CN101215590B - 一种利用固定化酵母去除低聚半乳糖中单糖组分的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用固定化酵母去除低聚半乳糖中单糖组分的方法，以海藻酸钙为载体将酵母细胞制成固定化细胞，应用该细胞采用分批发酵法或柱式连续发酵法处理低聚半乳糖溶液，完全去除葡萄糖和降低半乳糖含量。本发明采用的方法中，固定化酵母细胞可多次重复使用，工艺简单，安全可靠，大大降低了生产成本，可应用于工业化规模提高低聚半乳糖中转移低聚糖的含量。
Description
技术领域
本发明涉及一种去除低聚半乳糖中单糖组分的方法，尤其涉及一种利用固定化酵母细胞去除低聚半乳糖中单糖组分的方法。
技术背景
低聚半乳糖(galactooligosaccharides，GOS)是众多功能性低聚糖中令人瞩目的一种，具有许多益生功能，在降低梭菌数量、产生较多短链脂肪酸、产生较少气体等方面都具有突出的优点。商品化GOS是应用微生物β-半乳糖苷酶以乳糖为原料转糖基生成，所得产品为混合物，其组分包括葡萄糖、半乳糖、乳糖、转移低聚糖(例如：日本Yakult Honsha公司生产的GOS商品oligomate 55
组成为葡萄糖18％、半乳糖1％、乳糖24％、转移低聚糖包括转移二糖～转移五糖共57％)。由于GOS的单糖组分中含有葡萄糖，影响了糖尿病患者的使用，其应用范围受到局限；若能去除GOS中的单糖组分，则能扩大其应用范围。
目前GOS的分离纯化技术主要有色谱柱分离法、酶分离法、纳滤膜分离法和微生物发酵法。工业上利用活性炭作为色谱柱填料，采用乙醇溶液梯度洗脱去除单糖；硅胶和离子交换树脂通常也可以作为色谱柱填料用于GOS的分离，但由于分离效率低，操作复杂，而使分离后的成本大幅增加而影响其应用。酶分离法是利用酶制剂将GOS中的单糖专一性去除，例如，利用葡萄糖氧化酶将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，后者通过离子交换树脂法去除，但该法中的酶制剂价格昂贵，限制了工业化应用。利用纳滤膜分离法纯化GOS，通过选择不同孔径的纳滤膜，可将单糖、乳糖(包括转移二糖)、其他转移低聚糖依次分开，但所用设备昂贵，成本高，难以工业化应用。微生物发酵法工艺简单、设备投入成本较低，该方法是利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)特异性优先代谢葡萄糖的特性，将培养后收集获得的菌体细胞与GOS糖液混合，发酵去除葡萄糖。但这种游离酵母细胞寿命较短而且不易收集，难以重复使用，提升了工业化的成本，因而需要寻找更有效、更经济的方法用于去除GOS中单糖组分。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种利用固定化酵母细胞去除低聚半乳糖中单糖组分的方法。
发明概述
本发明的技术要点是以海藻酸钙为载体固定化酵母细胞处理低聚半乳糖溶液，完全去除葡萄糖和降低半乳糖含量，提高低聚半乳糖中转移低聚糖的含量。
发明详述
一种利用固定化酵母去除低聚半乳糖中单糖组分的方法，包括固定化酵母细胞的制备和利用该固定化酵母细胞处理低聚半乳糖溶液，具体步骤如下：
1)固定化酵母细胞的制备：
(1)将酵母菌种接种于10波美度(°Bé)麦芽汁培养基中培养18～36小时，培养温度26～30℃，摇床转速为150转/分；
(2)将培养液8000转/分离心10分钟，获得酵母细胞；
(3)将上述离心收集的酵母细胞采用海藻酸钙包埋法进行固定化，制得固定化酵母细胞。
制成的固定化酵母细胞放置于1％(w/w)葡萄糖溶液中，4℃保存备用；
2)固定化酵母细胞处理低聚半乳糖溶液：
固定化酵母细胞发酵低聚半乳糖溶液采用分批发酵法或柱式连续发酵法之一。
优选的，所述步骤1)第(3)步中海藻酸钙包埋法采用如下步骤操作：
将收集的酵母细胞以1∶2的比例(w/v)与3％(w/w)海藻酸钠溶液充分混合，滴入3％氯化钙溶液中，于4℃硬化后即制得固定化酵母细胞。
优选的，所述步骤2)中的分批发酵法采用如下步骤操作：
将步骤1)制备的固定化酵母细胞按照5～50％(W酵母/V糖)的比例加入到5～20％(w/w)低聚半乳糖溶液中，搅拌速度为100～150转/分，温度为25～30℃的条件下，处理4～12小时。处理结束后将溶液倾出，即获得转移低聚糖含量提高的低聚半乳糖溶液，通过高效液相色谱分析该溶液中各种糖组分的含量变化。将固定化酵母细胞置于新的5～20％(w/w)低聚半乳糖溶液中，在相同的处理条件下重复处理并进行糖组分分析。
优选的，所述步骤2)中的柱式连续发酵法采用如下步骤操作：
将步骤1)制备的固定化酵母细胞装入柱式填充床中，10～20％(w/w)低聚半乳糖溶液在温度25～30℃下连续通过此柱式填充床(图1)获得转移低聚糖含量提高的低聚半乳糖溶液，不同时间取样进行高效液相色谱分析该溶液中各种糖组分的含量变化。
优选的，所述步骤1)的酵母菌种优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ATCC 24860。
以上操作步骤如无特别说明，均采用本领域常规操作方法。
本发明提供了一种利用固定化酵母细胞去除低聚半乳糖中单糖组分的方法，以海藻酸钙为载体固定化酵母细胞，采用分批发酵法或柱式连续发酵法处理低聚半乳糖溶液，完全去除葡萄糖和降低半乳糖含量。在该方法中，固定化酵母细胞可多次重复使用，工艺简单，安全可靠，大大降低了生产成本，可应用于工业化规模提高低聚半乳糖中转移低聚糖的含量，且经过实验测得产物中转移低聚糖的含量显著高于市售产品oligomate 55
。
附图说明
图1为本发明采用的固定化酵母细胞柱式连续处理低聚半乳糖溶液示意图；
其中，1、低聚半乳糖溶液，2、柱式填充床，3、固定化酵母细胞，4、产物。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护内容不仅限于此。
实施例1
一种利用固定化酵母去除低聚半乳糖中单糖组分的方法，包括固定化酵母细胞的制备和利用固定化酵母细胞处理低聚半乳糖溶液，具体步骤如下：
将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ATCC24860接种于10波美度(°Bé)麦芽汁培养基中培养32小时，培养温度28℃，摇床转速为150转/分。8000转/分离心10分钟获得酵母细胞，以1∶2的比例(w/v)充分混合酵母细胞与3％(w/w)海藻酸钠溶液，滴入3％(w/w)氯化钙溶液中，4℃硬化2小时后制成固定化酵母细胞，置于1％(w/w)葡萄糖溶液中，4℃保存备用。
将制备的固定化酵母细胞按照10％(W酵母/V糖)的比例加入20％(w/w)低聚半乳糖溶液中(所用低聚半乳糖溶液是应用来源于德氏乳杆菌保加利亚亚种ATCC11842的β-半乳糖苷酶以乳糖为原料转糖基生成，糖组分为：葡萄糖25％、半乳糖12％、乳糖18％、转移低聚糖45％)，搅拌速度为120转/分，温度为28℃的条件下，处理6小时，将该批次处理后的溶液倾出，通过高效液相色谱分析该批次反应溶液中各种糖组分的变化，结果为单糖0、乳糖28％、转移低聚糖72％。然后将固定化酵母细胞置于新的20％(w/w)低聚半乳糖溶液中，在相同的代谢条件下重复处理和进行糖组分分析，结果可处理20批次，每批次低聚半乳糖溶液中葡萄糖含量为0，半乳糖含量≤1％，转移低聚糖含量≥71.5％(表1)。
表1、各反应批次低聚半乳糖溶液中各种糖组分的含量变化
| 使用批次 | 葡萄糖(％) | 半乳糖(％) | 乳糖(％) | 转移低聚糖(％) |
| 12468101214161820 | 00000000000 | 00000001111 | 2828282828282827.527.527.527.5 | 7272727272727271.571.571.571.5 |
实施例2
一种利用固定化酵母去除低聚半乳糖中单糖组分的方法，包括固定化酵母细胞的制备和利用固定化酵母细胞处理低聚半乳糖溶液，具体步骤如下：
将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ATCC24860接种于10波美度(°Bé)麦芽汁培养基中培养32小时，培养温度28℃，摇床转速为150转/分。8000转/分离心10分钟获得酵母细胞，以1∶2的比例(w/v)充分混合酵母细胞与3％(w/w)海藻酸钠溶液，滴入3％(w/w)氯化钙溶液中，4℃硬化4小时后制成固定化酵母细胞，放置在1％(w/w)葡萄糖溶液中，4℃保存备用。
将制备的固定化酵母细胞装入柱式填充床(2.7cm×30cm)体积的三分之二(图1)，将10％(w/w)低聚半乳糖溶液通过蠕动泵在温度28℃下连续通过此柱式填充床，流速为60毫升/小时，每隔12小时取样通过高效液相色谱分析低聚半乳糖溶液中各种糖组分的变化，连续发酵处理120小时，在该处理时间范围内，低聚半乳糖溶液中葡萄糖含量为0，半乳糖含量≤2％，转移低聚糖含量≥70.5％(表2)。
表2、不同取样时间低聚半乳糖溶液中各种糖组分的含量变化
| 取样时间(小时) | 葡萄糖(％) | 半乳糖(％) | 乳糖(％) | 转移低聚糖(％) |
| 1224364860728496108120 | 0000000000 | 0000011222 | 282828282827.527.527.527.527.5 | 727272727271.571.570.570.570.5 |
Claims (4)
1.一种利用固定化酵母去除低聚半乳糖中单糖组分的方法，包括固定化酵母细胞的制备和利用该固定化酵母细胞处理低聚半乳糖溶液，具体步骤如下：
1)固定化酵母细胞的制备：
(1)将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ATCC 24860接种于10波美度麦芽汁培养基中培养18～36小时，培养温度26～30℃，摇床转速为150转/分；
(2)将培养液8000转/分离心10分钟，获得酵母细胞；
(3)将上述离心收集的酵母细胞采用海藻酸钙包埋法进行固定化，制得固定化酵母细胞，制成的固定化酵母细胞放置于1％(w/w)葡萄糖溶液中，4℃保存备用；
2)固定化酵母细胞处理低聚半乳糖溶液：
固定化酵母细胞发酵低聚半乳糖溶液采用分批发酵法或柱式连续发酵法之一。
2.如权利要求1所述的一种利用固定化酵母细胞去除低聚半乳糖中单糖组分的方法，其特征是，所述步骤1)第(3)步中海藻酸钙包埋法采用如下步骤操作：
将收集的酵母细胞以1∶2的比例(w/v)与3％(w/w)海藻酸钠溶液充分混合，滴入3％氯化钙溶液中，于4℃硬化后即制得固定化酵母细胞。
3.如权利要求1所述的一种利用固定化酵母细胞去除低聚半乳糖中单糖组分的方法，其特征是，所述步骤2)中的分批发酵法采用如下步骤操作：
将步骤1)制备的固定化酵母细胞按照5～50％(W酵母/V糖)的比例加入5～20％(w/w)低聚半乳糖溶液中，搅拌速度为100～150转/分，温度为25～30℃的条件下，发酵处理4～12小时，将溶液倾出，即获得转移低聚糖含量提高的低聚半乳糖溶液，在相同的处理条件下重复处理新的5～20％(w/w)低聚半乳糖溶液。
4.如权利要求1所述的一种利用固定化酵母细胞去除低聚半乳糖中单糖组分的方法，其特征是，所述步骤2)中的柱式连续发酵法采用如下步骤操作：
将步骤1)制备的固定化酵母细胞装入柱式填充床中，将10～20％(w/w)低聚半乳糖溶液在温度25～30℃下连续通过此柱式填充床获得转移低聚糖含量提高的低聚半乳糖溶液。
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