CN110938090A - 一种磷脂酰丝氨酸的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磷脂酰丝氨酸的纯化方法，将酶解反应获得的脂溶性杂质含量低于30％的磷脂酰丝氨酸置于水中得到磷脂酰丝氨酸水溶液，调节水溶液的温度为5‑15℃，水溶液经乳化剪切、离心得到含量为至少70％的磷脂酰丝氨酸。本发明纯化磷脂酰丝氨酸的方法只使用水，不使用有机溶剂，即可制备磷脂酰丝氨酸含量大于70％的产品，克服了传统方法只有使用有机溶剂纯化才能制备高含量磷脂酰丝氨酸产品的不足，并且有机溶剂纯化后需加热浓缩收集磷脂酰丝氨酸，此过程易导致磷脂酰丝氨酸产品过氧化值升高，只用水的纯化过程即克服了这一缺点。
Description
技术领域
本发明涉及一种纯化方法，尤其涉及一种磷脂酰丝氨酸的纯化方法。
背景技术
磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，简称PS)，是细胞膜重要的组分之一，广泛存在于所有动物、高等植物以及微生物的膜中，它是唯一能够调控细胞膜关键蛋白功能状态的磷脂。其主要功能是提高脑活力，治疗脑萎缩、改善老年人的大脑功能预防老年痴呆症；修复大脑损伤，治疗儿童多动症；促进脑疲劳的恢复，平衡情绪，缓解抑郁；调高大脑信号传导速率，有助于改善记忆力、认知能力，提高学习成绩。2007年PS通过了美国FDA认证，2010年我国卫生部第15号公告公布PS为新资源食品。
目前，PS的主要制备方法是酶转化法，即磷脂酶D催化磷脂和L-丝氨酸发生转磷脂酰基反应生成PS。现有酶转化法制备磷脂酰丝氨酸有两种方式，即有机相-水相双相法和单一水相法。由于PS主要用于食品中，有机溶剂的使用对人体仍会带来一定的危害，因此应用纯水系的反应方法来制备PS较为广泛。磷脂酶D既有水解活性又有转移活性，目前发现的磷脂酶D大多具有较高的水解能力，只有少数具有较高的磷酰基转移能力。因此为了抑制水解反应，酶反应体系中添加了过量的底物L-丝氨酸，这些过量的丝氨酸会混合在PS产品中，降低PS的含量；并且酶转化生成的磷脂酰丝氨酸时还会产生一些副产物，因此需对其进行纯化提高含量，而目前的纯化过程均使用了有机溶剂，如乙酸乙酯、石油醚、正己烷、氯仿或乙醇等有机溶剂，需要通过浓缩来获得有机溶剂中的磷脂酰丝氨酸，并且使用有机溶剂的生产过程具有危险性，存在安全风险，回收过程能耗大，对环境也会造成一定污染。
发明内容
发明目的：本发明旨在提供一种不使用有机溶剂的磷脂酰丝氨酸的纯化方法，解决现有技术使用有机溶剂带来的危险性问题和产品安全性问题。
技术方案：本发明磷脂酰丝氨酸的纯化方法，将酶解反应获得的脂溶性杂质含量低于30％的磷脂酰丝氨酸置于水中得到磷脂酰丝氨酸水溶液，调节水溶液的温度为 5-15℃，水溶液经乳化剪切、离心得到含量为至少70％的磷脂酰丝氨酸。
本申请磷脂酰丝氨酸与水的质量比为1:4-6。研究发现，酶解制备磷脂酰丝氨酸的过程中，为抑制水解副反应的发生，添加了大量的丝氨酸，导致生成的磷脂酰丝氨酸中有丝氨酸残留，从而影响磷脂酰丝氨酸的含量。为此，本申请用过量的水(例如使用磷脂酰丝氨酸质量4-6倍的水)溶解残留的丝氨酸，从而提高磷脂酰丝氨酸的含量。
值得提及的是，本发明酶解反应获得的磷脂酰丝氨酸是通过水相的反应体系，以大豆卵磷脂为反应底物，加入L-丝氨酸和钙盐，在磷脂酶D的作用下生成，其中，所述磷脂酶D是通过镍离子层析柱纯化酶液获得，所述酶液是由产磷脂酶D的重组枯草芽孢杆菌发酵制得。本发明所使用的枯草芽孢杆菌，为通过生物技术手段重组构建的可高效表达磷脂酶D的菌株，通过镍离子层析柱纯化可提高磷脂酶D的含量，提高转化率，使用该酶转化大豆卵磷脂生成的磷脂酰丝氨酸在水溶液中稳定，不发生水解反应，因此适用于水溶液进行纯化。
磷脂酶D的制备方法是将重组枯草芽孢杆菌接种于种子培养基中，在36～38℃，150～200rpm条件下培养6～12h，至对数生长期，将种子液转移至发酵培养基中，在 36～38℃，150～200rpm条件下继续培养40～50h，获得酶液。该磷脂酶D具体的制备方法参见合作单位江南大学的发明专利，名称为“一种产磷脂酶D的重组枯草芽孢杆菌及其应用”，专利号为CN 109456929A。
本申请调节磷脂酰丝氨酸水溶液的温度为5-15℃，研究发现，磷脂酰丝氨酸水溶液在50℃左右时为较软的膏状物体，当水溶液的温度低于50℃、大于15℃时，得到的磷脂酰丝氨酸仍然呈较软的物体，不利于乳化剪切，当水溶液的温度降低至5-15℃时，得到的磷脂酰丝氨酸可形成颗粒状物质，易于分离处理，进一步的，水溶液稳定可以降低至5-10℃，当水溶液的温度低于5℃时，所需能耗较高，不适合工业化生产。
由于酶解反应生成的磷脂酰丝氨酸产品中含有磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱等杂质，本申请研究发现，当脂溶性杂质含量低于20％，使用本方法纯化磷脂酰丝氨酸的最终含量在80％以上，当脂溶性杂质含量低于30％，使用本方法纯化磷脂酰丝氨酸的最终含量在70％以上，当脂溶性杂质含量超过30％，使用本方法纯化磷脂酰丝氨酸的最终含量将低于70％。
优选的，磷脂酰丝氨酸水溶液乳化剪切的时间为5-30min。通过乳化剪切可使磷脂酰丝氨酸形成粉末，易于在水溶液中分散和残留丝氨酸的溶解。
考虑到残留杂质丝氨酸易溶于水，而磷脂酰丝氨酸不溶于水，磷脂酰丝氨酸水溶液经乳化剪切后需经过水洗溶解丝氨酸杂质，同时随着水洗次数的增加，例如水洗2-4次可以减少丝氨酸残留的比例。
本发明将磷脂酰丝氨酸配成水溶液所用的水以及水洗所用的水均可选用纯化水或其它水。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：本发明纯化磷脂酰丝氨酸的方法只使用水，不使用有机溶剂，即可制备磷脂酰丝氨酸含量大于70％的产品，克服了传统方法只有使用有机溶剂纯化才能制备高含量磷脂酰丝氨酸产品的不足，并且有机溶剂纯化后需加热浓缩收集磷脂酰丝氨酸，此过程易导致磷脂酰丝氨酸产品过氧化值升高，只用水的纯化过程即克服了这一缺点。本发明的纯化方法生产过程安全，绿色环保，无有机溶剂污染；同时，本发明的纯化方法纯化步骤少，操作简单，条件温和，适合工业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
(1)磷脂酰丝氨酸的制备
将重组的枯草芽孢杆菌接种于10L种子培养基中，37℃、200rpm条件下培养10h 至对数生长期；再将种子液以6％的接种量接种于40L发酵培养基中，37℃、200rpm条件下培养48h，发酵下罐后降温至4～8℃，酶活检测为125U/ml。
发酵液经陶瓷膜离心，陶瓷膜孔径100nm过滤后得到49L滤液，检测酶活为80 U/ml。滤液经Ni2+柱吸附，缓冲液A为Tris缓冲液(40mM，pH 7.4)配置的150mM 氯化钠。缓冲液B为A液配的500mM咪唑。基于线性洗脱(0～100％缓冲液B)，收集纯化后磷脂酶D。检测酶活为2000U/ml。
将12kg大豆卵磷脂(磷脂酰胆碱含量70％)、16kgL-丝氨酸和1kg氯化钙加入到纯水中，定容至50L，55℃搅拌充分溶解，加入100ml酶液开始酶解反应，反应6h，检测磷脂酰丝氨酸含量达到66.7％，脂溶性杂质含量为19.6％。
(2)磷脂酰丝氨酸的纯化
离心生成的磷脂酰丝氨酸固体颗粒，加入6倍体积预冷的纯化水，降温至15℃，经乳化器剪切10min，离心，重复水洗2次，离心后磷脂酰丝氨酸固体经真空干燥箱干燥得到磷脂酰丝氨酸粉末，经检测其含量为75.2％。
实施例2
(1)磷脂酰丝氨酸的制备
将重组的枯草芽孢杆菌接种于10L种子培养基中，37℃、200rpm条件下培养9h至对数生长期；再将种子液以5％的接种量接种于35L发酵培养基中，37℃、200rpm条件下培养52h，发酵下罐后降温至4～8℃，酶活检测为116U/ml。
发酵液经陶瓷膜离心，陶瓷膜孔径100nm，过滤后得到44L滤液，检测酶活为68.8U/ml。滤液经Ni2+柱吸附，缓冲液A为Tris缓冲液(40mM，pH 7.4)配置的150mM 氯化钠。缓冲液B为A液配的500mM咪唑。基于线性洗脱(0～100％缓冲液B)，收集纯化后磷脂酶D。检测酶活为1988U/ml。
将12kg大豆卵磷脂(磷脂酰胆碱含量65％)、16kgL-丝氨酸和1kg氯化钙加入到纯水中，定容至50L，55℃搅拌充分溶解，加入100ml酶液开始酶解反应，反应6h，检测磷脂酰丝氨酸含量达到61.5％，脂溶性杂质含量为27.7％。
(2)磷脂酰丝氨酸的纯化
离心生成的磷脂酰丝氨酸固体颗粒，加入4倍体积预冷的纯化水，降温至10℃，经乳化器剪切10min，离心，重复水洗3次，离心后磷脂酰丝氨酸固体经真空干燥箱干燥得到磷脂酰丝氨酸粉末，经检测其含量为70.4％。
实施例3
(1)磷脂酰丝氨酸的制备
将重组的枯草芽孢杆菌接种于10L种子培养基中，37℃、200rpm条件下培养10h 至对数生长期；再将种子液以4％的接种量接种于30L发酵培养基中，37℃、200rpm条件下培养49h，发酵下罐后降温至4～8℃，酶活检测为121U/ml。
发酵液经陶瓷膜离心，陶瓷膜孔径100nm，过滤后得到38L滤液，检测酶活为83.7U/ml。滤液经Ni2+柱吸附，缓冲液A为Tris缓冲液(40mM，pH 7.4)配置的150mM 氯化钠。缓冲液B为A液配的500mM咪唑。基于线性洗脱(0～100％缓冲液B)，收集纯化后磷脂酶D。检测酶活为2021U/ml。
将12kg大豆卵磷脂(磷脂酰胆碱含量55％)、16kgL-丝氨酸和1kg氯化钙加入到纯水中，定容至50L，55℃搅拌充分溶解，加入100ml酶液开始酶解反应，反应6h，检测磷脂酰丝氨酸含量达到52.3％，脂溶性杂质含量为37.6％。
(2)磷脂酰丝氨酸的纯化
离心生成的磷脂酰丝氨酸固体颗粒，加入5倍体积预冷的纯化水，降温至5℃，经乳化器剪切10min，离心，重复水洗4次，离心后磷脂酰丝氨酸固体经真空干燥箱干燥得到磷脂酰丝氨酸粉末，经检测其含量为70.6％。
对比例1
(1)磷脂酰丝氨酸的制备：与实施例2制备方法相同。
(2)磷脂酰丝氨酸的纯化
酶解反应后，离心生成的磷脂酰丝氨酸固体颗粒，设计6组试验，分别加入1倍、 2倍、3倍、3.5倍、6倍、7倍体积预冷的纯化水，降温至10℃，经乳化器剪切10min，离心，重复水洗4次，离心后磷脂酰丝氨酸固体经真空干燥箱干燥得到磷脂酰丝氨酸粉末，检测含量结果见表1。
当磷脂酰丝氨酸与水的比例低于1：4时，即试验组1、2、3终产品磷脂酰丝氨酸的含量均低于70％；当磷脂酰丝氨酸与水的比例高于1：4时，即试验组5、6终产品磷脂酰丝氨酸的含量高于70％，但含量基本一致，因此从节约能源的角度考虑，水的比例达到纯化效果即可。由此可见，本申请将水溶液中的磷脂酰丝氨酸与水的质量比控制为 1:4-6才能获得相应的技术效果。
表1磷脂酰丝氨酸与纯化水的质量比研究试验
对比例2
(1)磷脂酰丝氨酸的制备：与实施例2制备方法相同。
(2)磷脂酰丝氨酸的纯化
酶解反应后，离心生成的磷脂酰丝氨酸固体颗粒，加入4倍体积预冷的纯化水，设计9组试验，分别降温至1℃、2℃、3℃、4℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃，经乳化器剪切10min，离心，重复水洗3次后经真空干燥箱干燥得到磷脂酰丝氨酸粉末，检测含量结果见表2。
当温度高于15℃时，水溶液中磷脂酰丝氨酸较粘不能剪切成细粉，呈较大团状，影响纯化效果。当温度低于5℃时，虽然也可达到较好的纯化效果，但所需降温时间较长，生产能耗高，不适合工业化生产。
表2磷脂酰丝氨酸水溶液温度调节研究试验
对比例3
(1)磷脂酰丝氨酸的制备
分别利用四种不同含量的大豆卵磷脂(磷脂酰胆碱含量70％、65％、55％、50％)来制备磷脂酰丝氨酸，将12kg大豆卵磷脂、16kgL-丝氨酸和1kg氯化钙加入到纯水中，定容至50L，55℃搅拌充分溶解，加入100ml酶液开始酶解反应，反应6h，分别得到如下含量的磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺以及磷脂酰胆碱，见表3。
表3不同含量的大豆卵磷脂制备磷脂酰丝氨酸的脂溶性杂质含量对比表
(2)磷脂酰丝氨酸的纯化
酶解反应后，离心生成的磷脂酰丝氨酸固体颗粒，加入5倍体积预冷的纯化水，降温至10℃，经乳化器剪切10min，离心，重复水洗3次，离心后磷脂酰丝氨酸固体经真空干燥箱干燥得到磷脂酰丝氨酸粉末，经检测其含量如下表4：
表4不同脂溶性杂质含量的磷脂酰丝氨酸纯化结果
| 大豆卵磷脂含量 | 70％ | 65％ | 55％ | 50％ |
| 脂溶性杂质含量 | 19.6％ | 27.7％ | 37.6％ | 42.2％ |
| 纯化后磷脂酰丝氨酸含量 | 75.2％ | 70.4％ | 58.3％ | 53.1％ |
对比例4
设计采用本申请酶解反应获得磷脂酰丝氨酸和其他重组菌获得的磷脂酶D酶解制备的磷脂酰丝氨酸进行纯化反应的对比试验。
(1)本申请酶解反应获得磷脂酰丝氨酸的制备方法：与实施例2制备方法相同。
(2)重组大肠杆菌获得的磷脂酶D制备磷脂酰丝氨酸
将重组的大肠杆菌接种于10L种子培养基中，37℃、220rpm条件下培养15h至对数生长期；再将种子液以3％的接种量接种于30L发酵培养基中，37℃、220rpm条件下培养3小时，加入0.1mMIPTG，25℃、220rpm条件下继续发酵培养40h，发酵下罐后降温至4～8℃，酶活检测为98U/ml。
发酵液经陶瓷膜离心，陶瓷膜孔径100nm，过滤后得到37.5L滤液，检测酶活为66.9U/ml。滤液经Ni2+柱吸附，缓冲液A为Tris缓冲液(40mM，pH 7.4)配置的150mM 氯化钠。缓冲液B为A液配的500mM咪唑。基于线性洗脱(0～100％缓冲液B)，收集纯化后磷脂酶D。检测酶活为2004U/ml。
将12kg大豆卵磷脂(磷脂酰胆碱含量65％)、16kgL-丝氨酸和1kg氯化钙加入到纯水中，定容至50L，55℃搅拌充分溶解，加入99.2ml酶液开始酶解反应，反应6h，检测磷脂酰丝氨酸含量达到59.7％，脂溶性杂质含量为32.5％。
(3)重组链霉菌获得的磷脂酶D制备磷脂酰丝氨酸
将重组的链霉菌接种于10L含阿泊拉霉素抗体的种子培养基中，28℃、220rpm条件下培养20h；将种子液以8％的接种量接种于30L发酵培养基中，28℃℃、220rpm条件下发酵培养70小时，发酵下罐后降温至4～8℃，酶活检测为74U/ml。
发酵液经陶瓷膜离心，陶瓷膜孔径100nm，过滤后得到40.5L滤液，检测酶活为51.2U/ml。滤液经Ni2+柱吸附，缓冲液A为Tris缓冲液(40mM，pH 7.4)配置的150mM 氯化钠。缓冲液B为A液配的500mM咪唑。基于线性洗脱(0～100％缓冲液B)，收集纯化后磷脂酶D。检测酶活为1886U/ml。
将12kg大豆卵磷脂(磷脂酰胆碱含量65％)、16kgL-丝氨酸和1kg氯化钙加入到纯水中，定容至50L，55℃搅拌充分溶解，加入105.4ml酶液开始酶解反应，反应6h，检测磷脂酰丝氨酸含量达到57.8％，脂溶性杂质含量为34.6％。
(4)磷脂酰丝氨酸的纯化
与实施例2纯化方法相同，得到如下结果，见表5。
表5不同磷脂酶D对比试验
本申请使用重组的枯草芽孢杆菌获得的磷脂酶D与现有其它技术(例如重组大肠杆菌或重组链霉菌获得的磷脂酶D)获得的磷脂酶D制备的磷脂酰丝氨酸，经水纯化后其磷脂酰丝氨酸含量提高幅度较高，且最终含量差别较大，因此该方法更适合用水进行纯化制备高含量的磷脂酰丝氨酸。
对比例5
(1)磷脂酰丝氨酸的制备：与实施例2制备方法相同。
(2)磷脂酰丝氨酸的纯化：
设计采用水纯化法和有机溶剂纯化法纯化磷脂酰丝氨酸，水纯化法与实施例2纯化方法相同，有机溶剂法如下：
离心生成的磷脂酰丝氨酸固体颗粒，加入4倍体积正己烷，2倍体积异丙醇和2倍体积水，1％氯化钠，充分混匀后，静置分层，收集上层有机相，再加入1倍体积异丙醇和2倍体积水，充分混匀后，静置分层，收集上层有机相。将两次收集有机相混合后 55℃浓缩，得到膏状物体，加入4倍无水乙醇充分混匀，无水乙醇重复洗3次，离心收集磷脂酰丝氨酸固体经真空干燥箱干燥得到磷脂酰丝氨酸粉末。检测磷脂酰丝氨酸含量和过氧化值，见表6。由此可见，有机溶剂纯化后需加热浓缩收集磷脂酰丝氨酸，此过程易导致磷脂酰丝氨酸产品过氧化值升高；而用水纯化磷脂酰丝氨酸能很好地解决产品过氧化值升高的问题，如表6所示，用水纯化后磷脂酰丝氨酸过氧化值仅为0.1％，而用有机溶剂纯化后磷脂酰丝氨酸过氧化值高达2.8％。
表6不同纯化方法对比试验
| 磷脂酰丝氨酸含量 | 磷脂酰丝氨酸过氧化值 | |
| 水纯化 | 70.4％ | 0.1％ |
| 有机溶剂纯化 | 72.1％ | 2.8％ |
对比例6
(1)磷脂酰丝氨酸的制备
与实施例2制备方法相同。
(2)磷脂酰丝氨酸的纯化
酶解反应后，离心生成的磷脂酰丝氨酸固体颗粒，加入4倍体积预冷的纯化水，降温至10℃，设计10组试验，分别经乳化器剪切1min、3min、5min、10min、15min、 20min、25min、30min、32min、35min，离心，重复水洗3次，离心后磷脂酰丝氨酸固体经真空干燥箱干燥得到磷脂酰丝氨酸粉末，检测含量见表7。
表7乳化剪切时间研究试验
Claims (10)
1.一种磷脂酰丝氨酸的纯化方法，其特征在于：将酶解反应获得的脂溶性杂质含量低于30％的磷脂酰丝氨酸置于水中得到磷脂酰丝氨酸水溶液，调节水溶液的温度为5-15℃，水溶液经乳化剪切、离心得到含量为至少70％的磷脂酰丝氨酸。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述水溶液中磷脂酰丝氨酸与水的质量比为1:4-6。
3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述酶解反应获得的磷脂酰丝氨酸是通过水相的反应体系，以大豆卵磷脂为反应底物，加入L-丝氨酸和钙盐，在磷脂酶D的作用下生成，其中，所述磷脂酶D通过镍离子层析柱纯化酶液获得，所述酶液由产磷脂酶D的重组枯草芽孢杆菌发酵制得。
4.根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于：所述磷脂酶D的制备方法是将重组枯草芽孢杆菌接种于种子培养基中，在36～38℃，150～200rpm条件下培养6～12h，至对数生长期，将种子液转移至发酵培养基中，在36～38℃，150～200rpm条件下继续培养40～50h，获得酶液。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述酶解反应获得的磷脂酰丝氨酸，脂溶性杂质含量低于20％。
6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述水溶液乳化剪切的时间为5-30min。
7.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：调节所述水溶液的温度为5-10℃。
8.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述水溶液经乳化剪切、离心后至少水洗1次。
9.根据权利要求8所述的纯化方法，其特征在于：所述水洗次数为2-4次。
10.根据权利要求1、8或9所述的纯化方法，其特征在于：所述水洗所用的水为纯水。
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