵レシチンもしくは合成ホスファチジルコリ
ンとＬ−セリンを反応させることによって、ＰＳ（Ｌ）
とＰＡの約１：１混合物を製造することを最初に開示し
ている。
【００１０】ＰＳ（Ｌ）は次に、溶離液としてクロロホ
ルム／メタノール混合液を用いるセルロースでのクロマ
トグラフィーによって精製される。そのような方法は、
酢酸エチルの使用と低い選択性のために、工業的製造に
は適さないことは明らかである。
【００１１】さらに興味深い結果が、ヤマネら（Yamane
T. et al., Biochim. Biophys. Acta 1003, 277(198
9)）によって報告されており、そこでは（Ｄ）−および
（Ｌ）−セリンを用いるホスファチジルコリン（以下Ｐ
Ｃと称する）変換において各種ホスファチジル基転移活
性を有する各種起源のＰＬＤ酵素（キャベツおよびスト
レプトミセス菌株からのもの）を比較している。ｐＨ、
溶媒、温度、試薬および酵素（固定化後のものについて
も）濃度などの各種反応パラメータの検討も行われてい
る。
【００１２】検討したｐＨは５．５〜７．０の範囲であ
り、遊離酵素に最も有効な二相溶媒系はエチルエーテル
−水または酢酸エチル−水であるが、ベンゼン、トルエ
ンおよびクロロホルムなどの溶媒は効果が低い。さら
に、酢酸エチルは固定化酵素には適さない。温度は２０
℃〜４０℃であり、反応速度が温度とともに上昇すると
しても試験は好ましくは３０℃で実施されている。試験
はｐＨ５．６、３０℃での溶解度に相当するセリン濃度
３．４Ｍで行われているが、ＰＣ濃度は非常に低く保た
れ（５３．４ｍＭ未満、通常は１７．８ｍＭ）、酵素濃
度は０．２〜０．８Ｕ／ｍｌ（１単位は、３０℃±０．
５℃で１分間で１μｍｏｌの純粋なＰＣを加水分解して
ＰＡとする酵素量と定義される）である。
【００１３】非常に純粋なホスファチジルコリンを用い
ると、至適反応条件では、ほぼ完全なＰＳの変換が行わ
れると考えられる。キャベツからのＰＬＤとは異なった
形で、細菌起源のＰＬＤも同様に（Ｄ）および（Ｌ）−
セリンを用いるホスファチジル基転移を触媒する。
【００１４】従来使用されてきた方法に対して利点を有
しているにもかかわらず、その試験は純粋な酵素および
非常に純粋なＰＣを用いて至適条件を見いだすことを目
的としており、低コスト・低純度のレシチンの使用や未
精製酵素の使用については言及されていないことから、
この方法でもやはり、工業的に利用できるものと考える
ことはできない。
【００１５】特開昭６３−０３６７９１号には、セリン
およびＰＬＤ用の吸着剤として多量の活性炭その他の担
体を使用し、リン脂質を溶解した低含水量（好ましくは
０．２％未満）の溶媒にその材料を懸濁させて、ＰＡの
競争的生成を低下させる方法が開示されている。別法と
して、その担体をカラムに充填し、そのカラムに上記有
機溶媒を流す方法がある。この方法では酵素および基質
を同じ担体に取り込む必要があり、低含水量が要求され
ることから、工業的に応用するのは困難である。
【００１６】特公昭６３−０３６７９２号には、溶媒と
しての水／ジイソプロピルエーテルの二相系でキャベツ
ＰＬＤを使用し、ミセル条件下で操作を行う方法が開示
されている。ＰＣ含有量が約６８％の部分精製大豆レシ
チンからは変換率が非常に低く、反応終了後のＰＳ
（Ｌ）含有率は２４％である。
【００１７】特公平０２−０７９９９６号にはそれより
良好な結果が報告されており、そこでは、酢酸エチル中
でストレプトミセス属のＰＬＤが使用されている。しか
しながら、原料として合成の純粋なホスファチジルコリ
ンを用いても、相当するＰＳ（Ｌ）の収率は約６８％で
あり、それは卵ＰＣをエチルエーテル中で、Nocardiops
isまたはActinomaduraのＰＬＤによってＰＳ（Ｄ）に変
換している特公昭６３−１２３３８９号に報告の収率と
同様である。
【００１８】最後に、オカハタらの報告（Okahata Y. e
t al., J.Chem.Soc. Perkin trans.1, 919(1995)）に
は、ｐＨ５．５の有機溶媒中で触媒活性を示すことがで
きる別個に製造した脂質でコーティングされたストレプ
トミセス属からのＰＬＤを利用することが開示されてい
る。この酵素は、反応が完結しない場合が多い粗酵素よ
りかなり活性が高いはずである。粗酵素の最大反応速度
は約４というより酸性側のｐＨで得られることがその論
文で認められているにもかかわらず、反応速度は脂質コ
ーティング酵素の速度の２％未満である。
【００１９】溶媒として二相の水／ベンゼン系を用い
て、脂質コーティング酵素を用いて４０℃で２４時間、
卵ＰＣを処理して、ＰＳ（Ｌ）が約７５％の収率で得ら
れると考えられる。
【００２０】上記の先行技術の所見から、当業者は次の
ような結論に達すると考えられる。
【００２１】−粗レシチンの使用は不便であり、可能で
もない。
【００２２】−精製酵素すなわち少なくとも粗材料では
ない高価な酵素を用いる必要がある。
【００２３】−工業的に許容され、無毒性で環境的に適
合する溶媒を使用することは困難である。
【００２４】−かなりのセリン過剰が必要であることか
ら、セリンの回収もしくはリサイクルの必要性を伴う。
さらに、上記の方法で開示されているクロマトグラフィ
ー法はそれらの方法を工業的に利用する上でさらに悪い
条件となる。
【００２５】
【課題を解決するための手段】驚くべきことに、本発明
は、好適なカットオフ値を持つ膜によって適宜に透析を
行った細胞外ＰＬＤ産生微生物菌株の発酵液を水系／有
機系の二相溶媒系、好ましくは水／トルエン中で用い
て、先行技術の欠点および偏向を克服することができる
方法を提供するものである。
【００２６】従って本発明は、高いホスファチジル基転
移活性を有する細胞外ＰＬＤを産生する微生物菌株の発
酵液の遠心したものから得た粗ホスホリパーゼＤの存在
下に、ホスファチド（ＩＩ）とラセミ体もしくはエナン
チオマー的に純粋なセリン、好ましくはＬ−セリンとを
反応させる工程を有する化合物（Ｉ）の製造方法を提供
するものである。
【００２７】別の実施態様において本発明は、高いホス
ファチジル基転移活性を有する細胞外ＰＬＤを産生する
新たなストレプトミセス属菌株を提供するものでもあ
る。
【００２８】その菌株は、寄託番号５５７１７で、１９
９５年１０月１３日にＡＴＣＣに寄託してある。
【００２９】本発明の方法は、公知の好適な菌株を用い
ても有効に実施することができる。
【００３０】
【発明の実施の形態】好ましい有機溶媒であるトルエン
は、低コスト、低毒性、環境的適合性、ホスファチド
（ＩＩ）と特に粗レシチンおよびＰＳの高い溶解度、セ
リンの低い溶解度（それによって、産生ＰＳから大過剰
に存在するこのアミノ酸を除去・回収することができ
る）、ＰＬＤの酵素活性との適合性、十分に早く非常に
選択的な（ＰＳ／ＰＡ比）ホスファチジル基転移反応の
提供などの多くの利点を提供するものである。
【００３１】さらにトルエンを用いると、溶解および濃
縮を反復することによって、市販のレシチンには０．５
％以下で存在する１級アルコール、特にはエタノール
を、使用されるレシチンから完全に除去することができ
る。それらのアルコールは、ホスファチジル基転移反応
でセリン競合剤として極めて反応性が高く、多い場合は
８％という収率でホスファチジルエタノールなどの望ま
しくないホスファチドを生成して、結果的にＰＳの品質
および収率を低下させることになると考えられる。
【００３２】反応は好ましくは２５±５℃で、４〜４．
５のｐＨ値にて行われる。それに対して先行技術の方法
でのｐＨは５以上であった。さらに、既報の結果とは対
照的に、本発明者らは、反応温度が４０℃以上となった
場合には選択性が低下することを認めている。撹拌方法
および添加方法などの他の反応条件や、アルカリ金属も
しくはアルカリ土類金属のイオンなどの添加剤の存在は
従来の通りであり、当業者には容易に決定できるもので
ある。
【００３３】驚くべきことに本発明の方法は、エピクロ
ン（Epikuron）２００（登録商標；Lucas Meyerから市
販の９５％大豆ＰＣ）などの高純度レシチンとＰＣ（３
５％）およびＰＥ（８％）およびトリグリセリド類（５
０％）の混合物からなるエピクロン１３５（登録商標；
Lucas Meyer）などの低コスト・低純度レシチンの両方
に、好適に適用することができる。そして同じことが、
オボチン（Ovothin）１６０（６０％卵ＰＣ、Lucas Mey
er）などの卵ＰＣまたは式（ＩＩ）の合成ホスファチド
にも当てはまる。
【００３４】最後に、本発明はまた、ＰＳ、ＰＡ、Ｐ
Ｃ、ＰＥなどのホスファチドと相当する塩、特にはヘプ
タン／メタノール二相系での相当するカルシウム塩の形
での相当するリゾホスファチドの二相有機溶媒系中での
分配係数が異なることに基づいた、得られるＰＳの精製
方法をも提供するものである。
【００３５】ヘプタン相でのその好ましい再分配（ripa
rtition）により、エピクロン２００から得られる収率
９０％で得られるＰＳ（Ｌ）の純度は８８％から９５％
に上昇させることが可能であり、同様に、エピクロン１
３５から得られるＰＳ（Ｌ）の純度は５８％から約８０
％まで上昇した。最後に、ヘプタン／アセトンからカル
シウム塩の形で結晶化し、次に従来の技術によって他の
何らかの塩に変換することで、さらにＰＳを精製するこ
とができる。
【００３６】セリンの回収は、各種の方法によって行う
ことができる。第１の方法は、トルエン相の分離と活性
炭による処理後のホスファチジル基転移反応からの水溶
液の減圧下での部分濃縮と、その溶液からのセリンの結
晶化を行うものである。別法として、その後のバッチで
完了した反応液から水相をリサイクルして含有セリンの
単離を回避することが可能である。これは、活性炭で水
相を処理し、接線流電気透析装置にてセリンの等電性ｐ
ＨであるｐＨ５．７で電気透析を行うことによって無機
塩とコリン塩を除去し、電気透析時にｐＨ値を一定に保
つことによって行われる。得られる水溶液をそのまま用
いるか、あるいは減圧下もしくは逆浸透によってその水
溶液を適宜に濃縮した後に用いることができる。
【００３７】電気透析に代えて、イオン交換樹脂を用い
て無機塩およびコリン塩を除去し、次にその水溶液を上
記の方法で濃縮して、同様の方法を行うこともできる。
【００３８】本発明の方法は、上記のホスファチジル−
（Ｌ）−セリン類（Ｒ1およびＲ2は大豆レシチンの場合
と同様の割合でのパルミチン酸、ステアリン酸、オレイ
ン酸、リノール酸のアシル鎖であるか、あるいはＲ1お
よびＲ2は卵レシチンの場合と同様の割合でのパルミチ
ン酸、ステアリン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、
リノール酸、アラキドン酸のアシル鎖である）の製造に
容易に適用することができる。
【００３９】以下に記載の方法によって本発明をさらに
具体的に説明する。
【００４０】
【実施例】実施例１ ＰＬＤ触媒の製造（一般的手順） グルコース（１０ｇ／ｌ）、酵母抽出物（２０ｇ／
ｌ）、ペプトン（５ｇ／ｌ）、Ｋ2ＨＰＯ4（２ｇ／
ｌ）、ＭｇＳＯ4・７水和物（０．５ｇ／ｌ）から成る
培地２００ｍｌを１Ｍ ＨＣｌを加えてｐＨ７としたも
のの入った複数の１リットルフラスコ中で２４時間撹拌
下に、使用する各種ストレプトミセス菌株を成長させ
た。その培養液を用いて同じ栄養培地５リットルと必要
に応じて消泡剤の入った１０リットル発酵槽に接種し、
０．１Ｍ ＮａＯＨまたは０．１Ｍ ＨＣｌを自動的に加
えることによってｐＨ値を７で一定に保ちながら、回転
数５００ｒｐｍで撹拌しながら、気流下に３０℃で２４
時間発酵を継続した。その後、その発酵液を遠心し、４
℃で保存した。
【００４１】同様の手順で２０００リットルのリアクタ
中で工業的発酵を行ったところ、２３時間後に、文献記
載の試験（Biotechn. Techn., 7, 795(1993)）によって
測定した発酵液の最終活性は２〜３Ｋｕ／ｌのＰＬＤで
あった。得られた発酵液を遠心し、そのまま使用する
か、あるいは０．１Ｍ酢酸ナトリウムを緩衝液として用
いてｐＨ値を５．６として、１００００ダルトンのカッ
トオフ値を持つミリポア（Millipore）膜による限外濾
過によって当初容量の約１／１０まで濃縮した後に使用
した。
【００４２】実施例２ 大豆レシチンのエピクロン２００を原料とするＰＳ
（Ｌ）の製造 エピクロン２００（Lucas Meyer）２０ｇとトルエン１
００ｍｌを窒素下に１０００ｍｌリアクタに入れ、減圧
下に溶媒約８０ｍｌを留去してその溶液を濃縮する。新
鮮なトルエンを加え、溶液を再度減圧下に濃縮する。そ
の手順を繰り返して、市販のレシチンに通常存在してい
るエタノールその他のＣ1〜Ｃ4アルコールの含有量を２
０ｐｐｍ以下まで低下させる。残留物を新鮮なトルエン
に取って容量を４００ｍｌとし、（Ｌ）−セリン９４．
５ｇを加える。得られる懸濁液に、実施例１の手順に従
って製造され２Ｕ／ｍｌの酵素活性を有するＡＴＣＣ５
５７１７からのＰＬＤを含有する水溶液（３００ｍｌ）
を加え、１０℃で塩化カルシウム３．３４ｇ、酢酸ナト
リウム・３水和物４．０８ｇおよび氷酢酸約３ｇを加え
て、ｐＨを約４．５とする。得られる二相系を昇温して
２５±２℃の温度とし、その温度で約６時間にわたって
強撹拌する。その混合物をデカライト（decalite）で濾
過し、デカライトをさらにトルエン１００ｍｌで２回洗
浄する。有機相を、過剰のセリンを含む水相から分離
し、減圧下に濃縮して残留物を得て（２２．３ｇ）、そ
れをｎ−ヘプタン５２５ｍｌとメタノール１７１ｍｌと
に取る。下層のメタノール相を廃棄し、上層をさらにメ
タノール２２０ｍｌで抽出する。分液後、上側の相を減
圧下に濃縮して少量とし、−５℃で撹拌しながらアセト
ン４００ｍｌを加え、濾過し、減圧下に乾燥して、ＨＰ
ＬＣで９７％（ＰＡ含有率３％未満）のＰＳ（Ｌ）カル
シウム塩１５ｇを得る。
【００４３】セリンを含む水相は活性炭１６ｇで処理
し、デカライト濾過し、次に減圧下に（３０ｍｍＨｇ）
溶媒の約７０％を留去してそれを濃縮し、次に冷却、濾
過および５０℃での乾燥を行って、純粋な（Ｌ）−セリ
ン約５２ｇを得る。過剰のセリン（約４３ｇ）を含む母
液を、別のＰＳ合成から生じる水相に加えて、後に回収
する。
【００４４】実施例３ 大豆レシチンのエピクロン１３５を原料とするＰＳ
（Ｌ）の製造 エピクロン１３５（Lucas Meyer）４００ｋｇ、トルエ
ン３０００リットルおよび水１００リットルを窒素下に
５０００リットルのステンレス製リアクタに入れ、減圧
下に４５℃で溶媒約１０００リットルを留去してその混
合物を濃縮する。別の６０００リットルのステンレス製
リアクタに、約３ＫＵ／ＩのＰＬＤを含むＡＴＣＣ５５
７１７からの発酵液１３５５リットル、塩化カルシウム
２２．７ｋｇ、酢酸ナトリウム・３水和物２７．６ｋｇ
と、１０℃で８０％酢酸２２リットルおよびＬ−セリン
６２５ｋｇを加える（最終ｐＨは４．２）。その２つの
溶液を合わせ、得られる混合物を昇温して２５℃として
その温度に維持して、８時間強撹拌する。ＨＰＬＣ分析
により、総リン脂質中のＰＳ（Ｌ）含有率が約７５％で
あることが明らかになる。その混合物にデカライト３６
ｋｇをトルエン／水（体積基準で３／１）５００リット
ルに懸濁させたものを加え、濾過し、フィルターをトル
エン／水（体積基準で３／１）４００リットルで洗浄す
る。水相は以下の実施例６に記載の方法と同様にして分
液・処理して（Ｌ）−セリンを回収し、有機相はさらに
デカライトで濾過してから減圧下に濃縮して約４４０ｋ
ｇの残留物とし、それをアセトン５０００リットルで取
り、室温で６時間撹拌する。その混合物を０℃に冷却
後、生成物を濾過して、ＰＳ（Ｌ）の湿カルシウム塩約
３２３ｋｇを得る（５０％）。
【００４５】その生成物をさらにアセトン２０００リッ
トルで処理して精製し、乾燥して、ＰＳ（Ｌ）カルシウ
ム塩約２７３ｋｇを得る（５８％）。
【００４６】実施例２に記載の方法と同様にして、ヘプ
タン／メタノールでの抽出によってサンプル２０ｇを精
製して、ＰＳ（Ｌ）カルシウム塩１１．６ｇを得た（８
０％）。
【００４７】実施例４ 卵レシチンを原料とするＰＳ（Ｌ）の製造 オボチン１６０（６０％ＰＣ；Lucas Meyer）１３ｇ、
トルエン１５８ｍｌおよび（Ｌ）−セリン３８ｇを窒素
下に５００ｍｌのリアクタに入れる。得られる懸濁液
に、実施例１の手順に従って得られた酵素活性２Ｕ／ｍ
ｌのＡＴＣＣ５５７１７からのＰＬＤを含有する水溶液
（３００ｍｌ）を加え、１０℃で塩化カルシウム１．４
ｇ、酢酸ナトリウム・３水和物１．７ｇおよびｐＨを約
４．１とするのに必要な氷酢酸を加える。得られる二相
系を昇温して２５±２℃の温度とし、その温度で約６時
間にわたって強撹拌する。その混合物をデカライトで濾
過し、デカライトをさらにトルエン１００ｍｌで２回洗
浄する。有機相を、過剰のセリンを含む水相から分離
し、減圧下に濃縮して残留物を得て、それをｎ−ヘプタ
ン３２０ｍｌとメタノール１００ｍｌとに取る。下層の
メタノール相を廃棄し、上層をさらにヘプタン３５ｍｌ
で希釈し、メタノール９５ｍｌでさらに抽出する。上側
の相を分液し、減圧下に濃縮して少量とし、−５℃で撹
拌しながらアセトン２５０ｍｌを加え、濾過し、減圧下
に乾燥して、ＨＰＬＣで８４％のＰＳ（Ｌ）カルシウム
塩７．３ｇを得る。
【００４８】実施例５ ＤＬＰＣを原料とするＤＬＰＳ（Ｌ）の製造 エピクロン２００（２０ｇ）に代えてＬ−α−ジリノネ
イル（ｄｉｌｉｎｏｎｅｙｌ）ホスファチジルコリン
（以下、ＤＬＰＣと称する）２０ｇを用いる以外、実施
例２に記載の手順を繰り返して、Ｌ−α−ジリノネイル
（ｄｉｌｉｎｏｎｅｙｌ）ホスファチジル−Ｌ−セリン
１５．１ｇをカルシウム塩として得る（ＨＰＬＣで純度
９６％）。
【００４９】実施例６ Ｌ−セリンの回収およびリサイクル 実施例３の手順によるホスファチジル基転移反応終了
後、トルエン溶液の分離とデカライトでの濾過後に得ら
れた水溶液（１０リットル）を活性炭０．３ｋｇで処理
し、３０％ＮａＯＨ水溶液を加えてｐＨを５．７に調節
した。得られた溶液を、送液チャンバーのｐＨを５．７
±０．５に維持しながら接線流電気透析装置中で４時間
経過させた。
【００５０】その間の送液チャンバーでの伝導率は、開
始時値１２７００μシーメンス／ｃｍから最終値４８０
μシーメンス／ｃｍに低下した。その後のホスファチジ
ル基転移反応では新鮮な固体Ｌ−セリンに代えて、逆浸
透によって適切に濃縮したそのＬ−セリン水溶液（アミ
ノ酸回収率９７％）を再度使用し、同様の結果を得た。
フロントページの続き (72)発明者 ピエトロ マッサルド イタリア国 パトリカ ヴィア ヴァディ ージ ５ (72)発明者 オレステ ピッコロ イタリア国 パトリカ ヴィア ヴァディ ージ ５ (72)発明者 ステファノ セルヴィ イタリア国 ミラノ ヴィア ヴォルヴィ ーニオ 22

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記式（Ｉ）の化合物 【化１】 ［式中、Ｒ1およびＲ2は同一もしくは異なっており、モ
    ノ不飽和もしくは多価不飽和であっても良いＣ10〜Ｃ30
    アシルであり；ＸはＯＨもしくはＯＭであって、Ｍはア
    ルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウムまたはア
    ルキルアンモニウム（分子内塩を含む）である。］の製
    造方法において、 高いホスファチジル基転移活性を有する細胞外ホスホリ
    パーゼＤを産生する微生物菌株の発酵液の遠心したもの
    から得た粗ホスホリパーゼＤの存在下に、水系／有機系
    の二相溶媒系中で、下記一般式（ＩＩ） 【化２】 ［式中、Ｒ1、Ｒ2およびＸは上記で定義した通りであ
    り、Ｒ3はＣＨ2−ＣＨ2ＮＨ2またはＣＨ2−ＣＨ2Ｎ
    +（ＣＨ3）3である。］のホスファチドとラセミ体もし
    くはエナンチオマー的に純粋なセリン、好ましくはＬ−
    セリンとを反応させる工程を有する方法。
  2. 【請求項２】 有機溶媒がトルエンであることを特徴と
    する請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 一般式（ＩＩ）のホスファチドが、リン
    脂質含有率２０％〜９５％である大豆もしくは卵のレシ
    チンから選択される天然起源のホスファチジルコリンお
    よび／またはホスファチジルエタノールアミンの混合物
    であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 反応ｐＨが４〜４．５であることを特徴
    とする請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 反応温度が２５℃±５℃であることを特
    徴とする請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 粗ホスホリパーゼＤがストレプトミセス
    菌株ＡＴＣＣ５５７１７によって産生されたものである
    ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 Ｒ1およびＲ2が大豆レシチンと同様の割
    合でのパルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノ
    ール酸またはリノレン酸のアシル鎖であることを特徴と
    する請求項１に記載のホスファチジル−（Ｌ）−セリン
    の製造方法。
  8. 【請求項８】 Ｒ1およびＲ2が卵レシチンと同様の割合
    でのパルミチン酸、ステアリン酸、パルミトレイン酸、
    オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸のアシル鎖であ
    ることを特徴とする請求項１に記載のホスファチジル−
    （Ｌ）−セリンの製造方法。
  9. 【請求項９】 有機溶媒の二相系でＰＳを含有するリン
    脂質混合物の選択的抽出を行うことによる、アルカリ金
    属、アルカリ土類金属、アンモニウムまたはアルキルア
    ンモニウムの塩の形でのホスファチジルセリンの精製方
    法。
  10. 【請求項１０】 ヘプタン／メタノール混合液から相当
    するカルシウム塩を選択的に抽出することで、他のリン
    脂質、特にはＰＣ、ＰＥ、ＰＡおよび相当するリゾリン
    脂質からホスファチジルセリンを精製することを特徴と
    する請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 請求項１０記載の方法に従って得られ
    るホスファチジルセリンのさらなる精製方法であって、
    ホスファチジルセリンについて、カルシウム塩の形でヘ
    プタン／アセトンから結晶化を行い、次に従来技術に従
    って他の塩に変換することを特徴とする精製方法。
  12. 【請求項１２】 請求項１記載の方法に従って実施され
    るホスファチジル基転移反応の水溶液から、結晶固体と
    してＬ−セリンを回収する方法であって、有機相を分液
    した後、該水溶液を減圧下に部分的に濃縮して、結晶の
    Ｌ−セリンを沈殿させることを特徴とする回収方法。
  13. 【請求項１３】 請求項１記載の方法に従って実施され
    るホスファチジル基転移反応の水溶液から、無機塩およ
    びコリン塩を含まない水溶液の形でＬ−セリンを回収す
    る方法であって、濾過および有機相の分液後、該水相に
    ついてｐＨ値５．７±０．５での電気透析を行うかある
    いは別法としてイオン交換樹脂で処理することを特徴と
    する回収方法。
  14. 【請求項１４】 １９９５年１０月１３日に寄託番号５
    ５７１７でＡＴＣＣ（American Type Culture Collecti
    on）に寄託されたストレプトミセス菌株。
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