CN109486790B - 一种以磷脂酶d转化制备磷酯酰丝氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以磷脂酶D转化制备磷酯酰丝氨酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明是以磷脂酶D为催化剂，并以PC60和L‑丝氨酸为底物，通过优化底物摩尔比、反应pH、温度、反应时间、酶添加量、盐离子种类及浓度等，发现底物摩尔比为磷脂：丝氨酸＝1:9‑11，pH选择5.5左右，反应温度45度，磷脂酶D酶液加量50U/g磷脂酰胆碱条件下，反应6小时后，磷酯酰丝氨酸(PS)产率为55.1％，底物磷脂酰胆碱(PC)剩余2％，几乎无副产物(PA)生成。
Description
技术领域
本发明涉及一种以磷脂酶D转化制备磷酯酰丝氨酸的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
磷酯酰丝氨酸(简称PS)是存在于细菌、酵母、植物、哺乳动物细胞中的一种重要膜磷脂，也是大脑中的主要酸性磷脂。虽然在人体内数量很少，但其保健功效显著，具有改善老年人阿尔茨海默病、提高认知力、抗抑郁、抗压抑等功效。它可以影响信息间传递，被誉为继胆碱和DHA之后一大新兴“智能营养素”，可用于医药，食品等领域，作为食品添加剂添加在酸奶，奶粉及营养剂中。
PS于2010年10月21日被原中国卫生部(现更名为国家卫生计生委)添加到新资源食品目录中，允许其作为新资源食品。目前中国市面上可随膳食一起食用的磷脂酰丝氨酸产品不多，常见的有美国的自然之宝记忆原素、GNC健安喜磷脂酰丝氨酸、Puritan'sPride脑磷脂PS、宝利美添加磷酯酰丝氨酸的藻油DHA软胶囊以及脑黄金磷脂酰丝氨酸DHA复合片。
制备磷脂酰丝氨酸的方法主要有提取法和酶转化法。目前市面上出售的PS多是利用有机试剂氯仿/甲醇(2:1，v/v)从牛脑或大豆中提取，一方面提取工艺复杂且产量较少，另一方面由于疯牛病原因，其产品安全性也受到一定程度质疑。Sigma出售的从牛脑提取的纯度为97％的PS售价约为120元/mg，从土豆中提取的纯度为97％的PS售价约为62.68元/mg，阿拉丁等其他试剂公司售价与其类似。与提取法相比，酶转化法工艺简单，条件温和，产物收率高且低碳环保，这也表明了其市场前景广阔。
然而，现有的酶转化法生产磷脂酰丝氨酸大多在有机相中进行，获得的产物安全性存疑，不适用于食品领域。而目前在水相中用酶转化法生产磷脂酰丝氨酸的副产物含量极高。Yugo lwasaki等以PC70(质量分数为70％的磷脂酰胆碱)作为底物在纯水相中进行反应，反应24h，时仅获得约5％的PS，10％的副产物PA(甘油磷脂酸)，此时还有约80％PC未被消耗。Saovanee Choojit等以PC50作为底物在纯水相中进行反应，反应结束时仅生成约26％的PS；Duan Zhangqun等以PC98作为底物，在反应24h后也仅生成不到10％的PS，生成约40％的副产物PA，此时还有约50％的底物PC未被消耗。此外，现有的酶转化法生产磷脂酰丝氨酸大多以PC98(质量分数为98％的磷脂酰胆碱)为底物，成本较高，sigma公司目前出售的PC98价格为每100mg 545元，成本较高，不适合大规模工业生产。我们目前使用的PC60价格则为每千克200元(报价来源于博帅天津生物科技有限公司)。Toshiyuki Itoh和MagaretSivapragasam等人指出在离子液中也能进行转酯反应，虽然检测到了产物PS的生成，但离子液价格昂贵，工业化生产势必增加过多额外成本。因此，提供一种安全、副产物含量低、成本低廉、产率较高的磷脂酰丝氨酸生产方法，对于工业上制备磷脂酰丝氨酸具有重要的意义。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种以磷脂酶D转化制备磷酯酰丝氨酸的方法，是以质量分数为30％-70％的磷脂酰胆碱和丝氨酸为底物，在水相中反应；磷脂酰胆碱和丝氨酸的摩尔比为1:9-1:11，pH为5-6，温度为35-50℃，反应时间为6-12h，磷脂酶D添加量为50-70U/g磷脂酰胆碱，反应体系中添加了盐离子，所述盐离子包括氯化钠、氯化镁、氯化钙、氯化钾或氯化锌。
在本发明的一种实施方式中，是以质量分数为60％的磷脂酰胆碱和丝氨酸为底物。
在本发明的一种实施方式中，磷脂酰胆碱和丝氨酸的摩尔比为1:10。
在本发明的一种实施方式中，反应体系中pH为5.5-6。
在本发明的一种实施方式中，反应温度为40-45℃。
在本发明的一种实施方式中，反应体系中添加了质量分数为5-10％的盐离子。
在本发明的一种实施方式中，添加质量分数为5-10％的氯化钙、氯化镁或氯化锌。
在本发明的一种实施方式中，反应时间为5-10h。
在本发明的一种实施方式中，反应时间优选5-6h。
本发明的有益效果：
本发明是以磷脂酶D为催化剂，并以PC60和L-丝氨酸为底物，通过优化底物摩尔比、反应pH、温度、反应时间、酶添加量、盐离子种类及浓度等，发现底物摩尔比为磷脂：丝氨酸＝1:9-11，pH为5.5左右，反应温度45℃，磷脂酶D添加量为50U/g磷脂酰胆碱，反应6小时后，磷酯酰丝氨酸(PS)产率为55.1％，底物磷脂酰胆碱(PC)剩余2％，几乎无副产物(PA)生成。且此方法得到的产物安全性较高、副产物含量低、成本低廉。
附图说明
图1：底物摩尔比对磷酯酰丝氨酸的产率的影响。
图2：缓冲液pH对磷酯酰丝氨酸的产率的影响。
图3：反应温度对磷酯酰丝氨酸的产率的影响。
图4：反应时间对磷酯酰丝氨酸的产率的影响。
图5：酶添加量对磷酯酰丝氨酸的产率的影响。
图6：盐离子种类对磷酯酰丝氨酸的产率的影响。
图7：盐离子浓度对磷酯酰丝氨酸的产率的影响。
具体实施方式
(一)液相检测产物方法
色谱柱为Sepax HP-Silica(250mm×4.6mm×5μm)，柱温为40℃，流速为1mL/min，蒸发光散色检测器漂移管温度为60℃，增益值为6，氮气流速为1L/min，流动相A为甲醇/水/醋酸/三乙胺(85:15:0.5:0.05)，B为正己烷/异丙醇/A(20:48:32)，洗脱程序为：0-5min100％B；5-15min 22％A，78％B；15-27min 90％A，10％B，27-28min 100％A；28-32min100％A。
实施例1优化底物摩尔比
向100mL烧杯中加入50mL 40mM醋酸-醋酸钠缓冲液(pH＝6)，再加入磷脂酰胆碱(PC60)10g和L-丝氨酸，其摩尔比依次选择为1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11，升温到37℃，待底物完全溶解后加入5mL磷脂酶D酶液(酶活为100U/mL)，反应6小时，转速300rpm，反应结束后检测PS、PA、PC的含量。
如图1所示，磷酯酰丝氨酸的产率随磷脂酰胆碱与L-丝氨酸摩尔比的增加而增大，且向副产物PA方向转化变少。磷脂酰胆碱与L-丝氨酸的摩尔比为1:10时，磷酯酰丝氨酸的产率达到31.2％。
实施例2优化缓冲液pH
向100mL烧杯中分别加入pH为3、4、4.5、5、5.5、6、7的醋酸-醋酸钠缓冲液50mL，再加入磷脂酰胆碱(PC60)10g和L-丝氨酸，其摩尔比选择为1:10，升温到37℃，待底物完全溶解后加入5mL磷脂酶D酶液(酶活为100U/mL)，反应6小时，转速300rpm，反应结束后检测PS、PA、PC的含量。
由图2可以看出，pH为5.5时，PS产率最高，达33.1％。
实施例3反应温度优化
向100mL烧杯中加入50mL 40mM醋酸-醋酸钠缓冲液(pH＝5.5)，再加入磷脂酰胆碱(PC60)10g和L-丝氨酸，其摩尔比选择为1:10，分别升温到30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，待底物完全溶解后加入5mL磷脂酶D酶液(酶活为100U/mL)，反应6小时，转速300rpm，反应结束后检测PS、PA、PC的含量。
由图3可以看出，反应温度为45℃时，PS产率最高，达37.4％。
实施例4反应时间优化
向100mL烧杯中加入50mL 40mM醋酸-醋酸钠缓冲液(pH＝5.5)，再加入磷脂酰胆碱(PC60)10g和L-丝氨酸，其摩尔比选择为1:10，升温到45℃，待底物完全溶解后加入5mL磷脂酶D酶液(酶活为100U/mL)，转速300rpm，分别在反应3h、6h、9h、12h时取样检测PS、PA、PC的含量。
由图4可以看出，反应6h时，PS产率最高，达38％。
实施例5酶添加量优化
向100mL烧杯中加入50mL 40mM醋酸-醋酸钠缓冲液(pH＝5.5)，再加入磷脂酰胆碱(PC60)10g和L-丝氨酸，其摩尔比选择为1:10，升温到45℃，待底物完全溶解后向体系中分别加入1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL磷脂酶D酶液(酶活为100U/mL)，对应的酶添加量分别为10U/g磷脂酰胆碱、20U/g磷脂酰胆碱、30U/g磷脂酰胆碱、40U/g磷脂酰胆碱、50U/g磷脂酰胆碱、60U/g磷脂酰胆碱、70U/g磷脂酰胆碱，磷脂酰胆碱转速300rpm，反应6h后取样检测PS、PA、PC的含量。
由图5可以看出，酶添加量为5mL时，PS产率最高，达37.7％。
实施例6盐离子种类优化
向100mL烧杯中加入50mL 40mM醋酸-醋酸钠缓冲液(pH＝5.5)，分别向其中加入质量分数为5％的氯化钠、氯化镁、氯化钙、氯化钾、氯化锌。再加入磷脂酰胆碱(PC60)和L-丝氨酸，其摩尔比选择为1:10，升温到45℃，待底物完全溶解后向体系中加入5mL磷脂酶D酶液(酶活为100U/mL)，转速300rpm，反应6h后取样检测PS、PA、PC的含量。
由图6可以看出体系中添加氯化钙能明显提高PS得率，达到50.8％。
实施例7盐离子浓度优化
向100mL烧杯中加入50mL 40mM醋酸-醋酸钠缓冲液(pH＝5.5)，分别向其中加入质量分数为4％、6％、8％、10％、12％、14％的氯化钙。再加入磷脂酰胆碱(PC60)和L-丝氨酸，其摩尔比选择为1:10，升温到45℃，待底物完全溶解后向体系中加入5mL磷脂酶D酶液(酶活为100U/mL)，转速300rpm，反应6h后取样检测PS、PA、PC的含量。
由图7可以看出，随着氯化钙浓度由低到高，PS得率也随之提高。当氯化钙浓度为10％时，PS产率最高，达55.1％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (4)
1.一种以磷脂酶D转化制备磷酯酰丝氨酸的方法，其特征在于，是以质量分数为60%的磷脂酰胆碱和丝氨酸为底物，在水相中反应；磷脂酰胆碱和丝氨酸的摩尔比为1:10-1:11，磷脂酶D添加量为50-70 U/g磷脂酰胆碱，反应体系中添加了质量分数为5-10%盐离子，所述盐离子为氯化镁、氯化钙或氯化锌；
反应体系中pH为5.5-6；
反应温度为40-45℃；
反应时间为5-10 h。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应时间优选5-6 h。
3.权利要求1-2任一所述的方法在医药或食品领域中的应用。
4.权利要求1-2任一所述的方法在生产营养剂中的应用。
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Denomination of invention: A Method for Preparing Phosphosylserine by Phospholipase D Conversion Effective date of registration: 20231101 Granted publication date: 20210803 Pledgee: Industrial Bank Co.,Ltd. Shanghai Putuo sub branch Pledgor: NANTONG LICHENG BIOLOGICAL ENGINEERING Co.,Ltd.|Nantong Licheng Biotechnology Co.,Ltd. Registration number: Y2023310000703 |
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