KR20030086128A

KR20030086128A - 효소 및 세린의 재사용을 포함하는 포스파티딜세린 및리소포스파티딜세린의 제조방법

Info

Publication number: KR20030086128A
Application number: KR1020020024506A
Authority: KR
Inventors: 한정준; 정국훈; 고의찬
Original assignee: 주식회사 두산
Priority date: 2002-05-03
Filing date: 2002-05-03
Publication date: 2003-11-07

Abstract

본 발명은 포스파티딜세린 및 리소포스파티딜세린을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 의한 포스파티딜세린의 제조방법은 포스포리파제 D의 존재 하에서 레시틴과 세린을 반응시켜 포스파티딜세린을 제조하는 방법에 있어서, 상기 레시틴은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜산 및 포스파티딜이노시톨 중 적어도 하나를 포함하고, 상기 반응은 염화칼슘 및 완충용액으로 이루어진 비 유기용매 시스템에서 이루어지며, 상기 반응 종료 후에 반응액을 여과하여 효소 및 세린을 포함하는 완충용액을 포스파티딜세린 함유 레시틴과 분리하고 분리된 효소 및 세린을 다시 상기 포스포리파제 D의 존재 하에서의 레시틴과 세린의 반응에 사용하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의한 포스파티딜세린 및 리소포스파티딜세린의 제조방법을 이용하면, 포스포리파제 D 효소 및 세린을 효과적으로 재이용할 수 있고 독성 유기용매를 사용하지 않아도 될 뿐만 아니라 효소의 불활성화도가 심하지 않으며 반응 효율이 높고, 안전하다. 또한 반응 중 유기용매를 이용하지 않으므로 반응 종료 후 분리 정제 과정이 단순화되며 분리 정제 시 사용하는 유기용매의 회수가 보다 용이하다. 또한, 고가의 효소 및 세린을 재사용할 수 있는 방법을 제공하여 대량생산시 원가 절감을 가져올 수 있는 효과가 있다.

Description

효소 및 세린의 재사용을 포함하는 포스파티딜세린 및 리소포스파티딜세린의 제조방법{Method for producing phosphatidylserine and lysophosphatidylserine comprising recycling enzymes and serines}

본 발명은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜산 및 포스파티딜이노시톨 중 적어도 한 종을 포함하는 천연 또는 합성 레시틴(phospholipid)을 포스포리파제 D 및 포스포리파제 A(A1 또는 A2)를 처리하여 포스파티딜세린 및 리소포스파티딜세린을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 반응 중 사용한 효소 및 세린을 재사용하는 방법에 관한 것이다.

포스파티딜세린은，천연에 존재하는 지방질의 일종이고，세린기(친수 부분)，인산기，글리세롤과 ２개의 지방산 기(소수부)가 결합된 물질이다. 인간의 뇌는 건조 중량 중 레시틴이 약 반을 차지하고，그 거의가 신경 세포의 막을 형성하고 있다． 세포막의 중요한 성분인 레시틴속에서 포스파티딜세린은，특히 뇌에 많게 존재하고 있는 물질이고， 신경세포막에 있어서， 생명 유지 활동을 위한 에너지의 출입， 신경 전달 물질의 방출이나 시냅스의 활동 등의 정보 전달 등 신경 세포의 기능 발현에 깊게 관여하고 있다고 생각되고 있다． 이것으로부터，포스파티딜세린은 「뇌의 영양소」라고 말하고 있다． 포스파티딜세린은，1948년 폴크(Folch)에 의해 분리 된 이 후，수많은 연구가 행해지고，1997년까지 34 건의 임상 시험 (이중 맹검 시험 17건)이 실시되고，그 결과로서 알츠하이머증을 시작으로 하는 치매증을 개선하는 것， 연령에 따르는 뇌 기능을 젊어지게 하는 기능이 있는 것으로 알려져 왔다. 이들 뇌기능 개선 효과에 대해서는 많은 연구 결과가 보고되었으며 간질에 대한 개선 효과, 스트레스 내성，호르몬 분비 리듬의 회복 등의 기능도 나타내고 있다. 또한 리조포스파티딜세린은 α위치 또는 β위치의 지방산 고리가 절제된 것으로 이 역시 뇌 내의 글루코오스 및 /또는 혈중 글루코오스의 농도를 증가시키는 작용을 표시하는 것으로 보고되어지고 있다 ( H.W. Changet al, Br. J. Pharmacol., vol 93, p611, 1988). 종래는 소뇌로부터 추출된 포스파티딜세린이 그 특징적인 지방산 조성에 따라서 뇌 내 글루코스의 농도의 증가 작용을 표시하는 것이라고 생각되고 있었다. 대부분의 포스파티딜세린의 초기의 연구는 소뇌로부터의 것이었다. 하지만 소뇌로부터 추출된 포스파티딜세린은 소 1마리분의 뇌로부터 1g 정도 밖에 입수할 수 없으며 소뇌 유래의 포스파티딜세린은 영국에서 발단하여， 전세계적으로 큰 문제가 되고 있는 광우병의 우려가 있다. 최근에는 대두로부터 유래된 레시틴으로부터 효소에 의한 포스파티딜기 전이반응을 사용해서 제조한 포스파티딜세린과 이를 포스포리파제 A2 처리를 하여 얻어진 리조포스파티딜세린도 뇌 내 글루코스 농도를 증가시키고 또한 기억장해를 회복하는 현저한 효과를 가지고 있는 것이 확인되었다. 따라서 현재는 대두 유래의 포스파티딜세린이 시장에 판매되고 있으며， 식품용 소재로서 안전하게 섭취될 수 있게 되었다. 이러한 대두유래의 포스파티딜세린도 여러 임상 예가 있으며, 이것들 모든 임상 예로는 부작용이 있다고 인정되지 않았고, 대두 유래의 포스파티딜세린이라면 광우병등의 문제도 없어서 극히 안전성이 높은 식품이라 말할 수 있다.

포스파티딜세린은 대두에 0.2% 이하의 극 미량으로 존재하여 이를 농축하여 얻는 것은 사실상 불가능하다. 따라서 포스포리파제 D를 이용, 전이반응을 이용하여 포스파티딜세린을 합성하는 것은 이미 잘 알려진 사실이다. 그러나 대부분 알려진 제조방법은 대부분 실험실 규모의 소량 합성에 불과하고 몇몇 산업적인 스케일 규모의 특허가 보고되고 있다. 실험실 규모의 합성은 실제로 산업적 규모의 생산이 쉽게 되지 못함은 잘 알려진 바이다.

포스포리파제 D는 전이반응과 가수분해 반응을 동시에 일으킬 수 있는 효소이며 반응이 상호 경쟁적이다. 이 두 반응의 우세의 정도는 반응 조건에 따라 매우 큰 영향을 받는다.

포스포리피드 개질에 대한 연구는 여러 연구자들에 의해 보고되어왔다. 그 예로 L. R. Juneja 등이 포스파티딜콜린의 함량이 매우 높은 정제된 기질을 이용하였다. 이상계 시스템을 이용하였으며 사용 용매로서 에틸에테르, 에틸아세테이트, 벤젠, 톨루엔 등을 이용하였다.

Okahata Y 등은 J Chem. Soc. Perkin trans. 1, 919 (1995)에 지질에 코팅된 방선균 유래의 포스포리파제 D를 이용하여 물과 벤젠 이상계를 이용하는 반응시스템을 선보였다.

포스파티딜세린을 생산에 대한 몇몇 특허가 있다. JP-B-63-036792 은 이소프로필 에테르와 물의 이상계를 이용하는 시스템으로 효소원으로 양배추 유래의 포스포리파제를 이용하였다. 68%정도의 포스파티딜콜린의 함량을 지닌 부분 정제된 기질을 이용하였으며 합성된 PS 함량은 24% 정도였다. 또한 JP-B-02 079996의 경우 에틸아세테이트에서 방선균 유래의 포스포리파제 D를 이용하였다. 순수한 포스파티딜콜린을 사용하였으며 68% 정도의 PS를 얻었다. JP-B-02 079996의 경우 0.6g의 포스파티딜콜린을 20ml의 에틸아세테이트와 10ml의 완충용액 이상계 시스템에서 반응시키는 매우 희석된 조건에서 반응을 시켰다. 또한 ITALFARMACO SUD SPA사의 유럽특허 (EP 0776976)에는 방선균 유래의 포스포리파제 D를 이용하여 벤젠-물 이상계 시스템에서의 포스파티딜세린을 합성하는 방법을 나타내었다.

이들 논문들이나 특허에 사용된 용매는 에틸아세테이트를 제외하고는 모두 식품용으로 사용할 수 없는 비교적 독성이 큰 용매들이고 또한 대부분 반응기질로서 높이 정제된 포스파티딜콜린을 사용하는 경우가 대부분이다. 이상계 시스템에서 에틸아세테이트를 이용한 경우도 레시틴을 유기용매에 일정 이상의 농도로 하여 합성을 진행시키는 경우 반응 중 응집이 일어나 반응성 및 수율이 현저히 저하되고 분리 정제가 용이하지 못하게 된다. 또한 유기 용매 사용에 의한 효소의 불활성화가 심하여 효소 재사용 등이 어렵다. 또한 제조에 이용되는 기질인 세린이 매우 고가이므로 이의 재사용이나 회수는 필수적이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 효소 및 세린을 포함한 완충용액을 효소반응액으로부터 분리킴으로써 분리된 완충용액에 원료 레시틴을 첨가하여 포스파티딜세린 제조에 다시 이용함으로써 효소 및 세린을 함유한 완충용액을 수회 사용하는 것이다. 또한, 완충용액만을 이용하여 포스파티딜세린을 합성함으로써, 독성 유기용매를 사용하지 않을 뿐만 아니라 효소의 불활성화도가 심하지 않으며 반응 효율이 높고, 안전한 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 반응 종료 후 분리 정제 과정이 단순화되며 분리 정제 시 사용하는 유기용매의 회수가 보다 용이한 제조방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 뿐만 아니라, 중·저순도의 레시틴 뿐만 아니라 고순도의 레시틴을 완충용액 만으로 이루어진 매우 안전하고도 반응성이 매우 좋은 비 유기용매 시스템을 이용 포스파티딜세린 및 리소포스파티딜세린을 제조함에 있어서 고가의 효소 및 세린을 재사용할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 의한 효소 및 세린의 재사용을 포함하는 포스파티딜세린의 제조방법은, 포스포리파제 D의 존재 하에서 레시틴과 세린을 반응시켜 포스파티딜세린을 제조하는 방법에 있어서, 상기 레시틴은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜산 및 포스파티딜이노시톨 중 적어도 하나를 포함하고, 상기 반응은 염화칼슘 및 완충용액으로 이루어진 비 유기용매 시스템에서 이루어지며, 상기 반응 종료 후에 반응액을 여과하여 효소 및 세린을 포함하는 완충용액을 포스파티딜세린 함유 레시틴과 분리하고 분리된 효소 및 세린을 다시 상기 포스포리파제 D의 존재 하에서의 레시틴과 세린의 반응에 사용하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 의한 효소 및 세린의 재사용을 포함하는 리소포스파티딜세린의 제조방법은, 포스포리파제 D의 존재하에서 레시틴과 세린을 1차 반응을 시킨 후 상기 반응물에 포스포리파제 A를 넣고 2차 반응시켜 리소포스파티딜세린을 제조하는 방법에 있어서, 상기 레시틴은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜산 및 포스파티딜이노시톨 중 적어도 하나를 포함하고, 상기 반응들은 염화칼슘 및 완충용액을 포함하는 비 유기용매 시스템에서 이루어지며, 상기 1차 반응 종료 후에 반응액을 여과하여 효소 및 세린을 포함하는 완충용액을 포스파티딜세린 함유 레시틴과 분리하고 분리된 효소 및 세린을 다시 상기 1차 반응에 사용하는 것을 특징으로 한다.

상기한 제조방법에 있어서, 상기 레시틴은 상기 완충용액에 대해 5 내지 50%의 양으로 첨가되어 반응되는 것을 특징으로 한다.

상기한 제조방법에 있어서, 상기 레시틴은 대두레시틴, 채종레시틴, 어류 유래 레시틴, 연체동물 유래 레시틴 및 난황레시틴으로 이루어진 군에서 선택된 것 중 하나로서, 지방산 고리가 탄소수 6 내지 30개의 포화, 모노-, 다가 불포화지방산, 또는 이들의 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 암모늄염, 인산염, 염산염 및 황산염 중 어느 하나인 것을 특징으로 한다.

상기한 제조방법에 있어서, 상기 포스포리파제 D는 미생물 유래 또는 식물 유래인 것을 특징으로 한다.

상기한 제조방법에 있어서, 상기 수회 재사용된 완충용액에 에탄올을 첨가하여 세린을 불용화 시키고 콜린과 에탄올아민을 제거하여 세린을 회수하는 것을 특징으로 한다.

리소포스파티딜세린을 얻기 위하여 포스파티딜세린을 함유한 레시틴에 포스포리파제 A 및 염화칼슘을 포함하는 완충용액을 첨가하여 반응시킨다.

상기 제조방법에서 완충용액으로 초산 완충용액 또는 인산 완충용액 등 pH 4∼8, 보다 바람직하게는 pH 5∼7, 사이의 완충용액을 사용한다.

지방산 고리가 탄소수 6 내지 30개의 같거나 다른 포화, 모노-, 다가 불포화지방산을 포함하는 식물성 혹은 동물성 레시틴일 수 있으며 상기 레시틴에 수소를 첨가하여 지방산의 조성을 바꾼 것일 수 있으며, 염의 형태일 수 있다. 염으로서는 제약학상 허용될 수 있는 염의 형태라면 아무런 문제없이 사용가능하며, 구체적인 염으로서는 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 암모늄염, 인산염, 염산염, 황산염을 들 수 있다. 특히, 이들 염 중에서 나트륨염, 칼륨염이 바람직하다.

또한, 상기 완충용액의 pH는 4 에서 8의 범위이며, 상기 방법에서 반응온도는 20℃에서 60℃의 범위인 것이 좋다.

본 발명에 의한 상기 포스포리파제 D는 미생물 유래 또는 식물 유래의 것일 수 있다.

제조방법을 보다 구체적으로 설명하면, 교반 장치 및 온도 조절 장치를 갖추고 있는 반응조에 세린을 넣고, 초산 완충용액 또는 인산 완충용액 (pH 4∼8, 보다 바람직하게는 pH 5∼7, 약 0.2 M)을 반응 기질인 레시틴의 3 6배 정도를 넣는다 반응은 필요에 따라 20∼50도의 범위에서 행할 수 있다. 세린이 녹아있는 완충용액에 포스포리파제 D의 활성을 갖는 효소를 필요량 만큼 첨가한다. 이 후 레시틴을적당한 농도로 분산시켜 첨가한 후 5 시간∼24시간 교반한다. 반응이 끝난 후 반응액을 감압 여과를 하여 포스파티딜세린과 세린 및 효소를 포함한 완충용액을 분리 시키고 분리된 완충용액에 새로운 원료 레시틴을 완충용액 의 1/3 1/6 되게 첨가하여 포스파티딜세린 제조에 다시 이용하는 식으로 효소 및 세린을 포함한 완충용액을 수회 사용하는 방법이다.

이 후 완충용액에 3-5배의 에탄올을 가하여 교반하고 온도를 0-20도 범위에서 교반한 후 여과하여 잔사를 에탄올로 반복 수세하여 세린을 회수한다.

리소포스파티딜에탄올아민을 얻기 위해서는 반응 후 여과된 포스파티딜세린을 물로 수세한 후 염화칼슘이 포함된 완충용액을 2 4 배 정도 첨가하고 포스포리파제 A를 필요량만큼 첨가하여 5 시간∼12시간 교반한다.

이 후 반응물을 헥산 및 아세톤이나 에탄올을 이용 지방산을 제거하면 리소포스파티딜세린을 고농도로 함유하는 인지질을 얻을 수 있다.

또한, 제조된 포스파티딜세린 또는 리소포스파티딜세린에 수소 첨가 반응하여 지방산 조성을 바꿀 수 있다. 수소 첨가 반응의 경우는 에탄올에 10∼20％의 농도로 원료 레시틴이나 전이반응에 의해 합성된 포스파티딜에탄올아민 또는 리소포스파티딜에탄올아민을 녹이고, 4％ 팔라디움 카본을 전체의 3.3∼5％가 되도록 첨가한 후, 40 psi 이상의 수소압으로 3회 불어넣고, 최종적으로 원하는 수소 첨가의 정도에 따라 40∼60 psi의 수소압에서 50℃에서 300∼900 rpm의 조건으로 6∼15 시간 정도 반응을 시키면 수소 첨가된 원료 레시틴, 포스파티딜세린 또는 리소포스파티딜세린을 얻을 수 있다.

이하 실시예에서 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

<측정 조건>

포스파티딜세린 및 리소포스파티딜세린의 함량을 측정하기위해 HPLC 분석 방법을 이용하였으며, 그 조건은 다음과 같다. HPLC 분석용 LiChrosphere 100 diol (머크사, 4m x 125 mm) 을 사용하였고, 이동상으로 A상은 헥산/이소프로판올/아세트산/트리에틸아민 = 82 : 17 : 1 : 0.08, B상은 이소프로판올/물/아세트산/트리에틸아민 = 85 : 14 : 1 : 0.08 인 두 용매 시스템의 농도 구배를 이용한다. 시간 프로그램은 다음 표와 같다.

시간(분)	플로우(mL/분)	%A	%B
0	1.5	95	5
23	1.5	60	40
28	1.5	0	100
29	1.5	0	100
39	1.5	95	5

유속은 분당 1.5ml이며, 검출기로는 ELSD 검출기를 사용하였고, 검출기 온도는 65℃, 가스 압력은 1.9 L/min으로 하였다.

<실시예 1>

세린 150 g과 염화칼슘이 7g을 포함하는 소디움 아세테이트 완충용액 (pH 5.6) 0.8ℓ에 넣고, 방선균 유래 포스포리파제 D 2000 unit를 첨가하고, 40℃에서 교반하면서 여기에 레시틴(SLP-PC55,쯔루레시틴사, 포스파티딜콜린 함량 55％) 200g 을 넣어, 200rpm으로 교반하면서 12 시간동안 반응시킨다. 이 후 반응액을 감압 여과하여 효소 및 세린을 포함한 완충용액을 포스파티딜세린을 함유한 레시틴 (PS I) 과 분리한다. 이 완충용액에 새로운 레시틴(SLP-PC55,쯔루레시틴사, 포스파티딜콜린 함량 55％)을 150g 첨가하여 200rpm으로 교반하면서 12 시간동안 반응시킨다. 이 후 반응액을 감압 여과하여 효소 및 세린을 포함한 완충용액을 포스파티딜세린을 함유한 레시틴 (PS II) 과 분리한다. 이 완충용액에 또다시 새로운 레시틴(SLP-PC55,쯔루레시틴사, 포스파티딜콜린 함량 55％)을 100g 첨가하여 200rpm으로 교반하면서 12 시간동안 반응시킨다. 반응액을 감압 여과하여 효소 및 세린을 포함한 완충용액을 포스파티딜세린을 함유한 레시틴 (PS III) 과 분리한다. 이 후 얻어진 포스파티딜세린 함유 레시틴을 각각 물로 수세한 후 아세톤을 이용하여 탈 수한 후 건조한다. 이와 같이하여 얻어진 포스파티딜세린의 함량은 각각 PS I의 경우 63% 함량으로 190g, PS II의 경우 60% 함량으로 145g, PS I의 경우 55% 함량으로 93g 얻어졌다.

<실시예 2>

실시예 1에서 최종적으로 효소의 활성이 상당히 떨어진 상태의 최종적으로 분리된 완충용액에 3배의 에탄올을 가하면서 교반하고 0 도로 온도를 내리고 여과를 행하여 세린을 회수하고 이를 에탄올로 수세하여 에탄올아민 및 콜린을 제거하고 이 후 건조하여 세린을 회수하였으며 회수율은 초기 투입한 세린의 65% 였다.

<실시예 3>

실시예 1에서의 전이반응에 이어서, 포스포리파제 A를 추가로 처리하여 리소포스파티딜세린을 제조한다.

실시에서 얻어진 포스파티딜세린 함유 레시틴 100g에 대하여 깨끗한 물 0.5ℓ로 교반 수세한 후 여과한다. 이 잔사에 다시 물 0.5ℓ를 첨가하여 교반한 후 여과하는 과정을 거친 후 소디움 아세테이트 완충용액 (pH 5.6) 200 ml을 첨가하고 염화 칼슘 1.8g과 돼지 췌장 포스포리파제 A2 (8,000 IU/ml, 상품명 LECITASE 10L, NOVO NORDISK Co.)를 3ml 첨가한 후 37℃에서 6 시간 반응시킨다. 반응 종료 후 헥산, 에탄올 및 물을 각 1000, 600, 400 ml 을 첨가하여 30분간 교반한 후 정치하여 둔다. 상분리가 된 후 상층부를 덜어내어 증발 농축 시키고 이어 아세톤 1 ℓ를 이용하여 분말화 시킨다. 이렇게 얻어진 것의 수율은 64% 였으며 리소포스파티딜세린의 함량은 61% 였다.

<실시예 4>

실시예 1에서의 반응에 있어서 원료를 난황 유래의 레시틴을 원료로 이용하였다. 세린 250 g과 염화칼슘이 7g을 포함하는 소디움 아세테이트 완충용액 (pH 5.6) 0.8ℓ에 넣고, 방선균 유래 포스포리파제 D를 2000 unit 첨가하고, 40℃에서 교반하면서 레시틴 (PL95, 두산 바이오텍사, 포스파티딜콜린 함량 75％) 200g 을 넣어, 200rpm으로 교반하면서 12 시간동안 반응시킨다.

이 후 반응액을 감압 여과하여 효소 및 세린을 포함한 완충용액을 포스파티딜세린을 함유한 레시틴 (PS IV) 과 분리한다. 이 완충용액에 새로운 레시틴(PL95, 두산 바이오텍사, 포스파티딜콜린 함량 75％)을 150g 첨가하여 200rpm으로 교반하면서 12 시간동안 반응시킨다. 이 후 반응액을 감압 여과하여 효소 및 세린을 포함한 완충용액을 포스파티딜세린을 함유한 레시틴 (PS V) 과 분리한다. 이 완충용액에 또다시 새로운 레시틴 (PL95, 두산 바이오텍사, 포스파티딜콜린 함량 75％)을 100g 첨가하여 200rpm으로 교반하면서 12 시간동안 반응시킨다. 반응액을 감압 여과하여 효소 및 세린을 포함한 완충용액을 포스파티딜세린을 함유한 레시틴 (PS VI) 과 분리한다. 이 후 얻어진 포스파티딜세린 함유 레시틴을 각각 물로 수세한 후 아세톤을 이용하여 탈 수한 후 건조한다. 이와 같이하여 얻어진 포스파티딜세린의 함량은 각각 PS IV의 경우 80% 함량으로 190g, PS II의 경우 76% 함량으로 145g, PS I의 경우 72% 함량으로 93g 얻어졌다.

<실시예 5>

실시예 1에서의 반응에 있어서 효소를 대두 유래의 포스포리파제 D 를 이용하였다. 세린 250 g과 염화칼슘이 7g을 포함하는 소디움 아세테이트 완충용액 (pH 5.6) 0.8ℓ에 넣고, 대두 유래 포스포리파제 D를 2000 unit 첨가하고, 40℃에서 교반하면서 레시틴 (PL95, 두산 바이오텍사, 포스파티딜콜린 함량 75％) 200g 을 넣어, 200rpm으로 교반하면서 12 시간동안 반응시킨다.

이 후 반응액을 감압 여과하여 효소 및 세린을 포함한 완충용액을 포스파티딜세린을 함유한 레시틴 (PS VII) 과 분리한다. 이 완충용액에 새로운 레시틴 (PL95, 두산 바이오텍사, 포스파티딜콜린 함량 75％)을 150g 첨가하여 200rpm으로교반하면서 12 시간동안 반응시킨다. 이 후 반응액을 감압 여과하여 효소 및 세린을 포함한 완충용액을 포스파티딜세린을 함유한 레시틴 (PS VIII) 과 분리한다. 이 후 얻어진 포스파티딜세린 함유 레시틴을 각각 물로 수세한 후 아세톤을 이용하여 탈수한 후 건조한다. 이와 같이하여 얻어진 포스파티딜세린의 함량은 각각 PS VII의 경우 40% 함량으로 161g, PS VIII의 경우 35% 함량으로 119g 얻어졌다.

<실시예 6>

실시예 1, 2, 3 에서 얻어진 포스파티딜세린 및 리소포스파티딜세린을 1kg을 10％의 농도로 헥산에 녹이고, 5％ 팔라디움 카본을 전체의 2.5 중량％가 되도록 첨가한 후 14.7 psi의 수소압으로 50℃에서 15시간 정도 반응을 시킴으로써 거의 모든 지방산이 수소첨가가 되어 포화 지방산으로 이루어진 포스파티딜세린 또는 리소포스파티딜세린을 95% 정도의 수율로 얻을 수 있었다.

이상에서 본 발명을 실시예에서 살펴보았다. 이상에서 보는 바와 같이, 포스포리파제 D를 이용 레시틴을 효소 반응 시켜 포스파티딜세린 또는 리소포스파티딜세린을 제조할 경우 염화칼슘이 녹아 있는 완충 용액 만을 매개로 하여 반응시켜 포스파티딜세린 및 리소포스파티딜세린을 생산함에 있어 사용되는 포스포리파제 D 효소 및 세린을 효과적으로 재이용하는 방법을 개발하였다.

본 발명에 의한 포스파티딜세린 및 리소포스파티딜세린의 제조방법을 이용하면, 포스파티딜세린 및 리소포스파티딜세린을 생산함에 있어 사용되는 포스포리파제 D 효소 및 세린을 효과적으로 재이용할 수 있다. 또한, 완충용액만을 이용하여 포스파티딜세린을 합성하면, 독성 유기용매를 사용하지 않아도 될 뿐만 아니라 효소의 불활성화도가 심하지 않으며 반응 효율이 높고, 반응 중 유기용매를 이용하지 않으므로 안전하다. 또한 반응 중 유기용매를 이용하지 않으므로 반응 종료 후 분리 정제 과정이 단순화되며 분리 정제 시 사용하는 유기용매의 회수가 보다 용이하다. 또한, 중·저순도의 레시틴 뿐만 아니라 고순도의 레시틴을 완충용액 만으로 이루어진 매우 안전하고도 반응성이 매우 좋은 비 유기용매 시스템을 이용 포스파티딜세린 및 리소포스파티딜세린을 제조함에 있어서 고가의 효소 및 세린을 재사용할 수 있는 방법을 제공하여 대량생산시 원가 절감을 가져올 수 있는 효과가 있다.

Claims

포스포리파제 D의 존재 하에서 레시틴과 세린을 반응시켜 포스파티딜세린을 제조하는 방법에 있어서,

상기 레시틴은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜산 및 포스파티딜이노시톨 중 적어도 하나를 포함하고,

상기 반응은 염화칼슘 및 완충용액으로 이루어진 비 유기용매 시스템에서 이루어지며,

상기 반응 종료 후에 반응액을 여과하여 효소 및 세린을 포함하는 완충용액을 포스파티딜세린 함유 레시틴과 분리하고 분리된 효소 및 세린을 다시 상기 포스포리파제 D의 존재 하에서의 레시틴과 세린의 반응에 사용하는 것을 특징으로 하는 효소 및 세린의 재사용을 포함하는 포스파티딜세린의 제조방법.
포스포리파제 D의 존재하에서 레시틴과 세린을 1차 반응을 시킨 후 상기 반응물에 포스포리파제 A를 넣고 2차 반응시켜 리소포스파티딜세린을 제조하는 방법에 있어서,

상기 레시틴은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜산 및 포스파티딜이노시톨 중 적어도 하나를 포함하고,

상기 반응들은 염화칼슘 및 완충용액을 포함하는 비 유기용매 시스템에서 이루어지며,

상기 1차 반응 종료 후에 반응액을 여과하여 효소 및 세린을 포함하는 완충용액을 포스파티딜세린 함유 레시틴과 분리하고 분리된 효소 및 세린을 다시 상기 1차 반응에 사용하는 것을 특징으로 하는 효소 및 세린의 재사용을 포함하는 리소포스파티딜세린의 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 레시틴은 상기 완충용액에 대해 5 내지 50%의 양으로 첨가되어 반응되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레시틴은 대두레시틴, 채종레시틴, 어류 유래 레시틴, 연체동물 유래 레시틴 및 난황레시틴으로 이루어진 군에서 선택된 것 중 하나로서, 지방산 고리가 탄소수 6 내지 30개의 포화, 모노-, 다가 불포화지방산, 또는 이들의 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 암모늄염, 인산염, 염산염 및 황산염 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 포스포리파제 D는 미생물 유래 또는 식물 유래인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 수회 재사용된 완충용액에 에탄올을 첨가하여 세린을 불용화 시키고 콜린과 에탄올아민을 제거하여 세린을 회수하는 것을 특징으로 하는 제조방법.