CN117776948A - 一种基于磷脂酰丝氨酸酶促合成反应液回收l-丝氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于磷脂酰丝氨酸酶促合成反应液回收L‑丝氨酸的方法，包括如下步骤，将磷脂酰胆碱与L‑丝氨酸在磷脂酶的催化作用下进行酶促反应，反应后得到含有L‑丝氨酸及胆碱的混合水溶液；将所得的L‑丝氨酸及胆碱混合水溶液中加入多孔介质和醇类，析出晶体，得到L‑丝氨酸和多孔介质的固体混合物；通过固液分离得到L‑丝氨酸和多孔介质固体混合物，用水溶解得到的L‑丝氨酸和多孔介质固体混合物，固液分离后得到L‑丝氨酸溶液，本发明在结晶之前加入多孔介质，使L‑丝氨酸水溶液在发生毛细相分离的现象，毛细相分离现象使得L‑丝氨酸析晶的所需的饱和浓度更低，消耗的乙醇的量更少，降低了磷脂酰丝氨酸的生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及L-丝氨酸回收领域，尤其是一种基于磷脂酰丝氨酸酶促合成反应液回收L-丝氨酸的方法。
背景技术
磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,简称PS)作为一种天然的稀有磷脂，是人体必需的三种磷脂之一，也是继大豆卵磷脂后的第二代益智产品。PS在动植物体当中广泛存在且有着极其重要的生理作用。在人体当中,PS在大脑中含量丰富，占大脑总磷脂的10-20％，是脑中神经纤维细胞膜最主要的酸性磷脂，可快速被人体所吸收，穿越血脑屏障调控细胞膜关键蛋白的功能状态，具有改善大脑功能、修复大脑损伤、提高人体免疫力和记忆力等功能。
磷脂酰丝氨酸的制备工艺有物理萃取法、化学合成法和酶催化合成法。酶催化法具有反应条件温和(通常为常温常压)、反应选择性好、转化率高的优势，是目前工业制备磷脂酰丝氨酸的主流工艺。
酶催化法合成PS是以磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,简称PC)和L-丝氨酸为底物，经磷脂酶D催化反应得到。理论上PC和L-丝氨酸是以摩尔比1：1进行反应,但实践中L-丝氨酸实际投料量可高达理论值的100倍(摩尔比)。其原因在于：首先，除了PC酶促反应生成PS主反应,还存在PC水解生成磷脂酸(Phosphatidic acid，PA)的副反应，降低了磷脂酰丝氨酸的收率；其次,产物胆碱存在反馈抑制现象，既抑制了反应平衡向右移动，降低了磷脂酰丝氨酸的转化率，又降低了酶促反应的速率。因此生产实践主要采用提高相对廉价的第二底物L-丝氨酸的投料量克服上述弊端，由此导致L-丝氨酸实际投料量远超理论值，L-丝氨酸损耗过大。例如：中国专利200810017261.9和江波等(磷脂酶D的纯化及催化制备磷脂酰丝氨酸研究，中国油脂2020，45：97-101)。因此，在PS的生产过程中，L-丝氨酸的回收重复利用对PS的降本增效十分重要。
对于酶法制备磷脂酰丝氨酸，L-丝氨酸的回收重复利用就是指既回收反应液中的L-丝氨酸，也要去除其中的副产物胆碱，L-丝氨酸的结晶可达到上述目的。将含L-丝氨酸的溶液先经过活性炭脱色，脱色液浓缩至有晶体析出，冷却，加乙醇结晶过滤得到L-丝氨酸产品。中国专利CN 201310508490.1中提到将L-丝氨酸的洗脱液浓缩到30％，加入等体积的80％乙醇，搅拌均匀后缓慢降温至5℃，静置6h以上让L-丝氨酸充分结晶，过滤得到L-丝氨酸产品，L-丝氨酸收率为79.6％。
封娟娟(基于L-丝氨酸有效利用的磷脂酰丝氨酸催化合成工艺研究，2016，西北大学)采用乙醇重结晶法回收PLD催化大豆卵磷脂合成PS反应体系中过量的L-丝氨酸，需要无水乙醇与较低的温度，L-丝氨酸的回收率可达90％左右，回收的L-丝氨酸中胆碱的夹杂量0.56％，虽可实现L-丝氨酸的回收重复利用，但成本依然较高。
这些工艺都需要先将L-丝氨酸溶液浓缩至一定的过饱和度，然后再加入高浓度的乙醇结晶，浓缩过程能耗较大，且易导致L-丝氨酸分解变质，因此需要开发一种能够减少能耗或乙醇消耗，避免L-丝氨酸变质的回收方法。
为此，本发明提出一种基于磷脂酰丝氨酸酶促合成反应液回收L-丝氨酸的方法解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于磷脂酰丝氨酸酶促合成反应液回收L-丝氨酸的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种基于磷脂酰丝氨酸酶促合成反应液回收L-丝氨酸的方法，包括如下步骤：
S1、将磷脂酰胆碱与L-丝氨酸在磷脂酶的催化作用下进行酶促反应，反应后得到含有L-丝氨酸及胆碱的混合水溶液；
S2、将S1所得的L-丝氨酸及胆碱混合水溶液中加入多孔介质和醇类，析出晶体，得到L-丝氨酸和多孔介质的固体混合物；
S3、将S2的固体混合物通过固液分离得到L-丝氨酸和多孔介质固体混合物；
S4、用水溶解S3得到的L-丝氨酸和多孔介质固体混合物，固液分离后得到L-丝氨酸溶液。
在进一步的实施例中，S1中磷脂酰胆碱的含量为25-60％，有机溶剂采用乙酸乙酯、氯仿或者乙醚。
在进一步的实施例中，S1中酶促反应包括将磷脂酰胆碱溶于有机溶剂中，得到第一混合物，再将丝氨酸溶于缓冲液中，得到第二混合物，最终将第一混合物和第二混合物相互混合后加入磷脂酶并反应。
在进一步的实施例中，磷脂酶为磷脂酶D。
在进一步的实施例中，S2中多孔介质可采用大孔硅胶、树脂、沸石、分子筛。
在进一步的实施例中，S2中醇类可采用乙醇和异丙醇。
在进一步的实施例中，S4中的固体混合物采用去离子水进行洗涤，使L-丝氨酸溶解并去除不溶解的多孔介质。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
L-丝氨酸的结晶一般将L-丝氨酸的水溶液浓缩至过饱和溶液，再通过降低温度逐步析晶。本发明在结晶之前加入多孔介质，使L-丝氨酸水溶液在多孔介质内部发生毛细相分离(Capillary Phase Separation，CPS)，CPS现象使得L-丝氨酸析晶所需的L-丝氨酸过饱和浓度降低，或者同样的L-丝氨酸过饱和浓度下，乙醇的消耗量更少，因此本发明工艺实现了降低析晶所需要的浓缩能耗，降低了乙醇的消耗量，获得了更高的回收率，并且整个过程中所添加的多孔介质可以继续循环使用，降低了磷脂酰丝氨酸的生产成本。
附图说明
图1为新的L-丝氨酸和回收的L-丝氨酸酶促反应合成PS的薄层色谱(TLC)检测对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明实施例中，一种基于磷脂酰丝氨酸酶促合成反应液回收L-丝氨酸的方法，包括以下步骤：
选取10g含量为25％的磷脂酰胆碱，溶于50mL的乙酸乙酯中，再称取84g L-丝氨酸溶于240mL pH＝5.6的醋酸盐缓冲液，将二者混合均匀后再加入5mL磷脂酶D(酶活120U/mL)，于40℃反应6h，反应结束后通过分液漏斗分相得到水相，再通过离心去除水相中残留的有机溶剂，得到含有L-丝氨酸与胆碱的水溶液，调整水溶液的L-丝氨酸浓度至30％。
取水相200ml均分为2份；
传统结晶法：一份采用常规结晶方法，加入100mL 80％的乙醇(v/v)搅拌均匀后，降温至10℃静置6h让其自然结晶；过滤得到L-丝氨酸晶体，用去离子水120mL溶解得到L-丝氨酸水溶液，检测L-丝氨酸和胆碱的含量，回收得到L-丝氨酸的含量为24.6g，胆碱含量为36.8mg；
本发明回收工艺：另一份先加入10g Amberlite FPC11(DOW Chemical)阳离子干树脂，再加入100mL 80％的乙醇(v/v)搅拌均匀后，降温至10℃静置6h让其自然结晶，过滤得到L-丝氨酸晶体和树脂混合物，用去离子水120mL洗涤丝氨酸树脂的混合固体，过滤除去与水不溶的树脂，得到L-丝氨酸水溶液，检测L-丝氨酸和胆碱的含量，回收L-丝氨酸的含量为38.8g，胆碱含量为40.5mg。传统结晶方法和本发明方法回收L-丝氨酸结果如下表：
实施例2
选取10g含量为60％的磷脂酰胆碱，溶于50mL的乙酸乙酯中，加入240mL pH＝5.6的醋酸盐缓冲液，搅拌均匀后再加入1.6g CaCl2和84g L-丝氨酸，混合均匀后再加入5mL的磷脂酶D(酶活120U/mL)，保持反应温度40℃，反应20h。反应结束后离心得到含有L-丝氨酸和胆碱的水相；
在水相加入30g大孔硅胶和200mL 80％的乙醇(v/v)搅拌均匀后，并保持温度10℃静置6h让其自然结晶，过滤得到L-丝氨酸晶体和硅胶混合物，用去离子水200mL洗涤L-丝氨酸和硅胶的混合固体，过滤除去不溶于水的硅胶，从而得到L-丝氨酸水溶液，用茚三酮法检测L-丝氨酸的含量，回收的L-丝氨酸含量为78g，胆碱含量为72.8mg。
实施例3
回收后的L-丝氨酸的酶促反应制备磷脂酰丝氨酸的使用效果如下：
称取10g含量为60％的磷脂酰胆碱2份，分别溶于50mL的乙酸乙酯中，一份使用新鲜的L-丝氨酸，一份使用回收的L-丝氨酸，其他反应操作步骤同实施例1，考察二者反应情况。反应结束后，有机相取样用TLC分析，使用氯仿:甲醇:氨水:水＝10:4:0.5:0.4(V/V)作为展开剂，使用磷钼酸显色剂显色后，对比用新鲜的L-丝氨酸和回收的L-丝氨酸反应合成磷脂酰丝氨酸，如图1所示可知，新的L-丝氨酸和回收的L-丝氨酸在反应上没有显著差异，因此回收的L-丝氨酸可以用于重复使用。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (7)
1.一种基于磷脂酰丝氨酸酶促合成反应液回收L-丝氨酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、将磷脂酰胆碱与L-丝氨酸在磷脂酶的催化作用下进行酶促反应，反应后得到含有L-丝氨酸及胆碱的混合水溶液；
S2、将S1所得的L-丝氨酸及胆碱混合水溶液中加入多孔介质和醇类，析出晶体，得到L-丝氨酸和多孔介质的固体混合物；
S3、将S2的固体混合物通过固液分离得到L-丝氨酸和多孔介质固体混合物；
S4、用水溶解S3得到的L-丝氨酸和多孔介质固体混合物，固液分离后得到L-丝氨酸溶液。
2.根据权利要求1所述的一种基于磷脂酰丝氨酸酶促合成反应液回收L-丝氨酸的方法，其特征在于：S1中磷脂酰胆碱的含量为25-60％，有机溶剂采用乙酸乙酯、氯仿或者乙醚。
3.根据权利要求1所述的一种基于磷脂酰丝氨酸酶促合成反应液回收L-丝氨酸的方法，其特征在于：S1中酶促反应包括将磷脂酰胆碱溶于有机溶剂中，得到第一混合物，再将丝氨酸溶于缓冲液中，得到第二混合物，最终将第一混合物和第二混合物相互混合后加入磷脂酶并反应。
4.根据权利要求1所述的一种基于磷脂酰丝氨酸酶促合成反应液回收L-丝氨酸的方法，其特征在于：磷脂酶为磷脂酶D。
5.根据权利要求1所述的一种基于磷脂酰丝氨酸酶促合成反应液回收L-丝氨酸的方法，其特征在于：S2中多孔介质可采用大孔硅胶、树脂、沸石、分子筛。
6.根据权利要求1所述的一种基于磷脂酰丝氨酸酶促合成反应液回收L-丝氨酸的方法，其特征在于：S2中醇类可采用乙醇和异丙醇。
7.根据权利要求1所述的一种基于磷脂酰丝氨酸酶促合成反应液回收L-丝氨酸的方法，其特征在于：S4中的固体混合物采用去离子水进行洗涤，使L-丝氨酸溶解并去除不溶解的多孔介质。
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