KR100442538B1

KR100442538B1 - 유기용매에서 포스파티딜세린 및 리조포스파티딜세린의제조방법

Info

Publication number: KR100442538B1
Application number: KR10-2001-0065038A
Authority: KR
Inventors: 한정준; 정국훈; 고의찬
Original assignee: 주식회사 두산
Priority date: 2001-05-07
Filing date: 2001-10-22
Publication date: 2004-07-30
Also published as: KR20020085756A

Abstract

본 발명은 유기용매 상에서 포스포리파제 D로 레시틴을 처리하여 포스파티딜세린을 제조하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 포스파티딜세린의 제조 공정에서 포스포리파제 A를 추가로 처리하여 리조포스파티딜세린을 제조하는 방법을 제공한다. 보다 상세하게는, 헥산과 에틸아세테이트로 된 혼합용매 또는 헥산과 아세톤으로 된 혼합용매(제 1상)와 세린이 포함된 완충용액(제 2상)으로 이루어진 이상계 시스템(two phase system)에서, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜이노시톨 중 적어도 하나를 포함하는 레시틴과 세린의 혼합물을 포스포리파제 D로 처리하여(리조포스파티딜세린을 제조하는 경우는 포스포리파제 A를 추가로 처리) 포스파티딜세린(또는, 리조포스파티딜세린)을 제조하는 방법을 제공한다.

Description

유기용매에서 포스파티딜세린 및 리조포스파티딜세린의 제조방법{Method for producing phosphatidylserine and lysophosphatidylserine in organic solvent}

본 발명은 유기용매에서 레시틴(lecithin)을 포스포리파제 D로 처리함으로써 포스파티딜세린을 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 천연 또는 합성의 레시틴의 단일물 혹은 혼합물, 특히, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜이노시톨 중 적어도 하나를 포함하는 레시틴을 헥산과 에틸아세테이트로 이루어진 혼합용매 또는 헥산과 아세톤으로 이루어진 혼합용매에서 세린 및 포스포리파제 D로 처리하여 전이반응을 행함으로써 포스파티딜세린을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 상기 포스파티딜세린을 제조하는 공정에서, 포스파티딜세린의 제조 후 또는 제조 과정 중에 추가로 포스포리파제 A를 처리함으로써, 리조포스파티딜세린을 제조하는 방법에 관한 것이다.

포스파티딜세린은 천연에 존재하는 지방질의 일종으로서, 세린기(친수 부분), 인산기, 글리세롤 및 2개의 지방산기(소수부)가 결합된 물질이다. 인간의 뇌는 건조중량 중 레시틴의 중량이 약 반을 차지하는데, 이러한 레시틴의 대부분은 신경 세포막을 형성하고 있다. 포스파티티딜세린은 세포막의 중요한 성분인 레시틴 유도체의 일종으로서 특히 뇌에 많이 존재하고 있는 물질인데, 신경세포막에서 생명유지 활동을 위한 에너지의 출입, 신경전달물질의 방출이나 시냅스의 활동 등의 정보전달 등 신경세포의 기능발현에 깊이 관여하고 있다고 생각되고 있다.

이 때문에, 포스파티딜세린은 '뇌의 영양소'라고 일컬어지고 있다. 포스파티딜세린은 1948년 폴치(Folch)에 의해 분리 된 이후, 수많은 연구자에 의하여 연구되어지고 있다. 1997년까지 34건의 임상시험(이 중 맹검 시험이 17건)이 실시 되었고, 그 결과로서 알츠하이머증을 시작으로 하는 치매증을 개선하는 기능 및 뇌 기능을 젊어지게 하는 기능이 있는 것으로 알려져 왔다. 이들 뇌기능 개선효과에 대해서는 이미 많은 연구 결과가 보고되었으며 간질에 대한 효과, 스트레스에 대한 내성 및 호르몬 분비 리듬의 회복기능 등도 밝혀지고 있다.

한편, 리조포스파티딜세린은 포스타티딜세린의 α위치 또는 β위치의 지방산 고리가 절제된 것으로 이 역시 뇌 내의 글루코오스 및 혈중 글루코오스의 농도를 증가시키는 작용을 하는 것으로 보고되고 있다(H.W. Changet al., Br. J. Pharmacol., vol 93, p611, 1988).

종래에는 소뇌(bovine cerebrum)로부터 추출된 포스파티딜세린이, 그 특징적인 지방산 조성 때문에, 뇌 내의 글루코스 농도를 증가시키는 작용을 하는 것이라고 생각되었다. 초기에는 대부분의 포스파티딜세린의 연구는 소의 뇌로부터 얻은 것에 기초하여 이루어졌다. 그러나 소뇌로부터 포스파티딜세린을 추출할 경우, 소 1마리분의 뇌로부터 포스파티딜세린을 1g 정도밖에 입수할 수 없었으며, 소뇌 유래의 포스파티딜세린은 영국에 발단하여, 전세계적으로 큰 문제가 되고 있는 광우병의 우려가 있다.

한편, 최근의 연구에 의하면, 대두로부터 유래된 레시틴으로부터 효소에 의한 포스파티딜기 전이반응을 이용해서 제조된 포스파티딜세린 및 이를 포스포리파제 A2 처리를 하여 얻어진 리조포스파티딜세린도 뇌 내의 글루코스 농도를 증가시키고, 기억장애를 회복하는 현저한 효과를 가지고 있는 것이 확인되었다. 따라서 현재는 대두 유래의 포스파티딜세린이 시장에 판매되고 있으며, 식품용 재료로서 안전성 또한 우수하다는 평가를 받고있다. 이러한 대두 유래의 포스파티딜세린에 대해서도 여러 가지 임상 시험이 이루어졌으며, 이러한 임상 시험 결과, 대두 유래의 포스파티딜세린에는 특별한 부작용이 발견되지 않았고, 또한, 광우병등의 문제도 없어서 식품으로 이용할 경우 안전성이 매우 높다고 평가된다.

포스파티딜세린은 대두에 0.2％ 이하의 극 미량으로 존재하기 때문에 이를 농축하여 얻는 것은 사실상 불가능하다. 따라서 포스포리파제 D를 이용하는 전이반응에 의하여 포스파티딜세린을 합성하려는 시도가 있어왔다. 그러나, 알려진 제조방법의 대부분은 실험실 규모의 소량 합성에 불과하다. 따라서, 실험실 규모의 합성은 실제로 산업적 규모의 생산이 쉽게 되지 못함은 잘 알려진 바이다. 산업적인 스케일로 포스파티딜세린을 합성하는 방법에 대하여 몇 가지 특허가 보고되고 있기는 하지만, 아직 초보적인 수준이다.

포스포리파제 D는 전이반응과 가수분해 반응을 동시에 일으킬 수 있는 효소로서 상기 전이반응과 가수분해 반응은 상호 경쟁적(상보적)이다. 이 두 반응의 우세 정도는 반응 조건에 의해 매우 큰 영향을 받는다.

한편, 레시틴을 개질하여 포스파티딜세린을 합성하는 연구는 여러 연구자들에 의해 보고되어 왔다. 그 예로 L. R. Juneja[Biochimica Biophysica Acta, 1003, 277∼283, 1989] 등이 포스파티딜콜린의 함량이 매우 높은 정제된 레시틴을 기질로 한 포스파티딜세린의 합성을 보고하였다. 이들은 물과 단일 유기용매로 구성된이상계 시스템을 이용하였으며, 사용된 용매는 에틸에테르, 에틸아세테이트, 벤젠, 톨루엔 등이었다.

Okahata Y. 등은 그들의 논문[J. Chem. Soc. Perkin trans.1, 919(1995)]에서 물과 벤젠 이상계를 이용하여 지질에 코팅된 방선균 유래의 포스포리파제 D를 처리하여 포스파티딜세린을 합성하는 반응시스템을 선보였다.

또한, 포스파티딜세린을 생산하는 방법에 대한 몇몇 특허도 보고되고 있다. JP 소63-036792B는 이소프로필 에테르와 물로 이루러진 이상계 시스템을 이용하고, 효소로서 양배추 유래의 포스포리파제를 이용하는 방법에 대하여 기재하고 있다. 여기서는, 포스파티딜콜린의 함량이 68％ 정도인 부분 정제된 기질을 이용하였으며 합성된 포스파티딜세린의 함량은 24％ 정도였다.

또한, JP 평02-079996B의 경우, 용매로서 에틸아세테이트를 이용하고, 효소로서 방선균 유래의 포스포리파제 D를 이용하는 방법에 대하여 기재하고 있다. 여기서는, 순수한 포스파티딜콜린을 사용하였으며 68％ 정도의 포스파티딜세린을 얻었다. 한편, JP 평02-079996B의 경우 0.6g의 포스파티딜콜린을 20ml의 에틸아세테이트와 10ml의 완충용액로 이루어진 이상계 시스템에서 매우 희석된 조건에서 반응을 시켰다.

또한 ITALFARMACO SUD SPA사의 유럽특허 (EP 0776976호)에는 방선균 유래의 포스포리파제 D를 이용하여 벤젠-물 이상계 시스템에서 포스파티딜세린을 합성하는 방법을 기재하고 있다.

그러나, 상기 방법에 사용된 용매는 에틸아세테이트를 제외하고는 모두 식용으로 사용할 수 없는 비교적 독성이 큰 용매들이며, 또한, 대부분 반응기질로서 고순도로 정제된 포스파티딜콜린을 사용하였다. 이상계 시스템에서 용매로서 에틸아세테이트를 이용한 경우에 있어서도, 기질인 레시틴을 일정농도 이상 사용하여 반응을 진행시킬 경우, 반응 중 응집이 일어나 반응성 및 수율이 현저히 저하되고 분리 정제가 용이하지 못하다는 문제점이 있다.

한편, 독일의 LUCAS MEYER 회사는 유기 용매를 이용하지 않는 포스파티딜세린 방법을 개발하였다. 하지만 이 경우 반응 중 미생물에 오염이 되기 쉬우며 반응중 산패가 일어나기 쉽다는 단점이 있다

이에 본 발명자들은 선행기술의 문제점을 해결하고, 식용으로서도 안전한 포스파티딜세린 및 리조포스파티딜세린을 제공할 수 생산방법에 대하여 연구하였다.

식품 생산에 사용 가능한 용매로서 각국에서 허가된 것으로는 헥산, 에틸아세테이트, 아세톤, 에탄올 등이 있으며, 기타 화학적 유기용매는 대부분의 나라에서 식용 원료 생산에 사용하는 것이 금지되어 있다. 그 중에서 에틸아세테이트는 포스포리파제 D 반응에 있어서 많은 이용이 보고되고 있으며 이와 관련한 몇몇 특허도 보고되고 있다.

포스파티딜콜린의 함량이 20∼40％, 포스파티딜에탄올아민의 함량이 20∼30％ 정도인 저순도 레시틴(예, 신동방 SOYA LECITHIN POWDER 95, CENTRAL SOYA 사 FP 40, D, RP40 등)은 에틸아세테이트에 잘 녹지 않는다. 특히, 에틸아세테이트-물로 이루어진 이상계 시스템에서는, 레시틴을 일정 농도 이상 사용할 경우, 교반이 원활하지 않으며 레시틴의 응집현상이 일어나며 반응성이 매우 떨어진다. 헥산의 경우는 레시틴을 녹일 수 있는 매우 효율적인 용매이지만 포스파티딜세린 합성전이 반응에서 반응성이 매우 떨어진다는 단점이 있다.

그러나, 혼합용매, 특히, 헥산과 아세틸렌 또는 헥산과 아세톤으로 이루어진 혼합용매를 사용할 경우, 상기와 같은 문제점을 해결할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 상기 문제점을 해결하여, 식품용 포스파티딜세린 및 리조포스파티딜세린의 생산에 적합한 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 중·저순도의 레시틴(레시틴 함량 50％ 이하) 뿐만 아니라 고순도의 레시틴도 모두 원활하게 용해시킬 수 있으며, 반응성이 매우 우수한 용매계 및 그 용매계를 이용한 포스파티딜세린 및 리조포스파티딜세린의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 반응 후 포스파티딜세린 또는 리조포스파티딜세린을 포함한 레시틴 반응물의 회수가 용이한 포스파티딜세린의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 레시틴의 극성 부분을 치환하여프스파티딜 세린 또는 리조포스타티딜 세린을 제조하는데 있어서, 유기용매로서 2 이상의 유기용매를 혼합한 혼합용매를 사용하는 방법을 제공한다.

즉, 본 발명에 의한 제조방법은 미생물 유래 또는 식물 유래의 포스포리파제 D를 이용하여, 상업적으로 이용 가능한 레시틴의 극성부분을 세린기로 치환하여 포스파티딜세린을 제조하는 것으로서, 유기용매로서 에틸아세테이트와 헥산 혼합용매 또는 헥산과 아세톤의 혼합용매를 사용하며, 수용액 성분으로는 초산 완충용액 또는 인산 완충용액으로서, pH 4∼8, 보다 바람직하게는 pH 5∼7, 사이의 완충용액을 사용하는 이상계 시스템을 이용한다.

본 발명은 2 이상의 유기용매를 혼합하여 제조된 유기용매(제 1상) 및 완충용액(제 2상)으로 이루어진 이상계 시스템에서, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민 및 포스타티딜이노시톨 중 적어도 하나를 포함하는 레시틴과 세린을 포스포리파제 D의 존재하에서 반응시켜 포스파티딜세린을 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 2 이상의 유기용매를 혼합하여 제조된 유기용매 및 완충용액으로 이루어진 이상계 시스템에서, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜이노시톨 중 적어도 하나를 포함하는 레시틴과 세린을 포스포리파제 D와 포스포리파제 A(A1 또는 A2)로 처리하여 리조포스파티딜세린을 제조하는 방법을 제공한다.

상기 방법에서 세린은 라세믹 세린 또는 L-세린 어느 것이나 사용할 수 있으며, 이들의 혼합물을 사용할 수도 있다.

상기 혼합용매는 레시틴을 용해하는 데 사용할 수 있으며, 그 결과, 용해가원활하며, 반응 후, 반응 생성물의 회수에도 용이하다.

상기 제조방법에서 레시틴은 지방산 고리가 탄소수 6 내지 30개의 같거나 다른 포화, 모노-, 다가 불포화지방산을 포함하는 식물성 혹은 동물성 레시틴일 수 있으며, 상기 레시틴에 수소를 첨가하여 지방산의 조성을 바꾼 것일 수 있으며, 염의 형태일 수도 있다. 염으로서는 제약학상 허용될 수 있는 염의 형태라면 아무런 문제없이 사용가능하며, 구체적인 염으로서는 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 암모늄염, 인산염, 염산염, 황산염을 들 수 있다. 특히, 이들 염 중에서 나트륨염, 칼륨염이 바람직하다.

또한, 상기 완충용액의 pH는 4 에서 8의 범위이며, 상기 방법에서 반응온도는 20℃에서 60℃의 범위인 것이 좋다.

바람직하게는 상기 2 이상의 유기용매를 혼합하여 제조된 유기용매는 에틸아세테이트와 헥산으로 이루어진 혼합용매 또는 헥산과 아세톤으로 이루어진 혼합용매이다. 여기서, 에틸아세테이트:헥산의 비가 9:1 에서 1:9까지인 경우가 좋으며, 보다 바람직하게는 에틸아세테이트:헥산의 비는 4:6 내지 8:2인 것이 좋다. 또한, 헥산 및 아세톤의 혼합용매의 경우 그 혼합비가 7:3 에서 2:8 인 경우가 좋으며, 보다 바람직하게는 6:4 에서 5:5인 경우가 좋다.

본 발명에 의한 상기 포스포리파제 D는 미생물 유래 또는 식물 유래의 것일 수 있다.

제조방법을 보다 구체적으로 설명하면, 교반 장치 및 온도 조절 장치를 갖추고 있는 반응조에 L-세린(또는 라세믹-세린)을 넣고, 초산 완충용액 또는 인산 완충용액 (pH 4∼8, 보다 바람직하게는 pH 5∼7, 약 0.2 M)을 상기 세린의 3∼6배정도 되도록 넣는다. 반응은 필요에 따라 20∼60℃의 범위에서 행할 수 있다. 세린이 녹아있는 완충용액에 포스포리파제 D의 활성을 갖는 효소를 필요량만큼 첨가한다. 이 후, 혼합용매(특히, 헥산과 에틸아세테이트의 혼합용매 또는 헥산과 아세톤의 혼합용매)에 레시틴을 적당한 농도로 녹여 첨가한다. 반응 상황에 따라 5시간∼24시간 교반한다. 반응이 끝나고 2 시간정도 정치시킨 후, 상층부를 회수하여 10℃ 정도의 온도에서 보관하면서, 12시간 정치 후 여과하여 여액을 물로 씻은 다음, 상분리시켜 상층부를 감압건조하여 유기용매가 완전히 제거되도록 한다. 이 후, 이를 분쇄하거나 필요에 따라 아세톤을 침전을 행하고 아세톤을 증발시켜 분말화 시켜 포스파티딜세린을 얻는다.

리조포스파티딜세린을 합성하기 위해서는 포스포리파제 A(A1 또는 A2)를 상기 반응에 추가로 처리한다. 즉, 앞에 기술한 방법대로, 유기용매로서 혼합용매(헥산과 에틸아세테이트의 혼합용매 또는 헥산과 아세톤의 혼합용매)를 사용하며 수용액 성분으로 초산 완충용액 또는 인산 완충용액과 같은 pH 4∼8, 바람직하게는 pH 5∼7 사이의 완충용액을 사용하는 이상계 시스템을 이용하여 포스파티딜세린을 합성한 후, 여기에 포스포리파제 A(A1 또는 A2)를 첨가하여 교반함으로써 포스파티딜세린 중의 지방산 사슬 하나를 가수분해시켜 리조포스파티딜세린을 얻을 수 있다. 반응 순서를 바꾸어서 원료 레시틴에 먼저 포스포리파제 A(A1 또는 A2)를 처리하여 리조레시틴을 만든 후, 세린과 포스포리파제 D를 처리하여 리조포스파티딜세린을 얻을 수도 있다.

또한, 원료 레시틴, 포스파티딜세린 또는 리조포스파티딜세린에 수소 첨가 반응하여 지방산 조성을 바꿀 수 있다. 수소 첨가 반응의 경우는 헥산:에탄올의 비가 9:1인 용매에 10∼20％의 농도로 원료 레시틴이나 전이반응에 의해 합성된 포스파티딜세린 또는 리조포스파티딜세린을 녹이고, 5％ 팔라디움 카본을 전체의 3.3∼4％가 되도록 첨가한 후, 40 psi 이상의 수소압으로 3회 불어넣고, 최종적으로 원하는 수소 첨가의 정도에 따라 40∼60 psi의 수소압에서 50℃에서 300∼900 rpm의 조건으로 6∼15 시간 정도 반응을 시키면 수소 첨가된 원료 레시틴, 포스파티딜세린 또는 리조포스파티딜세린을 얻을 수 있다.

이하 실시예에서 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

<실시예 1>

L-세린 350g을 소디움 아세테이트 완충용액 (pH 5.6) 1.3ℓ에 넣고, 방선균 유래 포스포리파제 D 1000 unit를 첨가하고, 40℃에서 교반하여 세린을 완전히 녹인 후, 여기에 레시틴(CENTROLEX D, CENTRAL SOYA사, 포스파티딜콜린 함량 23％) 1 kg을 헥산:에틸아세테이트의 비율이 1:4인 혼합용매 2ℓ에 녹인 것을 섞어, 200rpm으로 교반하면서 24시간동안 반응시킨다. 반응이 끝난 후 30분간 정치시킨 후 상층부를 회수하여 10℃로 냉각 한 후, 여과하여 여액을 물로 수세하고, 감압증발시켜 용매를 완전히 증발시킨다. HPLC 분석한 결과 상기에서 얻은 포스파티딜세린의 함량은 29.5％ 였고, 수율은 90.2％ 였다.

<참고예 1>

포스파티딜세린 함량을 측정하기위해 HPLC 분석 방법을 이용하였으며, 그 조건은 다음과 같다. HPLC 분석용 컬럼으로 Lichrosphere Si 60-5㎛(4 x 125 mm)을 사용하였고, 이동상으로 A상은 클로로포름:메탄올:30％ 암모니아 = 80:19.5:0.5 이고, B상은 클로로포름:메탄올:물:30％ 암모니아 = 60:34.5:5.5:0.5 인 두 용매 시스템의 농도 구배를 이용하였다. 시간 프로그램은 초기 14분 동안 A상 100％에서 B상 100％로 하고, 이 후 9분간 B상 100％에서 후 다시 A상 100％로 변화시키는 방법을 이용하였다. 유속은 분당 1ml이며, 검출기로는 ELSD 검출기를 사용하였고, 검출기 온도는 85℃, 가스 압력은 1.8 L/min으로 하였다. 이하 같다.

<실시예 2>

효소원으로서 방선균 유래의 포스포리파제 D 이외에도 식물 유래의 포스포리파제 D도 이용 가능하다. 식물 유래 포스포리파제 D에는 양배추, 대두 등이 있는데, 본 예에서는 포스포리파제 D를 활성을 나타내는 양배추 추출물을 이용하여 포스파티딜세린을 합성하였다. L-세린 300g을 소디움 아세테이트 완충용액 (pH 5.6) 1.3ℓ에 넣고, 40℃에서 교반하여 세린을 완전히 녹인 후, PLD 활성을 지닌 양배추 추출물 1000unit를 넣고, 레시틴 (CENTROLEX D, CENTRAL SOYA사) 1kg을 헥산:에틸아세테이트 1:3인 용매 2ℓ에 녹인 것을 섞어, 200rpm으로 교반하면서 8 시간 반응시킨다. 반응이 끝난 후, 30분간 정치시킨 후, 상층부를 회수하여 10℃로 조절한 후 여과하여 여액을 물로 수세한 후, 감압 증발시켜 용매를 완전히 증발시킨다. 이렇게 얻은 결과물에서 포스파티딜세린의 함량은 HPLC 분석한 결과 25.5％였고 수율은 92.5％ 였다.

<실시예 3>

L-세린 150g을 소디움 아세테이트 완충용액 (pH 5.6) 400ml에 넣고 포스포리파제 D(Streptomycessp.유래) 1000 unit를 넣고 40℃에서 교반하여 세린을 완전히 녹인 후, 여기에 포스파티딜 콜린 함량 95％ 이상인 레시틴 (DS- PC 95, 두산 바이오텍사) 75g을 헥산:에틸아세테이트 2:2인 용매 400ml에 녹인 것을 섞어, 200rpm으로 교반하면서 24 시간 반응시킨다. 반응이 끝난 후 30분간 정치시킨 후, 상층부를 회수하여 10℃에서 3 시간 정치한 후 여과하여, 여액을 물로 수세한 후 감압 증발시켜 용매를 완전히 증발시킨다. 이렇게 얻은 결과물의 포스파티딜세린의 함량은 HPLC 분석한 결과 90.5％ 였고 수율은 90.3％였다.

<실시예 4>

L-세린 150g을 소디움 아세테이트 완충용액 (pH 5.6) 400ml에 넣고 포스포리파제 D(Streptomycessp. 유래, 두산 바이오텍사) 1000 unit를 넣고 40℃에서 교반하여 세린을 완전히 녹인 후, 여기에 디올레오일포스파티딜콜린 함량 95％ 이상인 합성 레시틴 (DS-DOPC 95, DOOSAN BIOTECH사) 75g을 헥산:에틸아세테이트 3:2인 용매 400ml에 녹인 것을 섞어, 200rpm으로 교반하면서 24 시간 반응시킨다. 반응이 끝난 후 30분간 정치시키고, 상층부를 회수하여 10℃에서 3 시간 정치한 후 여과하여, 여액을 물로 수세한 후 감압 증발시켜 용매를 완전히 증발시킨다. 이렇게 얻은 결과물의 포스파티딜세린의 함량은 HPLC 분석한 결과 85.5％였고 수율은 92.3％였다.

<실시예 5>

L-세린 150g을 소디움 아세테이트 완충용액 (pH 5.6) 400ml에 넣고 포스포리파제 D(Streptomycessp. 유래) 1000unit을 넣고 40℃에서 교반하여 세린을 완전히 녹인 후, 여기에 포스파티딜 콜린 함량이 70％ 이상인 수소화 레시틴(DS- HPC 70, 두산바이오텍사) 100g을 헥산:에틸아세테이트 2:2인 용매 400 ml에 녹인 것을 섞어, 200 RPM으로 교반하면서 24 시간 반응시킨다. 반응이 끝난 후 30분간 정치시킨 후, 상층부를 회수하여 10℃에서 3 시간 정치한 후 여과하여, 여액을 감압 증발시켜 용매를 완전히 증발시킨다. 이렇게 얻은 결과물의 포스파티딜세린의 함량은 HPLC 분석한 결과 88.5％였고 수율은 89.3％였다.

<실시예 6>

실시예 1에서 얻어진 포스파티딜세린 1kg을 10％의 농도로 헥산:에탄올의 비가 9:1인 용매에 녹이고, 5％ 팔라디움 카본을 전체의 3.3 중량％가 되도록 첨가한 후 40 psi 이상의 수소압으로 3회 불어넣고, 이후 60 psi의 수소압으로 50℃에서 900rpm의 조건으로 15 시간 정도 반응을 시키면 거의 모든 지방산이 수소첨가가 되어 포화 지방산으로 이루어진 포스파티딜세린을 908g을 얻을 수 있었다.

<실시예 7>

실시예 1에서 얻어진 포스파티딜세린 1kg을 20％의 농도로 에탄올에 녹이고, 5％ 팔라디움 카본을 전체의 4 중량％가 되도록 첨가한 후 40 psi 이상의 수소압으로 3회 불어넣고, 이후 30 psi의 수소압으로 50℃에서 300rpm의 조건으로 6 시간 정도 반응을 시키면 지방산이 올레인산이 60%, 리놀렌산이 10% 미만 나머지는 포화지방산으로 이루어진 포스파티딜세린을 890g을 얻을 수 있었다.

<실시예 8>

실시예 1에서의 전이반응에 이어서, 포스포리파제 A를 추가로 처리하여 리조포스파티딜세린을 제조한다.

즉, L-세린 400g을 소디움 아세테이트 완충용액 (pH 5.6) 1.3ℓ에 넣고, 방선균 유래 포스포리파제 D 1000 unit을 첨가하고 40℃에서 교반하여 세린을 완전히 녹인 후, 여기에 레시틴(CENTROLEX D, CENTRAL SOYA사, 포스파티딜콜린 함량 28％) 1kg을 헥산:에틸아세테이트 2:2인 용매 2ℓ에 녹인 것을 섞어, 200rpm으로 교반하면서 24시간 반응시킨 후, 돼지 췌장 포스포리파제 A2 (8,000 IU/ml, 상품명 LECITASE 10L, NOVO NORDISK Co.)를 15ml 첨가한 후 40℃에서 6 시간 반응시킨다. 반응이 끝난 후 30분간 정치시킨 후 상층부를 회수하여 10℃로 조절한 후 여과하여, 여액을 물로 수세한 후 감압 증발시켜 용매를 완전히 증발시킨다. 이렇게 얻은 리조포스파티딜세린의 함량은 HPLC 분석한 결과 30.5％였고, 수율은 70.2％였다.

<실시예 9>

레시틴(CENTROLEX D, CENTRAL SOYA사, 포스파티딜콜린 함량 23％) 1kg을 헥산:에틸아세테이트 2:2인 용매 2ℓ에 녹인 후, 200rpm으로 교반하면서 소디움 아세테이트 완충용액(pH 5.6) 1.3ℓ에 넣고, 이 후 돼지 췌장 포스포리파제 A2 (8,000 IU/ml, 상품명 LECITASE 10L, NOVO NORDISK Co.)를 15ml 첨가한 후 40℃에서 6시간 반응시킨다. 이 후 L-세린 400g과 함께 방선균 유래 포스포리파제 D 1000 unit을 첨가하고, 40℃에서 교반하면서 24시간 반응시킨 후 30분간 정치시킨 후, 상층부를 회수하여 10℃로 조절한 후 여과하여, 여액을 물로 수세한 후 감압 증발시켜 용매를 완전히 증발시킨다. 이렇게 얻은 리조포스파티딜세린의 함량은 HPLC 분석한 결과 23.5％였고, 수율은 65.2％였다.

<실시예 10>

L-세린 350g을 소디움 아세테이트 완충용액 (pH 5.6) 1.3ℓ에 넣고, 방선균 유래 포스포리파제 D 1000 unit를 첨가하고, 40℃에서 교반하여 세린을 완전히 녹인 후, 여기에 레시틴(CENTROLEX D, CENTRAL SOYA사, 포스파티딜콜린 함량 23％) 1 kg을 헥산:아세톤의 비율이 5:5인 혼합용매 2ℓ에 녹인 것을 섞어, 200rpm으로 교반하면서 24시간동안 반응시킨다. 반응이 끝난 후 30분간 정치시킨 후 상층부를 회수하여 10℃로 냉각 한 후, 여과하여 여액을 물로 수세하고, 감압증발시켜 용매를 완전히 증발시킨다. 이렇게 얻은 포스파티딜세린의 함량은 HPLC 분석한 결과 29.5％ 였고, 수율은 85.2％ 였다.

<실시예 11>

L-세린 350g을 소디움 아세테이트 완충용액 (pH 5.6) 1.3ℓ에 넣고, 방선균 유래 포스포리파제 D 1000 unit를 첨가하고, 40℃에서 교반하여 세린을 완전히 녹인 후, 여기에 레시틴(CENTROLEX FP40, CENTRAL SOYA사, 포스파티딜콜린 함량 40％) 1 kg을 헥산:아세톤의 비율이 6:4인 혼합용매 2ℓ에 녹인 것을 섞어, 200rpm으로 교반하면서 24시간동안 반응시킨다. 반응이 끝난 후 30분간 정치시킨 후 상층부를 회수하여 10℃로 냉각 한 후, 여과하여 여액을 물로 수세하고, 감압증발시켜 용매를 완전히 증발시킨다. 이렇게 얻은 포스파티딜세린의 함량은 HPLC 분석한 결과 41.5％ 였고, 수율은 89.2％ 였다.

<비교예 1>

L-세린 400g을 소디움 아세테이트 완충용액 (pH 5.6) 1.3ℓ에 넣고 포스포리파제 D(Streptomyces sp.) 400 unit를 넣고, 40℃에서 교반하여 세린을 완전히 녹인 후, 여기에 레시틴 (CENTROLEX D, CENTRAL SOYA사, 포스파티딜콜린 함량 23％이상) 1kg을 에틸아세테이트 용매 4ℓ에 녹인 것을 섞어, 200rpm으로 교반하면서 24 시간 반응시킨다. 반응이 끝난 후 30분간 정치시킨 후 상층부를 덜어내어 버린 후, 하층부를 헥산을 이용하여 추출한 후 정치하여, 헥산층을 회수하여 용매를 감압 농축시켜 용매를 완전히 제거한다. 이렇게 해서 얻은 것의 포스파티딜세린의 함량은 16％ 였다.

<비교예 2>

L-세린 500g을 소디움 아세테이트 완충용액 (pH 5.6) 1.3ℓ에 넣고 포스포리파제 D(Streptomyces sp.) 400unit를 넣고, 40℃에서 교반하여 세린을 완전히 녹인 후, 여기에 레시틴(CENTROLEX D, CENTRAL SOYA사, 포스파티딜콜린 함량 23％이상) 1kg을 헥산 4ℓ에 녹인 것을 섞어 200rpm으로 교반하며 24 시간 반응시킨다. 반응이 끝난 후 30분간 정치시킨 후, 상층부를 덜어내어 10℃에서 하여 3시간 정치 후 상층부를 물로 수세한 후, 상층부의 용매를 감압 농축시켜 용매를 완전히 제거한다. 이렇게 해서 얻은 것의 포스파티딜세린의 함량은 3.5％였다.

이상에서 본 발명이 실시예 및 비교예를 살펴보았다. 이상에서 보는 바와 같이, 레시틴을 용해시킬 때 혼합용매, 특히 헥산과 에틸아세테이트를 소정의 비율로 혼합한 혼합용매를 사용함으로써, 포스파티딜세린과 리조포스파티딜세린의 수율이 우수해짐을 알 수 있다. 또한, 정제 공정에 있어서도, 정제 수율이 우수함을 알 수 있다.

본 발명은 헥산과 에틸아세테이트의 혼합용매 또는 헥산과 아세톤의 혼합용매와 완충용액의 이상계 반응시스템을 사용함으로써 식품용 포스파티딜세린의 생산에 적합하게 하였다. 이와 같은 복합용매-완충용액의 이상계 시스템은 중 저순도의 레시틴 (레시틴 함량 50％ 이하) 뿐만 아니라 고순도의 레시틴도 모두 원활하게 용해시킬 수 있으며, 따라서, 반응성이 매우 높다. 또한, 반응 후 포스파티딜세린을 포함한 레시틴 반응물은 모두 헥산 및 에틸아세테이트 층에 녹아있어, 반응 후 반응물의 회수가 매우 용이하다. 이 방법은 천연 레시틴뿐만 아니라 합성 레시틴의 전이 반응에도 매우 적합하다.

Claims

포스포리파제 D의 존재 하에서 레시틴과 세린을 반응시켜 포스파티딜세린을 제조하는 방법에 있어서,

상기 레시틴은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜이노시톨 중 적어도 하나를 포함하고,

상기 반응은 유기용매 및 완충용액으로 이루어진 이상계 시스템(two phase system)에서 진행되며,

상기 유기용매는 (A) 헥산; 및 (B) 에틸아세테이트 및 아세톤으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종;을 포함하는 2 이상의 유기용매를 혼합하여 제조된 혼합용매인 것을 특징으로 하는 포스파티딜세린의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 2 이상의 유기용매를 혼합하여 제조된 혼합용매는 에틸아세테이트 및 헥산을 9:1 내지 1:9의 비율로 혼합하여 이루어진 혼합용매인 것을 특징으로 하는 포스파티딜세린의 제조방법.
제 2항에 있어서, 에틸아세테이트:헥산의 비는 4:6 내지 8:2인 것을 특징으로 하는 포스파티딜세린의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 2 이상의 유기용매를 혼합하여 제조된 혼합용매는 헥산 및 아세톤을 7:3 내지 2:8의 비율로 혼합하여 이루어진 혼합용매인 것을 특징으로 하는 포스파티딜세린의 제조방법.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충용액의 pH는 4 에서 8의 범위인 것을 특징으로 하는 포스파티딜세린의 제조방법.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 반응온도는 20℃에서 60℃의 범위인 것을 특징으로 하는 포스파티딜세린의 제조방법.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레시틴은 대두레시틴, 채종레시틴, 어류 유래 레시틴, 연체동물 유래 레시틴 및 난황레시틴으로 이루어진 군에서 선택된 것 중 하나인 지방산 고리가 탄소수 6 내지 30개의 포화, 모노-, 다가 불포화지방산, 또는 이들의 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 암모늄염, 인산염, 염산염 및 황산염 중 하나인 것을 특징으로 하는 포스파티딜세린의 제조방법.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포스포리파제 D는 미생물 유래 또는 식물 유래인 것을 것을 특징으로 하는 포스파티딜세린의 제조방법.
제 7항에 있어서, 상기 레시틴에 수소를 첨가하여 지방산의 조성을 바꾼 것을 특징으로 하는 제조방법.
레시틴과 세린을 포스포리파제 D 및 포스포리파제 A로 처리하여 리조포스파티딜세린을 제조하는 방법에 있어서,

제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에서 제조된 포스파티딜세린에 포스포리파제 A를 추가로 처리하여 제조되는 것을 특징으로 하는 리조포스파티딜세린의 제조방법.
레시틴과 세린을 포스포리파제 D 및 포스포리파제 A로 처리하여 리조포스파티딜세린을 제조하는 방법에 있어서,

제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에서, 먼저 레시틴을 포스포리파제 A로 처리한 후 상기 제조방법을 수행하여 제조되는 것을 특징으로 하는 리조포스파티딜세린의 제조방법.