CN102676600A

CN102676600A - 一种制备磷脂酰丝氨酸的方法

Info

Publication number: CN102676600A
Application number: CN2012101284088A
Authority: CN
Inventors: 段章群; 王瑛瑶; 马榕; 胡飞; 栾霞; 杜传林
Original assignee: Academy of State Administration of Grain
Current assignee: Academy of State Administration of Grain
Priority date: 2012-04-28
Filing date: 2012-04-28
Publication date: 2012-09-19

Abstract

本发明公开了一种制备磷脂酰丝氨酸的方法。该方法是将磷脂和L-丝氨酸在磷脂酶D的作用下进行转磷脂酰基反应，生成磷脂酰丝氨酸，所述转磷脂酰基反应是在均相介质体系中进行的，磷脂酰丝氨酸的产率达到80%~98%。本发明的优点在于，采用新型绿色反应介质，使反应体系为均相体系，没有副产物磷脂酸产生，酶催化效率高，产品质量好，工艺绿色安全环保。

Description

一种制备磷脂酰丝氨酸的方法

技术领域

本发明涉及一种制备磷脂酰丝氨酸的方法。

背景技术

磷脂是一类含磷酸根脂质的总称，主要包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸以及神经鞘磷脂等。其中，磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）是一种重要的稀有磷脂，可影响脑内化学讯息的传递、并帮助脑细胞储存和读取资料，是维持大脑正常记忆力、反应和健康情绪的重要营养元素，被称为“大脑维生素”。其结构式如所示：以甘油为主要骨架，1、2号碳原子连接脂肪酸；3号碳原子连接一个带丝氨酸的磷脂基团。

磷脂酰丝氨酸

近年来的研究表明，PS具有预防老年痴呆症、改善记忆力、集中注意力、缓解抑郁、减少压力激素分泌、治疗儿童多动症等功能。PS于2007年通过了美国FDA认证，也是我国卫生部2010年第15号公告公布的一种新资源食品。

然而，PS不能由人体自身完全合成。目前获得PS的方法主要是提取法和酶转化法。提取源以动物的大脑和内脏为主，专利CN1583766和CN1649988分别公布了从动物脑和鱼内脏中提取PS的方法。但是，由于量的限制，依赖动物大脑和内脏工业化生产PS是不适宜的，此外，动物的传染病（如疯牛病）使提取法产品的安全性遭到质疑，所以提取法已处于淘汰的边缘。

目前，PS的制备主要是通过酶转化法实现，即磷脂与L-丝氨酸在磷脂酶D的催化下、发生转磷脂酰基反应生成PS。该反应通常是在含有磷脂的有机相（乙酸乙酯、乙醚、氯仿等）与含有L-丝氨酸的水相组成的液液双相体系中进行。由于PS是供食用的，其生产过程应避免对人体有害溶剂的使用，为此，专利JP2002051794和DE102004002053公布了纯水体系中制备PS的工艺，借助于特殊均质化设备，整个反应体系呈均质胶状。为了减少设备投入，专利CN101230365加大了水的用量（最高可达反应物的10倍），用普通的搅拌设备即可使反应体系呈均质胶状。但是，这些工艺中大量水的存在，促使底物磷脂和产物PS发生水解反应生成副产物磷脂酸（PA），比如，底物磷脂的转化率虽然最高可达94%、但转化成PS的底物磷脂只有54%、而转化成副产物PA的底物磷脂高达40%，反应效率降低的同时也增加了产物分离纯化难度。专利CN101157946公布了亚临界流体中酶催化制备PS的工艺，由于磷脂在该介质中的溶解度有限（80 mg/500 mL），亚临界装置结构复杂、制造成本高、且局限于某一种亚临界流体，使得该工艺的应用受到很大局限。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种制备磷脂酰丝氨酸的方法。该方法是在均相体系中完成的转磷脂酰基反应，克服了现有技术存在的副产物磷脂酸较多、酶催化反应效率低的问题。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

本发明提供了一种制备磷脂酰丝氨酸的方法，该方法是将磷脂和L-丝氨酸在磷脂酶D的作用下进行转磷脂酰基反应，生成磷脂酰丝氨酸，与现有技术中公开的方法相比，本发明的特点就是所述转磷脂酰基反应是在均相介质体系中进行的，其中，所述均相介质为γ-戊内酯、2-甲基四氢呋喃或其混合物。在该均相反应体系中，不产生副产物磷脂酸，酶促转化效率显著提高，产品质量好，工艺绿色安全环保，磷脂酰丝氨酸的产率达到80%~98%。

本发明所述的磷脂来源于植物、动物、微生物，优选为大豆磷脂、蛋黄磷脂、鱿鱼磷脂，更优选为从上述磷脂中分级浓缩的磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）中的一种或者几种。

本发明所述的磷脂酶D来源于植物、动物和微生物，其中，植物包括胡萝卜、白菜、菠菜、甜菜、花椰菜、黄瓜、番茄、甘蓝、棉籽、水稻、大豆、玉米、蓖麻籽、油菜、花生、草莓、葡萄、甜瓜、拟南芥、烟草、海藻等；动物包括鼠、牛、养、猪等的大脑、肝脏及胰脏；微生物包括链霉菌（Streptomycete）、棒状杆菌（Corynebacteria）、大肠杆菌（Escherichia）、假单胞菌（Pseudomonas）、沙门氏杆菌（Salmonella）、酵母菌（Yeast）等。优选为微生物来源的磷脂酶D，更优选为来源于链霉菌（Streptomycete）的磷脂酶D。这些不同的磷脂酶D可以单独使用，也可以组合使用。

本发明所述的γ-戊内酯、2-甲基四氢呋喃是新型绿色溶剂。γ-戊内酯是无色至微黄色液体、具有香兰素和椰子香味，我国GB/T14156-2009规定γ-戊内酯为允许使用的食用香料，主要用于配制桃、椰子、香草等型香精。它来源于天然的纤维质碳水化合物（如，纤维素）、对人体无毒、可生物降解、热稳定性高、适于长期大规模使用。2-甲基四氢呋喃是无色透明液体，有类似醚的气味，属于惰性溶剂、性质稳定、易于储运、适于长期大规模使用，便于回收（用2-甲基四氢呋喃-水共沸物即可完全回收2-甲基四氢呋喃）。它来源于可再生资源如玉米芯、蔗渣、燕麦壳等，对人体无毒、可生物降解。γ-戊内酯和2-甲基四氢呋喃均能溶解反应物（磷脂和L-丝氨酸），使整个反应体系呈均相。由于该均相反应体系中没有添加水，所以不会发生底物磷脂和产物磷脂酰丝氨酸的水解反应，因而，没有副产物磷脂酸产生。

根据本发明所述方法，所述均相介质的量优选为所述磷脂和L-丝氨酸总质量的1~30倍量，更优选为5~20倍量。

进一步地，所述磷脂与L-丝氨酸的摩尔比为1:0.5~30，优选为1:3~9。

进一步地，所述磷脂酶D的量为所述磷脂和L-丝氨酸总质量的1%~20%。

进一步地，所述转磷脂酰基反应的条件为：反应温度为20^oC~65^oC，反应时间为2~48小时。并且，该转磷脂酰基反应是在生物反应器中进行的。

进一步地，所述均相介质为γ-戊内酯和2-甲基四氢呋喃的混合物，γ-戊内酯与2-甲基四氢呋喃体积比为1~6:1。

本发明的有益效果：现有工艺中大量水的存在，促使底物磷脂和产物磷脂酰丝氨酸发生水解反应生成副产物磷脂酸，虽然底物磷脂的转化率最高可达94%、但转化成磷脂酰丝氨酸的底物磷脂只有54%、而转化成副产物磷脂酸的底物磷脂高达40%。本发明采用新型绿色溶剂（γ-戊内酯和2-甲基四氢呋喃）作为反应介质，使反应体系为均相体系。由于该均相反应体系中没有添加水，所以不会发生底物磷脂和产物磷脂酰丝氨酸的水解反应，因而，没有副产物磷脂酸产生，从而酶促转化效率显著提高。这两种溶剂都来源于天然的碳水化合物（例如植物秸秆、纤维素），工艺绿色环保、产品质量好，具有更好的工业应用前景。

具体实施例方式

下面结合具体实施例，进—步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1：

将摩尔比为1:9的磷脂酰胆碱（99%，Sigma-Aldrich公司）和L-丝氨酸（市售），以及基于反应物质量5倍的γ-戊内酯（Sigma-Aldrich公司）、基于反应物质量5%的磷脂酶D（来源于链霉菌，日本旭化成公司），一起装入适于生物酶催化反应的生化反应器中混合均匀，温度控制在65 ^oC，反应2小时，磷脂酰丝氨酸的产率达到98%。

实施例2：

将摩尔比为1:6的磷脂酰乙醇胺（98%，Sigma-Aldrich公司）和L-丝氨酸（市售），以及基于反应物质量1倍的2-甲基四氢呋喃（Sigma-Aldrich公司）、基于反应物质量1%的磷脂酶D（来源于链霉菌，日本旭化成公司），一起装入适于生物酶催化反应的生化反应器中混合均匀，温度控制在45 ^oC，反应8小时，磷脂酰丝氨酸的产率达到95%。

实施例3：

将摩尔比为1:3的磷脂酰肌醇（50%，Sigma-Aldrich公司）和L-丝氨酸（市售），以及基于反应物质量8倍的γ-戊内酯和2-甲基四氢呋喃混合物（体积比1:1，Sigma-Aldrich公司）、基于反应物质量10%的磷脂酶D（来源于链霉菌，Sigma-Aldrich公司），一起装入适于生物酶催化反应的任何生化反应器中混合均匀，温度控制在35 ^oC，反应48小时，磷脂酰丝氨酸的产率达到82%。

实施例4：

将摩尔比为1:15的大豆磷脂（含磷脂酰胆碱37.5%、磷脂酰乙醇胺22.7%、磷脂酰肌醇15.8%，市售）和L-丝氨酸（市售），以及基于反应物质量10倍的γ-戊内酯和2-甲基四氢呋喃混合物（体积比3:1，Sigma-Aldrich公司）、基于反应物质量15%的磷脂酶D（来源于链霉菌，日本旭化成公司），一起装入适于生物酶催化反应的生化反应器中混合均匀，温度控制在50 ^oC，反应12小时，磷脂酰丝氨酸的产率达到90%。

实施例5：

将摩尔比为1:0.5的大豆磷脂（含磷脂酰胆碱50.6%、磷脂酰乙醇胺13.2%、磷脂酰肌醇7.4%，市售）和L-丝氨酸（市售），以及基于反应物质量20倍的2-甲基四氢呋喃（Sigma-Aldrich公司）、基于反应物质量20%的磷脂酶D（来源于链霉菌，Sigma-Aldrich公司），一起装入适于生物酶催化反应的生化反应器中混合均匀，温度控制在30 ^oC，反应18小时，磷脂酰丝氨酸的产率达到81%。

实施例6：

将摩尔比为1:30的蛋黄磷脂（含磷脂酰胆碱94.1%，市售）和L-丝氨酸（市售），以及基于反应物质量30倍的γ-戊内酯（Sigma-Aldrich公司）、基于反应物质量8%的磷脂酶D（来源于链霉菌，日本旭化成公司），一起装入适于生物酶催化反应的生化反应器中混合均匀，温度控制在40 ^oC，反应24小时，磷脂酰丝氨酸的产率达到97%。

实施例7：

将摩尔比为1:20的鱿鱼磷脂（含磷脂酰胆碱42.7%，提取自鱿鱼卵）和L-丝氨酸（市售），以及基于反应物质量15倍的γ-戊内酯和2-甲基四氢呋喃混合物（体积比6:1，Sigma-Aldrich公司）、基于反应物质量5%的磷脂酶D（来源于链霉菌，Sigma-Aldrich公司）和8%的磷脂酶D（来源于链霉菌，日本旭化成公司），一起装入适于生物酶催化反应的生化反应器中混合均匀，温度控制在20 ^oC，反应36小时，磷脂酰丝氨酸的产率达到84%。

表1 实施例中反应前后磷脂中各成分含量

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims

1.一种制备磷脂酰丝氨酸的方法，是将磷脂和L-丝氨酸在磷脂酶D的作用下进行转磷脂酰基反应，生成磷脂酰丝氨酸，其特征在于，所述转磷脂酰基反应是在均相介质体系中进行的，其中，所述均相介质为γ-戊内酯、2-甲基四氢呋喃或其混合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述均相介质的量为所述磷脂和L-丝氨酸总质量的1~30倍量，优选为5~20倍量。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷脂与L-丝氨酸的摩尔比为1:0.5~30，优选为1:3~9。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷脂酶D的量为所述磷脂和L-丝氨酸总质量的1%~20%。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷脂为大豆磷脂、蛋黄磷脂或鱿鱼磷脂。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷脂为磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇中的一种或者几种。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转磷脂酰基反应的条件为：反应温度为20 ~65℃，反应时间为2~48小时。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述均相介质为γ-戊内酯和2-甲基四氢呋喃的混合物，其中，所述γ-戊内酯与2-甲基四氢呋喃体积比为1~6:1。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转磷脂酰基反应是在生化反应器中进行的。