KR20040069438A - 유기용매 혼합물을 이용한 변형 레시틴의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 포스포리파제 D를 이용하여 레시틴을 가수분해하거나 개질하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 의한 제조방법은 레시틴을 개질하여 변형 레시틴을 제조하는 방법에 있어서, 2이상의 유기용매를 혼합하여 제조된 혼합용매 및 완충용액으로 이루어지는 이상계 시스템에서 포스포리파제 D의 존재 하에 레시틴을 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 헥산과 에틸아세테이트의 혼합용매와 완충용액의 이상계 반응시스템을 사용함으로써 식품용 변형 레시틴 생산에 적합한 제조방법을 제공할 수 있다. 이와 같은 복합용매-완충용액의 이상계 시스템은 중 저순도의 레시틴 (PC 함량 25％ 이하) 뿐만 아니라 고순도의 레시틴까지도 모두 원활하게 용해시킬 수 있으며, 따라서, 반응성이 매우 높다. 또한, 반응 후 원하는 변성 레시틴을 포함한 레시틴 반응물은 모두 용매층에 녹아 있어, 반응 후 반응물의 회수가 매우 용이하다. 이 방법은 천연 레시틴 뿐만 아니라 합성 레시틴의 전이 반응에도 매우 적합한 장점이 있다.

Description

유기용매 혼합물을 이용한 변형 레시틴의 제조방법{Method for producing modified lecithin using mixture of organic solvents}

본 발명은 포스포리파제 D를 이용하여 레시틴을 가수분해하거나 개질하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 2 이상의 특정 유기용매가 혼합된 유기용매 혼합물과 완충용액의 이상계 시스템에서 반응을 진행함으로써 고순도 레시틴도 원활하게 용해시킬 수 있으며 반응성이 우수하여 수율이 높은 변형 레시틴 제조방법에 관한 것이다.

포스포리파제 D에 의한 전이반응을 이용하여 레시틴을 개질하는 것은 이미 잘 알려진 사실이다. 그러나 대부분 알려진 제조방법은 대부분 실험실 규모의 소량 합성에 불과하고 몇몇 산업적인 스케일 규모의 특허가 보고되고 있다. 실험실 규모의 합성이 실제로 산업적 규모의 생산에까지 이르는 것이 쉽지 않음은 잘 알려진 바이다.

포스포리파제 D는 전이반응과 가수분해 반응을 동시에 일으킬 수 있는 효소이며 반응이 상호 경쟁적이다. 이 두 반응의 우세의 정도는 반응 조건에 따라 매우 큰 영향을 받는다.

레시틴의 개질에 대한 연구는 여러 연구자들에 의해 보고되어 왔다. 레시틴의 개질은 통상 자연상태에 다량으로 존재 하지 않는 물질을 얻기 위해 행하게 된다. 레시틴 개질에 대한 연구로 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜산 등의 합성이 많이 보고 되어 있다. 한 예로 L. R. Juneja 등이 포스파티딜세린 합성을 보고하였다. 이들은 반응시 이상계 시스템을 이용하였으며 포스파티딜콜린의 함량이 매우 높은 정제된 기질을 이용하였다. 사용 유기용매로서 에틸에테르, 에틸아세테이트, 벤젠, 톨루엔 등을 이용하였다. 이 반응에서 특히 기질인 포스파티딜콜린의 농도는 매우 낮았다 (<53.5 mM, 보통 17.8mM) .

Okahata Y 등은 J Chem. Soc. Perkin trans. 1, 919 (1995)에서 지질에 코팅된 방선균 유래의 포스포리파제 D를 이용하여 물과 벤젠 이상계를 이용하는 반응시스템을 선보였다.

레시틴 개질 반응 중 포스파티딜세린을 생산하는 것에 대한 몇몇 특허가 있다. JP-B-63-036792은 이소프로필 에테르와 물의 이상계를 이용하는 시스템으로 효소원으로서 양배추 유래의 포스포리파제를 이용하였다. 68%정도의 포스파티딜콜린의 함량을 지닌 부분 정제된 기질을 이용하였으며 합성된 PS 함량은 24% 정도였다. 또한 JP-B-02 079996의 경우 에틸아세테이트에서 스트렙토마이세스속(Streptomycessp.) 유래의 포스포리파제 D를 이용하였다. 순수한 포스파티딜콜린을 사용하였으며 68% 정도의 PS(포스파티딜세린)를 얻었다. 또한 ITALFARMACO SUD SPA사의 유럽특허 EP 0776976에는 방선균 유래의 포스포리파제 D를 이용하여 벤젠-물 이상계 시스템에서의 포스파티딜세린을 합성하는 방법이 기술되어 있다.

포스파티딜글리세롤의 합성에 대한 예로는 Lee 등의 보고가 있으며 고도로 정제된 포스파티딜콜린을 1% 정도의 매우 낮은 농도로 반응시켰다. 유기용매로 헥산, 이소프로필에테르, 디에틸에테르, 부틸아세테이트, 에틸아세테이트, 피리딘등을 사용하였다. 효소원으로 양배추 유래의 포스포리파제 D를 이용하였다.

레시틴을 포스포리파제 D를 이용하여 가수분해하면 포스파티딜산이 얻어진다. 포스파티딜산을 얻는 방법으로 몇몇 특허가 보고되어 있다.

일본 특허공개 4145088호는 활성제 존재하에서의 비용매 시스템에서의 포스파티딜산 제조 방법을 제공하고 있다. 또한 일본 특허 공개 4267822호에는 기계적인 분산력에 의해 수용액상에서 입경을 100 마이크로미터 이하로 억제하여 효소처리하여 포스파티딜산을 얻는 방법을 제공한다.

식품 생산에 사용 가능한 용매로서 각국에서 허가된 것으로는 헥산, 에틸아세테이트, 아세톤, 에탄올이 있으며, 그 외의 유기용매는 대부분의 나라에서 식용 원료 생산에 사용하는 것이 금지되어 있다. 따라서 공업용이 아닌 식용으로 변형 레시틴을 제조하기 위해서는 식품에의 사용에 적합한 것으로 허가된 용매들의 사용으로 제한될 것이다. 그런데 상기 논문들이나 특허에서 사용되고 있는 용매는 헥산 및 에틸아세테이트를 제외하고는 모두 식품용으로 사용할 수 없는 용매들이고 또한 대부분 반응기질로서 높이 정제된 포스파티딜콜린을 사용하는 경우가 대부분이다. 이상계 시스템에서 에틸아세테이트를 이용한다 하더라도 기질인 레시틴 농도가 10% 이상이 되면 합성 진행 동안 반응 중 응집이 일어나 반응성이 현저히 저하되는 문제점이 있었다. 이로 인해 수율이 낮으며 분리 정제가 용이하지 않은 문제점이 있었다.

포스파티딜콜린의 함량이 20 내지 40％, 포스파티딜에탄올아민의 함량이 20 내지 30％ 정도인 레시틴 (예컨대, 신동방 SOYA LECITHIN POWDER 95, CENTRAL SOYA 사 FP 40, D, RP40 등)은 에틸아세테이트에 잘 녹지 않는다. 특히, 에틸아세테이트-물로 이루어진 이상계 시스템에서는, 레시틴을 일정 농도 이상 사용할 경우, 교반이 원활하지 않으며 레시틴의 응집현상이 일어나며 반응성이 매우 떨어진다. 헥산의 경우는 레시틴을 녹일 수 있는 매우 효율적인 용매이지만 합성전이 반응에서 반응성이 매우 떨어진다는 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 선행기술의 문제점을 해결하고, 식용으로서도 안전한 레시틴을 제조하는 효율적인 방법에 대하여 연구하였다.

본 발명자들은 혼합용매, 특히, 헥산과 에틸아세테이트로 이루어진 혼합용매를 사용할 경우, 상기와 같은 문제점을 해결할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 중·저순도의 레시틴 (레시틴 함량 50％ 이하) 뿐만 아니라 고순도의 레시틴도 모두 원활하게 용해시킬 수 있으며, 반응성 또한 매우 우수한 유기 용매계를 이용한 레시틴의 개질 방법을 제공하는 것이다.

또한, 반응 후 개질된 레시틴 반응물의 회수가 용이한 제조방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 의한 변형 레시틴 제조방법은 레시틴을 개질하여 변형 레시틴을 제조하는 방법에 있어서, 2이상의 유기용매를 혼합하여 제조된 혼합용매 및 완충용액으로 이루어지는 이상계 시스템에서 포스포리파제 D의 존재 하에 레시틴을 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

이하 본 발명에 의한 변형 레시틴의 제조방법에 대해 구체적으로 살펴본다.

본 발명은 유기 용매 시스템에서 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜산, 포스파티딜이노시톨 등을 적어도 한 종 포함하는 천연 또는 합성 레시틴(phospholipid)을 포스포리파제 D (리소 변형 레시틴을 얻기 위해서는 추가로 포스포리파제 A (A1 또는 A2)를 처리)를 이용하여 레시틴을 가수분해 하거나 개질하는 것이다. 보다 상세히 설명하면 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜산, 포스파티딜이노시톨 등을 적어도 한 종 포함하는 레시틴을 헥산 및 에틸아세테이트의 혼합용매를 매개로 하여 레시틴을 개질하는 것이다. 극성부분을 변형시키고자 하는 경우 포스파티딜기의 수용체로서 수산기(hydroxyl group)를 가진 물질을 완충용액과 함께 포스포리파제 D를 처리하여 전이반응을 하고, 가수분해 시키려고 하는 경우는 복합 유기용매에 완충용액만으로 가수분해 반응을 하여 변형 레시틴을 얻는다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 유기용매로서 2 이상의 유기용매를 혼합한 혼합용매를 사용하였다. 바람직하게는 에틸아세테이트 및 헥산으로 된 혼합용매이다. 여기서, 에틸아세테이트:헥산의 비는 부피비로 9:1 내지 1:9인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 8:2 내지 4:6이다. 본 발명은 상기와 같은 혼합 유기용매 이외에도 완충액을 포함하는 이상계 시스템 하에서 효소 반응이 이루어진다. 완충액으로서는 초산 완충용액 또는 인산 완충용액 등이 사용될 수 있으며, pH 4 내지 8인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 pH 5 내지 7에 속하는 것이다.

또한 상기 혼합용매는 헥산 및 아세톤으로 구성된 혼합용매일 수 있다. 여기서, 헥산 및 아세톤의 혼합 용매의 경우 그 혼합비가 7:2 내지 2:8인 것이 바람직하며 더욱 바람직하게는 6:4 내지 5:5이다.

본 발명에 의한 제조방법은 미생물 유래 또는 식물 유래의 포스포리파제 D를 이용하여, 상업적으로 이용 가능한 레시틴의 극성부분을 수산기 (hydroxyl group)를 가진 것과 치환하거나 가수분해 하여 변형 레시틴을 제조하는 것이다.

본 발명은 2 이상의 유기용매를 혼합하여 제조된 유기용매(제 1상) 및 완충용액(제 2상)으로 이루어진 이상계 시스템에서, 극성부분을 변형시키고자 하는 경우 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜산, 포스파티딜이노시톨 등을 적어도 한 종 포함하는 레시틴과 포스파티딜기의 수용체로서 수산기 (hydroxyl group)를 가진 물질을 완충용액과 함께 포스포리파제 D를 처리하여 전이반응을 하고, 가수분해 시키려고 하는 경우는 복합 유기용매에 완충용액만으로 가수분해 반응을 하여 변형 레시틴을 얻는다.

또한, 본 발명은 리소 형태의 변형 레시틴을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 2 이상의 유기용매를 혼합하여 제조된 유기용매 및 완충용액으로 이루어진 상기 이상계 시스템에서, 포스포리파제 D에 더하여 포스포리파제 A (A1 또는 A2)로 처리하여 상기 변형 레시틴의 리소형(lyso type)을 제조하는 방법을 제공한다.

상기 혼합용매는 레시틴을 용해하는 데 사용할 수 있으며, 그 결과, 용해가 원활하며, 반응 후, 반응 생성물의 회수에도 용이하다.

상기 제조방법에서 지방산 고리가 탄소수 6 내지 30개의 같거나 다른 포화, 모노-, 다가 불포화지방산을 포함하는 식물성 혹은 동물성 레시틴일 수 있으며 상기 레시틴에 수소를 첨가하여 지방산의 조성을 바꾼 것일 수 있으며, 염의 형태일 수 있다. 염으로서는 제약학상 허용될 수 있는 염의 형태라면 아무런 문제없이 사용가능하며, 구체적인 염으로서는 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 암모늄염, 인산염, 염산염, 황산염을 들 수 있다. 특히, 이들 염 중에서 나트륨염, 칼륨염이 바람직하다.

포스파티딜기의 수용체로서 수산기(hydroxyl group)를 가진 물질을 상기 효소 반응에 더 첨가할 수 있는데, 그 수산기를 가진 물질의 예로서 세린, 콜린, 에탄올아민, 글리세롤, 폴리에틸렌글리콜, 글루코스 등의 당류 뿐 아니라 스핑고신과 아스콜빈산 등 다양하게 적용이 가능하다.

또한, 상기 반응의 온도는 20℃ 내지 60℃의 범위인 것이 바람직하다.

또한, 상기 방법에 의해 제조된 변형 레시틴에 수소 첨가 반응하여 지방산 조성을 바꿀 수 있다. 수소 첨가 반응의 경우는 헥산 또는 헥산 및 에탄올의 혼합용매에 10 내지 20％의 농도로 원료 레시틴이나 전이반응에 의해 합성된 변형 레시틴을 녹이고, 4％ 팔라디움 카본을 전체의 3.3 내지 5％가 되도록 첨가한 후, 40 psi 이상의 수소압으로 3회 불어넣고, 최종적으로 원하는 수소 첨가의 정도에 따라 40 내지 60 psi의 수소압에서 50℃에서 300 내지 900 rpm의 조건으로 6 내지 15 시간 정도 반응을 시키면 수소 첨가된 원료 레시틴, 포스파티딜에탄올아민 또는 리소포스파티딜에탄올아민을 얻을 수 있다.

이하 구체적인 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하나, 이는 예시적인 목적에 불과할 뿐이고 본원 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.

먼저 본 발명이 목적으로 하는 최종 산물인 변형 레시틴의 양을 측정하기 위한 조건은 다음과 같다.

<측정 조건>

변형 레시틴의 함량 측정하기 위하여 HPLC 분석 방법을 이용하였으며, 그 조건은 다음과 같다. HPLC 분석용 LiChrosphere 100 디올(diol) (머크사, 4μm x 125 mm)을 사용하였고, 이동상으로 A상은 헥산/이소프로판올/아세트산/트리에틸아민 = 82 : 17 : 1 : 0.08, B상은 이소프로판올/물/아세트산/트리에틸아민 = 85 : 14 : 1 : 0.08 인 두 용매 시스템의 농도 구배를 이용한다. 시간 프로그램은 다음 표와 같다.

시간(분)	플로우(mL/분)	%A	%B
0	1.5	95	5
23	1.5	60	40
28	1.5	0	100
29	1.5	0	100
39	1.5	95	5

유속은 분당 1.5ml이며, 검출기로는 ELSD 검출기를 사용하였고, 검출기 온도는 65℃, 가스 압력은 1.9 L/min으로 하였다.

<실시예 1: 헥산-에틸아세테이트 혼합용매를 이용한 포스파티딜세린의 제조>

L-세린 700g을 소디움 아세테이트 완충용액 (pH 5.6) 1.3L에 넣은 다음 방선균 유래 포스포리파제 D 8000 unit를 첨가하고, 40℃에서 교반하여 세린을 완전히 녹인 후, 여기에 레시틴 (DS-PC55, 포스파티딜콜린 함량 55％) 1 kg을 헥산:에틸아세테이트의 비율이 2:2인 혼합용매 2L에 녹인 것을 섞어, 200rpm으로 교반하면서 24시간동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 30분간 정치시킨 후 상층부를 회수하여 5도로 냉각 한 후, 상층부를 물로 수세하고, 감압 증발시켜 용매를 완전히 증발시킨다. 이렇게 얻은 포스파티딜세린의 함량은 HPLC 분석한 결과 70.5％ 였고, 수율은 90.2％이었다.

<비교예 1: 에틸아세테이트를 이용한 포스파티딜세린의 제조>

L-세린 700g을 소디움 아세테이트 완충용액 (pH 5.6) 1.3L에 넣은 다음 방선균 유래 포스포리파제 D (스트렙토버시실리움속(Streptoverticiliumsp.), 두산 바이오텍) 8000 unit를 첨가하고, 40℃에서 교반하여 세린을 완전히 녹인 후, 여기에 레시틴 (DS-PC55, 포스파티딜콜린 함량 55％) 1 kg을 에틸아세테이트 2L에 녹인 것을 섞어, 200rpm으로 교반하면서 24시간동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 정치시킨 후 상층부의 에틸아세테이트를 덜어낸 후 헥산으로 포스파티딜세린을 추출하여 감압증발시켜 용매를 완전히 증발시킨다. 이렇게 얻은 포스파티딜세린의 함량은HPLC 분석한 결과 55.5％ 였고, 수율은 85.2％이었다.

<비교예 2: 헥산을 이용한 포스파티딜세린의 제조>

L-세린 700g을 소디움 아세테이트 완충용액 (pH 5.6) 1.3L에 넣은 다음 방선균 유래 포스포리파제 D (스트렙토버시실리움속(Streptoverticiliumsp.), 두산 바이오텍) 8000 unit를 첨가하고, 40℃에서 교반하여 세린을 완전히 녹인 후, 여기에 레시틴 (DS-PC55, 포스파티딜콜린 함량55％) 1 kg을 헥산 2L에 녹인 것을 섞어, 200rpm으로 교반하면서 24시간동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 정치시킨 후 헥산을 이용 추출한 후 포스파티딜세린을 추출하여 감압증발시켜 용매를 완전히 증발시킨다. 이렇게 얻은 포스파티딜세린의 함량은 HPLC 분석한 결과 2.5％로 거의 포스파티딜세린이 합성되지 않았다.

상기 실시예1 및 비교예1및 비교예2의 결과를 비교해 보면, 포스파티딜세린의 제조에 있어서 유기용매로서 에틸아세테이트만을 사용한 경우보다 헥산과 에틸아세테이트의 혼합 용매를 사용한 경우에 그 효과가 현저히 우수한 것을 알 수 있었다.

<실시예 2: 헥산-에틸아세테이트 혼합용매를 이용한 리소포스파티딜세린의 제조>

상기 실시예 1에서의 전이반응에 이어서, 포스포리파제 A를 추가로 처리하여리소포스파티딜세린을 제조하였다.

즉, L-세린 700g을 소디움 아세테이트 완충용액 (pH 5.6) 1.3L에 넣은 다음 A방선균 유래 포스포리파제 D (스트렙토버티실리움속(Streptoverticiliumsp.), 두산 바이오텍) 8000 unit을 첨가하고 40℃에서 교반하여 세린을 완전히 녹인 후, 여기에 레시틴 (DS-PC55, 포스파티딜콜린 함량 55％) 1kg을 헥산:에틸아세테이트 2:2인 용매 2L에 녹인 것을 섞어, 200 rpm으로 교반하면서 24시간 반응시킨 후, 돼지 췌장 포스포리파제 A2 (8,000 IU/ml, 상품명 LECITASE 10L, NOVO NORDISK Co.)를 15ml 첨가한 후 40℃에서 6 시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 30분간 정치시킨 후 상층부를 회수하여 5℃로 조절한 후 여과하여, 여액을 물로 수세한 후 감압 증발시키고 아세톤 5리터를 첨가하고 교반하여 지방산을 제거한 후 여과하여 감압건조 시켰다. 이렇게 얻은 리소포스파티딜세린의 함량은 HPLC 분석한 결과 71.5％였고, 수율은 40.2％였다.

<실시예 3: 식물 유래 PLD를 이용한 포스파티딜세린의 제조>

효소원으로서 방선균 유래의 포스포리파제 D 이외에도 식물 유래의 포스포리파제 D도 이용 가능하다. 식물 유래 포스포리파제 D에는 양배추, 대두 등을 사용할 수 있는데, 본 실시예에서는 포스포리파제 D를 활성을 나타내는 양배추 추출물을 이용하여 포스파티딜세린을 합성하였다. L-세린 300g을 소디움 아세테이트 완충용액 (pH 5.6) 1.3L에 넣고, 40℃에서 교반하여 세린을 완전히 녹인 후, PLD(포스파리파제 D) 활성을 지닌 양배추 추출물 5000 unit를 넣고, 레시틴 (CENTROLEX D,CENTRAL SOYA사) 1kg을 헥산:에틸아세테이트 1:3인 용매 2L에 녹인 것을 섞어, 200rpm으로 교반하면서 8 시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 30분간 정치시킨 후, 상층부를 회수하여 5℃로 조절한 후 상층부를 물로 수세한 후, 감압 증발시켜 용매를 완전히 증발시켰다. 이렇게 얻은 결과물에서 포스파티딜세린의 함량은 HPLC 분석한 결과 25.5％였고 수율은 92.5％였다.

<실시예 4: 헥산-에틸아세테이트 혼합용매를 이용한 포스파티딜글리세롤의 제조>

글리세롤 40 g을 소디움 아세테이트 완충용액 (pH 5.6) 400ml에 넣은 다음 포스포리파제 D (스트렙토버티실리움속(Streptoverticiliumsp.), 두산 바이오텍) 1000 unit를 넣고 40℃에서 교반하여 글리세롤을 완전히 녹인 후, 여기에 포스파티딜 콜린 함량 40％ 이상인 레시틴 (CEBTROLEX FP 40, CENTRAL SOYA) 100 g을 헥산:에틸아세테이트 2:2인 용매 400ml에 녹인 것을 섞어, 200 rpm으로 교반하면서 12 시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 30분간 정치시킨 후, 상층부를 회수하여 10℃에서 3 시간 정치한 후 여과하여, 여액을 물로 수세한 후 감압 증발시켜 용매를 완전히 증발시켰다. 이렇게 얻은 결과물의 포스파티딜글리세롤의 함량은 HPLC 분석한 결과 70.3 ％ 였고 수율은 88.3％였다.

<비교예 3 : 에틸아세테이트를 이용한 포스파티딜글리세롤의 제조>

글리세롤 40g을 소디움 아세테이트 완충용액 (pH 5.6) 1.3L에 넣은 다음 방선균 유래 포스포리파제 D (스트렙토버티실리움속(Streptoverticiliumsp.), 두산 바이오텍 ) 1000 unit를 첨가하고, 40℃에서 교반하여 글리세롤을 완전히 녹인 후, 여기에 레시틴 (DS-PC55, 포스파티딜콜린 함량 55％) 100 g을 에틸아세테이트 400 ml에 녹인 것을 섞어, 200rpm으로 교반하면서 12시간동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 정치시킨 후 상층부의 에틸아세테이트를 덜어낸 후 헥산으로 포스파티딜글리세롤을 추출하여 감압증발시켜 용매를 완전히 증발시켰다. 이렇게 얻은 포스파티딜글리세롤의 함량은 HPLC 분석한 결과 60.5％ 였고, 수율은 80.2％ 였다.

상기 실시예4 및 비교예2의 결과를 비교해보면, 포스파티딜글리세롤의 제조에 있어서도 에틸아세테이트 단독 용매만을 사용한 경우보다 헥산과 에틸아세테이트의 혼합 용매를 사용한 경우에 그 효과가 훨씬 우수함을 알 수 있었다.

<실시예 5: 헥산-에틸아세테이트 혼합용매를 이용한 리소포스파티딜글리세롤의 제조>

상기 실시예 4에서의 전이반응에 이어서, 포스포리파제 A를 추가로 처리하여 리소포스파티딜글리세롤을 제조하였다.

즉, 글리세롤 40g을 소디움 아세테이트 완충용액 (pH 5.6) 1.3L에 넣은 다음 방선균 유래 포스포리파제 D (스트렙토버티실리움속(Streptoverticiliumsp.), 두산 바이오텍 ) 1000 unit을 첨가하고 40℃에서 교반하여 글리세롤을 완전히 녹인 후, 여기에 레시틴 (DS-PC55, 포스파티딜콜린 함량 55％) 75g을 헥산:에틸아세테이트 1:3인 용매 2L에 녹인 것을 섞어, 200 rpm으로 교반하면서 12 시간 반응시킨 후, 돼지 췌장 포스포리파제 A2 (8,000 IU/ml, 상품명 LECITASE 10L, NOVO NORDISK Co.)를 15ml 첨가한 후 40℃에서 6 시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 30분간 정치시킨 후 상층부를 회수하여 5℃로 조절한 후 상층부를 물로 수세한 후 감압 증발시키고 아세톤 5리터를 첨가하고 교반하여 지방산을 제거한 후 여과하여 감압건조 시켰다. 이렇게 얻은 리소포스파티딜글리세롤의 함량은 HPLC 분석한 결과 68.5％였고, 수율은 37.2％였다.

<실시예 6: 헥산-에틸아세테이트 혼합용매를 이용한 포스파티딜에탄올아민의 제조>

에탄올아민 60 g을 소디움 아세테이트 완충용액 (pH 5.6) 400ml에 넣은 다음 포스포리파제 D (Streptoverticiliumsp., 두산 바이오텍) 1000 unit를 넣고 40℃에서 교반하여 에탄올아민을 완전히 녹인 후, 여기에 포스파티딜콜린 함량 40％ 이상인 합성레시틴 (Centrolex FP40, CENTRAL SOYA사) 100g을 헥산:에틸아세테이트 2:2인 용매 400ml에 녹인 것을 섞어, 200rpm으로 교반하면서 12 시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 30분간 정치시키고, 상층부를 회수하여 10℃에서 3 시간 정치한 후 상층부를 물로 수세한 후 감압 증발시켜 용매를 완전히 증발시켰다. 이렇게 얻은 결과물의 포스파티딜에탄올아민의 함량은 HPLC 분석한 결과 83.5％였고 수율은 88.3％였다.

<비교예 4: 에틸아세테이트를 이용한 포스파티딜에탄올아민의 제조>

에탄올아민 60 g을 소디움 아세테이트 완충용액 (pH 5.6) 400ml에 넣고 포스포리파제 D (스트렙토버티실리움속(Streptoverticiliumsp.), 두산 바이오텍) 1000 unit를 넣고 40℃에서 교반하여 에탄올아민을 완전히 녹인 후, 여기에 포스파티딜콜린 함량 40％ 이상인 합성 레시틴(Centrolex FP40, CENTRAL SOYA사) 100g을 에틸아세테이트 400ml에 녹인 것을 섞어, 200rpm으로 교반하면서 12 시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 정치시킨 후 상층부의 에틸아세테이트를 덜어낸 후 헥산으로 포스파티딜에탄올아민을 추출하여 감압증발시켜 용매를 완전히 증발시켰다. 이렇게 얻은 포스파티딜에탄올아민의 함량은 HPLC 분석한 결과 75.5％ 였고, 수율은 80.2％ 였다.

상기 실시예6 및 비교예3의 결과에서 알 수 있듯이, 포스파티딜에탄올아민의 제조에 있어서도 에틸아세테이트 단독 용매보다는 헥산-에틸아세테이트의 혼합 용매를 사용하는 경우에 그 효과가 더 우수하였다.

<실시예 7: 헥산-에틸아세테이트 혼합용매를 이용한 리소포스파티딜에탄올아민의 제조>

실시예 6에서의 전이반응에 이어서, 포스포리파제 A를 추가로 처리하여 리소포스파티딜에탄올아민을 제조하였다.

에탄올아민 60 g을 소디움 아세테이트 완충용액 (pH 5.6) 400ml에 넣고 포스포리파제 D (스트렙토버티실리움속(Streptoverticiliumsp.), 두산 바이오텍)1000 unit를 넣고 40℃에서 교반하여 에탄올아민을 완전히 녹인 후, 여기에 포스파티딜콜린 함량 40％ 이상인 합성 레시틴 (Centrolex FP40, CENTRAL SOYA사) 100g을 헥산:에틸아세테이트 2:2인 용매 400ml에 녹인 것을 섞어, 200rpm으로 교반하면서 24 시간 반응시켰다. 이 후 돼지 췌장 포스포리파제 A2 (8,000 IU/ml, 상품명 LECITASE 10L, NOVO NORDISK Co.)를 6ml 첨가한 후 37℃에서 6 시간 반응시켰다. 반응 종료 후 정치하고 상분리가 되면 상층부를 덜어내어 증발 농축시키고 이어 아세톤 1L를 이용하여 분말화시켰다. 이렇게 얻어진 것의 수율은 40.2% 였으며 리소포스파티딜에탄올아민의 함량은 68% 였다.

<실시예 8 : 헥산-에틸아세테이트 혼합용매를 이용한 포스파티딘산의 제조>

소디움 아세테이트 완충용액 (pH 5.6) 400ml에 포스포리파제 D (양배추 유래) 1000unit을 넣고 40℃에서 교반한 후, 여기에 포스파티딜 콜린 함량이 70％ 이상인 레시틴(DS- PC 70, 두산바이오텍사) 50g 을 헥산:에틸아세테이트 2:2인 용매 100 ml에 녹인 것을 섞어, 200 RPM으로 교반하면서 12 시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 30분간 정치시킨 후, 상층부를 회수하여 감압 증발시켜 용매를 완전히 증발시켰다. 이렇게 얻은 결과물의 포스파티딘산의 함량은 HPLC 분석한 결과 90.5％였고 수율은 80.3％였다.

<비교예 5: 에틸아세테이트를 이용한 포스파티딘산의 제조>

소디움 아세테이트 완충용액 (pH 5.6) 400ml에 포스포리파제 D (양배추 유래) 1000unit을 넣고 40℃에서 교반한 후, 여기에 포스파티딜 콜린 함량이 70％ 이상인 레시틴(DS- PC 70, 두산바이오텍사) 50g 을 에틸아세테이트 100 ml에 녹인 것을 섞어, 200 RPM으로 교반하면서 12 시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 30분간 정치시킨 후, 상층부를 제거하고 헥산으로 추출하여 추출된 상층부를 회수하여 감압 증발시켜 용매를 완전히 증발시켰다. 이렇게 얻은 결과물의 포스파티딘산의 함량은 HPLC 분석한 결과 35.5％였고 수율은 70.3％였다.

상기 실시예8 및 비교예4의 결과에서 알 수 있듯이, 포스파티딘산의 제조에 있어서도 에틸아세테이트 단독 용매 보다는 헥산과 에틸아세테이트의 혼합 용매의 경우 그 효과가 우수하였다.

<실시예 9 : 헥산-에틸아세테이트 혼합용매를 이용한 리소포스파티딘산의 제조>

실시예 8에서의 가수분해 반응에 이어서, 포스포리파제 A를 추가로 처리하여 리소포스파티딘산을 제조하였다.

즉, 소디움 아세테이트 완충용액 (pH 5.6) 1.3L에 포스포리파제 D 1000 unit (양배추 유래)를 첨가하고 40℃에서 교반한 후, 여기에 레시틴(CENTROLEX D, CENTRAL SOYA사, 포스파티딜콜린 함량 28％) 1kg을 헥산:에틸아세테이트 1:3인 용매 2L에 녹인 것을 섞어, 200rpm으로 교반하면서 24시간 반응시킨 후 돼지 췌장 포스포리파제 A2 (8,000 IU/ml, 상품명 LECITASE 10L, NOVO NORDISK Co.)를 15ml 첨가한 후 40℃에서 6 시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 감압농축시키고 아세톤 5 리터를 이용하여 물과 지방산을 제거한 후 리소포스파티딘산을 제조하였다. 이렇게 얻은 결과물인 리소포스파티딘산 함량은 85.2 % 였으며 수율은 43.2% 였다.

이상에서 본 발명이 실시예를 살펴보았다. 결론적으로 레시틴을 용해시킬 때 혼합용매, 특히 헥산과 에틸아세테이트를 소정의 비율로 혼합한 혼합용매를 사용함으로써, 레시틴 개질 반응성이 우수해짐을 알 수 있다.

본 발명은 헥산과 에틸아세테이트의 혼합용매와 완충용액의 이상계 반응시스템을 사용함으로써 식품용 변형 레시틴 생산에 적합한 제조방법을 제공할 수 있다. 이와 같은 복합용매-완충용액의 이상계 시스템은 중 저순도의 레시틴 (PC 함량 25％ 이하) 뿐만 아니라 고순도의 레시틴까지도 모두 원활하게 용해시킬 수 있으며, 따라서, 반응성이 매우 높다. 또한, 반응 후 원하는 변성 레시틴을 포함한 레시틴 반응물은 모두 용매층에 녹아 있어, 반응 후 반응물의 회수가 매우 용이하다. 이 방법은 천연 레시틴 뿐만 아니라 합성 레시틴의 전이 반응 및 가수분해반응에도 매우 적합한 장점이 있다.

Claims (13)

1. 레시틴을 개질하여 변형 레시틴을 제조하는 방법에 있어서,

   2이상의 유기용매를 혼합하여 제조된 혼합용매 및 완충용액으로 이루어지는 이상계 시스템에서 포스포리파제 D의 존재 하에 레시틴을 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 변형 레시틴의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 혼합용매는 헥산과 에틸아세테이트의 혼합물인 것을 특징으로 하는 변형 레시틴의 제조방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 헥산과 에틸아세테이트의 혼합물의 부피비는 에틸아세테이트 : 헥산이 9:1 내지 1:9 인 것을 특징으로 하는 변형 레시틴의 제조방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 에틸아세테이트:헥산의 비는 8:2 내지 4:6 인 것을 특징으로 하는 변형 레시틴의 제조방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충용액의 pH는 4 내지 8인 것을 특징으로 하는 변형 레시틴의 제조방법.
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응은 20℃ 내지 60℃의온도범위에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 변형 레시틴의 제조방법.
7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레시틴은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜산 및 포스파티딜이노시톨 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형 레시틴의 제조방법.
8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레시틴을 반응시키는 단계는 레시틴과 함께 수산기 함유 물질을 반응시키는 것을 특징으로 하는 변형 레시틴의 제조방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 수산기 함유 물질은 세린, 콜린, 에탄올아민, 글리세롤, 이노시톨, 폴리에틸렌글리콜, 글루코스, 스핑고신 및 아스콜빈산으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 변형 레시틴의 제조방법.
10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레시틴은 대두레시틴, 채종레시틴, 어류 유래 레시틴, 연체동물 유래 레시틴 및 난황레시틴으로 이루어진 군에서 선택된 것 중 하나인 지방산 고리가 탄소수 6 내지 30개의 포화, 모노-, 다가 불포화지방산, 또는 이들의 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 암모늄염, 인산염, 염산염 및 황산염 중 하나인 것을 특징으로 하는 변형 레시틴의 제조방법.
11. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포스포리파제 D는 미생물 유래 또는 식물 유래인 것을 것을 특징으로 하는 변형 레시틴의 제조방법.
12. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레시틴을 반응시키는 단계 이후에, 수소를 첨가하여 지방산의 조성을 바꾸는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 변형 레시틴의 제조방법.
13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레시틴을 반응시키는 단계 이후에, 리소 형태의 변형 레시틴을 제조하기 위하여 포스포리파제 A를 추가로 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 변형 레시틴의 제조방법.