RU2662949C1 - Способ получения нативного симбиотического препарата - Google Patents
Способ получения нативного симбиотического препарата Download PDFInfo
- Publication number
- RU2662949C1 RU2662949C1 RU2017112818A RU2017112818A RU2662949C1 RU 2662949 C1 RU2662949 C1 RU 2662949C1 RU 2017112818 A RU2017112818 A RU 2017112818A RU 2017112818 A RU2017112818 A RU 2017112818A RU 2662949 C1 RU2662949 C1 RU 2662949C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cultivation
- nutrient medium
- preparation
- culture fluid
- concentration
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 51
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 31
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 19
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims abstract description 13
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 13
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 26
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 16
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 16
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 16
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 8
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 8
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims description 7
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 6
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 6
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 6
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 5
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 5
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 5
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 4
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 claims description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 2
- 238000009331 sowing Methods 0.000 claims description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000033116 oxidation-reduction process Effects 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 56
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 17
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 15
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 4
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 3
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 3
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 235000019621 digestibility Nutrition 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 2
- 230000000384 rearing effect Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000012365 batch cultivation Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- -1 essential ones) Chemical class 0.000 description 1
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 239000003324 growth hormone secretagogue Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 244000005709 gut microbiome Species 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000006180 nutrition needs Nutrition 0.000 description 1
- 210000004798 organs belonging to the digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения симбиотического препарата предусматривает засев штаммом Escherichia coli VL-613 питательной среды на основе перевара Хоттингера. Осуществляют концентрирование бактериальной суспензии с последующим смешиванием с защитной средой в заданном соотношении с последующей фасовкой во флаконы. При этом окислительно-восстановительный потенциал культуральной жидкости поддерживают в течение 75 мин – (-160) - (-60) мВ, парциональное давление растворенного кислорода в культуральной жидкости - на уровне 15 ±5 % от насыщения кислорода воздуха. Изобретение позволяет сократить продолжительность культивирования и повысить накопление жизнеспособных микробных клеток. 4 табл., 5 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологии и зоотехнии и может быть использовано при промышленном производстве симбиотического препарата на основе штамма Escherichia coli VL-613.
Способ получения препарата заключается в том, что глубинное культивирование Escherichia coli проводят в питательной среде в соответствии с разработанным алгоритмом управления процессом, полученную культуру концентрируют, бактериальную массу ресуспендируют в защитной среде для сохранения биологических свойств симбиотического препарата и расфасовывают во флаконы.
Разработанный способ позволяет получать комплекс незаменимых аминокислот: аспарагиновую, треонин и лизин, сократить время культивирования, повысить накопление жизнеспособных микробных клеток, улучшить качество биопрепарата, повысить стабильность и стандартность его биологических свойств.
В настоящее время одной из актуальных задач животноводства является обеспечение населения страны экологически чистыми продуктами питания. Доля свинины в общем объеме производства мяса занимает второе место после мяса птицы и составляет 33%.
Увеличение производства свинины достигается за счет увеличения поголовья, использования высокопродуктивных пород и интенсификации технологий содержания и кормления животных. Наиболее эффективным способом откорма для получения высококачественной свинины считается дорогостоящий комбикорм, однако полноценное кормление зачастую не является достаточным для достижения высокой продуктивности. Поэтому немаловажную роль при производстве свинины играет ускорение роста животных за счет использования стимуляторов роста.
Стимуляторы роста - вещества, способствующие увеличению мясной продуктивности животных сверх той, которая обеспечена полноценным сбалансированным кормлением. Широкое использование в качестве стимуляторов получили антибиотики. Однако применение антибиотических стимуляторов роста даже при субтерапевтических дозах продолжительное время может привести к селекции резистентных по отношению к антибиотикам штаммов бактерий у животных, подвергнутых стимуляции, кроме того, антибиотики, которые подавляют патогенную микрофлору, также угнетают и полезные микроорганизмы, участвующие в процессах пищеварения.
Еще одним из распространенных стимуляторов роста в свиноводстве является применение синтетических аминокислот в качестве добавок к кормам, основным недостатком которых служит дороговизна ввиду их производства в основном за границей.
Альтернативой использования антибиотиков и синтетических аминокислот как стимуляторов могут стать симбиотики, которые помогают развитию организма животного и повышают возможности его по перевариванию и наиболее полной усвояемости питательных веществ корма, повышая экономическую рентабельность откорма и полностью удовлетворяя пищевые потребности животных на разных этапа жизни.
Симбиотики - продукты биотехнологического производства, содержащие живые микроорганизмы, продуцирующие в желудочно-кишечном тракте животных аминокислоты (в том числе незаменимые), ферменты и витамины.
В последние годы ученые расширили и детализировали знания об участии представителей микрофлоры желудочно-кишечного тракта в различных функциях и реакциях организма. Они способны оказывать выраженное воздействие на процессы гомеостаза организма хозяина, участвовать в регулировании обменных, эндокринных и иммунных процессов. Даже незначительные изменения в составе микрофлоры кишечника животного отражаются на других органах пищеварения и организме в целом.
Современный подход к разработке пробиотических препаратов подразумевает, во-первых, применение различных видов микроорганизмов в определенных сочетаниях, во-вторых, выпуск их в форме, допускающей длительное хранение при обычной температуре, и, в-третьих, не теряющих своих свойств при внесении их в процессе производства кормов и кормовых добавок.
Большая группа пробиотиков производится с использованием метода лиофильной сушки субстрата живых активных бактерий. Препараты выпускают в форме порошка, таблеток, капсул или свечей. Эти формы имеют длительные сроки годности и не требовательны к непродолжительным изменениям температуры хранения. Существенным их недостатком является то, что процесс лиофилизации приводит бактерии в анабиоз (неактивное состояние). Для возвращения в активное физиологическое состояние им требуется 8-10 ч, а за это время уже большая часть бактерий выводится из организма животных. Поэтому необходимо разработать такие условия лиофилизации, которые позволяют сохранять наибольший процент жизнеспособных клеток после высушивания.
Кроме того, в процессе лиофилизации бактериальные клетки теряют специфические рецепторы, которые помогают им закрепляться на поверхностях клеток, поэтому их пребывание в кишечнике еще более снижается.
При производстве нативных (жидких) пробиотиков микробные клетки остаются в активном состоянии и способны к адгезии и колонизации желудочно-кишечного тракта уже в первые часы после попадания в организм. Жидкие формы препаратов содержат дополнительный лечебный фактор - продукты метаболизма активных форм живых бактерий, часть из которых (например - ферменты) могут разрушаться в процессе сублимационного высушивания. Кроме того, они на 30-40% дешевле сухих форм. Недостатком нативных (жидких) форм препаратов являются трудности с их хранением и транспортировкой.
Известны способы культивирования бактерий рода Escherichia, которые проводятся на жидких [1] и плотных [2] питательных средах.
Однако способ культивирования эшерихий на плотных питательных средах является нетехнологичным и малопродуктивным - культуру эшерихий выращивают в течение 24 ч в чашках Петри на твердой питательной среде. Культивирование в жидких питательных средах проводится без регулирования основных технологических параметров - окислительно-восстановительного потенциала, количества растворенного в культуральной жидкости кислорода и длительностью - в течение 24 - 48 ч.
Известен также способ получения кормовой добавки, содержащей культуру штамма Е. coli - продуцент лизин [3]. Однако в данном случае выращивание эшерихий проводится в неуправляемом режиме - без регулирования окислительно-восстановительного потенциала, количества растворенного в культуральной жидкости кислорода, длительностью 6-12 ч, что не позволяет получить стабильную по биологическим свойствам культуру.
Также известна технология получения симбиотического препарата «Пролизэр» на основе штамма Escherichia coli VL-613, при которой среда высушивания готовится по следующей прописи: концентрация основных компонентов: желатин - 2,0%; сахароза - 10,0%, в качестве растворителя - калий-фосфатный буфер [4].
Известен ближайший аналог (прототип) заявляемого способа [5], включающий засев штамма Escherichia coli VL-613, культивирование в жидкой питательной среде на основе перевара Хоттингера, концентрирование бактериальной суспензии с последующим смешиванием со стабилизатором, расфасовку и лиофилизацию препарата; при этом в процессе культивирования Е. coli VL-613 сразу после засева окислительно-восстановительный потенциал снижают до минус (80-100) мВ, после чего до окончания процесса культивирования рО2 поддерживают на уровне (20±5)% от насыщения кислородом воздуха, рН регулируют на уровне (7,0-7,4), а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации (0,1-0,2)% при лимитировании роста Escherichia coli VL-613 глюкозой, длительность процесса культивирования составляет 4-6 ч.
Однако в данном случае препарат выпускается только в сухом виде и является продуцентом только одной незаменимой аминокислоты - лизина.
Задачей изобретения является повышение качества целевого продукта за счет получения культуры симбиотических бактерий с высокой выживаемостью и биологической активностью и возможностью длительного хранения.
Технический результат изобретения достигается в способе получения нативного симбиотического препарата путем включения в состав заявляемого препарата в качестве микроорганизмов бактериальной массы штамма Escherichia coli VL - 613, а культивирование проводят течение 4-6 ч в жидкой питательной среде, дополнительно содержащей пептон, натрий фосфорнокислый двузамещенный и дрожжевой экстракт, при следующем соотношении компонентов, мас. %: перевар Хоттингера - 12,0-5,0; пептон - 0,8-1,2; натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,7-0,9; хлористый натрий - 0,7-0,9; глюкоза - 0,15-0,25; дрожжевой экстракт - 0,4-0,6; вода дистиллированная - до 100,0, причем после засева ферментера окислительно-восстановительный потенциал культуральной жидкости поддерживают в течение 75 мин (-160) - (-60) мВ, при перемешивании с оборотами мешалки в пределах (40-80) об/мин, далее в процессе культивирования поддерживается парциональное давление растворенного кислорода в культуральной жидкости на уровне (15±5)% от насыщения кислородом воздуха, дробная подача глюкозы осуществляется дозированно, до концентрации (0,15-0,2)% от объема питательной среды, причем с целью длительного хранения вводят в концентрат бактериальной культуры при соотношении 1:1-2 защитную среду, содержащую: желатин - 0,3 мас. %; сахароза - 10,0 мас. %; глицерин - 0,6 мас. %, хитозан пищевой - 2 мас. % и вода - до 100 мас. %.
В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие режимы способа получения нативного симбиотичского препарата, аналогичные заявляемому, т.е. предложение соответствует критерию «новизны».
Все режимы способа осуществимы в промышленных условиях, направлены на решение реальной технической задачи, т.е. предложение «промышленно применимо».
Впервые предложен способ изготовления нативного симбиотического препарата, где повышается качество целевого продукта за счет того, что: культивирование проводят в оптимизированной питательной среде в соответствии с разработанным алгоритмом управления процессом, концентрируют полученную культуру и ресуспендируют в защитной среде; осуществлением управляемого периодического процесса культивирования и эффективной защитной среды. Заявляемый препарат обладает высокой профилактической эффективностью при определенных условиях, т.е. предложение соответствует критериям «новизна» и «изобретательский уровень».
Способ осуществляют следующим образом.
За прототип технологии производства жидкого симбиотического препарата были взяты питательная среда и процесс культивирования, приведенные в патенте RU №2450051 (5).
Для этого в стерильный ферментер, который снабжен системой автоматического контроля и регулирования основных технологических параметров (температура, обороты мешалки, рН, рО2, еН), вносят жидкую питательную среду на основе перевара Хоттингера, приготовленную по следующей прописи, мас. %:
- перевар Хоттингера - 18,0-22,0;
- пептон - 0,8-1,2;
- натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,7-0,9;
- хлористый натрий - 0,7-0,9;
- глюкоза - 0,15-0,25;
- дрожжевой экстракт - 0,4-0,6;
- вода дистиллированная - до 100,0.
Глюкозу в виде 40% стерильного раствора добавляют в ферментер после стерилизации питательной среды и охлаждения реактора до 30-40°С. Готовая стерильная питательная среда содержит 160-180 мг % аминного азота и имеет рН 7,4-7,6 ед. рН.
В ферментер с питательной средой, разогретой до (37±1)°С, вносят 18-24-часовую матровую расплодку эшерихий, выращенную в жидкой питательной среде такого же состава, что и среда культивирования, в соотношении 5-10% от объема питательной среды в ферментере, и выращивают при (37±1)°С в течение 4-7 ч.
После засева ферментера окислительно-восстановительный потенциал (еН) культуральной жидкости поддерживают (-100) - (-80) мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха на аэрацию и выключенной мешалке, после чего до окончания процесса культивирования с помощью изменения расхода воздуха на аэрацию и скоростью вращения мешалки поддерживают парциональное давление растворенного кислорода (рО2) в культуральной жидкости на уровне (20±5)% от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости регулируют на уровне (7,2-7,4) ед. рН подачей 10%-ного раствора NaOH, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозированно, до конечной концентрации в питательной среде 0,1-0,2%. Общая концентрация эшерихий по окончании культивирования составляет (10-16) млрд м.к./см3. После завершения процесса культивирования образцы культуральной жидкости и исходной питательной среды проверяют на содержание свободных аминокислот (табл. 1).
Как видно из представленных данных, в результате культивирования штамма Escherichia coli в питательной среде данного состава существенных изменений в составе аминокислот, кроме лизина, в питательной среде и в культуральной жидкости после выращивания штамма Е. coli не произошло. Отмечено незначительное понижение содержания большинства аминокислот в культуральной жидкости, что свидетельствует об активном процессе их утилизации штаммом Е. coli, с одной стороны, и их избытком в питательной среде, с другой.
Поэтому в разрабатываемой эффективной питательной среде по совершенствованию ростовых качеств среды снижено количество аминного азота на 30% с тем, чтобы нивелировать избыток аминокислот и стимулировать бакмассу к их ферментации. После снижения аминного азота состав усовершенствованной питательной среды принял следующий вид:
- перевар Хоттингера - 12,0-15,0;
- пептон - 0,8-1,2;
- натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,7-0,9;
- хлористый натрий - 0,7-0,9;
- глюкоза - 0,15-0,25;
- дрожжевой экстракт - 0,4-0,6;
- вода дистиллированная - до 100,0.
Проведя культивирование штамма в новой питательной среде по описанной выше методике, отобраны образцы культуральной жидкости, исходной питательной среды и они проверены на содержание аминокислот. Полученные результаты аминокислотного анализа подтвердили предположение о необходимости сокращения азотсодержащих питательных веществ в среде. Изготовленные на новой питательной среде четыре образца жидкого симбиотического препарата также проверены на содержание аминокислот. Среднеарифметические показатели аминокислотного состава данных серий препарата и исходных питательных сред, используемых для их изготовления, представлены в таблице 2.
Как следует из представленных данных, в результате культивирования штамма Escherichia coli в питательной среде усовершенствованного состава в культуральной жидкости существенно повысилось содержание аспарагиновой кислоты, треонина и лизина.
В ферментер с питательной средой, разогретой до (37±1)°С, вносят 18-24-часовую матровую расплодку эшерихий из флаконов, выращенную в жидкой питательной среде такого же состава, что и среда культивирования, в соотношении 5-10% от объема питательной среды в ферментере, и выращивают при (37±1)°С в течение 4-6 ч.
После засева ферментера окислительно-восстановительный потенциал (еН) культуральной жидкости поддерживают в течение 75 мин (-160) - (-60) мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха на аэрацию и перемешивании с оборотами мешалки в пределах 40-80 об/мин, после чего до окончания процесса культивирования с помощью изменения расхода воздуха на аэрацию и скоростью вращения мешалки поддерживают парциональное давление растворенного кислорода (рО2) в культуральной жидкости на уровне (15±5) % от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости регулируют на уровне (7,2-7,4) ед. рН подачей 10%-ного раствора NaOH, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозировано, до концентрации (0,15-0,2)% от объема питательной среды. Общая концентрация эшерихий по окончании культивирования составляет (12-20) млрд м.к./см3.
Полученную бактериальную культуру концентрируют, осадок смешивают с защитной средой сохранения жидкого симбиотического препарата при соотношении 1:1-2. Защитная среда имеет состав: желатин - 0,3%; сахароза - 10,0%; глицерин - 0,6%, хитозан пищевой - 2% и вода - до 100 мас. %. Хитозан пищевой соответсвует ТУ 9289-067-00472124-01 (Изменение №1) «Хитозан пищевой».
После тщательного перемешивания смешанную с защитной средой бактериальную суспензию расфасовывают с соблюдением условий асептики в стерильные флаконы.
Пример 1. В ферментер с питательной средой, разогретой до (37±1)°С, вносили 18-24-часовую матровую расплодку эшерихий из флаконов, выращенную в жидкой питательной среде такого же состава, что и среда культивирования, в соотношении 5-10% от объема питательной среды в ферментере, и выращивали при (37±1)°С в течение 4 ч. еН культуральной жидкости поддерживают - 160 мВ; рО2 поддерживают на уровне 10%; рН в культуральной жидкости регулируют на уровне 7,2 ед. рН; дробная подача глюкозы осуществляется дозами до концентрации 0,15%.
Культивирование - в течение 4 ч. Накопление - 12,0 млрд м.к./см3.
После окончания процесса культивирования биомассу охлаждают до температуры 6°С и центрифугируют при частоте оборотов 3500 об/с, в течение 15 мин. Концентрирование бакмассы E.coli осуществляли с помощью лабораторных центрифуг К-70Д, S-60 и установки «Сартокон-мини» («Владисарт», г. Владимир). Суспензию клеток отделяют от культуральной жидкости и смешивают с защитной средой в соотношении 1:1-2. Защитная среда имеет состав: желатин - 0,3%; сахароза - 10,0%; глицерин - 0,6%, хитозан пищевой - 2% и вода - до 100%. Суспензию разливают дозаторами в стерильные флаконы. Флаконы укупоривают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. Срок хранения при этой температуре составляет шесть месяцев. При этом срок хранения жидкого препарата не менее 6 месв, а сохраняемость жизнеспособных клеток выше на 15-17%, чем у прототипа, и выше эффективность применения.
Пример 2. Способ получения препарата с оптимальными значениями параметров
В ферментер с питательной средой, разогретой до (37±1)°С, вносили 18-24-часовую матровую расплодку эшерихий из флаконов, выращенную в жидкой питательной среде такого же состава, что и среда культивирования, в соотношении 5-10% от объема ПС в ферментере, и выращивали при (37±1)°С в течение 5 ч. еН культуральной жидкости поддерживают - 100 мВ; рО2 поддерживают на уровне 15%; рН в культуральной жидкости регулируют на уровне 7,3 ед. рН; дробная подача глюкозы осуществляется дозами до концентрации 0,175%. Культивирование - в течение 5 ч.
Накопление - 22,0 млрд м.к./см3. Затем способ получения препарата ведут по примеру 1. При этом срок хранения жидкого препарата не менее 6 месяцев, а сохраняемость жизнеспособных клеток выше на 15-17%, чем у прототипа, и выше эффективность применения.
Пример 3. Способ получения препарата с максимальными значениями параметров
В ферментер с питательной средой, разогретой до (37±1)°С, вносили 18-24-часовую матровую расплодку эшерихий из флаконов, выращенную в жидкой питательной среде такого же состава, что и среда культивирования, в соотношении 5-10% от объема ПС в ферментере, и выращивали при (37±1)°С. еН культуральной жидкости поддерживают - 60 мВ; рО2 поддерживают на уровне 20%; рН в культуральной жидкости регулируют на уровне 7,4 ед. рН; дробная подача глюкозы осуществляется дозами до концентрации 0,2%.
Культивирование - в течение 6 ч. Накопление - 18,0 млрд м.к./см3. Затем способ получения препарата ведут по примеру 1. При этом срок хранения жидкого препарата - до 6 месяцев, а сохраняемость жизнеспособных клеток выше на 15-17%, чем у прототипа, и выше эффективность применения.
Пример 4. Способ получения препарата со значениями параметров ниже минимальных
В ферментер с питательной средой, разогретой до (37±1)°С, вносили 18-24-часовую матровую расплодку эшерихий из флаконов, выращенную в жидкой питательной среде такого же состава, что и среда культивирования, в соотношении 5-10% от объема питательной среды в ферментере, и выращивали при (37±1)°С. еН культуральной жидкости поддерживают - 170 мВ; рО2 поддерживают на уровне 5%; рН в культуральной жидкости регулируют на уровне 7,1 ед. рН; дробная подача глюкозы осуществляется дозами до концентрации 0,125%.
Культивирование - в течение 3 ч. Накопление - 6,0 млрд м.к./см3. Затем способ получения препарата ведут по примеру 1. При этом срок хранения жидкого препарата - до 3 мес, эффективность применения через 6 мес хранения не соответствует прототипу.
Пример 5. Способ получения препарата со значениями параметров выше максимальных
В ферментер с питательной средой, разогретой до (37±1)°С, вносили 18-24-часовую матровую расплодку эшерихий из флаконов, выращенную в жидкой питательной среде такого же состава, что и среда культивирования, в соотношении 5-10% от объема питательной среды в ферментере, и выращивали при (37±1)°С. еН культуральной жидкости поддерживают - 50 мВ; рО2 поддерживают на уровне 25%; рН в культуральной жидкости регулируют на уровне 7,5 ед. рН; дробная подача глюкозы осуществляется дозами до концентрации 0,225%.
Культивирование - в течение 7 ч. Накопление - 17,0 млрд м.к./см3. Затем способ получения препарата ведут по примеру 1. При этом срок хранения жидкого препарата - до 4 месяцев, а эффективность применения через 6 мес хранения не соответствует прототипу.
Технологические параметры изготовления симбиотического препарата из штамма Escherichia coli VL-613, указанные в примерах, приведены в таблице 3.
Препарат, приготовленный по примерам 1-3, содержит на конец срока годности 85-95% жизнеспособных клеток и соответствует требованиям технических условий, тогда как препарат, приготовленный по примерам 4 и 5, содержит 65-70% жизнеспособных клеток и является малоэффективным для применения.
Для определения эффективности жидкого симбиотического препарата в таблице 4 представлены данные по влиянию добавок симбиотических препаратов на прирост живой массы поросят. В каждой группе было по 30 поросят-отъемышей и свиней на доращивании, взвешивание производили на 60, 80, 100 и 120-й день доращивания, рацион кормления был одинаковый.
Как следует из таблицы 4, живая масса опытных животных, которым давали жидкий препарат, превышала живой вес контрольных животных и тех, кому давали сухой препарат. При этом она была достоверно выше за весь цикл выращивания поросят по сравнению с прототипом. Заявляемый препарат позволяет обеспечить синтез незаменимых аминокислот в организме поросят в наиболее ответственный период жизни, когда пищеварительная система отличается наибольшей уязвимостью и незрелостью. Использование заявляемого препарата не повлияло отрицательно на сохранность поросят и конверсию корма.
Преимущества способа изготовления нативного препарата на основе штамма Е. coli VL-613 по разработанной технологии:
1. Применение разработанной питательной среды и процесса культивирования симбиотического нативного препарата на основе штамма Е. coli VL-613 позволяет получать комплекс незаменимых аминокислот: аспарагиновую, треонина и лизина, сократить время культивирования до 4-6 ч, повысить накопление бакмассы, жизнеспособность бактерий и эффективность от применения.
2. Использование жидкого препарата снижает расход корма на весь цикл выращивания.
Источники информации
1. Патент РФ №2175351 от 27.01.2001.
2. Патент РФ №2189253 от 09.04.2001.
3. Патент РФ №2347807 от 27.02.2009.
4. Павленко И.В., Самуйленко А.Я., Еремец В.И. и др. Разработка технологии производства симбиотического препарата Пролизэр на основе штамма Escherichia coli VL-613, часть 1, часть 2. // Вестник Казанского технологического университета Т16, - №9, - 2013, - стр. 171-180.
5. Патент РФ №2450051 от 18.08.2010 г. (прототип).
6. ТУ 9289-067-00472124-01 (Изменение №1) «Хитозан пищевой.
Claims (1)
- Способ получения нативного симбиотического препарата на основе штамма Escherichia coli VL - 613, включающий засев, культивирование в жидкой питательной среде на основе перевара Хоттингера, концентрирование бактериальной суспензии с последующим смешиванием с защитной средой, сохранение и расфасовку препарата, отличающийся тем, что культивирование проводят течение 4-6 ч в жидкой питательной среде, дополнительно содержащей пептон, натрий фосфорнокислый двузамещенный и дрожжевой экстракт, при следующем соотношении компонентов, мас. %: перевар Хоттингера - 12,0-15,0; пептон - 0,8-1,2; натрий фосфорнокислый двузамещенный - 0,7-0,9; хлористый натрий - 0,7-0,9; глюкоза - 0,15-0,25; дрожжевой экстракт - 0,4-0,6; вода дистиллированная - до 100,0, причем после засева ферментера окислительно-восстановительный потенциал культуральной жидкости поддерживают в течение 75 мин (-160) - (-60) мВ, при перемешивании с оборотами мешалки в пределах 40-80 об/мин, в процессе культивирования поддерживается парциональное давление растворенного кислорода в культуральной жидкости на уровне 15±5 % от насыщения кислородом воздуха, дробная подача глюкозы осуществляется дозированно, до концентрации 0,15-0,2 % от объема питательной среды, причем с целью длительного хранения вводят в концентрат бактериальной культуры при соотношении 1:1-2 защитную среду, содержащую: желатин - 0,3%; сахароза - 10,0%; глицерин - 0,6%, хитозан пищевой - 2% и вода - до 100%.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017112818A RU2662949C1 (ru) | 2017-04-14 | 2017-04-14 | Способ получения нативного симбиотического препарата |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017112818A RU2662949C1 (ru) | 2017-04-14 | 2017-04-14 | Способ получения нативного симбиотического препарата |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2662949C1 true RU2662949C1 (ru) | 2018-07-31 |
Family
ID=63142401
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017112818A RU2662949C1 (ru) | 2017-04-14 | 2017-04-14 | Способ получения нативного симбиотического препарата |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2662949C1 (ru) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2450051C1 (ru) * | 2010-08-18 | 2012-05-10 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности РАСХН | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СИМБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ Escherichia coli VL-613 |
-
2017
- 2017-04-14 RU RU2017112818A patent/RU2662949C1/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2450051C1 (ru) * | 2010-08-18 | 2012-05-10 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности РАСХН | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СИМБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ Escherichia coli VL-613 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| САМУЙЛЕНКО А.Я. и др. Моделирование и оптимизация технологии производства симбиотического препарата "СИМБИОХИТ", Вестник Казанского Технологического Университета, 2014, т. 17, N 8, с. 219-223. * |
| ШКОЛЬНИКОВ Е.Э. и др. Разработка технологии производства симбиотического препарата на основе E. coli VL-613. Материалы VI Международной конференции, посвященной 55-летию ВНИИФБиП, г. Боровск, 15-17 сентября 2015, с.219-221. * |
| ШКОЛЬНИКОВ Е.Э. и др. Разработка технологии производства симбиотического препарата на основе E. coli VL-613. Материалы VI Международной конференции, посвященной 55-летию ВНИИФБиП, г. Боровск, 15-17 сентября 2015, с.219-221. САМУЙЛЕНКО А.Я. и др. Моделирование и оптимизация технологии производства симбиотического препарата "СИМБИОХИТ", Вестник Казанского Технологического Университета, 2014, т. 17, N 8, с. 219-223. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103583880B (zh) | 南美白对虾微生物发酵饲料 | |
| RU2576200C1 (ru) | Способ получения биологически активной кормовой добавки для сельскохозяйственных животных и птицы с пробиотиком и белком насекомых | |
| CN106538869A (zh) | 一种乳猪饲料 | |
| CN1771831A (zh) | 一种饲料级微生物添加剂及其制备与应用 | |
| CN110269146A (zh) | 一种应用于饲料上的微生态制剂 | |
| CN114651915B (zh) | 一种用于制备提高免疫力促进生长的后生元的方法及应用 | |
| CN110982750A (zh) | 一种沼泽红假单胞菌高密度发酵方法及其应用 | |
| Aleksandrova et al. | Intestinal microbiocenosis and fodder digestibility in broiler chickens when using probiotics | |
| CN105285399A (zh) | 一种仔猪用液态复合微生态制剂及其制备方法 | |
| Xatamov et al. | THE USE OF INNOVATIVE METHODS IN FEEDING KARAKUL SHEEP | |
| CN107043724B (zh) | 一种地衣芽孢杆菌及其分离方法与应用 | |
| RU2347807C1 (ru) | Штамм escherichia coli - продуцент лизина, способ получения кормовой добавки, содержащей данный штамм, композиция, полученная этим способом, и способ кормления моногастричных животных и птиц | |
| RU2546880C2 (ru) | Способ получения кормового пробиотического препарата для сельскохозяйственных животных | |
| CN106035988B (zh) | 一种畜禽用精氨酸活性肽粉的生产方法 | |
| RU2662949C1 (ru) | Способ получения нативного симбиотического препарата | |
| CN107058181B (zh) | 一种枯草芽孢杆菌及其分离方法与应用 | |
| RU2450051C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СИМБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ Escherichia coli VL-613 | |
| RU2652155C1 (ru) | Способ производства функционального кормового продукта для сельскохозяйственных животных | |
| CN104894028A (zh) | 一种渔用海洋微生态制剂及其制备方法 | |
| CN109486704A (zh) | 一种颗粒状水产养殖复合微生物菌剂及其生产方法 | |
| CN103621792A (zh) | 一种含l-赖氨酸复合益生菌的饲料添加剂及其制备方法 | |
| CN109486713B (zh) | 一种液态复合乳酸杆菌制剂及其制备方法与应用 | |
| CN106689798B (zh) | 海洋合生元添加剂及其制备方法与在刺参养殖中的应用 | |
| RU2758880C1 (ru) | Способ получения биопрепарата для коррекции метаболизма у поросят-сосунов | |
| RU2786910C1 (ru) | Способ производства функционального кормового продукта для сельскохозяйственных животных |