CN110156829A - 高含量磷脂酰丝氨酸的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种高含量磷脂酰丝氨酸纯化方法。目前主流的制备方法是将大豆卵磷脂和L‑丝氨酸利用磷脂酶D进行转酯反应，再通过水洗结晶获得PS，这样获得的磷脂酰丝氨酸产品含量一般在40‑80％之间，目前还没有达到90％的有效方法。本发明的纯化方法包括将含有磷脂酰丝氨酸的上柱液通过树脂柱层析；再用烃类溶剂与低级醇或烃类溶剂与低级酮的混合溶剂进行洗脱得到洗脱液；洗脱液经减压浓缩后直接结晶得到磷脂酰丝氨酸。通过本发明使磷脂酰丝氨酸产品纯度含量达到90％以上，同时过程操作较简单，使得高含量磷脂酰丝氨酸的生产能够有效实施。
Description
技术领域
本发明涉及磷脂酰丝氨酸纯化方法，具体地说是一种利用树脂层析法纯化磷脂酰丝氨酸的方法。
背景技术
磷脂酰丝氨酸，又称丝氨酸磷脂，英文名：Phosphatidylserine，简称PS，是一类普遍存在于自然界的磷脂，通常位于细胞膜的内层，磷酯化合物中的磷酸甘油酯类，是细胞膜组分之一，是能够调控细胞膜关键蛋白功能状态的唯一磷脂，与一系列的膜功能有关。尤其在人体的神经系统，是大脑的细胞膜的重要组成成分之一，同时对大脑的各种功能(尤其是对大脑的记忆力和情绪的稳定)起到重要的调节作用，如它能影响着细胞膜的流动性、通透性，并且能激活多种酶类的代谢和合成。PS被誉为继胆碱和“脑黄金”DHA之后的一大新兴的“智能营养素”。专家认为，这种天然物质能够帮助细胞壁保持柔韧性，并且能够增强传送大脑信号的神经递质的效率，帮助大脑高效运转，激发大脑的活化状态。目前没有关于PS副作用的报道。意大利的Cenacchi博士的大型双盲研究显示，PS与老年人服用的大多数药物兼容性良好。于2006年5月被韩国食品药品监督管理局(KFDA)允许在添加PS的制品中突出表示，并宣传相关产品有“改善不良情绪，增强记忆力”预防老年痴呆等功能。同年10月被美国食品药品监督管理局(FDA)通过GRAS认定，这意味着PS 可在酸奶，奶粉，面包，粉末饮料等食品中作为营养强化型机能性食品素材添加。日本食药HBM将之收录于所属的食品(非药品)名单中，并且于2010年2月5日通过了食品添加剂个别审查。原中国卫生部(现更名为国家卫生计生委)于2010年10月21日将之添加到新资源食品目录中，允许其作为新资源食品。
目前PS产品为粉末和流体形式，其中流体形式的PS的含量通常在10-20％之间，主要用于软胶囊形式的实物增补剂。粉末形式的PS通常含量在20-90％之间，通常用于固体胶囊或者直接对食品进行添加，属于营养制品范畴。在药用方面目前还是空白，估计其含量要求在90％以上。
目前主流的制备方法是将大豆卵磷脂和L-丝氨酸利用磷脂酶D进行转酯反应，再通过水洗结晶获得PS，这样获得的磷脂酰丝氨酸产品含量一般在40-80％之间，目前还没有达到90％的有效方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提高磷脂酰丝氨酸产品纯度含量达到90％以上，同时要求纯化过程操作较简单。
为此，本发明采用的技术方案为：高含量磷脂酰丝氨酸纯化方法，其包括步骤：
(1)将含有55000-63000μg/ml的磷脂酰丝氨酸上柱液通过大孔吸附树脂柱层析；
(2)接续步骤(1)再用混合溶剂进行洗脱得洗脱液；
(3)洗脱液经减压浓缩后直接结晶得到磷脂酰丝氨酸；
其中，
所述的混合溶剂为烃类溶剂与低级醇或烃类溶剂与丙酮的混合溶剂；
所述的烃类溶剂选自：正己烷、正庚烷、环己烷、石油醚的一种或几种；
所述的低级醇选自：甲醇、乙醇、异丙醇的一种或几种。
作为本发明优选，步骤(1)的磷脂酰丝氨酸的上柱液通过如下步骤制得：
(11)磷脂酶D发酵液通过过滤浓缩得到含磷脂酶D的浓酶液；
(12)将大豆卵磷脂溶于烃类溶剂相，得大豆卵磷脂溶剂相；
(13)L-丝氨酸、醋酸钠、氯化钙在水相中加入步骤(11)的浓酶液，以醋酸调节pH为4.5-6.5，再与步骤(12)大豆卵磷脂溶剂相混合，温度20-40℃间搅拌进行转酯反应，得反应液；
(14)反应液经过分液和水洗得到含有磷脂酰丝氨酸的烃类溶剂相，此为磷脂酰丝氨酸上柱液；
其中，大豆卵磷脂在烃类溶剂中的质量体积浓度为10％；L-丝氨酸在水相中质量体积浓度为10％；醋酸钠在水相中质量体积浓度为1％；氯化钙在水相中质量体积浓度为1％；浓酶液在水相中体积浓度为1％(V/V)；溶剂相和水相的体积比例为1/2。
作为本发明优选，步骤(1)的磷脂酰丝氨酸上柱液预先通过孔径为0.5-2μm的滤芯过滤。
作为本发明优选，大孔吸附树脂柱选自：聚苯乙烯树脂柱或聚丙烯酸树脂柱，因为本发明磷脂酰丝氨酸与其中所含有的杂质均属于磷脂类，分子量较接近，均属于小分子物质，所以树脂要求的孔径比较广泛。
作为本发明优选，上柱量为0.5-2％；其中，
上柱量为上柱液中所含主产品的总亿与树脂柱体积的比值，总亿的单位为：克，体积的单位为:毫升；总亿＝效价×体积÷1000000。
作为本发明优选，上柱液通过大孔吸附树脂柱层析的流速控制在每小时1-1.5倍的大孔吸附树脂柱体积。
作为本发明优选，步骤(1)的上柱液通过大孔吸附树脂柱后，再通过用量为1倍树脂柱体积、洗涤流速为每小时1-1.5倍树脂柱体积的烃类溶剂进行洗涤该树脂柱，之后再进行步骤(2)。
作为本发明优选，混合溶剂包括含烃类溶剂和在混合溶剂中体积浓度为0.5-4％的甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮的一种。
作为本发明优选，浓酶液的酶活在100-120U/ml之间。
作为本发明优选，步骤(14)中，水洗的加水量为溶剂相体积的1/4-1/2，水洗至少两次。
作为本发明最优选，步骤(1)中，的磷脂酰丝氨酸上柱液预先通过孔径为1μm的滤芯过滤。
作为本发明最优选，步骤(13)中，以醋酸调节pH为5.5，再与步骤(12)大豆卵磷脂溶剂相混合，温度30℃，搅拌进行转酯反应直到反应液中磷脂酰胆碱基本消失。
作为本发明最优选，步骤(14)中，反应液进行静置分液后分去下层水相，上层水相体积1/3的水洗两遍后分去水相得到磷脂酰丝氨酸上柱液。
作为本发明最优选，混合溶剂包括含体积浓度为1-4％甲醇的烃类溶剂、含体积浓度 0.8-3％(V/V)乙醇的烃类溶剂、含体积浓度1-3％(V/V)异丙醇的烃类溶剂、含0.5-2.5％ (V/V)丙酮的烃类溶剂的一种；洗脱流速为每小时0.5-1.5倍大孔吸附树脂柱体积。
作为本发明优选，洗脱时采用一种浓度的溶剂洗脱到底；或者，采用先低浓度的溶剂洗，再用高浓度的溶剂洗脱到底；洗脱液经减压浓缩后加相应洗脱液中的强极性溶剂结晶，过滤烘干后得到磷脂酰丝氨酸。
作为本发明优选，所述混合溶剂中的甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、正己烷、环己烷、正庚烷的原料含量都在99％(wt)以上，石油醚沸程在60℃以上，大豆卵磷脂的磷脂酰胆碱含量在20％(wt)以上，L-丝氨酸含量在99％(wt)以上。
本发明所选用的获得磷脂酰丝氨酸的反应体系为低极性溶剂和水双相体系，因为双相反应体系相对于水相反应，其最后的反应产物中磷脂酰丝氨酸比例较高，副产物磷脂酸比例低了很多，这样更有利于后续的分离纯化工作。
另外，本发明还具以下优点：
1.本发明采用大孔树脂进行分离纯化，相对硅胶来说对分离效果较接近，但硅胶的再生比较复杂，且有些物质的死吸附程度比较高，这会大大影响后续的使用效率；使用大孔径树脂，再生比较方便，只要用含50％(V/V)低级醇或酮的烃类溶剂洗涤2-3倍柱体积量后再用烃类溶剂洗涤1-2倍柱体积量就可以投入使用。
2.本发明层析步骤所使用的混合溶剂与硅胶系统相似，不存在难分离的情况。
通过本发明在方法得到的PS组分含量达到90％以上，同时过程操作较简单，树脂再生比较方便，使得高含量磷脂酰丝氨酸的生产能够有效实施。
附图说明
图1为磷脂酰丝氨酸对照品色谱图；
图2为大豆卵磷脂色谱图；
图3为本发明上柱液色谱图；
图4为本发明产品色谱图。
具体实施方式
通过以下实施例来对本发明作进一步具体说明，但并不仅限于以下实施例和实施例中的工艺参数范围。
实施例中，甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、正己烷、环己烷、正庚烷的原料含量都在99％以上，石油醚沸程在60℃以上，大豆卵磷脂的磷脂酰胆碱含量在20％(wt)以上，L-丝氨酸含量在99％(wt)以上。
实施例1
磷脂酶D发酵液40L，酶活12U/ml，经陶瓷膜过滤，水顶洗后得到滤液120L，滤液经超滤浓缩得到浓酶液4L，酶活105U/ml。
实施例2
称取50g大豆卵磷脂(磷脂酰胆碱含量63.2％(wt))，用正己烷溶解后定容到500ml；称取10g醋酸钠、10g氯化钙、100g L-丝氨酸溶于水中，量取10ml如实施例1方法得到的浓酶液到上述水溶液中，用水定容到1000ml，pH5.79，用醋酸调pH至5.5。合并两相，在30℃条件下搅拌反应10小时后测得反应液中磷脂酰胆碱含量很少后停止搅拌，静置30 分钟，去掉下层重相，轻相用330ml水洗涤两遍后获得上柱液，效价60040μg/ml，主组分HPLC峰面积比例78.6％。
实施例3
称取50g大豆卵磷脂(磷脂酰胆碱含量63.2％(wt))，用环己烷溶解后定容到500ml；称取10g醋酸钠、10g氯化钙、100g L-丝氨酸溶于水中，量取10ml如实施例1方法得到的浓酶液到上述水溶液中，用水定容到1000ml，pH5.78，用醋酸调pH至5.5。合并两相，在30℃条件下搅拌反应11小时后测得反应液中磷脂酰胆碱含量很少后停止搅拌，静置30 分钟，去掉下层重相，轻相用330ml水洗涤两遍后获得上柱液，效价59845μg/ml，主组分HPLC峰面积比例75.3％。
实施例4
称取50g大豆卵磷脂(磷脂酰胆碱含量63.2％(wt))，用正庚烷溶解后定容到500ml；称取10g醋酸钠、10g氯化钙、100g L-丝氨酸溶于水中，量取10ml如实施例1方法得到的浓酶液到上述水溶液中，用水定容到1000ml，pH5.78，用醋酸调pH至5.5。合并两相，在30℃条件下搅拌反应9.5小时后测得反应液中磷脂酰胆碱含量很少后停止搅拌，静置 30分钟，去掉下层重相，轻相用330ml水洗涤两遍后获得上柱液，效价60136μg/ml，主组分HPLC峰面积比例78.9％。
实施例5
称取50g大豆卵磷脂(磷脂酰胆碱含量63.2％(wt))，用石油醚溶解后定容到500ml；称取10g醋酸钠、10g氯化钙、100g L-丝氨酸溶于水中，量取10ml如实施例1方法得到的浓酶液到上述水溶液中，用水定容到1000ml，pH5.8，用醋酸调pH至5.5。合并两相，在30℃条件下搅拌反应11小时后测得反应液中磷脂酰胆碱含量很少后停止搅拌，静置30 分钟，去掉下层重相，轻相用330ml水洗涤两遍后获得上柱液，效价59502μg/ml，主组分HPLC峰面积比例76.5％。
实施例6
如实施例2方法得到的经孔径为1μm的滤芯过滤过的上柱液65ml，效价60040μg/ml，总亿3.9g，上大孔树脂柱，柱体积为200ml，上柱量为1.95％，上柱流速为200ml/hr，上完后用200ml的正己烷洗涤，流速为200ml/hr。后用含1％(V/V)甲醇的正己烷溶液洗脱，流速为100ml/hr，得洗脱液1650ml，效价2015μg/ml。将洗脱液减压浓缩后加甲醇结晶，过滤烘干后得到PS干粉3.3g，主份含量94.6％。参见下表1。
实施例7
如实施例2方法得到的经孔径为1μm的滤芯过滤过的上柱液17ml，效价60040μg/ml，总亿1.02g，上大孔树脂柱，柱体积为200ml，上柱量为0.51％，上柱流速为300ml/hr，上完后用200ml的正己烷洗涤，流速为300ml/hr。后用含4％(V/V)甲醇的正己烷溶液洗脱，流速为300ml/hr，得洗脱液720ml，效价1073μg/ml。将洗脱液减压浓缩后加甲醇结晶，过滤烘干后得到PS干粉0.76g，主份含量93.8％。参见下表1。
实施例8
如实施例2方法得到的经孔径为1μm的滤芯过滤过的上柱液65ml，效价60040μg/ml，总亿3.9g，上大孔树脂柱，柱体积为200ml，上柱量为1.95％，上柱流速为200ml/hr，上完后用200ml的正己烷洗涤，流速为200ml/hr。后用含0.8％(V/V)乙醇的正己烷溶液洗脱，流速为100ml/hr，得洗脱液1530ml，效价2253μg/ml。将洗脱液减压浓缩后加乙醇结晶，过滤烘干后得到PS干粉3.4g，主份含量94.8％。参见下表1。
实施例9
如实施例2方法得到的经孔径为1μm的滤芯过滤过的上柱液17ml，效价60040μg/ml，总亿1.02g，上大孔树脂柱，柱体积为200ml，上柱量为0.51％，上柱流速为300ml/hr，上完后用200ml的正己烷洗涤，流速为300ml/hr。后用含3％(V/V)乙醇的正己烷溶液洗脱，流速为300ml/hr，得洗脱液755ml，效价1038μg/ml。将洗脱液减压浓缩后加乙醇结晶，过滤烘干后得到PS干粉0.78g，主份含量94.2％。参见下表1。
实施例10
如实施例2方法得到的经孔径为1μm的滤芯过滤过的上柱液65ml，效价60040μg/ml，总亿3.9g，上大孔树脂柱，柱体积为200ml，上柱量为1.95％，上柱流速为200ml/hr，上完后用200ml的正己烷洗涤，流速为200ml/hr。后用含1％(V/V)异丙醇的正己烷溶液洗脱，流速为100ml/hr，得洗脱液1555ml，效价2196μg/ml。将洗脱液减压浓缩后加异丙醇结晶，过滤烘干后得到PS干粉3.3g，主份含量94.5％。参见下表1。
实施例11
如实施例2方法得到的经孔径为1μm的滤芯过滤过的上柱液17ml，效价60040μg/ml，总亿1.02g，上大孔树脂柱，柱体积为200ml，上柱量为0.51％，上柱流速为300ml/hr，上完后用200ml的正己烷洗涤，流速为300ml/hr。后用含3％(V/V)异丙醇的正己烷溶液洗脱，流速为300ml/hr，得洗脱液780ml，效价992μg/ml。将洗脱液减压浓缩后加异丙醇结晶，过滤烘干后得到PS干粉0.77g，主份含量93.2％。参见下表1。
实施例12
如实施例2方法得到的经孔径为1μm的滤芯过滤过的上柱液65ml，效价60040μg/ml，总亿3.9g，上大孔树脂柱，柱体积为200ml，上柱量为1.95％，上柱流速为200ml/hr，上完后用200ml的正己烷洗涤，流速为200ml/hr。后用含0.5％(V/V)丙酮的正己烷溶液洗脱，流速为100ml/hr，得洗脱液1530ml，效价2218μg/ml。将洗脱液减压浓缩后加丙酮结晶，过滤烘干后得到PS干粉3.2g，主份含量93.9％。参见下表1。
实施例13
如实施例2方法得到的经孔径为1μm的滤芯过滤过的上柱液17ml，效价60040μg/ml，总亿1.02g，上大孔树脂柱，柱体积为200ml，上柱量为0.51％，上柱流速为300ml/hr，上完后用200ml的正己烷洗涤，流速为300ml/hr。后用含2.5％(V/V)丙酮的正己烷溶液洗脱，流速为300ml/hr，得洗脱液765ml，效价1015μg/ml。将洗脱液减压浓缩后加丙酮结晶，过滤烘干后得到PS干粉0.78g，主份含量93.1％。参见下表1。
实施例14
如实施例3方法得到的经孔径为1μm的滤芯过滤过的上柱液65ml，效价59845μg/ml，总亿3.89g，上大孔树脂柱，柱体积为200ml，上柱量为1.94％，上柱流速为200ml/hr，上完后用200ml的环己烷洗涤，流速为200ml/hr。后用含1％(V/V)甲醇的环己烷溶液洗脱，流速为100ml/hr，得洗脱液1680ml，效价1926μg/ml。将洗脱液减压浓缩后加甲醇结晶，过滤烘干后得到PS干粉3.2g，主份含量93.6％。参见下表1。
实施例15
如实施例3方法得到的经孔径为1μm的滤芯过滤过的上柱液17ml，效价59845μg/ml，总亿1.02g，上大孔树脂柱，柱体积为200ml，上柱量为0.51％，上柱流速为300ml/hr，上完后用200ml的环己烷洗涤，流速为300ml/hr。后用含4％(V/V)甲醇的环己烷溶液洗脱，流速为300ml/hr，得洗脱液735ml，效价1022μg/ml。将洗脱液减压浓缩后加甲醇结晶，过滤烘干后得到PS干粉0.76g，主份含量92.3％。参见下表1。
实施例16
如实施例3方法得到的经孔径为1μm的滤芯过滤过的上柱液65ml，效价59845μg/ml，总亿3.89g，上大孔树脂柱，柱体积为200ml，上柱量为1.94％，上柱流速为200ml/hr，上完后用200ml的环己烷洗涤，流速为200ml/hr。后用含0.8％(V/V)乙醇的环己烷溶液洗脱，流速为100ml/hr，得洗脱液1610ml，效价2098μg/ml。将洗脱液减压浓缩后加乙醇结晶，过滤烘干后得到PS干粉3.3g，主份含量93.7％。参见下表1。
实施例17
如实施例3方法得到的经孔径为1μm的滤芯过滤过的上柱液17ml，效价59845μg/ml，总亿1.02g，上大孔树脂柱，柱体积为200ml，上柱量为0.51％，上柱流速为300ml/hr，上完后用200ml的环己烷洗涤，流速为300ml/hr。后用含3％(V/V)乙醇的环己烷溶液洗脱，流速为300ml/hr，得洗脱液775ml，效价991μg/ml。将洗脱液减压浓缩后加乙醇结晶，过滤烘干后得到PS干粉0.77g，主份含量92.5％。参见下表1。
实施例18
如实施例3方法得到的经孔径为1μm的滤芯过滤过的上柱液65ml，效价59845μg/ml，总亿3.89g，上大孔树脂柱，柱体积为200ml，上柱量为1.94％，上柱流速为200ml/hr，上完后用200ml的环己烷洗涤，流速为200ml/hr。后用含1％(V/V)异丙醇的环己烷溶液洗脱，流速为100ml/hr，得洗脱液1595ml，效价2077μg/ml。将洗脱液减压浓缩后加异丙醇结晶，过滤烘干后得到PS干粉3.3g，主份含量93.2％。参见下表1。
实施例19
如实施例3方法得到的经孔径为1μm的滤芯过滤过的上柱液17ml，效价59845μg/ml，总亿1.02g，上大孔树脂柱，柱体积为200ml，上柱量为0.51％，上柱流速为300ml/hr，上完后用200ml的环己烷洗涤，流速为300ml/hr。后用含3％(V/V)异丙醇的环己烷溶液洗脱，流速为300ml/hr，得洗脱液805ml，效价942μg/ml。将洗脱液减压浓缩后加异丙醇结晶，过滤烘干后得到PS干粉0.76g，主份含量92.2％。参见下表1。
实施例20
如实施例3方法得到的经孔径为1μm的滤芯过滤过的上柱液65ml，效价59845μg/ml，总亿3.89g，上大孔树脂柱，柱体积为200ml，上柱量为1.94％，上柱流速为200ml/hr，上完后用200ml的环己烷洗涤，流速为200ml/hr。后用含0.5％(V/V)丙酮的环己烷溶液洗脱，流速为100ml/hr，得洗脱液1545ml，效价2130μg/ml。将洗脱液减压浓缩后加丙酮结晶，过滤烘干后得到PS干粉3.2g，主份含量92.7％。参见下表1。
实施例21
如实施例3方法得到的经孔径为1μm的滤芯过滤过的上柱液17ml，效价59845μg/ml，总亿1.02g，上大孔树脂柱，柱体积为200ml，上柱量为0.51％，上柱流速为300ml/hr，上完后用200ml的环己烷洗涤，流速为300ml/hr。后用含2.5％(V/V)丙酮的环己烷溶液洗脱，流速为300ml/hr，得洗脱液775ml，效价972μg/ml。将洗脱液减压浓缩后加丙酮结晶，过滤烘干后得到PS干粉0.77g，主份含量91.9％。参见下表1。
实施例22
如实施例4方法得到的经孔径为1μm的滤芯过滤过的上柱液65ml，效价60136μg/ml，总亿3.91g，上大孔树脂柱，柱体积为200ml，上柱量为1.95％，上柱流速为200ml/hr，上完后用200ml的正庚烷洗涤，流速为200ml/hr。后用含1％(V/V)甲醇的正庚烷溶液洗脱，流速为100ml/hr，得洗脱液1640ml，效价2036μg/ml。将洗脱液减压浓缩后加甲醇结晶，过滤烘干后得到PS干粉3.4g，主份含量94.7％。参见下表1。
实施例23
如实施例4方法得到的经孔径为1μm的滤芯过滤过的上柱液17ml，效价60136μg/ml，总亿1.02g，上大孔树脂柱，柱体积为200ml，上柱量为0.51％，上柱流速为300ml/hr，上完后用200ml的正庚烷洗涤，流速为300ml/hr。后用含4％(V/V)甲醇的正庚烷溶液洗脱，流速为300ml/hr，得洗脱液725ml，效价1067μg/ml。将洗脱液减压浓缩后加甲醇结晶，过滤烘干后得到PS干粉0.76g，主份含量94.1％。参见下表1。
实施例24
如实施例4方法得到的经孔径为1μm的滤芯过滤过的上柱液65ml，效价60136μg/ml，总亿3.91g，上大孔树脂柱，柱体积为200ml，上柱量为1.95％，上柱流速为200ml/hr，上完后用200ml的正庚烷洗涤，流速为200ml/hr。后用含0.8％(V/V)乙醇的正庚烷溶液洗脱，流速为100ml/hr，得洗脱液1525ml，效价2262μg/ml。将洗脱液减压浓缩后加乙醇结晶，过滤烘干后得到PS干粉3.4g，主份含量94.5％。参见下表1。
实施例25
如实施例4方法得到的经孔径为1μm的滤芯过滤过的上柱液17ml，效价60136μg/ml，总亿1.02g，上大孔树脂柱，柱体积为200ml，上柱量为0.51％，上柱流速为300ml/hr，上完后用200ml的正庚烷洗涤，流速为300ml/hr。后用含3％(V/V)乙醇的正庚烷溶液洗脱，流速为300ml/hr，得洗脱液755ml，效价1026μg/ml。将洗脱液减压浓缩后加乙醇结晶，过滤烘干后得到PS干粉0.77g，主份含量93.9％。参见下表1。
实施例26
如实施例4方法得到的经孔径为1μm的滤芯过滤过的上柱液65ml，效价60136μg/ml，总亿3.91g，上大孔树脂柱，柱体积为200ml，上柱量为1.95％，上柱流速为200ml/hr，上完后用200ml的正庚烷洗涤，流速为200ml/hr。后用含1％(V/V)异丙醇的正庚烷溶液洗脱，流速为100ml/hr，得洗脱液1570ml，效价2172μg/ml。将洗脱液减压浓缩后加异丙醇结晶，过滤烘干后得到PS干粉3.3g，主份含量94.4％。参见下表1。
实施例27
如实施例4方法得到的经孔径为1μm的滤芯过滤过的上柱液17ml，效价60136μg/ml，总亿1.02g，上大孔树脂柱，柱体积为200ml，上柱量为0.51％，上柱流速为300ml/hr，上完后用200ml的正庚烷洗涤，流速为300ml/hr。后用含3％(V/V)异丙醇的正庚烷溶液洗脱，流速为300ml/hr，得洗脱液770ml，效价1023μg/ml。将洗脱液减压浓缩后加异丙醇结晶，过滤烘干后得到PS干粉0.78g，主份含量93.8％。参见下表1。
实施例28
如实施例4方法得到的经孔径为1μm的滤芯过滤过的上柱液65ml，效价60136μg/ml，总亿3.91g，上大孔树脂柱，柱体积为200ml，上柱量为1.95％，上柱流速为200ml/hr，上完后用200ml的正庚烷洗涤，流速为200ml/hr。后用含0.5％(V/V)丙酮的正庚烷溶液洗脱，流速为100ml/hr，得洗脱液1515ml，效价2231μg/ml。将洗脱液减压浓缩后加丙酮结晶，过滤烘干后得到PS干粉3.2g，主份含量94.2％。参见下表1。
实施例29
如实施例4方法得到的经孔径为1μm的滤芯过滤过的上柱液17ml，效价60136μg/ml，总亿1.02g，上大孔树脂柱，柱体积为200ml，上柱量为0.51％，上柱流速为300ml/hr，上完后用200ml的正庚烷洗涤，流速为300ml/hr。后用含2.5％(V/V)丙酮的正庚烷溶液洗脱，流速为300ml/hr，得洗脱液770ml，效价1018μg/ml。将洗脱液减压浓缩后加丙酮结晶，过滤烘干后得到PS干粉0.8g，主份含量93.5％。参见下表1。
实施例30
如实施例5方法得到的经孔径为1μm的滤芯过滤过的上柱液65ml，效价59502μg/ml，总亿3.87g，上大孔树脂柱，柱体积为200ml，上柱量为1.93％，上柱流速为200ml/hr，上完后用200ml的石油醚洗涤，流速为200ml/hr。后用含1％(V/V)甲醇的石油醚溶液洗脱，流速为100ml/hr，得洗脱液1670ml，效价1938μg/ml。将洗脱液减压浓缩后加甲醇结晶，过滤烘干后得到PS干粉3.1g，主份含量93.6％。参见下表1。
实施例31
如实施例5方法得到的经孔径为1μm的滤芯过滤过的上柱液17ml，效价59502μg/ml，总亿1.01g，上大孔树脂柱，柱体积为200ml，上柱量为0.5％，上柱流速为300ml/hr，上完后用200ml的石油醚洗涤，流速为300ml/hr。后用含4％(V/V)甲醇的石油醚溶液洗脱，流速为300ml/hr，得洗脱液720ml，效价1039μg/ml。将洗脱液减压浓缩后加甲醇结晶，过滤烘干后得到PS干粉0.76g，主份含量92.1％。参见下表1。
实施例32
如实施例5方法得到的经孔径为1μm的滤芯过滤过的上柱液65ml，效价59502μg/ml，总亿3.87g，上大孔树脂柱，柱体积为200ml，上柱量为1.93％，上柱流速为200ml/hr，上完后用200ml的石油醚洗涤，流速为200ml/hr。后用含0.8％(V/V)乙醇的石油醚溶液洗脱，流速为100ml/hr，得洗脱液1620ml，效价2076μg/ml。将洗脱液减压浓缩后加乙醇结晶，过滤烘干后得到PS干粉3.2g，主份含量93.8％。参见下表1。
实施例33
如实施例5方法得到的经孔径为1μm的滤芯过滤过的上柱液17ml，效价59502μg/ml，总亿1.01g，上大孔树脂柱，柱体积为200ml，上柱量为0.5％，上柱流速为300ml/hr，上完后用200ml的石油醚洗涤，流速为300ml/hr。后用含3％(V/V)乙醇的石油醚溶液洗脱，流速为300ml/hr，得洗脱液750ml，效价1027μg/ml。将洗脱液减压浓缩后加乙醇结晶，过滤烘干后得到PS干粉0.78g，主份含量92.6％。参见下表1。
实施例34
如实施例5方法得到的经孔径为1μm的滤芯过滤过的上柱液65ml，效价59502μg/ml，总亿3.87g，上大孔树脂柱，柱体积为200ml，上柱量为1.93％，上柱流速为200ml/hr，上完后用200ml的石油醚洗涤，流速为200ml/hr。后用含1％(V/V)异丙醇的石油醚溶液洗脱，流速为100ml/hr，得洗脱液1585ml，效价2086μg/ml。将洗脱液减压浓缩后加异丙醇结晶，过滤烘干后得到PS干粉3.3g，主份含量94.1％。参见下表1。
实施例35
如实施例5方法得到的经孔径为1μm的滤芯过滤过的上柱液17ml，效价59502μg/ml，总亿1.01g，上大孔树脂柱，柱体积为200ml，上柱量为0.5％，上柱流速为300ml/hr，上完后用200ml的石油醚洗涤，流速为300ml/hr。后用含3％(V/V)异丙醇的石油醚溶液洗脱，流速为300ml/hr，得洗脱液805ml，效价960μg/ml。将洗脱液减压浓缩后加异丙醇结晶，过滤烘干后得到PS干粉0.77g，主份含量92.3％。参见下表1。
实施例36
如实施例5方法得到的经孔径为1μm的滤芯过滤过的上柱液65ml，效价59502μg/ml，总亿3.87g，上大孔树脂柱，柱体积为200ml，上柱量为1.93％，上柱流速为200ml/hr，上完后用200ml的石油醚洗涤，流速为200ml/hr。后用含0.5％(V/V)丙酮的石油醚溶液洗脱，流速为100ml/hr，得洗脱液1540ml，效价2124μg/ml。将洗脱液减压浓缩后加丙酮结晶，过滤烘干后得到PS干粉3.2g，主份含量93.6％。参见下表1。
实施例37
如实施例5方法得到的经孔径为1μm的滤芯过滤过的上柱液17ml，效价59502μg/ml，总亿1.01g，上大孔树脂柱，柱体积为200ml，上柱量为0.5％，上柱流速为300ml/hr，上完后用200ml的石油醚洗涤，流速为300ml/hr。后用含2.5％(V/V)丙酮的石油醚溶液洗脱，流速为300ml/hr，得洗脱液780ml，效价960μg/ml。将洗脱液减压浓缩后加丙酮结晶，过滤烘干后得到PS干粉0.76g，主份含量91.9％。参见下表1。
以上工艺可用于高含量磷脂酰丝氨酸中间体和成品的制备，也可通过多次层析组合提纯PS。
表1
以上所述，仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其它修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.高含量磷脂酰丝氨酸纯化方法，其特征在于，包括步骤：
(1)将含有55000-63000μg/ml的磷脂酰丝氨酸上柱液通过大孔吸附树脂柱进行吸附；
(2)接续步骤(1)再用混合溶剂进行洗脱得洗脱液；
(3)洗脱液经减压浓缩后直接结晶得到磷脂酰丝氨酸；
其中，
所述的混合溶剂为烃类溶剂与低级醇或烃类溶剂与丙酮的混合溶剂；
所述的烃类溶剂选自：正己烷、正庚烷、环己烷、石油醚的一种或几种；
所述的低级醇选自：甲醇、乙醇、异丙醇的一种或几种。
2.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)的磷脂酰丝氨酸的上柱液通过如下步骤制得：
(11)磷脂酶D发酵液通过过滤浓缩得到含磷脂酶D的浓酶液；
(12)将大豆卵磷脂溶于烃类溶剂相，得大豆卵磷脂溶剂相；
(13)L-丝氨酸、醋酸钠、氯化钙在水相中加入步骤(11)的浓酶液，以醋酸调节pH为4.5-6.5，再与步骤(12)中的大豆卵磷脂溶剂相混合，温度20-40℃间搅拌进行转酯反应，得反应液；
(14)反应液经过分液和水洗得到含有磷脂酰丝氨酸的烃类溶剂相，此为磷脂酰丝氨酸上柱液；
其中，大豆卵磷脂在烃类溶剂中的质量体积浓度为10％；L-丝氨酸在水相中质量体积浓度为10％；醋酸钠在水相中质量体积浓度为1％；氯化钙在水相中质量体积浓度为1％；浓酶液在水相中体积浓度为1％；溶剂相和水相的体积比例为1/2。
3.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)的磷脂酰丝氨酸上柱液预先通过孔径为0.5-2μm的滤芯过滤。
4.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，大孔吸附树脂柱选自：聚苯乙烯树脂柱或聚丙烯酸树脂柱。
5.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，上柱量为0.5-2％。
6.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，上柱液通过大孔吸附树脂柱层析的流速控制在每小时1-1.5倍的大孔吸附树脂柱体积。
7.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，上柱液通过大孔吸附树脂柱后，再通过用量为1倍树脂柱体积、洗涤流速为每小时1-1.5倍树脂柱体积的烃类溶剂进行洗涤该树脂柱，之后再进行步骤(2)。
8.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，混合溶剂包括含烃类溶剂和在混合溶剂中体积浓度为0.5-4％的甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮的一种。
9.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，浓酶液的酶活在100-120U/ml之间。
10.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，步骤(14)中，水洗的加水量为溶剂相体积的1/4-1/2，水洗至少两次。
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