TWI642359B - 生質ｎ－乙醯基－ｌ－甲硫胺酸及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明關於生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸及其製備方法。此外，本發明關於含有N-乙醯基-L-甲硫胺酸的飼料添加物、含有該飼料添加物的飼料組成物以及用於飼養動物的方法，其包括對動物餵食含有N-乙醯基-L-甲硫胺酸的飼料添加物或含有該飼料添加物的飼料組成物。

Description

生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸及其用途
本發明係關於生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸及其製備方法。此外，本發明係關於包含生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸的飼料添加物及飼料組成物。
為了維持生命、形成新組織以及持續用於製造乳、肉、蛋等，動物必須持續補充體外所提供的充足營養素。因此，業經有許多嘗試去增加如增重率及肉品質感之特質，係藉由除了動物飼料之外，直接餵食動物胺基酸、基礎營養元素。然而，被反芻動物所消化的多數胺基酸的60%至70%，於反芻動物的胃中(更具體地為瘤胃)經由微生物的分解過程被自發性消耗，而某些未被消化的胺基酸僅於小腸中分解或吸收。因此，雖然於用於反芻動物的飼料中添加胺基酸，但無法在養豬業或家禽畜養業中獲得效果，且因而有需要開發瘤胃保護的胺基酸，其繞道瘤胃而能被反芻動物消化。
亦即，在用於反芻動物的飼料中添加胺基酸的情況下，胺基酸必須被吸收且安全地到達小腸而避免於瘤胃中 被微生物降解。因此，對於保護免於瘤胃的效果或繞道瘤胃的改良新技術及其材料近來受到注目。
另一方面，即使N-乙醯基-L-甲硫胺酸係已知使用於動物添加物或動物餵料的材料，因其高的製備成本使得對於N-乙醯基-L-甲硫胺酸的需求受到限制。此外，其傳統的製備方法使用衍生自石油的材料，因而其引起有限資源及環境問題的消耗(美國專利第7960575號)。
用於N-乙醯基-L-甲硫胺酸的傳統製備方法的具體實例意指藉由L-甲硫胺酸的乙醯化而製造N-乙醯基-L-甲硫胺酸的方法，該L-甲硫胺酸係自石油藉由化學合成所製備的D/L甲硫胺酸分離。然而，由於其採用高成本而僅自D/L甲硫胺酸混合物分離L-甲硫胺酸具有一些不利處。
此外，已發現直接醱酵方法，其中L-型可藉由於甲硫胺酸產生菌株中過度表現乙醯化酵素(美國專利第8143031號)而獲得。然而，該方法已間接確認YncA可藉由DTNB分析使用乙醯輔酶A(acetyl-CoA)，但未經確認N-乙醯基-L-甲硫胺酸是否實質上製備為酵素反應產物或產生該基因轉形株的產物。再者，該方法因其高成本及隨後之降低產率而難以商業化。
本發明者們已進行廣泛研究以開發用於製造N-乙醯基-L-甲硫胺酸的方法，其中該方法因在整個過程中較少產生二氧化碳而為環境友善的，同時仍具有高功 效及經濟可行性。其結果，發明者們已藉由乙醯化生質L-甲硫胺酸而以高產率製造生質L-甲硫胺酸且經濟性地開發用於其製造的方法而無環境汙染的顧慮。由此，完成本發明。
本發明之一目的係提供用於製造生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸的方法，包括：(a)(i)藉由微生物醱酵製造L-甲硫胺酸前驅物；(ii)藉由酵素轉換由L-甲硫胺酸前驅物製造L-甲硫胺酸；以及(b)乙醯化L-甲硫胺酸。
本發明之另一目的係提供用於製造生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸的方法，包括：(a)藉由微生物醱酵製造L-甲硫胺酸；以及(b)乙醯化L-甲硫胺酸。
本發明之又一目的係提供用於製造生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸的方法，包括藉由具有乙醯化酵素活性之製造N-乙醯基-L-甲硫胺酸之微生物的醱酵而直接製造生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸。
本發明之再一目的係提供包括衍生自生物資源的碳之生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸。
本發明之再一目的係提供生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸族群，其中構成該族群的碳的50%至100%為衍生自生物資源的碳。
本發明之再一目的係提供包括生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸或其鹽的飼料添加物。
本發明之再一目的係提供包括生質N-乙醯基-L-甲硫 胺酸或其鹽的飼料組成物。
本發明之再一目的係提供方法用於改良乳生產、乳脂或乳蛋白質，或動物的增重效果，包括餵食飼料添加物或飼料組成物。
用於製造本發明之生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸的方法係使用生物資源進行，且因而不僅引起較少的環境汙染，也以高產率經濟性地製造N-乙醯基-L-甲硫胺酸。因此，該方法可非常有效地使用於工業。特別地，藉由該方法所製造的N-乙醯基-L-甲硫胺酸展現顯著的功效於作為飼料添加物，此乃因該N-乙醯基-L-甲硫胺酸能繞道瘤胃。
第1圖係顯示N-乙醯基-L甲硫胺酸的瘤胃繞道率(%)。
為達成上述目地，本發明之態樣係用於製造生質n-乙醯基-L-甲硫胺酸的方法，包括(i)藉由微生物醱酵製造L-甲硫胺酸前驅物；以及(ii)藉由酵素轉換而由L-甲硫胺酸前驅物製造L-甲硫胺酸；以及(b)乙醯化該L-甲硫胺酸。
本發明之另一態樣係用於製造生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸的方法，包括(a)藉由微生物醱酵製造L-甲硫胺酸；以及(b)乙醯化該L-甲硫胺酸。
如使用於本文，用語「生質」意指衍生自生物資源的材料。用語「生物資源」包括所有可自各種藉由光合作用所製造之藻類及植物資源取得之材料，亦即，樹、草、部分作物、葉、根、果實等，特別地，意指環境友善的資源而非石油資源。
本發明之用於製造N-乙醯基-L-甲硫胺酸的方法係藉由醱酵生物碳來源，替代使用石油衍生的材料，而以高效率製造L-甲硫胺酸前驅物，以及由該前驅物製造N-乙醯基-L-甲硫胺酸(NALM)的方法。因此，該方法由於為環境友善及經濟性方式而於工業上非常有效。
後文中，將更詳細說明用於製造本發明之N-乙醯基-L-甲硫胺酸的方法。
步驟(a)包括(i)藉由微生物醱酵製造L-甲硫胺酸前驅物；以及(ii)藉由酵素轉換由L-甲硫胺酸前驅物製造L-甲硫胺酸。
L-甲硫胺酸意指在藉由醱酵生物碳來源所製造的材料中可轉換為L-甲硫胺酸的化合物，且可意指O-乙醯基-L-高絲胺酸或O-琥珀醯基-L-高絲胺酸，但不限於其等。
使用於上述醱酵的微生物意指能製造L-甲硫胺酸前驅物的菌株。此外，如使用於本文，用語「能製造L-甲硫胺酸前驅物的菌株」意指於微生物中製造L-甲硫胺酸前驅物的原核或真核微生物菌株，以及進一步地意指於其中能蓄積該L-甲硫胺酸前驅物的菌株。能製造L-甲硫胺酸前驅 物的菌株可意指O-乙醯基-L-高絲胺酸或O-琥珀醯基-L-高絲胺酸的製造菌株。
例如，該菌株可包括微生物菌株屬於埃希氏菌屬(Escherichia sp.)、歐文氏菌屬(Erwinia sp.)、沙雷氏菌屬(Serratia sp.)、普羅威登斯菌屬(Providencia sp.)、棒狀桿菌屬(Corynebacteria sp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)、鉤端螺旋菌屬(Leptospira sp.)、沙門氏菌屬(Salmonellar sp.)、短桿菌屬(Brevibacteria sp.)、生絲單胞菌屬(Hypomononas sp.)、色桿菌屬(Chromobacterium sp.)、土壤絲菌屬(Norcardia sp.)、真菌或酵母菌；具體地，該菌株可為屬於埃希氏菌屬(Escherichia sp.)、棒狀桿菌屬(Corynebacteria sp.)、鉤端螺旋菌屬(Leptospira sp.)及酵母菌的微生物菌株；更具體地，其可為屬於埃希氏菌屬(Escherichia sp.)的微生物菌株；以及最具體地，該菌株可為大腸菌(Escherichia coli)，但不限於其等。
此外，上述菌株可包括揭示於美國專利第8609396號及第7851180號的菌株。
如使用於本文，用語「醱酵」意指藉由引起有機化合物的簡單製造的微生物降解有機材料。該醱酵可於厭氧條件或氧存在下發生。特別地，該醱酵可藉由培養該製造L-甲硫胺酸前驅物的菌株而進行。
培養製造所製備的L-甲硫胺酸前驅物的菌株的過程可根據所屬技術領域已知的充份培養基與培養條件進行。該培養過程可根據所屬技術領域中具有通常知識者選擇的 菌株容易地調整使用。培養方法的實例可包括批次培養、連續培養及饋料批次培養，但不限於其等。
培養中使用之培養基應適宜地符合特定菌株的所要條件。培養基可包括各種碳源，進一步地，可包括其他氮源及微元素的成分。碳源的特徵在於其特別地包括生質材料。具體地，該生質碳源可包括烴類如糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、澱粉及纖維素；脂類如大豆油、葵花油、蓖麻油、海狸油、及椰子油；脂肪酸如棕櫚酸、硬脂酸、及亞麻油酸；醇類如甘油及乙醇；及有機酸類如乙酸，但不限於其等。該等碳源可單獨或組合使用。氮源之實例可包括有機氮源如蛋白腖、酵母萃取物、肉汁、麥芽萃取物、玉米漿(CSL)、及豆麵；以及無機氮源如尿素、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨、及硝酸銨。該等氮源可單獨或組合使用。培養基可進一步包括作為磷源之磷酸二氫鉀、磷酸氫鉀、及對應之含鈉鹽類。培養基可包括金屬如硫酸鎂或硫酸鐵。此外，可包括胺基酸類、維生素類及合適的前驅物。培養基或前驅物可添加至為批次培養或連續培養形式的培養中。
此外，培養的pH可藉由於合適方式的培養期間添加化合物如氫氧化銨、氫氧化鉀、氨氣、磷酸、及硫酸而調整。此外，於培養期間使用消泡劑如脂肪酸聚二醇酯可預防泡形成。此外，為了於培養基中維持好氧條件，可將氧氣或含有氧氣的氣體(例如，空氣)添加至培養物。一般而言，培養溫度可為20℃至45℃，且具體地為25℃至40℃。 培養可連續擲到L-甲硫胺酸前驅物的製造達到所期望的程度，且培養時間可為10小時至160小時，但不限於其等。
酵素轉換過程意指藉由使用酵素將L-甲硫胺酸前驅物轉換為L-甲硫胺酸的過程。具體地，使用於酵素轉換過程期間的酵素可為選自胱硫醚-γ-合成酶(cystathionine-γ-synthase)、O-乙醯基高絲胺酸硫化氫解酶(O-acetyl homoserine sulfhydrylase)及O-琥珀醯基高絲胺酸硫化氫解酶(O-succinyl homoserine sulfhydrylase)所成群組之至少一種酵素，但不限於其等。具體地，酵素轉換意指在甲基-硫醇添加至L-甲硫胺酸前驅物或含有該前驅物之醱酵培養基時與酵素反應的過程，但不限於其等。
此外，上述步驟(a)可意指藉由微生物醱酵直接製造L-鉀硫胺酸的步驟。該情況中，使用於醱酵中的微生物意指能製造L-甲硫胺酸的菌株。進一步，如使用於本文，用語「能製造L-甲硫胺酸的菌株」意指於有機體中製造L-甲硫胺酸的原核或真核微生物菌株，且因而亦指能於該菌株中蓄積L-甲硫胺酸的菌株。
例如，該菌株可為微生物菌株屬於埃希氏菌屬(Escherichia sp.)、歐文氏菌屬(Erwinia sp.)、沙雷氏菌屬(Serratia sp.)、普羅威登斯菌屬(Providencia sp.)、棒狀桿菌屬(Corynebacteria sp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)、鉤端螺旋菌屬(Leptospira sp.)、沙門氏菌屬(Salmonellar sp.)、短桿菌屬(Brevibacteria sp.)、生絲單胞菌屬(Hypomononas sp.)、色桿菌屬(Chromobacterium sp.)、土壤絲菌屬(Norcardia sp.)、真菌或酵母菌；具體地，微生物菌株屬於埃希氏菌屬(Escherichia sp.)、棒狀桿菌屬(Corynebacteria sp.)、鉤端螺旋菌屬(Leptospira sp.)、及效母菌；更具體地，微生物菌株屬於埃希氏菌屬(Escherichia sp.)；以及最具體地，該菌株可為大腸菌(Escherichia coli)，但不限於其等。此外，上述菌株可包括揭示於韓國專利第10-1140906號的菌株。
步驟(b)意指乙醯化L-甲硫胺酸的步驟。
乙醯化L-甲硫胺酸的方法可藉由化學合成法、藉由微生物的製造方法、或乙醯化酵素而進行，但不限於此等。此外，所屬技術領域者可由能乙醯化L-甲硫胺酸的任何方法合適的使用及選擇方法。
化學合成法意指注入能乙醯化L-甲硫胺酸的胺基的化合物以於室溫或高溫反應的過程。可使用於L-甲硫胺酸的乙醯化反應的基質材料，可為乙酸酐、以及進一步地，可使用伴有過渡金屬系催化劑的乙酸。此外，為了緩和其中應用非質子溶劑的反應狀況，可使用乙醯基鹵化物作為乙醯化化合物。本發明中，高溫可意指70℃至100℃，以及具體地，80℃至90℃，但不限於其等。
此外，乙醯化可藉由將經純化的乙醯化酵素或表現乙醯化酵素的微生物經破碎的上清液添加至含有L-甲硫胺酸及乙醯輔酶A的混合物。該乙醯化酵素包括能轉換L-甲硫胺酸為N-乙醯基-L甲硫胺酸的乙醯基轉移酶。例如，該以醯化酵素可為L-胺基酸N-乙醯基轉移酶MnaT(YncA)、N-乙醯麩胺酸合成酶(ArgA)、假設性乙醯基轉移 酶(YfaP)、假設性乙醯基轉移酶(YedL)、或假設性乙醯基轉移酶(YjhQ)，但不限於其等。
乙醯化酵素可自大腸菌、棒狀桿菌、或酵母菌獲得，經轉形以表現上述酵素。亦即，大腸菌、酵母菌、或棒狀桿菌係使用編碼乙醯化酵素各者的基因經轉形。之後，經純化的乙醯化酵素可在其轉形株經培養後使用，或藉由在經轉形株破碎後藉由收集上清液而使用。此外，該乙醯化可藉由補充L-甲硫胺酸而誘發，經由使用二甲苯的預處理過程，使菌株中的細胞壁滲透性增加，而無破碎該經轉形菌株。
再者，乙醯化可使用菌株內的乙醯化酵素反應而進行，而該菌株係於對應時間藉由微生物醱酵培養。藉由微生物的直接醱酵可使用野生型菌株，其本質上包括能乙醯化L-甲硫胺酸的酵素；使用具有特徵為乙醯化酵素活性係經由人工突變而增強的突變體；或使用因能誘發L-甲硫胺酸乙醯化的酵素的過度表現而使其改良的經轉形菌株。亦即，可使用製造N-乙醯基-L-甲硫胺酸之具有乙醯化酵素活性的任何微生物而無限制。此外，N-乙醯基-L-甲硫胺酸的製造可能經由乙醯化反應，但不僅使用微生物內生合成的L-甲硫胺酸，亦使用於醱酵期間由外側來源補充的L-甲硫胺酸。
當乙醯化酵素或製造該酵素的微生物係於L-甲硫胺酸的乙醯化過程期間使用時，其可包括補充乙醯輔酶A的步驟。亦即，該步驟可藉由直接補充乙醯輔酶A而進行， 或藉由添加葡萄糖或乙酸而使得足量的乙醯輔酶A可補充至微生物而進行。
本發明係關於藉由醱酵而製備L-甲硫胺酸前驅物，然後以高產率經由酵素轉換過程製備L-甲硫胺酸，或者本發明係關於以各種乙醯化方法製備N-乙醯基-L-甲硫胺酸，在經由醱酵以高產率直接製備L-甲硫胺酸時。因此，本發明建議新的範例，其完全不同於製備石油系N-乙醯基-L-甲硫胺酸的傳統方法。
此外，依本發明，N-乙醯基-L-甲硫胺酸的製造能力可使用具有N-乙醯基-L-甲硫胺酸製造的本質能力的野生型微生物、其人工突變體或其中N-乙醯基-L-甲硫胺酸的製造能力藉由導入乙醯化酵素經改良的經轉形菌株，或轉換反應，藉由直接醱酵可顯著增加。進一步地，基於相同內容，顯現低製造能力的N-乙醯基-L-甲硫胺酸的生物製造方法的效率，亦可顯著改良。
構成該N-乙醯基-L甲硫胺酸的碳至少50%可為衍生自生物資源的碳。例如，構成該來自用於製造N-乙醯基-L甲硫胺酸的方法所製造的N-乙醯基-L甲硫胺酸的碳至少50%，可衍生自O-乙醯基-L-高絲胺酸，其指稱為藉由醱酵生質碳來源所獲得之L-甲硫胺酸前驅物，或O-琥珀醯基-L-高絲銨酸。
N-乙醯基-L-甲硫胺酸含有至少50%的生物衍生碳，因構成元素的基質材料係衍生自生物衍生碳。N-乙醯基-L-甲硫胺酸的分子量為191.25g/mol，以及N-乙醯基-L甲硫 胺酸係由L-高絲胺酸(119.12g/mol)、甲基-硫醇(48.11g/mol)及乙酸(59.04g/mol)構成。在接合期間，L-高絲胺酸的羥基與甲基-硫醇中的氫分開，以及乙酸中的羥基與L-高絲胺酸中的氫分開，以製備最終的N-乙醯基-L-甲硫胺酸。L-高絲胺酸係使用生物資源經由醱酵獲得，且於N-乙醯基-L-甲硫胺酸中具有全分子量的至少50%(L-高絲胺酸119.12g/mol-H2O 18.01g/mol=101.11g/mol，此數值顯示N-乙醯基-L-甲硫胺酸之分子量的至少50%)。此外，當使用乙醯化酵素的情況，N-乙醯基-L-甲硫胺酸中的生物衍生碳的含量將增加，此乃因乙酸亦衍生自生物資源(L-高絲胺酸無H2O 101.11g/mol+乙酸無羥基42.04g/mol=143.15g/mol，其具有N-乙醯基-L-甲硫胺酸的至少75%)。
另一方面，藉由測量其放射性碳可測定該材料是否為生物衍生的或石油衍生的。亦即，碳中存在有三種同位素(12C、13C、14C)，但多數的14C(放射性碳)不存在於石油材料碳源。因此，基於科學事實，14C僅存在於生物衍生碳中，進行14C的含量分析以測定該材料是否為生物衍生。
本發明之另一態樣係關於包括生物衍生碳之生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸。
構成該生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸的碳之50%至100%可為自生物資源衍生的碳。
本發明之再另一態樣係關於生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸的族群，其中構成該生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸的碳之50%至100%係自生物資源衍生的碳。
該生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸可藉由上述製造方法製造。
生物資源、生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸及其製造方法係如上文所述。
另一態樣中，本發明提供生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸或包含其鹽的飼料添加物。
又另一態樣中，本發明提供生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸或包含其鹽的飼料組成物。
該生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸係如上文所述。
如使用於本文，用語「飼料添加物」意指經添加至飼料組成物的材料。飼料添加物可增加對象動物的生產性或改良健康，但不限於其等。
飼料添加物可使用於反芻動物，但不限於其等。
本發明使用N-乙醯基-L-甲硫胺酸或包含其鹽的飼料添加物，其中除了N-乙醯基-L-甲硫胺酸或其鹽以外，該飼料添加物可額外地包括養分，如核苷酸、胺基酸、鈣、磷、有機酸等，用以改良對象動物的生產性或健康，但不限於其等。
如使用於本文，用語「飼料組成物」意指餵食動物的飼料。飼料組成物意指提供有機養分或礦物養分的材料，該等養分為維持動物生命或產肉、乳等所需要者。飼料組成物可包括飼料添加物，且本發明之飼料添加物可根據活體及魚飼料法案管控而可對應於補充飼料。
上述的飼料類型不特別限制，且可使用適合本發明之 所屬技術領域所使用的任何傳統飼料。飼料的非限制性實例包括蔬菜飼料如穀類、根/果實、食品加工副產物、藻類、纖維、醫藥副產物、油類及脂質、澱粉、瓜果及穀類副產物；以及動物飼料如蛋白質、無機材料、油類及脂質、礦物質、單細胞蛋白質、動物浮游生物及食品殘餘物。其等可單獨或二種或更多種組合使用。
可以本發明之飼料組成物施用的動物不特別限定，但可施用至任何種類。例如，飼料組成物可施用至動物，如牛、羊、長頸鹿、駱駝、鹿、山羊等而無限制，且具體地可施用至具有瘤胃的反芻動物。家畜牛可為其代表性實例，但不限於其等。
根據本發明之一具體例，N-乙醯基-L-甲硫胺酸或其鹽可使用作為瘤胃保護肽衍生物，因其藉由瘤胃中的微生物的低降解。因此，N-乙醯基-L-甲硫胺酸或其鹽可有效地使用作為用於反芻動物的飼料添加物，但不限於其等。
如使用於本文，用語「反芻動物的胃」意指可見於某些動物的特殊消化道，且分為由用於反芻的瘤胃、蜂巢胃、瓣胃及皺胃的四個部分所組成。反芻意指其中哺乳動物湧回先前攝取的飼料且將其咀嚼第二次的過程，以及能用於此反芻的胃係稱為反芻動物的胃。因為微生物以共生的方式存活於瘤胃中，該瘤胃具有降解動物通常不消化的植物纖維素的能力，且該經降解的纖維素可使用作為能量。
如使用於本文，用語「反芻動物」意指具有如上述之反芻動物的胃的動物，且包括駱駝科、鼷鹿科、鹿科、長 頸鹿及牛科。然而，駱駝及鼷鹿已知因為瓣胃及皺胃未完全分化而具有三個區的反芻動物的胃。
飼料添加物可添加至飼料組成物以包括N-乙醯基-L-甲硫胺酸或其鹽，相對於該飼料之總重，其量為0.01重量%至90重量%，但不限於其等。
此外，根據本發明之飼料添加物可分開使用；可與傳統的飼料添加物組合使用；以及可與傳統的飼料添加物依序或同時使用。進一步地，飼料添加物可以單一劑量或多劑量投予。明顯的需要完整考量上述因子以投予能以最低量達成最大功效的量，無副作用，以及進一步地，其可由所屬技術領域者輕易地決定。
本發明之另一態樣係關於包括生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸或製造其之微生物的顆粒調配物。
生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸及製造其之微生物與上文所述者相同。
顆粒調配物可藉由自具有N-乙醯基-L-甲硫胺酸的微生物的醱酵培養基直接形成顆粒而製備，或可藉由包括該微生物而製備。此外，顆粒調配物可藉由包括醱酵培養基及微生物二者而製備。所屬技術領域中具有通常知識者可利用合適的選擇實施顆粒的形成過程，但不限於其等。
產物可經由最適化顆粒乾燥器的操作方法以及藉由非標準產物的循環過程而提供，其中，最終產物的粒徑範圍小於或等於500μm為0%至5%；粒徑大於500μm但小於1000μm為20%至30%；粒徑大於1000μm但小於1300μ m為60%至70%；以及粒徑大於1300μm為5%，但不限於其等。
例示性具體例中，本發明提供顆粒調配物的製造方法，包括：濃縮N-乙醯基-L-甲硫胺酸的醱酵培養基至總固體含量40重量%至50重量%；藉由添加及混合選自稀釋劑及游離N-乙醯基-L-甲硫胺酸所成群組之至少一者至該濃縮培養基而形成混合濃縮物；以及注入粒種(其中其尺寸為200μm至500μm)至顆粒中，藉由噴灑混合濃縮物而自顆粒的將低部分包覆粒種，以及藉由增加粒種的尺寸而形成洋蔥型顆粒，藉此粒徑範圍小於或等於500μm為0%至5%，大於500μm但小於1000μm為20%至30%，大於1000μm但小於1300μm為60%至70%，以及大於1300μm為5%。
例如，根據本發明之顆粒調配物可含有N-乙醯基-L-甲硫胺酸的醱酵培養基作為主要成份，而具有組成物的顆粒以及特徵如下述。
N-乙醯基-L-甲硫胺酸含量超過50重量%；粒徑範圍小於或等於500μm為0%至5%，大於500μm但小於1000μm為20%至30%，大於1000μm但小於1300μm為60%至70%，以及大於1300μm為5%(以重量為基準)；表觀密度670±50kg/m3；蛋白質10重量%至15重量%；總糖類少於或等於1重量%； 礦物質少於或等於3重量%；水分少於或等於3重量%。
顆粒產物的最終含量可藉由調控於形成混合濃縮物過程中所添加的游離N-乙醯基-L-甲硫胺酸或賦形劑的量而經調整為所期望的含量。顆粒化可藉由以噴嘴在顆粒的較低部分噴灑混合濃縮物，同時施用熱空氣以形成流動床而實施。
可列化步驟中所獲得的顆粒尺寸可藉由調整混合濃縮物的流動速率、噴嘴壓力或熱空氣的氣流體積而達成。
賦形劑可為選自澱粉、卡拉膠及糖所成群組之至少一者，但不限於其等。
使用於顆粒調配物製造中的製造N-乙醯基-L-甲硫胺酸的微生物可為其藉由GRAS(一般辨識為安全(Generally Recognized as Safe)所分類之微生物。具體地，微生物可為屬於棒狀桿菌屬(Corynebacterium sp.)的微生物，其具有高蛋白質含量，可為屬於耶氏酵母菌屬(Yarrowia sp.)的微生物，其具有高脂質含量，但不限於其等。
微生物的醱酵條件並不特別限定，但其可以於醱酵期間蓄積最大量的N-乙醯基-L-甲硫胺酸而蓄積較少細胞質量的條件培養微生物。此外，糖類於醱酵培養基中預防醱酵培養基的乾燥，且增加所將獲得產物的吸濕性，且因而其可於降低其量的條件下培養微生物。然而，本發明中，N-乙醯基-L-甲硫胺酸的含量可藉由混合過程以及因顆粒化過程的具體特徵使產物得表面緊實而調整。因此，醱酵 條件應不必要限制於上述條件。
本發明中，吸濕性降低功效係無抗吸濕性劑的添加而存在。然而，必要時，可添加氧化矽、聚合物等，特別地液體石蠟，作為抗吸濕性劑。
本發明之另一態樣係關於改良增重或增加動物乳產生、乳脂肪或乳蛋白質的功效的方法，其中該方法包括餵食含有生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸或其鹽的飼料添加物，或餵食飼料組成物。該飼料添加物或飼料組成物係如上文所述。
該方法可具體地包括下列步驟：(a)混合飼料添加物或飼料組成物於動物飼料中；以及(b)將該動物飼料餵食動物。
根據本發明之步驟(a)係用於將包括本發明之N-乙醯基-L-甲硫胺酸或其鹽的飼料組成物與用於豢養動物的正常飼料混合的步驟，且因而可於0.01重量%至90重量%，或具體地0.1重量%至10量%的範圍內混合其等。
根據本發明之步驟(b)係將步驟(a)所製備的飼料餵食動物的步驟，且因而可被餵食的豢養動物不特定地限制為上文所述者，且其可具體為反芻動物。
當根據本發明之飼料添加物或飼料組成物係餵食至動物時，可期待顯著的功效，如增強或增加動物的乳產生、乳脂肪或乳蛋白質，或增加體重的功效。
[實施模式]
下文，本發明將伴隨例示性具體例更詳細 說明。然而，本文所揭示之例示性具體例將為說明的目的且不應解讀為限制本發明之範疇。
實施例
實施例1：生質L-甲硫胺酸的製造
實施例1-1. 製造L-甲硫胺酸前驅物的菌株的醱酵
使用大腸菌CJM-BTJA/pCJ-MetXlme-CL(韓國專利第10-0905381號)進行醱酵槽(5L)的培養大量地製造L-甲硫胺酸前驅物(O-乙醯基高絲胺酸)，該菌株係製造O-乙醯基高絲胺酸的菌株，作為製造L-甲硫胺酸前驅物的菌株。該等菌株接種於含有抗生素的LB平板培養基，然後於31℃培養過夜。接著，將單一純株接種於含有抗生素的LB培養基(10mL)，於31℃培養5小時，然後於含有L-甲硫胺酸的種培養基(200mL)的錐形燒瓶(100mL)中稀釋100倍。此外，於31℃以200rpm的速率培養該種培養基3小時至10小時，然後將種培養物接種於醱酵槽(5L)且使用批次饋料的醱酵方法培養50小時至100小時。製造L-甲硫胺酸之主要醱酵培養基的組成示於下表1。
實施例1-2. L-甲硫胺酸轉換反應
實施例1所製造的醱酵培養基係使用膜過濾器過濾而使得O-乙醯基高絲胺酸培養基與細胞分開。通過使用膜(0.1μm)的液體係命名為滲透物，其為無細胞液體。此外，細胞漿狀物命名為滯留物。
殘留於滯留物中的O-乙醯基高絲胺酸藉由添加去離子水予以再收集。
為了進行酵素轉換，O-乙醯基高絲胺酸硫化氫解酶或紅色假單胞菌(Rhodobacter sphaeroides)-衍生的O-乙醯基 高絲胺酸硫化氫解酶，其為L-甲硫胺酸轉換酵素(韓國專利第10-1250651號)，與甲基硫醇係添加至滲透物作為包括具有O-乙醯基高絲胺酸硫化氫解酶活性之酵素或包括上述酵素的菌株形式。
藉由進行酵素轉換反應6小時，以及此反應藉由測量殘留的O-乙醯基高絲胺酸的濃度，且於反應期間補充甲基硫醇而進行，當不再測得O-乙醯基高絲胺酸的濃度時終止反應。
實施例1-3. L-甲硫胺酸的結晶過程
無任何問題使用L-甲硫胺酸轉換流體本身。然而，為了獲得具有高含量的L-甲硫胺酸的組成物，可藉由濃縮實施例1及2所製備的甲硫胺酸的轉換流體分離晶體，或可於以硫酸調整其pH為4.0至5.5而濃縮結晶。為了獲得高純度的L-甲硫胺酸，此實施例中，添加硫酸調整pH為4.0至5.5，以及然後進一步添加L-甲硫胺酸總量的2重量%的活性碳並於50℃混合2小時。之後，於該等之過濾期間移除活性碳與不純物。濃縮濾液直到L-甲硫胺酸的濃度達到150g/L至200g/L，以及然後使用晶體分開裝置獲得結晶。由分開的晶體所獲的母液再一次濃縮以獲得第二次結晶。此外，溶解該第二次晶體，且然後該經溶解的第二次晶體再次添加至其pH經調整介於4.0及5.5的L-甲硫胺酸的反應液體。此外，上述過程重複使用。因此，獲得95.0重量%至99.969重量%的L-甲硫胺酸。
實施例2：使用化學合成方法合成N-乙醯基 -L-甲硫胺酸
將實施例1所製備之L-甲硫胺酸(20g,0.134mol)置於燒瓶(250mL)以使其與乙酸乙酯(30g)混合，且藉由攪拌該燒瓶(250mL)中之溶液以製備懸浮條件的L-甲硫胺酸溶液。當攪拌30分鐘後，L-甲硫胺酸顆粒均勻分散，添加濃硫酸(0.133g，98.5%)及蒸餾水(0.666g)，上述反應物的部分係轉換為漿態而由反應物萃取白色晶體。此時，持續攪拌，將能乙醯基化L-甲硫胺酸的胺基的化合物如乙酸酐(14.4g，0.141mol，以及97%)緩慢注入其中，且對配備有冷凝管的燒瓶施加熱。當施加熱且使用冷卻器維持冷凝管溫度低於0℃，經揮發的乙酸乙酯係經由冷凝管回流至燒瓶。此時，反應物的溫度維持於83℃。當反應進行20分鐘，漿態中反應物的顏色緩慢轉換為具有透明黃色液體。此時，收集反應物且快速將其冷卻。
當反應產物經強力攪拌1小時至2小時，液體中形成白色的N-乙醯基-L-甲硫胺酸晶體。此外，當白色晶體完全形成時，使用真空過濾器移除黃色的上清液。所收集的N-乙醯基-L-甲硫胺酸使用於0℃經冷卻的乙酸乙酯清洗，然後，使用真空過濾器再次純化。之後，所收集的N-乙醯基-L-甲硫胺酸使用減壓乾燥裝置在-0.1Mpa於50℃乾燥1小時。觀察到所收集的N-乙醯基-L-甲硫胺酸的質量時為19.448g(純化產率=77.8%)，以及亦觀察到藉由HPLC分析所鑑定的純度為95.8%，殘留L-甲硫胺酸的純度為0.6%。
此外，使用化學合成方法之N-乙醯基-L-甲 硫胺酸之生質含量的評估，該分析係基於美國專利第8946472號中之「生質含量」的測量方法進行。再者，生質含量係使用下式推衍。
生質含量=14C/12C比率樣品/14C/12C比率現狀/1.075
由化學合成所製造之N-乙醯基-L-甲硫胺酸中之平均生質含量的評估結果觀察到為51.9%。
實施例3：L-甲硫胺酸基於酵素反應之N-乙醯基-L-甲硫胺酸轉換
N-乙醯基-L-甲硫胺酸轉換研究係基於使用L-甲硫胺酸的酵素反應進行。
為了藉由乙醯基化酵素反應製造N-乙醯基-L-甲硫胺酸，使用惡臭假單孢菌(Pseudomonas putida)-衍生的N-乙醯基轉移酶(ppmat)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)-衍生的N-乙醯基轉移酶(bsmat)、腸內菌屬(Enterobacter sp.638)-衍生的N-乙醯基轉移酶(entmat)、假弧菌屬(Pseudovibrio sp.,FO-BEG1)-衍生的N-乙醯基轉移酶(pvmat)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)-衍生的N-乙醯基轉移酶(y1mat)、麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)-衍生的N-乙醯基轉移酶(cgmat)、以及大腸菌(Escherichia coli)-衍生的N-乙醯基轉移酶(YncA)酵素。該N-乙醯基轉移酶酵素自乙醯基-CoA通過乙醯基作用至受質。該酵素性反應可經由酵素施用，如N-乙醯基麩胺酸合成酶(ArgA)、推定的乙醯基轉移酶(YjdJ)、推定的乙醯基轉移酶(YfaP)、推定的乙醯基轉移 酶(YedL)、以及推定的乙醯基轉移酶(YjhQ)，以及進一步地可與其中基於序列的同一性高的具有乙醯基轉移酶的其他能力的酵素一起施用。
編碼N-乙醯基轉移酶的7種類型的DNA片段的製備中，係分別製備於各端具有各限制酵素位點，NdeI及XbaI，該等DNA片段接合至經以相同限制酵素處理的pUCtk載體。上述所製備的重組載體的轉形至大腸菌DH5 α中，然後將所得平板培養於含有卡納黴素的LB平板培養基，且於37℃培養隔夜。所得純株之一者接種至含有卡納黴素之液體LB培養基(3mL)且培養隔夜後，使用Plasmid Miniprep Kit(Bioneer公司，韓國)獲得重組質體。所得重組質體的序列資訊系藉由定序(Macrogen公司，韓國)確認，且各重組質體係分別名為pUCtk-ppmat、pUCtk-bsmat、pUCtk-entmat、pUCtk-pvmat、pUCtk-ylmat、pUCtk-cgmat及pUCtk-yncA。
其中經導入重組質體的經轉形大腸菌BL21(DE3)係於含有卡納黴素的LB平板培養基選擇。經選擇的轉形株係分別名為BL21(DE3)/pUCtk-ppmat、BL21(DE3)/pUCtk-bsmat、BL21(DE3)/pUCtk-entmat、BL21(DE3)/pUCtk-pvmat、BL21(DE3)/pUCtk-ylmat、BL21(DE3)/pUCtk-cgmat及BL21(DE3)/pUCtk-yncA。
所製備之轉形株，BL21(DE3)/pUCtk-ppmat、BL21(DE3)/pUCtk-bsmat、BL21(DE3)/pUCtk-entmat、BL21(DE3)/pUCtk-pvmat、BL21(DE3)/pUCtk-ylmat、BL21(DE3)/pUCtk-cgmat 及BL21(DE3)/pUCtk-yncA之各純株之一者係接種至含有卡納黴素(25mg/L)及1%葡萄糖(w/v)的液體LB培養基(3mL)，且於37℃培養8小時(種培養)。之後，種培養液各者接種於相同培養基(50mL)且培養隔夜。離心培養基以獲得團塊，將所得物懸浮於磷酸鹽緩衝液(pH 7.0，50mM，5mL)，然後藉由音振處理破碎細胞。細胞碎片藉由於14,000rpm離心30分鐘移除以獲得上清液。咸信乙醯基轉移酶的大小接近19kDa，酵素濃度係經由序列過濾獲得，通過Amicon Ultra(Millipore,Ireland)30-kDa截留膜，然後再過濾經由10-kDa截留膜且於過濾器獲得殘餘濃縮物。濃縮物填充至經填充Q sepharose的HiTrap Q FF管柱(GE,USA)且乙醯基轉移酶係使用NaCl濃度梯度(80、100、150、200、300、500mM順序)單純分離。經稀釋酵素經由Amicon Ultra 10-kDa截留膜再濃縮。乙醯基轉移酶的過度表現及純化係使用SDS-PAGE確認。為了測定經由經純化乙醯基轉移酶之N-乙醯基-L-甲硫胺酸的生產性，酵素濃縮物添加至含有乙醯基-CoA(20mM)及甲硫胺酸(20mM)的磷酸鹽緩衝液(pH 7.0，50mM)。允許於37℃反應1小時候，使用HPLC測量所產生的N-乙醯基-L-甲硫胺酸的量。
由上述結果，觀察到L-甲硫胺酸藉由乙醯基轉移酶轉換為N-乙醯基-L-甲硫胺酸。轉換反應不僅可利用經稀釋於緩衝溶液的L-甲硫胺酸，亦可利用自醱酵所產生的培養基與酵素轉換反應中未經純化的L-甲硫胺酸。另一方面，可能為經由添加葡萄糖或乙酸以補充乙醯基轉移酶產生細菌中之乙醯基-CoA的充足量的代謝工程方案，且N-乙醯基-L-轉移酶的產率係藉由醱酵過程改良。
使用生質L-甲硫胺酸的乙醯基化方法的實例應了解係作為例示性，且不意圖限制本發明。亦即，本發明之用於製造生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸的方法係藉由醱酵生質原始材料而以高產率製造L-甲硫胺酸，且經由各 種乙醯基化過程使用容易及簡單的方式製造N-乙醯基-L-甲硫胺酸。上述實例為實施該等之代表性。
實施例4：使用N-乙醯基轉移酶經誘發的轉形株製造N-乙醯基-L-甲硫胺酸
將轉形株BL21(DE3)/pUCtk-ppmat、BL21(DE3)/pUCtk-bsmat、BL21(DE3)/pUCtk-entmat、BL21(DE3)/pUCtk-pvmat、BL21(DE3)/pUCtk-ylmat、BL21(DE3)/pUCtk-cgmat及BL21(DE3)/pUCtk-yncA(實施例3中所製備者)中之各純株之一者，接種於含有卡納黴素(25mg/L)及1%葡萄糖的液體LB培養基(3mL)且於37℃培養8小時。之後，將培養基(500μL)接種至含有卡納黴素(25mg/L)、1%葡萄糖及2%甲硫胺酸(w/v)的液體LB培養基(50mL)，然後培養隔夜。其中經插入標靶基因的pUCtk載體，係經轉形作為對照。培養基中的細胞經由離心移除，然後使用HPLC分析所製造的N-乙醯基-L-甲硫胺酸。
其結果，BL21(DE3)/pUCtk-ppmat製造的N-乙醯基-L-甲硫胺酸為高濃度3.03g/L，以及BL21(DE3)/pUCtk-entmat製造的N-乙醯基-L-甲硫胺酸為次高濃度2.23g/L。於對照中偵測到微量的N-乙醯基-L-甲硫胺酸，且其係推測對照中的N-乙醯基-L-甲硫胺酸係由本質表現於大腸菌的YncA酵素所製造。此外，觀察到YncA過度表現於野生型大腸菌時，相較於對照者，N-乙醯基-L-甲硫胺酸的製造增加(表3)。
此外，為了評估以經轉形大腸菌為基礎所製造之N-乙醯基-L-甲硫胺酸的生物衍生含量，以美國專利第8946472的「生質含量」的測量方法為基礎進行分析。評估的結果，由經轉形大腸菌所製造之N-乙醯基-L-甲硫胺酸的平均生質含量確認為76.6%。
因此，確認L甲硫胺酸可藉由化學合成過程、乙醯基化酵素或製造該等酵素之微生物而乙醯基化，且具體地確認可藉由乙醯基化酵素反應而環境友善的以高效率製造生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸。
實施例5：經由經轉形L甲硫胺酸製造菌株 的醱酵之N-乙醯基-L-甲硫胺酸的製造
實施例5-1. 使用製造L甲硫胺酸及其酵素轉換功效之菌株之直接醱酵
使用大腸菌TF4076BJF metA#10+metYX(Lm)(韓國專利第10-1140906號；後文稱為metA10YXLm)作為製造L甲硫胺酸的菌株，進行錐形燒瓶培養以製造L-甲硫胺酸。該等菌株係接種於LB平板培養基，且於31℃培養隔夜。然後所形成之單一純株接種於種培養基(10mL)，且於31℃培養6小時。之後，該種培養基(1mL)接種於含有主要醱酵培養基(20mL)的錐形燒瓶(250mL)，且於31℃以200rpm培養78小時。種培養基及主要醱酵培養基的組成係揭示下述表4。
使用培養基中L-甲硫胺酸濃度的分析結果，製造6.6g/L的L-甲硫胺酸。
此外，N-乙醯基-L-甲硫胺酸的製造係使用乙醯基轉移酶與藉由L甲硫胺酸製造菌株之醱酵所直接製造的L-甲硫胺酸而進行。評估係藉由施用對應於實施例3者之方法所獲得的經純化乙醯基轉移酶而進行，且試驗係 藉由使用由直接醱酵所獲得的培養基中的L-甲硫胺而進行。亦即，乙醯輔酶A(20mM)與L-甲硫胺酸的直接醱酵培養基與磷酸鹽緩衝液(pH 7.0,50mM)混合，且於其中添加酵素濃縮物。之後，經混合的L-甲硫胺酸溶液於37℃反應1小時，使用HPLC測量由其所製造的N-乙醯基-L-甲硫胺酸的量，以及試驗結果示於下文。
雖然對於自上述實施例中直接醱酵所製造的L-甲硫胺酸的培養基評估製造N-乙醯基-L-甲硫胺酸的能力，N-乙醯基-L-甲硫胺酸的製造亦可使用對應於實施例3之直接醱酵所製造之L-甲硫胺酸之經純化粉末。
實施例5-2. 自其中N-乙醯基轉移酶係經導入之製造L-甲硫胺酸的菌株(直接製造N-乙醯基-L-甲硫胺酸的菌株)衍生的轉形株的醱酵之N-乙醯基-L-甲硫胺酸的製造
經由醱酵之N-乙醯基-L-甲硫胺酸的直接製造，係藉由利用大腸菌TF4076BJF metA#10+metYX(Lm)(韓國專利第10-1140906號；後文稱為metA10YXLm)作為製造L-甲硫胺酸的菌株而達成。分別導入由實施例3所製備重組質體，pUCtk-ppmat、pUCtk-bsmat、pUCtk-entmat、pUCtk-pvmat、pUCtk-ylmat、pUCtk-cgmat及pUCtk-yncA，以及自經轉形的大腸菌metA10YXLm所衍生的轉形株，係自含有卡納黴素的LB平板培養基選擇。所選擇的轉形株分別命名為metA10YXLm/pUCtk-ppmat、metA10YXLm/pUCtk-bsmat、metA10YXLm/pUCtk-entmat、metA10YXLm/pUCtk-pvmat、metA10YXLm/pUCtk-ylmat、metA10YXLm/pUCtk-cgmat及metA10YXLm/pUCtk-yncA。經轉形菌株係根據實施例5-1所揭示的醱酵條件進行培養與分析。分析的結果，metA10YXLm/pUCtk-ppmat製造最高濃度8.32g/L之N-乙醯基-L-甲硫胺酸，而metA10YXLm/pUCtk-entmat製造第二高濃度6.19g/L之N-乙醯基-L-甲硫胺酸(表6)。
此外，為了改良N-乙醯基-L-甲硫胺酸的直接製造，藉由自外側來源補充額外的L甲硫胺酸，進行所製備的轉形株的比較性評估。為此，2%的L-甲硫胺酸額外地添加於醱酵條件。由分析結果確認轉形株的N-乙醯基-L-甲硫胺 酸製造增加，且具體地確認已顯現N-乙醯基-L-甲硫胺酸最高製造的metA10YXLm/pUCtk-ppmat菌株，無添加L-甲硫胺酸，亦顯現N-乙醯基-L-甲硫胺酸最高製造(14.1g/L)(表6)。關於該等結果，當N-乙醯基-L-甲硫胺酸係使用其中製造L-甲硫胺酸的能力進一步經改良的菌株時可期待增加的製造量，以及同時，N-乙醯基-L-甲硫胺酸的增加製造可藉由自外側來源補充L-甲硫胺酸而期待。特別地，野生形大腸菌具有本質的YncA酵素，且因而顯現微量的製造N-乙醯基-L-甲硫胺酸(實施例4)。然而，確認其中製造L-甲硫胺酸的能力係經增加的製造N-乙醯基-L-甲硫胺酸的菌株，於對照中顯現N-乙醯基-L-甲硫胺酸的增加製造。咸信該增加製造係起因於菌株中所製造的L-甲硫胺酸，或起因於自外側來源所補充的L-甲硫胺酸。
此外，對於使用直接醱酵所製造之N-乙醯基-L-甲硫胺酸的生物衍生含量的評估，係根據美國專利第8946472號中的「生質含量」的方法進行分析。由評估結果確認，使用直接醱酵所製造之N-乙醯基-L-甲硫胺酸的平均生質含量為99.3%。
實施例6：藉由瘤胃微生物群之體外醱酵的生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸的繞道功效測試
6-1. 瘤胃液體的收集
提供一隻裝設有瘤胃套管(ruminal cannula)的荷仕登(Holstein)牛(重量約630kg至650kg)用於試驗目的，以及該荷仕登牛係藉由每天二次餵食商用飼料(MilkgenTM,CJ CheilJedang)及稻稈(7：30a.m.，3：00a.m.)哺育。
瘤胃液體的收集係於試驗日的10a.m.進行。經由套管移除瘤胃中的內容物，以及胃液藉由擠壓而以紗網抽出。之後，所抽出的胃液置於真空燒瓶，且以CO2冒泡處理。然後將含有胃液的真空燒瓶阻絕氧的滲透而攜至實驗室。於1小時內將瘤胃液體攜至實驗室。
6-2. 厭氧培養的進行
攜至實驗室的瘤胃液利用兩層紗網過濾後，藉由將其與通常使用於體外瘤胃繞道測試的McDougall's緩衝液(Troelsen and Donna，1966)的生物模擬溶液，以1：3的比率混合而使用作為厭氧培養基。McDougall's緩衝液的生物模擬溶液的組成係示於下表7。
使用於試驗的飼料為商用飼料(MilkgenTM)，實質上使用於牛哺育的飼料，且該飼料亦使用作為基礎膳食。進一步地，試驗樣品係藉由混合基礎膳食與測試料而製備。使用於試驗的測試材料為N-乙醯基-L-甲硫胺酸，且其使用作為試驗組1。試驗組1係與僅由基礎膳食組成且無測試材料的對照組1相比較，且亦與由測試材料，L-甲硫胺酸所組成的對照組2相比較。對於各試驗組進行三重複的培養。
基礎膳食與測試材料係以4：1(基礎膳食(0.4g)，測試材料(0.1g)；但於對照組1僅有0.5g的基礎膳食)的比率混合。當經混合的測試化合物(0.5g)添加於培 養瓶(125mL)時培養開始，以及然後將其與所製備的厭氧培養基(50mL)混合，且將其等緘封後置於40℃培養箱。
無O2的CO2於整個過程中噴灑，包過瘤胃液稀釋直到培養開始，使得瘤胃液不暴露於氧。因此，維持厭氧條件。
6-3. 測試材料之體外瘤胃繞道效率的取樣及測量結果
培養最終進行48小時，且自培養開始總共進行取樣培養基四次(0小時、24小時；36小時、48小時)。各取樣時，將置於40℃培養箱中的樣品自培養箱移出且打開其蓋。之後，藉由將培養基於4000rpm離心10分鐘獲得上清液後，測量上清液中存在的測試材料的量。
基於測試材料的HPLC定量分析的結果，計算瘤胃繞道率(%)，以及計算結果示於下表8。
繞道率(%)係以0小時時間點的測試材料的量為基礎(100%)，於24小時、36小時及48小時的時間點表現為殘留量(%)。第1圖顯示瘤胃繞道率(%)。
其結果，相較於0小時時間點的繞道率，對照組L-甲硫胺酸顯現48小時後的瘤胃繞道率(%)為1.5%，且因而確認多數解由瘤胃中的微生物消化。此外，相較於0小時時間點的繞道率，測試材料N-乙醯基-L-甲硫胺酸顯現瘤胃繞道率(%)於24小時後為89.1%，36小時後為76.2%，以及 甚至48小時後為55.4%。
實施例7：通過體外小腸及肝臟之抽出物測量生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸的消化性試驗
不由瘤胃中的微生物所降解的營養素係於小腸中吸收，使其可使用於蛋白質合成、能量代謝等。對於N-乙醯基-L-甲硫胺酸，期望以高的繞道率到達小腸。因此，其可藉由存在於小腸及肝臟的消化酵素轉換為甲硫胺酸，且因而可容易地於反芻動物的小腸中吸收。為此理由，存在於牛小腸及肝臟的酵素接受觀察N-乙醯基-L-甲硫胺酸的潛在消化降解。
實施例7-1. 自小腸獲得抽出物
購買於國家農業合作協會之釜山畜養動物產品所屠宰的韓國原生牛(紀錄編號：KOR005078680400)的小腸(40m)。將小腸切為約1m後，20mM的磷酸鈉緩衝液(pH 7.4，5mL)添加於經切斷的小腸。之後，一邊握持小腸的各端，一邊將小腸重複搖擺以有助於小腸中的多數酵素藉由磷酸鈉緩衝液溶解。藉此操作，由小腸(40m)獲得約200mL的酵素溶液，且藉由於4℃、於14,000rpm離心10分鐘獲得上清液後，將所得物稀釋2倍於磷酸鈉緩衝液(pH 7.4)。
實施例7-2. 自肝臟獲得抽出物
購買於國家農業合作協會之釜山畜養動物產品所屠宰的韓國原生牛(記錄編號：KOR005078680400)的肝臟。將肝臟組織(0.125g)與20mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.4,1mL)混合後，將玻璃珠粒(Sigma G1145)填充約管(2mL)的1/10。 細胞組織使用珠磨機(MPTM FastPrep)以每次20秒破碎3次，且所得物於4℃、於14,000rpm離心10分鐘以獲得上清液。
實施例7-3. 自小腸及肝臟所獲得的抽出物的酵素活性的評估
為確認自小腸及肝臟所獲得的抽出物的酵素活性，使用自豬腎臟抽出的醯化酶I(sigma A3010)。已知N-乙醯基-L-甲硫胺酸可藉由醯化酶I良好地降解(Chem.Res.Toxicol.1998,11(7)：800-809)。經由與醯化酶I比較相對活性，觀察到藉由小腸及肝臟的抽出物之N-乙醯基-L-甲硫胺酸的消化降解速率。試驗條件與示於下表9者相同，且反應於40℃進行24小時。
為了移除反應結束之樣品中的蛋白質，於其中添加過氯酸(0.5%)且稀釋10倍。之後，存在於上清液的N-乙醯基-L-甲硫胺酸及L-甲硫胺酸(其藉由於14,000離心10分鐘而分開)進行定量分析(HPLC)。藉由比較反應前之N-乙醯基-L-甲硫胺酸與反應後之L-甲硫胺酸之間的莫耳濃度(mM)計算轉換率(%)，以百分比表示(%)(N-乙醯基-L-甲硫胺酸的分子量：191.25g/L；以及L-甲硫胺酸的分子量：149.25g/L)。
關於分析的結果，觀察到醯化酶I顯現高的消化降解率(98.9%，莫耳轉換率)，其類似於文獻中的降解率。類似地，亦觀察到使用小腸抽出物的反應(97.5%莫耳轉換率)及使用肝臟抽出物的反應(99.1%莫耳轉換率)顯現非常高的消化降解率。
關於結果，自上述實施例，N-乙醯基-L-甲硫胺酸於小腸及肝臟的抽出物的體外反應中轉換為L-甲硫胺酸。由此結果，當N-乙醯基-L-甲硫胺酸到達小腸時，多數的N-乙醯基-L-甲硫胺酸於小腸中藉由消化酵素轉換為L-甲硫胺酸，且其可解讀為微量未降解的N-乙醯基-L-甲硫胺酸於小腸中被吸收，經由血液流入肝臟且轉換為L-甲硫胺酸。其表示提供N-乙醯基-L-甲硫胺酸作為飼料添加物可直接利用作為L-甲硫胺酸，其於反芻動物體中實質上使用作為胺基酸。
實施例8：藉由小腸及肝臟的抽出物之N-乙醯基-L-甲硫胺酸及N-乙醯基-D,L-甲硫胺酸的體外消化降解率的比較評估
實施例8-1. 藉由小腸及肝臟之抽出物的消化降解率評估
根據N-乙醯基-L-甲硫胺酸的光學異構物的消化降解率的比較評估係使用自實施例7所獲得之小腸及肝臟的抽出物進行。評估係以與實施例7-3的相同方式進行評估，且評估結果示於下文。
於小腸及肝臟的抽出物的體外反應中，含有約50%D-型的N-乙醯基-D,L-甲硫胺酸的約46%係藉由小腸的抽出物轉換為L-甲硫胺酸，而N-乙醯基-D,L-甲硫胺酸的約50%係藉由肝臟的抽出物轉換為L-甲硫胺酸。亦即，於體內，光學異構物中，相較於N-乙醯基-D-甲硫胺酸(D-型)，N-乙醯基-L-甲硫胺酸(L-型)的消化降解率顯著為高。此外，由上述結果，其可解讀為相對於使用N-乙醯基-L-甲硫胺酸時，當使用N-乙醯基-D,L-甲硫胺酸時，其顯現顯著低的消化降解率。
實施例9：經由餵食N-乙醯基-L-甲硫胺酸之乳組成的分析
基於體外評估，已觀察到其於小腸中的高消化降解率及於瘤胃中的繞道率的N-乙醯基-L-甲硫胺酸係利用乳牛經由實質評估進行其功效的確認。為此，將牛分為二個不 同群，且於評估期間根據N-乙醯基-L-甲硫胺酸的存在或不存在分析乳組成中的變化。為此，將8頭牛分為2組使得各組分別由4頭牛組成。此外，將N-乙醯基-L-甲硫胺酸添加至飼料組成物(表12)，其餵食於1組中的4頭牛(每日每頭牛30g的N-乙醯基-L-甲硫胺酸)，且進行84日。
-組1：無添加N-乙醯基-L-甲硫胺酸
-組2：添加N-乙醯基-L-甲硫胺酸
測試乳牛之乳組成的分析結果示於下表13。
如上述具體評估所示，未觀察到根據N-乙醯基-L-甲硫胺酸之存在或缺乏之總飼料攝取的變化(乾材料攝取，DMI)。然而，利用添加N-乙醯基-L-甲硫胺酸觀察到乳脂肪(12.2%)及乳蛋白質(3.5%)的增加。此外，相較於無添加N-乙醯基-L-甲硫胺酸，能量校正乳(ECM)增加 6.7%。進一步地，飼料效率(ECM產率/DMI)亦增加8.3%。亦即，如上述結果可見，例如乳中脂肪及蛋白質的增加，以及飼料效率的增加，係於對乳牛利用添加N-乙醯基-L-甲硫胺酸作為飼料添加物中觀察到。
實施例10：經由餵食N-乙醯基-L-甲硫胺酸之增重功效的分析
證實肉牛之經由餵食N-乙醯基-L-甲硫胺酸的增重功效。為了證實，24頭肉牛分為2組，使各組由12頭肉牛組成。之後，N-乙醯基-L-甲硫胺酸的存在或缺乏觀察增重功效90日。在添加N-乙醯基-L-甲硫胺酸的組中，各肉牛每日餵食N-乙醯基-L-甲硫胺酸(30g)。
基礎飼料組成物係與表12所示者相同，以及藉由評估之增重功效係示於下文。
如自肉牛的評估可觀察到，當進一步對肉牛餵食N-乙醯基-L-甲硫胺酸時觀察到約132.9kg的增重功效，且此對應於與未餵食N-乙醯基-L-甲硫胺酸者為16.5kg的額外增重。此外，相較於未添加N-乙醯基-L-甲硫胺酸者，平均每日增重亦顯示約14.7%的改良功效。亦即，由上述結果可知，各種功效，如乳牛的牛乳中的脂肪含量及蛋白質含量的增加，以及餵食效率的增加，不僅藉由施用N-乙醯基-L-甲硫胺酸的飼料添加(實施例9)觀察到，亦於肉牛的增重改良功效觀察到。基於該等結果，確認N-乙醯基-L-甲硫胺酸使用作為各種反芻動物之飼料添加物的可能性。
實施例11：對於生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸的醱酵培養基的製備
實施例11-1. 使用麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)之N-乙醯基-L-甲硫胺酸之醱酵培養基的製備
此實施例中，具有製造N-乙醯基-L-甲硫胺酸之本質能力的麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum(ATCC13032))於含有L甲硫胺酸的培養基(1L)(組成(以1L為基準)：L-甲硫胺酸(20g)、葡萄糖(20g)、蛋白腖(10g)、酵母萃取物(10g)、尿素(5g)、KH2PO4(4g)、K2HPO4(8g)、MgSO4．7H2O(0.5g)、生物素(100μg)、鹽酸硫胺素(1,000μg))中，於pH 6.0至8.0的範圍，於35℃培養72小時。因此，獲得其中N-乙醯基-L-甲硫胺酸的濃度為1.07g/L的醱酵培養基。
實施例11-2. 使用解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)之N-乙醯基-L-甲硫胺酸之醱酵培養基的製備
此實施例中，具有製造N-乙醯基-L-甲硫胺酸之本質能力的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica PO1f)(ATCC MYA-2613TM)，於含有L甲硫胺酸的培養基(1L)(組成(以1L為基準)：L-甲硫胺酸(20g)、葡萄糖(20g)、Na2HPO4(3.28g)、NaH2PO4(3.22g)、酵母萃取物(2g)、蛋白朊-蛋白腖(50g))中，於pH 6.0至8.0的範圍，於30℃培養72小時。因此，獲得其中N-乙醯基-L-甲硫胺酸的濃度為1.02g/L的醱酵培養基。
對於含有L-甲硫胺酸的培養基，其增加N-乙醯基-L-甲硫胺酸的製造，且可使用自微生物醱酵所製造的L-甲硫胺酸的母液。
實施例12：來自醱酵培養基之直接顆粒化
醱酵培養基或其濾液係濃縮至總固體含量為40重量%至60重量%，且pH經調整介於3.5及3.6。該pH調整係使用硫酸進行，且於pH調整後，使濃縮物於60℃靜置2.5小時。在gDNA降解過程後，使用底噴灑方法，將濃縮物經由造粒器(GR Engineering，Fluid Bed Spray Dryer Batch type Pilot)的較低噴嘴注入造粒器。用於操作造粒器的條件係如下述：加熱器溫度(170℃)、入口溫度(140℃至160℃)、出口溫度(60℃至70℃)及噴灑壓力(1.8bar至2.0bar)。用於顆粒化的種係藉由噴灑乾燥方法製備，且其尺寸為300μm。經注入造粒器的濃縮物藉由熱空氣乾燥，且然後將 其固化。之後，其尺寸藉由新注入的濃縮物而於流動於流體床中而增加。當顆粒尺寸達所期望尺寸時，停止顆粒器的操作，以及收集產物用以分析產物的組成及其含量。
由此實施例所獲得之麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)-醱酵培養基之顆粒及解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)-醱酵培養基之顆粒的特徵係示於下表15。
實施例13. 藉由添加游離N-乙醯基-L-甲硫胺酸至醱酵培養基之含量調整
於相同於實施例11的條件下，由醱酵培養過程所製造之醱酵培養基濃縮至總固體含量為40重量%至60重量%。進一步地，於混合槽中對其添加游離N-乙醯基-L-甲硫胺酸，且混合。之後，根據實施例12之相同條件形成顆粒。
使用麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)及解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)所獲得之最終產物的特徵係示於下表16。結果，可獲得具有增加的蛋白含量及脂肪含量的顆粒產物。
實施例14. 藉由對醱酵培養基添加稀釋劑之含量調整
濃縮醱酵培養基後，經溶解0.5L的水且所得為具有9.0%水分含量之玉米澱粉(0.22kg)，經添加於混合槽中作為稀釋劑，然後混合。醱酵培養基的濾液係於減壓下藉由濃縮方法濃縮至固體含量為50.5重量%，以及使用根據實施例12的相同條件形成顆粒。
使用麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)及解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)所獲得之最終產物的特徵係示於下表17。
因此，本發明所製備之N-乙醯基-L-甲硫胺酸由於瘤胃中的微生物所降解的N-乙醯基-L-甲硫胺酸量相較於L-甲硫胺酸為相對小而可顯示高的繞道率。此外，N-乙醯基-L-甲硫胺酸顯現高的消化降解率，以及觀察到因 對乳牛實質上餵食N-乙醯基-L-甲硫胺酸之乳脂肪及乳蛋白質改良。該等結果建議基於本發明的製備方法所製備之N-乙醯基-L-甲硫胺酸可非常有用於用為反芻動物的飼料添加物。此外，相較於石油衍生的材料，藉由對反芻動物餵食生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸可獲得環境友善功效。
由上述說明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者將能了解本發明可為具體化為其他形式而不改變本發明之技術概念或基本特徵。關於此點，本文所揭示之例示性具體例僅為說明目的且不應侷限本發明之範疇。另一方面，本發明係意圖不僅涵蓋例示性具體例，亦涵蓋如隨附之申請專利範圍所界定之本發明的精神與範疇內之各種替代性、修飾、均等及其他具體例。

Claims (9)

  1. 一種用於製造生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸的方法，包含：(a)(i)藉由微生物醱酵製造L-甲硫胺酸的前驅物；以及(ii)藉由酵素轉換自該L-甲硫胺酸的前驅物製造L-甲硫胺酸；以及(b)使用N-乙醯基轉移酶或產生N-乙醯基轉移酶的微生物乙醯化該L-甲硫胺酸，其中，該N-乙醯基轉移酶係選自由惡臭假單孢菌(Pseudomonas putida)-衍生的N-乙醯基轉移酶(ppmat)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)-衍生的N-醯基轉移酶(bsmat)及腸內菌屬(Enterobacter sp.638)-衍生的N-醯基轉移酶(entmat)所成群組。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該L-甲硫胺酸的前驅物為O-乙醯基-L-高絲胺酸或O-琥珀醯基-L-高絲胺酸。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該酵素轉換係藉由選自胱硫醚-γ-合成酶(cystathionine-γ-synthase)、O-乙醯基高絲胺酸硫化氫解酶及O-琥珀醯基高絲胺酸硫化氫解酶所成群組之至少一種酵素而進行。
  4. 一種用於製造生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸的方法，包含：(a)藉由微生物醱酵製造L-甲硫胺酸；以及(b)使用N-乙醯基轉移酶或產生N-乙醯基轉移酶的微生物乙醯化該L-甲硫胺酸，其中，該N-乙醯基轉移酶係選自由惡臭假單孢菌(Pseudomonas putida)-衍生的N-乙醯基轉移酶(ppmat)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)-衍生的N-醯基轉移酶(bsmat)及腸內菌屬(Enterobacter sp.638)-衍生的N-醯基轉移酶(entmat)所成群組。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之方法，進一步包含於步驟(b)補充乙醯輔酶A(乙醯基-CoA)。
  6. 一種用於製造生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸的方法，包含藉由製造N-乙醯基-L-甲硫胺酸之具有N-乙醯基轉移酶活性的微生物的直接醱酵而製造生質該N-乙醯基-L-甲硫胺酸，其中，該N-乙醯基轉移酶係選自由惡臭假單孢菌(Pseudomonas putida)-衍生的N-乙醯基轉移酶(ppmat)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)-衍生的N-醯基轉移酶(bsmat)及腸內菌屬(Enterobacter sp.638)-衍生的N-醯基轉移酶(entmat)所成群組。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之方法，包含於微生物醱酵期間對培養基補充生質L-甲硫胺酸。
  8. 如申請專利範圍第1、4及6項中任一項所述之方法，其中構成該生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸的碳的50%至100%係衍生自生物資源的碳。
  9. 一種用於改良動物之乳製造、乳脂肪或乳蛋白、或增重功效的方法，包含對動物餵食包含如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之方法所製造之生質N-乙醯基-L-甲硫胺酸或其鹽的飼料添加物或飼料組成物。
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