JP4792154B2 - ホスファチジルセリンの製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はホスファチジルセリンの製造方法に関する。特に、本発明は、水性媒体中で天然又は合成のリン脂質をセリンと反応することにより、リン脂質から出発してホスファチジルセリンを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ホスファチジルセリンは、多岐にわたる重要性を有し、特に老化又は血管病理性などの各種起源の退行性脳疾患の治療に好適な医薬組成物の製造、特殊なリポソーム製剤の製造用、並びに最近ではホスファチジル−Ｌ−セリン（以下、ＰＳという。）が豊富な天然レシチン、特に大豆レシチンを含み、さらにポリ不飽和脂肪酸のアシル残基も含有する食事療法組成物の商業化に特に重要である。
【０００３】
低価格のＰＳを工業的な量で得ることが次第に求められていることから、本願出願人は、工業的な規模における実施可能性の要求を満足すべくこの製品を製造する条件を見出すために広範囲にわたる検討を行った。
【０００４】
本願出願人による米国特許第5,700,668号には、ＰＳの製造方法が開示されている。それによると、先行技術（特に、Comfurius P. et al., Biochim. Biophys. Acta 488, 36(1977)、Yamane et al., Biochim. Biophys. Acta 1003, 277 （1989）、特開昭63−036791号公報、特開平02−079990号公報、及びJ. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 919（1995）参照）のものとは対照的に、工業規模で高収率で、しかも精製していない出発材料から、かつクロマトグラフ精製を用いることなくＰＳが製造できる。
【０００５】
この米国特許に記載の方法は、有機溶媒、代表的にはトルエンに原料ホスファチドを溶解した溶液と、セリン及びホスホリパーゼＤを含む水溶液とからなる二相系中で天然ホスファチド又は合成ホスファチドとセリンとを反応させるものである。前記の系を十分撹拌すると、ホスファチドはＰＳに変換され、ＰＳはアセトンで沈殿することによって有機相から回収することができる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
類似の方法は、高収率で大規模にホスファチジルセリンを製造するけれど、有機溶媒の使用を減らし、副製品を最少にするという工業的な化学プロセスの現在のトレンドから懸け離れている。実際、この方法は、膨大な量の有機溶媒の使用（及びリサイクル）と、反応中及び最終製品の単離中の両方でそれらの回収を含んでいる。
【０００７】
本発明は、先行技術に関する上述の欠点を克服し、工業規模でホスファチジルセリンを製造する方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明により、係る問題は解消された。すなわち、本発明は、下記一般式（１）で表されるホスファチジルセリンの製造方法において、
【０００９】
【化３】
【００１０】
（式（１）において、Ｒ1及びＲ2は独立して、飽和、モノ不飽和又はポリ不飽和のＣ10〜Ｃ30のアシル基であり、ＸはＯＨ又はＯＭであり、Ｍはアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム又は分子内塩を含むアルキルアンモニウムである。）
【００１１】
下記一般式（２）で表されるホスファチドと、ラセミ体もしくはエナンチオマー的に純粋なセリン、好ましくはＬ−セリンとをホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）の存在下に反応させることからなり、反応媒体が水性分散液であることを特徴とする式（１）のホスファチジルセリンを製造する方法である。
【００１２】
【化４】
【００１３】
（式（２）において、Ｒ1、Ｒ2及びＸは上記式（１）で定義したとおりであり、Ｒ3はＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ2又はＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+（ＣＨ3）3である。）
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の方法に用いる出発原料は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）のような合成ホスファチジルコリン（ＰＣ）又は天然のホスファチジルコリン又は、大豆又は卵のレシチンあるいは大豆又は卵のレシチンの部分精製により得られる商業的に入手可能なリン脂質混合物のようなリン脂質混合物のいずれでもよい。これらのリン脂質含有率は２０重量％〜９５重量％であることが好ましい。
【００１５】
プロセスコストに関する限り、レシチンから誘導された出発原料を用いることは、それらの低コストと、それらの混合物の重要な成分であるホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）はその反応条件下にＰＳに変換されるという事実の両方の観点から、とりわけ好都合である。
【００１６】
出発原料は、他の試薬を加える前に、活性を促進するために、水性媒体中に十分分散されるべきである。
分散は、出発リン脂質原料を３〜１０容量倍の水又は塩溶液と２０〜５０℃で１〜１０時間撹拌することを保持することにより行われる。
【００１７】
この段階で界面活性剤を使用すると、基質の分散が促進され、その結果反応速度が速くなる。
イオン系又は非イオン系界面活性剤を好ましく用いることができ、界面活性剤は、より好ましくは、ビス−（２−エチルヘキシル）スルホこはく酸エステル（ＡＯＴ）又はポリオキシエチレンソルビタンモノオレート（Ｔｗｅｅｎ ８０(R)）であり、基質（ホスファチド）１ｇ当たり０．０１〜０．４ｇ添加する。
これらの界面活性剤の効果は、水性媒体に分散する傾向が劣るＤＭＰＣのようなホスファチジルコリンを用いるとき、特に好適である。
【００１８】
本発明のさらなる特徴は、天然のリン脂質（例えば、大豆レシチンから得られるホスファチジルコリン濃縮分画）の調製物をしばしば汚濁するか、もしくは、それら（アルコール溶媒）はホスホリパーゼＤの存在下に反応し、相当するホスファチジル誘導体（エタノールが混合物中に存在するときホスファチジルエタノールのような誘導体）を生成することから、引き続いて起こるＰＳ形成反応において邪魔をするアルコール溶媒、特にエタノール、を容易に除去することができることである。
【００１９】
これは、水性塩溶液中に出発リン脂質を分散し、その懸濁物をデカンテーションし、エタノールが溶け込んでいる液体相を除去することによって簡便に除去することができる。ホスファチドは、不純物のアルコール含有量が０．１重量％以下であることが好ましい。
【００２０】
水性塩溶液として十分高い密度を有する塩溶液であれば如何なるものも使用でき、容易に出発原料を分離できる。好ましくは、塩化カルシウム溶液又は酢酸ナトリウム／酢酸緩衝溶液又はそれらの混合物である。
【００２１】
出発原料の水性分散液には、セリン、塩化カルシウム、ｐＨ制御のバッファー及びホスホリパーゼＤを含む水溶液が添加される。
【００２２】
セリンの量は、ＰＳに変換するために便宜的にはリン脂質１モル当たりセリン４〜２０モルの範囲とする。セリンは、Ｄ体、Ｌ体又はラセミ体であってもよく、どの場合にも、対応するホスファチジル誘導体が得られる。
【００２３】
塩化カルシウムは、ホスホリパーゼＤ触媒反応に好ましいカルシウムイオンの源泉であり、さらに、カルシウムイオンの存在により、反応の終結後、簡単に濾過できる形でホスファチジルセリンの分離が誘導される。
塩化カルシウムの濃度は、好ましくは０．０５〜０．５Ｍの範囲である。
【００２４】
水溶液のｐＨは、用いる酵素の起源に依存し、ｐＨ４〜９、特にはｐＨ４〜４．５が好ましい。酵素の場合、実質的に酸媒体においてそれらの活性を発揮するので、水溶液は０．０２〜０．２Ｍ 酢酸塩でバッファーすることが好ましい。
【００２５】
加水分解活性より高いホスファチジル変換（transphosphatidylation）活性を有する酵素は、反応を遂行する酵素として好適に用いることができる。発酵起源の酵素は有用に用いることができ、さらに、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）に寄託番号５５７１７号として寄託された微生物の発酵により得られた酵素が好ましい。
【００２６】
酵素は、粗酵素の形で、すなわち微生物を濾過除去した後の発酵混合物を使用することができるし、より好ましくは、低分子量の不純物を除去するために適切なカットオフ値（例えば、１０，０００ダルトン）を有する膜をとおす限外濾過による精製後のものを使用することもできる。酵素濃縮溶液はそのまま用いても、あるいはそれを凍結乾燥して固体の形で得た酵素を用いることもできる。酵素の量は、好ましくは、ホスファチド１ｇ当たり１０〜１００unitsの範囲である（酵素活性は、Biotechn 7, 795 (1993) に記載される試験で測定できる）。
【００２７】
反応は、好ましくは２５〜６０℃、より好ましくは４０〜５０℃で行うことができる。
ＰＳは、反応混合物を濾過し、セリン及び存在する塩を除去するために水で洗浄することによって回収される。
【００２８】
本発明の方法の特に有用な点は、反応生成物（ＰＳ）がその反応混合物から、その回収が溶剤を添加して沈殿させることを必要とせずに簡単な濾過により効果的になされるという形で、分離されることである。
【００２９】
本発明の方法の主要な利点は、水性媒体中でホスファチジルコリン及び類似のホスファチドのホスファチジル変換反応を遂行し、良好な純度のホスファチジルセリンを、しかも満足できる高い収率で得るという、先行技術から予測され得ない、実施可能性にある。
【００３０】
【実施例】
本発明の特徴及び利点を、以下の実施例によりさらに詳細に示す。
なお、％は、特に断らない限り、以下重量％を示す。
【００３１】
実施例１
純度９５％の大豆ホスファチジルコリン５ｇを、ｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸塩バッファー３０ｍｌに加えた。混合物を４０℃で１時間撹拌し、リン脂質を水相に均一に分散した。寄託番号ＡＴＣＣ ５５７１７号で寄託した微生物の発酵により得られた粗酵素溶液を、１０，０００ダルトンで分画する限外濾過膜を通して低分子量の不純物を完全に除去するまで透析した。なお、酵素としては２Ｕ／ｇの活性を有する８０ｍｌのホスホリパーゼＤ溶液からなる酵素溶液を用いた。この酵素溶液にＬ−セリン４０ｇ及び塩化カルシウム２．９ｇを加えた。得られた溶液をホスファチジルコリン分散液に加え、その混合物を４５℃に加熱した。
６時間撹拌し反応を行った。固体を濾別し、水で洗浄し、そして乾燥した。最終物の重量は４．２４ｇであった。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による組成分析結果：ＰＳ ９０．７％、ＰＣ １．４％、ＰＡ（ホスファチジン酸）６．２％。
【００３２】
実施例２
純度９５％の大豆ホスファチジルコリン５ｇを、Ｔｗｅｅｎ ８０(R)を０．０８ｇ含有するｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸塩バッファー３０ｍｌに加えた。混合物を４０℃で１時間撹拌し、リン脂質を水相に均一に分散した。実施例１に記したようにして得られた２Ｕ／ｇの活性を有するホスホリパーゼＤ溶液８０ｍｌにＬ−セリン４０ｇ、塩化カルシウム２．９ｇを加えた。得られた溶液をホスファチジルコリン分散液に加え、その混合物を４５℃に加熱した。９０分後のＨＰＬＣ分析による組成は次のとおり：ＰＳ ６９．７％、ＰＣ １１．６％、ＰＡ ５．３％。さらに４時間撹拌して反応を進めた。固体を濾別し、水で洗浄し、そして乾燥した。最終物の重量は４．７６ｇであった。
ＨＰＬＣ 組成： ＰＳ ９０．２％、ＰＣ ０．６％、ＰＡ ６．４％。
【００３３】
実施例３
純度９５％の大豆ホスファチジルコリン５ｇを、ＡＯＴを０．3ｇ含有するｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸塩バッファー３０ｍｌに加えた。混合物を４０℃で１時間撹拌し、リン脂質を水相に均一に分散した。実施例１に記したようにして得られた２Ｕ／ｇの活性を有するホスホリパーゼＤ溶液８０ｍｌにＬ−セリン４０ｇ、塩化カルシウム２．９ｇを加えた。得られた溶液をホスファチジルコリン分散液に加え、その混合物を４５℃に加熱した。
６時間反応した後、固体を濾別し、水で洗浄し、そして乾燥した。最終物の重量は４．１６ｇであった。
ＨＰＬＣ 組成： ＰＳ ８８．８％、ＰＣ ０．６％、ＰＡ ４．１％。
【００３４】
実施例４
主な成分がＰＣ６６％、ＰＥ１７％、ＰＡ２％である大豆レシチンを濃縮することにより得られたリン脂質２５ｇを、ｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸塩バッファー１００ｍｌに加えた。混合物を４０℃で１時間撹拌し、リン脂質を水相に均一に分散した。ｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸塩バッファー８０ｍｌ、Ｌ−セリン４０ｇ、塩化カルシウム２．９ｇの溶液を別途調製し、この溶液に実施例１に記したようにして得られたホスホリパーゼＤ溶液を凍結乾燥して得た固体１８８ｍｇを加えた。この固体の活性は０．９Ｕ／ｍｇである。得られた溶液をリン脂質分散液に加え、その混合物を４５℃に加熱した。
混合物を３時間撹拌した。固体を濾別し、水で洗浄し、そして乾燥した。最終物の重量は２２．８ｇであった。
ＨＰＬＣ 組成： ＰＳ ５９．８％、ＰＣ １．６％、ＰＡ ６．１％、ＰＥ ６．７％。
【００３５】
実施例５
出発原料として、実施例４で用いたリン脂質を、ｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸塩バッファー１００ｍｌに加えた。混合物を４０℃で１時間撹拌し、リン脂質を水相に均一に分散した。ｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸塩バッファー８０ｍｌ、Ｌ−セリン４０ｇ及び塩化カルシウム２．９ｇの溶液を別途調製し、この溶液に実施例４に記したように調製した凍結乾燥酵素９０ｍｇを加えた。得られた溶液をリン脂質分散液に加え、その混合物を４５℃に加熱し、そして１６時間撹拌した。最終組成物をＨＰＬＣで分析した：ＰＳ ３９．１％、ＰＣ ８．３％、ＰＡ １６．６％、ＰＥ ６．８％。
【００３６】
実施例６
反応中温度を５５℃に保持した以外は実施例５に記載した条件と同じ条件で反応を行った。１６時間後、反応を中止した。ＨＰＬＣ分析による組成は次のとおり：ＰＳ ４１．７％、ＰＣ ８．３％、ＰＡ １１．０％、ＰＥ ９．９％。
【００３７】
実施例７
塩化カルシウムを添加しなかった以外は実施例４に記載した条件と同じ条件で反応を行った。２０時間後、反応を中止した。ＨＰＬＣ分析による組成は次のとおり：ＰＳ ４１．２％、ＰＣ １５．９％、ＰＡ １０．９％、ＰＥ ７．４％。
【００３８】
実施例８
実施例４で出発原料として用いたリン脂質２ｇを、水４０ｍｌ中に塩化カルシウム３ｇを含む溶液が入った分液漏斗に加え、その混合物を２５℃で１時間撹拌した。撹拌を中止して３時間放置後、水相の３６ｍｌを底部バルブで抜き出した。ｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸塩バッファー６．５ｍｌ、Ｌ−セリン３．２ｇの溶液を別途調製し、この溶液に実施例４に記したように調製した凍結乾燥酵素１５ｍｇを加えた。得られた溶液をリン脂質分散液に加え、その混合物を４５℃に加熱した。
１時間撹拌し反応した。最終組成物をＨＰＬＣで分析した：ＰＳ ５５．７％、ＰＣ ９．４％、ＰＡ ４．０％、ＰＥ ９．０％。なお、この反応におけるホスファチジルエタノールの生成は、薄層クロマログラフィー（ＴＬＣ）検出限界以下（０．１％）であった。
【００３９】
実施例９
ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）５ｇ、Ｔｗｅｅｎ ８０(R)１．６ｇ及びｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー３０ｍｌを４５℃で１時間撹拌した。この分散液を実施例１に記載するようにして得た水性ホスホリパーゼＤ溶液８０ｍｌ、Ｌ−セリン４０ｇ、塩化カルシウム２．９ｇの溶液に加え、５０℃の温度で１７時間撹拌した。固体を濾別し、水で洗浄し、そして乾燥した。最終物の重量は５．４ｇであった。
ＨＰＬＣ 組成： ＰＳ ８３．２％、ＰＣ ４．３％、ＰＡ １１．７％。
【００４０】
実施例１０
ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）５ｇ、ＡＯＴ１．０ｇ及びｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー３０ｍｌを５０℃で４５分間撹拌した。この分散液を実施例１に記載するようにして得た水性ホスホリパーゼＤ溶液８０ｍｌ、Ｌ−セリン４０ｇ、塩化カルシウム２．９ｇの溶液に加え、５０℃の温度で２０時間撹拌した。固体を濾別し、水で洗浄し、そして乾燥した。最終物の重量は３．６６ｇであった。
ＨＰＬＣ 組成： ＰＳ ８５．２％、ＰＣ １０．５％、ＰＡ ３．５％。
【００４１】
実施例１１
オレイン酸エステル分解ぜず（non-deoleated）、トリグリセライドを除去していない大豆レシチンのＰＣ濃縮分画（組成：トリグリセライド５０％、ＰＣ３５％、ＰＥ８％）１０ｇをｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー３０ｍｌに加え、２５℃で１時間撹拌した。この混合物を実施例１に記載するようにして調製したホスホリパーゼＤ酵素の溶液８０ｍｌ、Ｌ−セリン４０ｇ及び塩化カルシウム２．９ｇの溶液に加えた。４５℃の温度で１１時間撹拌し反応した。水相を分離し、ゴム状の固体にアセトン１００mlを加えた。濾過後乾燥して３．９ｇの製品を得た。
ＨＰＬＣ 分析： ＰＳ ５８％、ＰＣ ２．０％、ＰＡ １７．０％、ＰＥ １．８％。
【発明の属する技術分野】
本発明はホスファチジルセリンの製造方法に関する。特に、本発明は、水性媒体中で天然又は合成のリン脂質をセリンと反応することにより、リン脂質から出発してホスファチジルセリンを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ホスファチジルセリンは、多岐にわたる重要性を有し、特に老化又は血管病理性などの各種起源の退行性脳疾患の治療に好適な医薬組成物の製造、特殊なリポソーム製剤の製造用、並びに最近ではホスファチジル−Ｌ−セリン（以下、ＰＳという。）が豊富な天然レシチン、特に大豆レシチンを含み、さらにポリ不飽和脂肪酸のアシル残基も含有する食事療法組成物の商業化に特に重要である。
【０００３】
低価格のＰＳを工業的な量で得ることが次第に求められていることから、本願出願人は、工業的な規模における実施可能性の要求を満足すべくこの製品を製造する条件を見出すために広範囲にわたる検討を行った。
【０００４】
本願出願人による米国特許第5,700,668号には、ＰＳの製造方法が開示されている。それによると、先行技術（特に、Comfurius P. et al., Biochim. Biophys. Acta 488, 36(1977)、Yamane et al., Biochim. Biophys. Acta 1003, 277 （1989）、特開昭63−036791号公報、特開平02−079990号公報、及びJ. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 919（1995）参照）のものとは対照的に、工業規模で高収率で、しかも精製していない出発材料から、かつクロマトグラフ精製を用いることなくＰＳが製造できる。
【０００５】
この米国特許に記載の方法は、有機溶媒、代表的にはトルエンに原料ホスファチドを溶解した溶液と、セリン及びホスホリパーゼＤを含む水溶液とからなる二相系中で天然ホスファチド又は合成ホスファチドとセリンとを反応させるものである。前記の系を十分撹拌すると、ホスファチドはＰＳに変換され、ＰＳはアセトンで沈殿することによって有機相から回収することができる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
類似の方法は、高収率で大規模にホスファチジルセリンを製造するけれど、有機溶媒の使用を減らし、副製品を最少にするという工業的な化学プロセスの現在のトレンドから懸け離れている。実際、この方法は、膨大な量の有機溶媒の使用（及びリサイクル）と、反応中及び最終製品の単離中の両方でそれらの回収を含んでいる。
【０００７】
本発明は、先行技術に関する上述の欠点を克服し、工業規模でホスファチジルセリンを製造する方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明により、係る問題は解消された。すなわち、本発明は、下記一般式（１）で表されるホスファチジルセリンの製造方法において、
【０００９】
【化３】
（式（１）において、Ｒ1及びＲ2は独立して、飽和、モノ不飽和又はポリ不飽和のＣ10〜Ｃ30のアシル基であり、ＸはＯＨ又はＯＭであり、Ｍはアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム又は分子内塩を含むアルキルアンモニウムである。）
【００１１】
下記一般式（２）で表されるホスファチドと、ラセミ体もしくはエナンチオマー的に純粋なセリン、好ましくはＬ−セリンとをホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）の存在下に反応させることからなり、反応媒体が水性分散液であることを特徴とする式（１）のホスファチジルセリンを製造する方法である。
【００１２】
【化４】
（式（２）において、Ｒ1、Ｒ2及びＸは上記式（１）で定義したとおりであり、Ｒ3はＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ2又はＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+（ＣＨ3）3である。）
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の方法に用いる出発原料は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）のような合成ホスファチジルコリン（ＰＣ）又は天然のホスファチジルコリン又は、大豆又は卵のレシチンあるいは大豆又は卵のレシチンの部分精製により得られる商業的に入手可能なリン脂質混合物のようなリン脂質混合物のいずれでもよい。これらのリン脂質含有率は２０重量％〜９５重量％であることが好ましい。
【００１５】
プロセスコストに関する限り、レシチンから誘導された出発原料を用いることは、それらの低コストと、それらの混合物の重要な成分であるホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）はその反応条件下にＰＳに変換されるという事実の両方の観点から、とりわけ好都合である。
【００１６】
出発原料は、他の試薬を加える前に、活性を促進するために、水性媒体中に十分分散されるべきである。
分散は、出発リン脂質原料を３〜１０容量倍の水又は塩溶液と２０〜５０℃で１〜１０時間撹拌することを保持することにより行われる。
【００１７】
この段階で界面活性剤を使用すると、基質の分散が促進され、その結果反応速度が速くなる。
イオン系又は非イオン系界面活性剤を好ましく用いることができ、界面活性剤は、より好ましくは、ビス−（２−エチルヘキシル）スルホこはく酸エステル（ＡＯＴ）又はポリオキシエチレンソルビタンモノオレート（Ｔｗｅｅｎ ８０(R)）であり、基質（ホスファチド）１ｇ当たり０．０１〜０．４ｇ添加する。
これらの界面活性剤の効果は、水性媒体に分散する傾向が劣るＤＭＰＣのようなホスファチジルコリンを用いるとき、特に好適である。
【００１８】
本発明のさらなる特徴は、天然のリン脂質（例えば、大豆レシチンから得られるホスファチジルコリン濃縮分画）の調製物をしばしば汚濁するか、もしくは、それら（アルコール溶媒）はホスホリパーゼＤの存在下に反応し、相当するホスファチジル誘導体（エタノールが混合物中に存在するときホスファチジルエタノールのような誘導体）を生成することから、引き続いて起こるＰＳ形成反応において邪魔をするアルコール溶媒、特にエタノール、を容易に除去することができることである。
【００１９】
これは、水性塩溶液中に出発リン脂質を分散し、その懸濁物をデカンテーションし、エタノールが溶け込んでいる液体相を除去することによって簡便に除去することができる。ホスファチドは、不純物のアルコール含有量が０．１重量％以下であることが好ましい。
【００２０】
水性塩溶液として十分高い密度を有する塩溶液であれば如何なるものも使用でき、容易に出発原料を分離できる。好ましくは、塩化カルシウム溶液又は酢酸ナトリウム／酢酸緩衝溶液又はそれらの混合物である。
【００２１】
出発原料の水性分散液には、セリン、塩化カルシウム、ｐＨ制御のバッファー及びホスホリパーゼＤを含む水溶液が添加される。
【００２２】
セリンの量は、ＰＳに変換するために便宜的にはリン脂質１モル当たりセリン４〜２０モルの範囲とする。セリンは、Ｄ体、Ｌ体又はラセミ体であってもよく、どの場合にも、対応するホスファチジル誘導体が得られる。
【００２３】
塩化カルシウムは、ホスホリパーゼＤ触媒反応に好ましいカルシウムイオンの源泉であり、さらに、カルシウムイオンの存在により、反応の終結後、簡単に濾過できる形でホスファチジルセリンの分離が誘導される。
塩化カルシウムの濃度は、好ましくは０．０５〜０．５Ｍの範囲である。
【００２４】
水溶液のｐＨは、用いる酵素の起源に依存し、ｐＨ４〜９、特にはｐＨ４〜４．５が好ましい。酵素の場合、実質的に酸媒体においてそれらの活性を発揮するので、水溶液は０．０２〜０．２Ｍ 酢酸塩でバッファーすることが好ましい。
【００２５】
加水分解活性より高いホスファチジル変換（transphosphatidylation）活性を有する酵素は、反応を遂行する酵素として好適に用いることができる。発酵起源の酵素は有用に用いることができ、さらに、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）に寄託番号５５７１７号として寄託された微生物の発酵により得られた酵素が好ましい。
【００２６】
酵素は、粗酵素の形で、すなわち微生物を濾過除去した後の発酵混合物を使用することができるし、より好ましくは、低分子量の不純物を除去するために適切なカットオフ値（例えば、１０，０００ダルトン）を有する膜をとおす限外濾過による精製後のものを使用することもできる。酵素濃縮溶液はそのまま用いても、あるいはそれを凍結乾燥して固体の形で得た酵素を用いることもできる。酵素の量は、好ましくは、ホスファチド１ｇ当たり１０〜１００unitsの範囲である（酵素活性は、Biotechn 7, 795 (1993) に記載される試験で測定できる）。
【００２７】
反応は、好ましくは２５〜６０℃、より好ましくは４０〜５０℃で行うことができる。
ＰＳは、反応混合物を濾過し、セリン及び存在する塩を除去するために水で洗浄することによって回収される。
【００２８】
本発明の方法の特に有用な点は、反応生成物（ＰＳ）がその反応混合物から、その回収が溶剤を添加して沈殿させることを必要とせずに簡単な濾過により効果的になされるという形で、分離されることである。
【００２９】
本発明の方法の主要な利点は、水性媒体中でホスファチジルコリン及び類似のホスファチドのホスファチジル変換反応を遂行し、良好な純度のホスファチジルセリンを、しかも満足できる高い収率で得るという、先行技術から予測され得ない、実施可能性にある。
【００３０】
【実施例】
本発明の特徴及び利点を、以下の実施例によりさらに詳細に示す。
なお、％は、特に断らない限り、以下重量％を示す。
【００３１】
実施例１
純度９５％の大豆ホスファチジルコリン５ｇを、ｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸塩バッファー３０ｍｌに加えた。混合物を４０℃で１時間撹拌し、リン脂質を水相に均一に分散した。寄託番号ＡＴＣＣ ５５７１７号で寄託した微生物の発酵により得られた粗酵素溶液を、１０，０００ダルトンで分画する限外濾過膜を通して低分子量の不純物を完全に除去するまで透析した。なお、酵素としては２Ｕ／ｇの活性を有する８０ｍｌのホスホリパーゼＤ溶液からなる酵素溶液を用いた。この酵素溶液にＬ−セリン４０ｇ及び塩化カルシウム２．９ｇを加えた。得られた溶液をホスファチジルコリン分散液に加え、その混合物を４５℃に加熱した。
６時間撹拌し反応を行った。固体を濾別し、水で洗浄し、そして乾燥した。最終物の重量は４．２４ｇであった。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による組成分析結果：ＰＳ ９０．７％、ＰＣ １．４％、ＰＡ（ホスファチジン酸）６．２％。
【００３２】
実施例２
純度９５％の大豆ホスファチジルコリン５ｇを、Ｔｗｅｅｎ ８０(R)を０．０８ｇ含有するｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸塩バッファー３０ｍｌに加えた。混合物を４０℃で１時間撹拌し、リン脂質を水相に均一に分散した。実施例１に記したようにして得られた２Ｕ／ｇの活性を有するホスホリパーゼＤ溶液８０ｍｌにＬ−セリン４０ｇ、塩化カルシウム２．９ｇを加えた。得られた溶液をホスファチジルコリン分散液に加え、その混合物を４５℃に加熱した。９０分後のＨＰＬＣ分析による組成は次のとおり：ＰＳ ６９．７％、ＰＣ １１．６％、ＰＡ ５．３％。さらに４時間撹拌して反応を進めた。固体を濾別し、水で洗浄し、そして乾燥した。最終物の重量は４．７６ｇであった。
ＨＰＬＣ 組成： ＰＳ ９０．２％、ＰＣ ０．６％、ＰＡ ６．４％。
【００３３】
実施例３
純度９５％の大豆ホスファチジルコリン５ｇを、ＡＯＴを０．3ｇ含有するｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸塩バッファー３０ｍｌに加えた。混合物を４０℃で１時間撹拌し、リン脂質を水相に均一に分散した。実施例１に記したようにして得られた２Ｕ／ｇの活性を有するホスホリパーゼＤ溶液８０ｍｌにＬ−セリン４０ｇ、塩化カルシウム２．９ｇを加えた。得られた溶液をホスファチジルコリン分散液に加え、その混合物を４５℃に加熱した。
６時間反応した後、固体を濾別し、水で洗浄し、そして乾燥した。最終物の重量は４．１６ｇであった。
ＨＰＬＣ 組成： ＰＳ ８８．８％、ＰＣ ０．６％、ＰＡ ４．１％。
【００３４】
実施例４
主な成分がＰＣ６６％、ＰＥ１７％、ＰＡ２％である大豆レシチンを濃縮することにより得られたリン脂質２５ｇを、ｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸塩バッファー１００ｍｌに加えた。混合物を４０℃で１時間撹拌し、リン脂質を水相に均一に分散した。ｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸塩バッファー８０ｍｌ、Ｌ−セリン４０ｇ、塩化カルシウム２．９ｇの溶液を別途調製し、この溶液に実施例１に記したようにして得られたホスホリパーゼＤ溶液を凍結乾燥して得た固体１８８ｍｇを加えた。この固体の活性は０．９Ｕ／ｍｇである。得られた溶液をリン脂質分散液に加え、その混合物を４５℃に加熱した。
混合物を３時間撹拌した。固体を濾別し、水で洗浄し、そして乾燥した。最終物の重量は２２．８ｇであった。
ＨＰＬＣ 組成： ＰＳ ５９．８％、ＰＣ １．６％、ＰＡ ６．１％、ＰＥ ６．７％。
【００３５】
実施例５
出発原料として、実施例４で用いたリン脂質を、ｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸塩バッファー１００ｍｌに加えた。混合物を４０℃で１時間撹拌し、リン脂質を水相に均一に分散した。ｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸塩バッファー８０ｍｌ、Ｌ−セリン４０ｇ及び塩化カルシウム２．９ｇの溶液を別途調製し、この溶液に実施例４に記したように調製した凍結乾燥酵素９０ｍｇを加えた。得られた溶液をリン脂質分散液に加え、その混合物を４５℃に加熱し、そして１６時間撹拌した。最終組成物をＨＰＬＣで分析した：ＰＳ ３９．１％、ＰＣ ８．３％、ＰＡ １６．６％、ＰＥ ６．８％。
【００３６】
実施例６
反応中温度を５５℃に保持した以外は実施例５に記載した条件と同じ条件で反応を行った。１６時間後、反応を中止した。ＨＰＬＣ分析による組成は次のとおり：ＰＳ ４１．７％、ＰＣ ８．３％、ＰＡ １１．０％、ＰＥ ９．９％。
【００３７】
実施例７
塩化カルシウムを添加しなかった以外は実施例４に記載した条件と同じ条件で反応を行った。２０時間後、反応を中止した。ＨＰＬＣ分析による組成は次のとおり：ＰＳ ４１．２％、ＰＣ １５．９％、ＰＡ １０．９％、ＰＥ ７．４％。
【００３８】
実施例８
実施例４で出発原料として用いたリン脂質２ｇを、水４０ｍｌ中に塩化カルシウム３ｇを含む溶液が入った分液漏斗に加え、その混合物を２５℃で１時間撹拌した。撹拌を中止して３時間放置後、水相の３６ｍｌを底部バルブで抜き出した。ｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸塩バッファー６．５ｍｌ、Ｌ−セリン３．２ｇの溶液を別途調製し、この溶液に実施例４に記したように調製した凍結乾燥酵素１５ｍｇを加えた。得られた溶液をリン脂質分散液に加え、その混合物を４５℃に加熱した。
１時間撹拌し反応した。最終組成物をＨＰＬＣで分析した：ＰＳ ５５．７％、ＰＣ ９．４％、ＰＡ ４．０％、ＰＥ ９．０％。なお、この反応におけるホスファチジルエタノールの生成は、薄層クロマログラフィー（ＴＬＣ）検出限界以下（０．１％）であった。
【００３９】
実施例９
ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）５ｇ、Ｔｗｅｅｎ ８０(R)１．６ｇ及びｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー３０ｍｌを４５℃で１時間撹拌した。この分散液を実施例１に記載するようにして得た水性ホスホリパーゼＤ溶液８０ｍｌ、Ｌ−セリン４０ｇ、塩化カルシウム２．９ｇの溶液に加え、５０℃の温度で１７時間撹拌した。固体を濾別し、水で洗浄し、そして乾燥した。最終物の重量は５．４ｇであった。
ＨＰＬＣ 組成： ＰＳ ８３．２％、ＰＣ ４．３％、ＰＡ １１．７％。
【００４０】
実施例１０
ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）５ｇ、ＡＯＴ１．０ｇ及びｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー３０ｍｌを５０℃で４５分間撹拌した。この分散液を実施例１に記載するようにして得た水性ホスホリパーゼＤ溶液８０ｍｌ、Ｌ−セリン４０ｇ、塩化カルシウム２．９ｇの溶液に加え、５０℃の温度で２０時間撹拌した。固体を濾別し、水で洗浄し、そして乾燥した。最終物の重量は３．６６ｇであった。
ＨＰＬＣ 組成： ＰＳ ８５．２％、ＰＣ １０．５％、ＰＡ ３．５％。
【００４１】
実施例１１
オレイン酸エステル分解ぜず（non-deoleated）、トリグリセライドを除去していない大豆レシチンのＰＣ濃縮分画（組成：トリグリセライド５０％、ＰＣ３５％、ＰＥ８％）１０ｇをｐＨ４．５の０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー３０ｍｌに加え、２５℃で１時間撹拌した。この混合物を実施例１に記載するようにして調製したホスホリパーゼＤ酵素の溶液８０ｍｌ、Ｌ−セリン４０ｇ及び塩化カルシウム２．９ｇの溶液に加えた。４５℃の温度で１１時間撹拌し反応した。水相を分離し、ゴム状の固体にアセトン１００mlを加えた。濾過後乾燥して３．９ｇの製品を得た。
ＨＰＬＣ 分析： ＰＳ ５８％、ＰＣ ２．０％、ＰＡ １７．０％、ＰＥ １．８％。
Claims (21)
- 下記一般式（１）
- カルシウム塩が、塩化カルシウムであり、その濃度が０．０５〜０．５Ｍである請求項１に記載の方法。
- セリンの量が、リン脂質１モル当たり４〜２０モルの範囲である請求項１に記載の方法。
- ホスファチドは、不純物として含まれるアルコールが０．１％以下のものである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
- アルコールが、エタノールである請求項４に記載の方法。
- リン脂質が、セリンと反応する前に、当該リン脂質を水性塩溶液に懸濁し、次いで液相をデカンテーションすることによりアルコールを分離し、精製されたものである請求項４に記載の方法。
- 水性塩溶液が、塩化カルシウム及び／又は酢酸／酢酸ナトリウム緩衝溶液である請求項６に記載の方法。
- 反応が、温度２５〜６０℃の範囲で行われる請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
- ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）が、ホスファチジル変換（ｔｒａｎｓｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌａｔｉｏｎ）活性を有するホスホリパーゼＤを産生する微生物菌株の発酵液を遠心して得られたものである請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
- ホスホリパーゼＤが、ストレプトミセス菌株ＡＴＣＣ５５７１７によって産生されたものである請求項９に記載の方法。
- ホスホリパーゼＤが、その溶液を限外濾過により精製されたものである請求項９に記載の方法。
- 限外濾過は１０，０００ダルトンを分画する膜を用いて行われる請求項１１に記載の方法。
- 限外濾過の濾液は凍結乾燥され、固体の形でホスホリパーゼＤを得る請求項１１に記載の方法。
- ホスファチドの水性分散液が当該ホスファチドと３〜１０容量倍の水又は塩溶液を混合し、該混合物を２０〜５０℃で１〜１０時間撹拌保持する請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
- １種以上の界面活性剤が、ビス−（２−エチルヘキシル）スルホこはく酸エステル（ＡＯＴ）又はポリオキシエチレンソルビタンモノオレート（Ｔｗｅｅｎ８０(R)）である請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
- 式（１）のホスファチジルセリンが、反応混合物から、濾過し、水で洗浄することにより回収される請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
- 式（２）のホスファチドが、リン脂質含有率２０％〜９５％である、大豆もしくは卵のレシチンから選択される天然起源のホスファチジルコリン及び／又はホスファチジルエタノールアミンの混合物である請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
- 式（２）のホスファチドが、合成ホスファチジルコリンである請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
- カルシウム塩が、塩化カルシウムである請求項１に記載の方法。
- ホスファチド水性分散液が、ｐＨ４〜４．５の範囲で緩衝されるものである請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
- 反応が、温度４０〜５０℃の範囲で行われる請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
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