CN108603206A - 生物基n-乙酰基-l-蛋氨酸及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及生物基N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸及其产生方法。此外，本申请涉及含有N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸的饲料添加剂，含有所述饲料添加剂的饲料组合物，以及饲养动物的方法，所述方法包括将含有N‑乙酰基‑L‑蛋氨酸的饲料添加剂或含有所述饲料添加剂的饲料组合物饲喂给动物。

Description

生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸及其用途
技术领域
本申请涉及生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸及其制备方法。另外，本申请涉及包含生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸的饲料添加剂和饲料组合物。
背景技术
为了维持生命、形成新的组织以及继续进行产生乳、肉、蛋等的活动，必须给动物连续供应足够的体外提供的营养物质。因此，除了动物饲料之外，通过直接饲喂动物氨基酸、必需营养元素，已经进行了许多尝试来提高诸如收获率和肉质的特征。然而，由反刍动物消化的大部分氨基酸中的60％至70％是通过反刍胃(更具体而言是瘤胃)中的微生物的消化过程而自主消耗，而一些未消化的氨基酸仅在小肠中被消化或吸收。因此，虽然在反刍动物的饲料中添加了氨基酸，但不能获得诸如养猪和养家禽的效果，因此，有必要开发瘤胃保护型氨基酸，其绕过瘤胃，同时能够被反刍动物消化。
也就是说，在反刍动物的饲料中加入氨基酸的情况下，所述氨基酸必须被吸收并安全到达小肠，同时避免被瘤胃中的微生物降解。因此，最近突出强调了瘤胃防护效果的必要性或改进的绕过瘤胃的新技术及其材料。
另一方面，尽管N-乙酰基-L-蛋氨酸是已知用于食品添加剂或动物饲料的材料，由于其制备成本高，对N-乙酰基-L-蛋氨酸的需求受到限制。此外，其常规制备方法使用源自石油的材料，这相应地导致有限资源的消耗和环境问题(美国专利第7960575号)。
N-乙酰基-L-蛋氨酸的常规制备方法的具体实例是指通过乙酰化L-蛋氨酸来产生N-乙酰基-L-蛋氨酸的方法，其中L-蛋氨酸是从由石油通过化学合成制备的D/L-蛋氨酸分离的。然而，它具有的一些缺点在于从D/L-蛋氨酸混合物中仅分离出L-蛋氨酸需要高成本。
此外，已经发现了直接发酵方法(美国专利第8143031号)，其中L-型可以通过在产蛋氨酸菌株中过表达乙酰化酶而获得。然而，通过DTNB分析，这种方法间接证实YncA可以使用乙酰辅酶A(乙酰-CoA)，但尚未证实N-乙酰基-L-蛋氨酸是否基本上制备为酶反应产物或该基因转化体产生的产物。此外，由于该方法成本高以及低产率，该方法难以商业化。
发明内容
技术问题
为了开发产生N-乙酰基-L-蛋氨酸的方法，本申请的发明人进行了广泛的研究，其中该方法由于在整个过程中产生的二氧化碳较少而利于保护环境，同时具有高效率和经济可行性。结果，本申请的发明人通过乙酰化生物基L-蛋氨酸，以高产率产生了生物基L-蛋氨酸，并在经济上开发了其产生方法，且没有环境污染的担心。从而完成了本申请。
技术方案
本申请的一个目的是提供产生生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸的方法，其包括：(a)(i)通过微生物发酵产生L-蛋氨酸前体；(ii)通过酶促转化从L-蛋氨酸前体产生L-蛋氨酸；和(b)乙酰化L-蛋氨酸。
本申请的另一目的是提供产生生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸的方法，其包括：(a)通过微生物发酵产生L-蛋氨酸；和(b)乙酰化L-蛋氨酸。
本申请的又一目的是提供产生生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸的方法，包括通过发酵产生N-乙酰基-L-蛋氨酸、具有乙酰化酶活性的微生物，直接产生生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸。
本申请的又一目的是提供包括源自生物资源的碳的生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸。
本申请的另一个目的是提供生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸的群体，其中构成所述群体的碳中的50％至100％是源自生物资源的碳。
本申请的另一目的是提供包含生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸或其盐的饲料添加剂。
本申请的另一目的是提供包含生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸或其盐的饲料组合物。
本申请的另一目的是提供提高动物的产乳量、乳脂或乳蛋白、或增重效果的方法，包括饲喂饲料添加剂或饲料组合物。
发明有益效果
使用生物资源进行本申请的产生生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸的方法，因此不仅造成较少的环境污染，而且以高产率经济地产生N-乙酰基-L-蛋氨酸。因此，该方法可以在工业中非常有效地使用。特别是，通过该方法产生的N-乙酰基-L-蛋氨酸作为饲料添加剂显示出显著的效果，因为N-乙酰基-L-蛋氨酸能够绕过瘤胃。
附图简要说明
图1图示了N-乙酰基-L-蛋氨酸的过瘤胃率(％)。
实施发明的最佳方式
为了实现上述目的，本申请的一个方面是用于产生生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸的方法，其包括(a)(i)通过微生物发酵产生L-蛋氨酸前体；和(ii)通过酶促转化由L-蛋氨酸前体产生L-蛋氨酸；以及(b)乙酰化L-蛋氨酸。
本申请的另一个方面是产生生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸的方法，其包括(a)通过微生物发酵产生L-蛋氨酸；和(b)乙酰化L-蛋氨酸。
如本文所用，术语“生物基”是指源自生物资源的材料。术语“生物资源”包括可由光合作用产生的各种藻类和植物资源获得的所有材料，即，树、草、作物分支、叶、根、果实等，特别是指石油资源以外的环保资源。
本申请的产生N-乙酰基-L-蛋氨酸的方法是代替使用石油来源材料而通过发酵生物碳源来高效率地产生L-蛋氨酸前体的方法，以及由其产生N-乙酰基-L-蛋氨酸(NALM)的方法。因此，该方法作为一种环保且经济的方法在工业上非常有效。
在下文中，将更详细地描述本申请的产生N-乙酰基-L-蛋氨酸的方法。
步骤(a)包括：(i)通过微生物发酵来产生L-蛋氨酸前体；和(ii)通过酶促转化从L-蛋氨酸前体产生L-蛋氨酸。
L-蛋氨酸前体是指在通过发酵生物碳源而产生的材料中可以被转化成L-蛋氨酸的化合物，并且可以指O-乙酰基-L-高丝氨酸或O-琥珀酰基-L-高丝氨酸，但不限于此。
用于上述发酵的微生物是指能够产生L-蛋氨酸前体的菌株。此外，如本文所用，术语“能够产生L-蛋氨酸前体的菌株”是指在生物体中产生L-蛋氨酸前体的原核或真核微生物菌株，并且还指能够在其中积累L-蛋氨酸前体的菌株。能够产生L-蛋氨酸前体的菌株可以指产生O-琥珀酰基-L-高丝氨酸或O-琥珀酰基-L-高丝氨酸的菌株。
例如，菌株可以包括属于以下物种的微生物菌株：埃希氏菌(Escherichia sp.)、欧文氏菌(Erwinia sp.)、沙雷氏菌(Serratia sp)、普罗威登斯菌(Providencia sp.)、棒状杆菌(Corynebacteria sp.)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)、钩端螺菌(Leptospirasp.)、沙门氏菌(Salmonellar sp.)、短杆菌(Brevibacteria sp.)、Hypomononas sp.、色杆菌(Chromobacterium sp.)、诺卡氏菌(Norcardia sp.)、真菌或酵母；具体而言，菌株可以是属于埃希氏菌、棒状杆菌、钩端螺旋体和酵母菌的微生物菌株；更具体地，它可以是属于埃希氏菌的微生物菌株；最具体而言，菌株可以是大肠杆菌，但不限于此。
另外，上述菌株可以包括美国专利第8609396号和第7851180号中公开的菌株。
如本文所用，术语“发酵”是指由导致有机化合物的简单产生的微生物对有机材料的降解。发酵可以在厌氧条件下或在氧气存在下发生。特别地，可以通过培养产生L-蛋氨酸前体的菌株来进行发酵。
培养产生所制备的L-蛋氨酸前体的菌株的方法可以根据本领域已知的充分的培养基和培养条件进行。根据本领域普通技术人员选择的菌株，可以容易地经过调整来使用这种培养方法。培养方法的实例可以包括分批培养、连续培养和补料分批培养，但不限于此。
培养中使用的培养基应合适地满足具体菌株所需的条件。培养基可以包括各种碳源，还可以包含其他氮源和微量元素的组分。碳源的特征在于其特别地包括生物基材料。具体而言，生物碳源可以包括碳水化合物，例如糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；脂肪，如大豆油、葵花油、蓖麻油、海狸油和椰子油；脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇，如甘油和乙醇；和有机酸，如乙酸，但不限于以上。这些碳源可以单独使用或组合使用。氮源的实例可以包括：有机氮源，如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆(CSL)和豆粉；以及无机氮源，如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些氮源可以单独使用或组合使用。培养基可进一步包括作为磷源的磷酸二氢钾、磷酸氢钾和相应的含钠盐。培养基可以包括金属，如硫酸镁或硫酸铁。另外，可以包括氨基酸、维生素和适当的前体。培养基或前体可以按分批培养或连续培养的形式加入到培养物中。
此外，可以通过在培养期间以适当的方式添加诸如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸的化合物来调节培养物的pH。另外，在培养过程中使用诸如脂肪酸聚乙二醇酯的消泡剂可防止形成气泡。此外，为了保持培养基中的有氧条件，可以向培养物中加入氧气或含有氧气的气体(例如空气)。通常，培养温度可以是20℃至45℃，特别是25℃至40℃。可以持续培养直至L-蛋氨酸前体的产生达到预期水平，并且培养时间可以是10小时至160小时，但不限于此。
酶转化过程是指通过使用酶将L-蛋氨酸前体转化为L-蛋氨酸的过程。具体而言，酶转化过程中使用的酶可以是至少一种选自以下的酶：胱硫醚-γ-合酶、O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶和O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶，但不限于此。具体而言，酶转化是指在向L-蛋氨酸前体或含有其的发酵培养基中添加甲硫醇时与酶反应的过程，但不限于此。
另外，上述步骤(a)可以指通过微生物发酵直接产生L-蛋氨酸的步骤。在这种情况下，用于发酵的微生物是指能够产生L-蛋氨酸的菌株。此外，如本文所用，术语“能够产生L-蛋氨酸的菌株”是指在生物体中产生L-蛋氨酸的原核或真核微生物菌株，并且因此是指能够在菌株中积累L-蛋氨酸的菌株。
例如，菌株可以包括属于以下物种的微生物菌株：埃希氏菌、欧文氏菌、沙雷氏菌、普罗威登斯菌、棒状杆菌、假单胞菌、钩端螺菌、沙门氏菌、短杆菌、Hypomononas sp.、色杆菌、诺卡氏菌、真菌或酵母；具体而言，微生物菌株属于埃希氏菌、棒状杆菌、钩端螺旋体和酵母；更具体地说，微生物菌株属于埃希氏菌；最具体而言，菌株可以是大肠杆菌，但不限于此。另外，上述菌株可以包括韩国专利10-1140906号中公开的菌株。
步骤(b)是指乙酰化L-蛋氨酸的步骤。
乙酰化L-蛋氨酸的方法可以通过化学合成方法、微生物产生方法或乙酰化酶进行，但不限于此。另外，本领域普通技术人员可以适当地使用和选择能够乙酰化L-蛋氨酸的任何方法。
化学合成方法是指将能够使L-蛋氨酸的胺基团乙酰化的化合物在室温或高温下进行反应的过程。可用于L-蛋氨酸的乙酰化反应的基材可以是乙酸酐，并且可以使用伴随过渡金属基催化剂的乙酸。此外，对于应用非质子溶剂的中等反应条件，可以使用乙酰卤作为乙酰化化合物。在本申请中，高温可以指70℃至100℃，具体地，80℃至90℃，但不限于此。
此外，可以通过将纯化的乙酰化酶或表达所述酶的破碎微生物的上清液添加到含有L-蛋氨酸和乙酰辅酶A的混合物来进行乙酰化。乙酰化酶包括能够将L-蛋氨酸转化为N-乙酰基-L-蛋氨酸的酰基转移酶。例如，乙酰化酶可以是L-氨基酸N-酰基转移酶MnaT(YncA)、N-乙酰谷氨酸合酶(ArgA)、推定的乙酰转移酶(YjdJ)、推定的乙酰转移酶(YfaP)、推定的乙酰转移酶(YedL)或推定的乙酰转移酶(YjhQ)，但不限于此。
乙酰化酶可以从转化成表达上述酶的大肠杆菌、棒状杆菌或酵母中获得。即，使用编码各种乙酰化酶的基因转化大肠杆菌、酵母或棒状杆菌。然后，纯化的乙酰化酶可以在其转化体被培养后使用，或者在破坏转化的菌株时收集上清液使用。此外，在通过使用二甲苯的预处理过程来增加菌株中细胞壁的渗透性之后，乙酰化可以通过供应L-蛋氨酸诱导，而不破坏转化的菌株。
此外，乙酰化可以使用菌株内的乙酰化酶反应进行，而菌株在相应的时间通过微生物发酵进行培养。微生物的直接发酵可以：使用固有地包括能够乙酰化L-蛋氨酸的酶的野生型菌株；使用具有通过人工突变来提高乙酰化酶活性的特征的突变体；或使用由于过表达能够诱导L-蛋氨酸乙酰化的酶而改良的转化菌株。即，可以使用任何具有乙酰化酶活性的、产生N-乙酰基-L-蛋氨酸的微生物而没有限制。此外，N-乙酰基-L-蛋氨酸的产生可能通过乙酰化反应来实现，不仅使用微生物中生物合成的L-蛋氨酸，而且使用在发酵期间从外部来源提供的L-蛋氨酸。
当在L-蛋氨酸的乙酰化过程中使用乙酰化酶或产生乙酰化酶的微生物时，可以包括提供乙酰辅酶A的步骤。也就是说，该步骤可以通过直接供应乙酰辅酶A或通过添加葡萄糖或乙酸来进行，以便可以将足够量的乙酰辅酶A供应给微生物。
本申请涉及通过发酵制备L-蛋氨酸前体，然后通过酶转化过程高产率地制备L-蛋氨酸，或涉及在通过发酵直接高产量地制备L-蛋氨酸时用各种乙酰化方法制备N-乙酰基-L-蛋氨酸。因此，本申请提出了与制备石油基N-乙酰基-L-蛋氨酸的常规方法完全不同的新范例。
另外，根据本申请内容，通过使用具有N-乙酰基-L-蛋氨酸产生固有能力的野生型微生物、其人工突变体或其中通过引入乙酰化酶改善了N-乙酰基-L-蛋氨酸的产生能力的转化的菌株的直接发酵、或转化反应，可以显著提高N-乙酰基-L-蛋氨酸的产生能力。此外，基于此，还可以显著提高表现出低的N-乙酰基-L-蛋氨酸产生能力的生物学产生方法的效率。
构成N-乙酰基-L-蛋氨酸的的碳中的至少50％可以是源自生物资源的碳。例如，构成由产生N-乙酰基-L-蛋氨酸的方法产生的N-乙酰基-L-蛋氨酸的碳中的至少50％可以来源于O-乙酰基-L-高丝氨酸或O-琥珀酰基-L-高丝氨酸，O-乙酰基-L-高丝氨酸指通过发酵生物碳源获得的蛋氨酸前体。
N-乙酰基-L-蛋氨酸含有至少50％的生物衍生碳，因为构成成分的基料来自生物衍生碳。N-乙酰基-L-蛋氨酸的分子量为191.25g/mol，N-乙酰基-L-蛋氨酸由L-高丝氨酸(119.12g/mol)、甲基硫醇(48.11g/mol)和乙酸(59.04g/mol)组成。在缀合过程中，L-高丝氨酸中的羟基和甲硫醇中的氢分离，乙酸中的羟基和L-高丝氨酸中的氢分离，以制备最终的N-乙酰基-L-蛋氨酸。L-高丝氨酸是使用生物资源通过发酵获得的，并且具有N-乙酰基-L-蛋氨酸中全部分子量的至少50％(L-高丝氨酸119.12g/mol—H2O 18.01g/mol＝101.11g/mol，该数值表示N-乙酰基-L-蛋氨酸的分子量的至少50％)。此外，在使用乙酰化酶的情况下，N-乙酰基-L-蛋氨酸中的生物衍生碳的含量将会增加，因为乙酸也来源于生物来源(不含水的L-高丝氨酸101.11g/mol+没有羟基的乙酸42.04g/mol＝143.15g/mol，它具有N-乙酰基-L-蛋氨酸的至少75％)。
另一方面，可以通过测量材料的放射性碳来确定该材料是生物衍生的还是石油衍生的。也就是说，在碳中存在三种同位素(12C、13C、14C)，但大部分14C(放射性碳)不存在于石油材料碳源中。因此，基于14C仅存在于生物来源碳中的科学事实，进行14C的含量分析以确定该物质是否是生物来源的。
本申请的另一方面涉及包括生物衍生碳的生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸。
构成生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸的的碳中的50％-100％可以是源自生物资源的碳。
本申请的又一方面涉及生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸的群体，其中构成N-乙酰基-L-蛋氨酸的碳中的50％至100％是来自生物资源的碳。
生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸可以通过上述产生方法来产生。
生物资源、生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸及其产生方法如上所述。
另一方面，本申请提供了生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸或包含其盐的饲料添加剂。
又一方面，本申请提供了生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸或包含其盐的饲料组合物。
N-乙酰基-L-蛋氨酸如上所述。
如本文所用，术语“饲料添加剂”是指添加到饲料组合物中的材料。饲料添加剂可以提高个头动物的生产能力或改善健康，但不限于此。
饲料添加剂可以用于反刍动物，但不限于此。
本申请使用N-乙酰基-L-蛋氨酸或包含其盐的饲料添加剂，其中除了N-乙酰基-L-蛋氨酸或其盐以外，饲料添加剂可另外包含用于提高个体动物生产能力或健康的营养物，如核苷酸、氨基酸、钙、磷酸盐、有机酸等，但不限于此。
如本文所用，术语“饲料组合物”是指给予动物的饲料。饲料组合物是指提供维持动物寿命或产生肉、乳等所必需的有机营养素或矿物质营养素的材料。饲料组合物可包含饲料添加剂，并且本申请的饲料添加剂可对应于根据“家畜和鱼类饲料管理法”的补充饲料。
以上饲料的类型没有具体限制，可以使用本申请所属领域中使用的任何常规饲料。饲料的非限制性实例可以包括植物饲料，如谷物、根/果实、食品加工副产品、藻类、纤维、药物副产品、油和脂肪、淀粉、葫芦(gourds)和谷物副产品；以及动物饲料如蛋白质、无机材料、油脂、矿物质、单细胞蛋白质、动物浮游生物和食物残渣。这些可以单独使用或以两种或更多种的组合使用。
可以用本申请的饲料组合物饲喂的动物没有具体限制，但可以应用于任何种类。例如，饲料组合物可以应用于动物，如牛、绵羊、长颈鹿、骆驼、鹿、山羊等，没有限制，并且特别适用于具有瘤胃的反刍动物。家养牛可以是其代表性实例，但不限于此。
根据本申请的一个实施方案，N-乙酰基-L-蛋氨酸或其盐可以用作瘤胃保护肽衍生物，因为其被瘤胃中微生物降解的程度低。因此，N-乙酰基-L-蛋氨酸或其盐可以有效地用作反刍动物的饲料添加剂，但不限于此。
如本文所用，术语“反刍胃”是指可在一些哺乳动物中发现的特殊消化道，并且被分成用于反刍的由瘤胃、网胃、瓣胃和皱胃组成的四个室。反刍是指哺乳动物使先前食用的饲料反刍，并第二次对其进行咀嚼的过程，并且能够进行这种反刍的胃被称为反刍胃。由于微生物以共生的方式生活在瘤胃中，所以瘤胃具有降解动物通常不会消化的植物纤维素的能力，并且这种降解的纤维素可以用作能量。
如本文所用，术语“反刍动物”是指具有上述反刍动物胃的动物，并且包括骆驼科、鼷鹿(chevrotain)科、鹿科、长颈鹿科和牛科动物中的成员。然而，已知骆驼和鼷鹿具有三个反刍胃的室，因为瓣胃和皱胃没有完全分化。
相对于饲料的总重量，饲料添加剂可以添加至饲料组合物，以包含0.01wt.％至90wt.％的量的N-乙酰基-L-蛋氨酸或其盐，但不限于此。
另外，根据本申请的饲料添加剂可以单独使用；可以与常规饲料添加剂组合使用；并且可以与常规饲料添加剂顺序或同时使用。此外，饲料添加剂可以按单剂量或多剂量施用。整体考虑上述因素来施用能够以最小量达到最大效果的量而没有副作用是重要的，并且此外，本领域普通技术人员可以容易地确定。
本申请的另一方面涉及包含生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸或产生其的微生物的颗粒制剂。
生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸和产生其的微生物如上所述。
可以通过从具有N-乙酰基-L-蛋氨酸的微生物的发酵培养基中直接形成颗粒来制备颗粒制剂，或者可以通过包含所述微生物来制备颗粒制剂。此外，可以通过包括所述发酵培养基和微生物两者来制备颗粒制剂。本领域普通技术人员可以进行适当选择来实施颗粒形成过程，但不限于此。
可以通过优化造粒干燥机的操作方法和非标准产品的回收过程来提供产品，其中最终产品的粒度范围小于或等于500μm占0％至5％；大于500μm但小于或等于1000μm的粒径占20％至30％；大于1000μm但小于或等于1300μm的粒径占60％至70％；以及大于1300μm的粒度占5％，但不限于此。
在一个示例性实施方案中，本申请提供了颗粒制剂的制备方法，其包括：将N-乙酰基-L-蛋氨酸的发酵培养基浓缩至总固体含量为40wt.％至50wt.％；通过向浓缩培养基中添加选自稀释剂和游离N-乙酰基-L-蛋氨酸的至少一种并混合来形成混合浓缩物；将粒径为200μm至500μm的颗粒种子注入造粒机中，通过从造粒机下部喷洒所述混合浓缩物来包覆所述颗粒种子，并通过增加颗粒种子的尺寸来形成洋葱形颗粒，从而颗粒尺寸小于或等于500μm的范围为0％至5％，大于500μm但小于或等于1000μm为20％至30％，大于1000μm但小于或等于1300μm为60％至70％，并且大于1300μm为5％。
例如，根据本申请的颗粒制剂可以通过具有以下组成和特征的造粒来含有N-乙酰基-L-蛋氨酸的发酵培养基作为主要成分。
N-乙酰基-L-蛋氨酸含量超过50wt.％；
小于或等于500μm的颗粒尺寸为0％至5％，大于500μm但小于或等于1000μm为20％至30％，大于1000μm但小于或等于1300μm为60％到70％，并且大于1300μm是5％(基于重量)；
表观密度670±50kg/m3；
蛋白质10wt.％至15wt.％；
总糖小于或等于1wt.％；
矿物质小于或等于3wt.％；
水小于或等于3wt.％。
通过在形成混合浓缩物的过程中控制加入的游离N-乙酰基-L-蛋氨酸或赋形剂的量，可以将颗粒产品的最终含量调节至所需含量。可以通过在造粒机下部用喷嘴喷射混合浓缩物，同时施加热空气以形成流化床来进行造粒。
在造粒步骤中获得的颗粒的尺寸可通过调节混合浓缩物的流量、喷嘴压力或热空气的风量来完成。
赋形剂可以是选自淀粉、角叉菜胶和糖中的至少一种，但不限于此。
用于产生颗粒制剂的产生N-乙酰基-L-蛋氨酸的微生物可以是通过GRAS(一般认为安全)分类的微生物。具体而言，微生物可以是属于具有高蛋白质含量的棒状杆菌的微生物，或微生物属于具有高脂肪含量的耶氏酵母，但不限于此。
微生物的发酵条件没有特别限制，但可以在发酵过程中积累大量N-乙酰基-L-蛋氨酸，同时积累较少细胞物质的条件下培养微生物。此外，发酵培养基中的糖防止发酵培养基的干燥，并且增加所获得的产品的吸湿性，因此可以在减少微生物量的条件下培养微生物。然而，在本申请中，N-乙酰基-L-蛋氨酸的含量可以通过混合过程进行调整，并且由于造粒过程的特殊特征而使产品表面被压实。因此，发酵条件不一定限于上述条件。
在本申请中，在不添加抗吸湿剂的情况下存在吸湿减少效果。然而，如果需要，可以加入二氧化硅、聚合物等，特别是液体石蜡作为抗吸湿剂。
本申请的另一方面涉及提高体重获得效果或增加动物乳产量、乳脂或乳蛋白的方法，其中包括饲喂含有生物基N-乙酰基-L蛋氨酸或其盐的饲料添加剂、或饲喂饲料组合物。所述饲料添加剂或饲料组合物如上所述。
所述方法可以具体包括以下步骤：(a)将饲料添加剂或饲料组合物在动物饲料中混合；和(b)用所述动物饲料饲喂动物。
根据本申请的步骤(a)是将包含本申请的N-乙酰基-L-蛋氨酸或其盐的动物饲料组合物与常规家畜饲料混合的步骤，并且因此可以在0.01wt.％至90wt.％，或具体地0.1wt.％至10wt.％的范围将其混入。
根据本申请的步骤(b)是将步骤(a)中制备的饲料饲喂动物的步骤，因此可以饲喂的家畜不受如上所述的具体限制，并且其可以特别是反刍动物。
当将根据本申请内容的饲料添加剂或饲料组合物饲喂动物时，可期待显著的效果如增强或增加动物的乳产量、乳脂或乳蛋白、或增加体重的效果。
实施例
以下将结合示例性实施方案来详细描述本申请。然而，本文公开的示例性实施方案仅用于举例说明的目的，而不应被解释为限制本申请的范围。
实施例1：生物基L-蛋氨酸的产生
实施例1-1.产生L-蛋氨酸前体的菌株的发酵
为了使用大肠杆菌CJM-BTJA/pCJ-MetXlme-CL(韩国专利第10-0905381号)大量产生L-蛋氨酸前体(O-乙酰基高丝氨酸)，进行发酵罐(5L)培养，所述大肠杆菌指产生O-乙酰基高丝氨酸的菌株，作为产生L-蛋氨酸前体的菌株。将这些菌株接种在含有抗生素的LB平板培养基上，然后在31℃下培养过夜。之后，将单菌落接种到含有抗生素的LB培养基(10mL)中，在31℃下培养5小时，然后在含有L-蛋氨酸前体的种子培养基(200mL)的锥形瓶(100mL)中稀释100倍。另外，在31℃、200rpm的条件下培养3小时至10小时后，将种子培养液体培养基接种于发酵罐(5L)中，使用批次补料发酵法培养50小时至100小时。产生L-蛋氨酸前体的主要发酵培养基的组成如下表1所示。
[表1]
产生L-蛋氨酸前体的发酵培养基的组成
组成 种子培养基 主要培养基 补料培养基
葡萄糖(g/L) 10.1 40 600
MgSO4·7H2O(g/L) 0.5 4.2
酵母提取物(g/L) 10 3.2
KH2PO4 3 3 8
硫酸铵(g/L) 6.3
NH4Cl(g/L) 1
NaCl(g/L) 0.5
Na2HPO4·12H2O(g/L) 5.07
DL-蛋氨酸(g/L) 0.5 0.5
L-异亮氨酸(g/L) 0.05 0.5 0.5
L-苏氨酸(g/L) 0.5 0.5
实施例1-2.L-蛋氨酸转化反应
采用膜过滤法来过滤由实施例1制备的发酵培养基，从而将O-乙酰基高丝氨酸培养基和细胞分离。采用膜(0.1μm)且通过其的液体称为透过物，其为无细胞液体。此外，细胞泥被称为滞留物。
通过加入去离子水重新收集滞留物中剩余的O-乙酰基高丝氨酸。
为了进行酶转化反应，向透过物中加入O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或类球红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)衍生的O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶(其为L-蛋氨酸转化酶)(韩国专利第10-1250651号)和甲硫醇，以包含具有O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶活性的酶的菌株或上述酶的形式。
通过测量剩余的O-乙酰基高丝氨酸的浓度并且在反应过程中提供甲硫醇进行该反应，进行酶转化反应6小时，当不再测量到O-乙酰基高丝氨酸的浓度时，终止反应。
实施例1-3.L-蛋氨酸的结晶过程
使用L-蛋氨酸转化液本身并不存在任何问题，然而，为了获得L-蛋氨酸含量高的组合物，可以通过浓缩实施例1和2中制备的L-蛋氨酸的转化液来分离晶体，或者可以在用硫酸将pH值调为4.0至5.5时浓缩晶体。为了获得更高纯度的L-蛋氨酸，在该实施例中，加入硫酸以将pH值调为4.0至5.5，然后进一步将占L-蛋氨酸总量0.5wt.％至2wt.％的活性碳加入，在50℃混合1小时至2小时。此后，进行过滤以去除活性炭和杂质。浓缩滤液直至L-蛋氨酸的浓度达到150g/L至200g/L，然后使用晶体分离装置获得晶体。然后将从晶体分离得到的母液再浓缩一次，以获得第二晶体。此外，将第二晶体溶解，然后将溶解的晶体重新加入pH值已被调节至4.0至5.5之间的L-蛋氨酸反应液中。此外，上述过程重复使用。从而获得95.0wt.％至99.9wt.％的L-蛋氨酸。
实施例2：使用化学合成方法合成N-乙酰基-L-蛋氨酸
将由实施例1制备的L-蛋氨酸(20g，0.134mol)置于烧瓶(250mL)中，使其与乙酸乙酰酯(30g)混合，并且通过搅拌烧瓶中的溶液(250mL)制备处于悬浮液条件的L-蛋氨酸溶液。在搅拌溶液30分钟后，当L-蛋氨酸颗粒均匀分散时，加入浓硫酸(0.133g，98.5％)和蒸馏水(0.666g)，上述反应物部分转变成浆液状态，同时白色晶体从反应物中提取出来。此时，在继续搅拌的同时，向其中缓慢注入能够将L-蛋氨酸的胺基团乙酰化的化合物，如乙酸酐(14.4g，0.141mol和97％)，并将热量施加到配有冷凝管的烧瓶。当施加热量同时使用冷却装置将冷凝管的温度保持在0℃以下时，蒸发的乙酸乙酰酯通过冷凝管回流到烧瓶中。此时，反应物的温度保持在83℃。当反应进行20分钟时，处于浆液状态的反应物的颜色缓慢转化成澄清黄色液体。此时，收集反应物并将其迅速冷却。
当强烈搅拌反应产物1小时至2小时时，在液体中形成白色N-乙酰基-L-蛋氨酸晶体。此外，当白色晶体完全形成时，使用真空过滤器除去黄色上清液。使用在0℃冷却的乙酸乙酰酯洗涤收集的N-乙酰基-L-蛋氨酸，然后使用真空过滤器再次纯化。此后，使用减压干燥装置在-0.1MPa、50℃将收集的N-乙酰基-L-蛋氨酸干燥1小时。观察到干燥时收集的N-乙酰基-L-蛋氨酸的质量为19.448g(纯化产率＝77.8％)，并且还观察到通过HPLC分析鉴定的纯度为95.8％，并且剩余的L-蛋氨酸的纯度为0.6％。
另外，为了使用化学合成法评估N-乙酰基-L-蛋氨酸的生物来源含量，基于美国专利第8946472号中的“生物基含量”的测定方法进行分析。另外，通过使用以下公式导出生物基含量。
生物基含量＝14C/12C比率样品/14C/12C比率现代/1.075
观察到由化学合成产生的N-乙酰基-L-蛋氨酸中平均生物基含量的评估结果为51.9％。
实施例3：基于酶促反应的L-蛋氨酸的N-乙酰基-L-蛋氨酸转化
使用L-蛋氨酸，基于酶促反应进行N-乙酰基-L-蛋氨酸转化研究。
为了通过乙酰化酶促反应产生N-乙酰基-L-蛋氨酸，使用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)来源的N-酰基转移酶(ppmat)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的N-酰基转移酶(bsmat)、肠杆菌(Enterobacter sp.)638来源的N-酰基转移酶(entmat)、假弧菌(Pseudovibrio sp.)FO-BEG1来源的N-酰基转移酶(pvmat)、解脂耶氏酵母来源的N-酰基转移酶(ylmat)、谷氨酸棒杆菌来源的N-酰基转移酶(cgmat)和大肠杆菌来源的N-酰基转移酶(YncA)。N-酰基转移酶的作用是将来自乙酰辅酶A的乙酰基传递至底物。这样的酶反应可通过以下的酶来实施：如N-乙酰谷氨酸合酶(ArgA)、推定的乙酰基转移酶(YjdJ)、推定的乙酰基转移酶(YfaP)、推定的乙酰基转移酶(YedL)和推定的乙酰基转移酶(YjhQ)，并且进一步地，可用其中基于序列同源性高的具有酰基转移酶的其他能力的酶来实施所述反应。
在制备编码7种类型的N-酰基转移酶的DNA片段时，分别在每个末端分别具有NdeI和XbaI的限制酶位点，将DNA片段连接到用相同限制酶处理的pUCtk载体上。将上面制备的重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中后，将得到的细菌接种到含有卡那霉素的LB平板培养基上，并在37℃培养过夜。将得到的菌落中的一个接种到含有卡那霉素的液体LB培养基(3mL)中并培养过夜后，使用Plasmid Miniprep试剂盒(Bioneer，韩国)获得重组质粒。通过测序(Macrogen，韩国)验证所获得的重组质粒的序列信息，并且每个重组质粒分别命名为：pUCtk-ppmat、pUCtk-bsmat、pUCtk-entmat、pUCtk-pvmat、pUCtk-ylmat、pUCtk-cgmat和pUCtk-yncA。
从含有卡那霉素的LB平板培养基中，选择导入重组质粒的转化大肠杆菌BL21(DE3)。所选择的转化体命名为：BL21(DE3)/pUCtk-ppmat、BL21(DE3)/pUCtk-bsmat、BL21(DE3)/pUCtk-entmat、BL21(DE3)/pUCtk-pvmat、BL21(DE3)/pUCtk-ylmat、BL21(DE3)/pUCtk-cgmat和BL21(DE3)/pUCtk-yncA。
将制备的转化体BL21(DE3)/pUCtk-ppmat、BL21(DE3)/pUCtk-bsmat、BL21(DE3)/pUCtk-entmat、BL21(DE3)/pUCtk-pvmat、BL21(DE3)/pUCtk-ylmat、BL21(DE3)/pUCtk-cgmat和BL21(DE3)/pUCtk-yncA的各菌落中的一个接种于含有卡那霉素(25mg/L)和1％葡萄糖(w/v)的液体LB培养基(3mL)，并在37℃下培养8小时(种子培养物)。之后，将每种种子培养液接种在相同的培养基(50mL)上并培养过夜。
将培养基离心分离得到沉淀物，将所得物悬浮于磷酸缓冲液(pH7.0,50mM,5mL)中，然后超声处理破碎细胞。通过以14,000rpm离心30分钟，去除细胞碎片以获得上清液。考虑到酰基转移酶的大小接近19kDa，通过顺序过滤获得酶浓缩物；通过Amicon Ultra(Millipore，Ireland)30-kDa截留膜，然后通过10-kDa截留膜重新过滤，并获得过滤器上的剩余浓缩物。将浓缩物注入到填充有Q琼脂糖的HiTrap Q FF柱(GE,USA)中，并且使用NaCl浓度梯度(80、100、150、200、300、500mM的顺序)纯化分离酰基转移酶。稀释的酶通过AmiconUltra 10-kDa截留膜重新浓缩。使用SDS-PAGE确认酰基转移酶的过表达和纯化程度。为了测定通过纯化的酰基转移酶的N-乙酰基-L-蛋氨酸的产生能力，将酶浓缩物加入含有乙酰辅酶A(20mM)和蛋氨酸(20mM)的磷酸盐缓冲液(pH7.0,50mM)。在37℃反应1小时后，使用HPLC测定生成的N-乙酰基-L-蛋氨酸的量。
[表2]
通过新的酰基转移酶转化反应来产生N-乙酰基-L-蛋氨酸
从以上结果可以看出，L-蛋氨酸被酰基转移酶转化为N-乙酰基-L-蛋氨酸。转化反应不仅可以用在缓冲溶液中稀释的L-蛋氨酸，而且可以用在由发酵和酶转化反应产生的培养基中未纯化的L-蛋氨酸。另一方面，为了在产酰基转移酶细菌中提供足够量的乙酰辅酶A，通过添加葡萄糖或乙酸，代谢工程方法是可能的，并且可以通过改进发酵过程来提高N-乙酰基-L-转移酶的产量。
使用生物基L-蛋氨酸的N-乙酰化方法的实例应理解为说明性的，而不意图限制本申请。即，本申请的产生生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸的方法是通过发酵生物基原材料来以高产率产生L-蛋氨酸，并且通过各种乙酰化方法使用简单、方便的方法制备N-乙酰基-L-蛋氨酸。上面的实施例是实施以上方法的代表方案。
实施例4：使用导入N-酰基转移酶的转化体产生N-乙酰基-L-蛋氨酸
将实施例3中制备的转化体BL21(DE3)/pUCtk-ppmat、BL21(DE3)/pUCtk-bsmat、BL21(DE3)/pUCtk-entmat、BL21(DE3)/pUCtk-pvmat、BL21(DE3)/pUCtk-ylmat、BL21(DE3)/pUCtk-cgmat和BL21(DE3)/pUCtk-yncA中的各菌落中的一个接种到含有卡那霉素(25mg/L)和1％葡萄糖(w/v)的液体LB培养基(3mL)中，37℃培养8小时。之后，将培养基(500μL)接种到含有卡那霉素(25mg/L)、1％葡萄糖(w/v)和2％蛋氨酸(w/v)的液体LB培养基(50mL)中，然后培养过夜。将未插入目标基因的pUCtk载体进行转化以用作对照。通过离心除去培养基中的细胞，然后使用HPLC分析产生的N-乙酰基-L-蛋氨酸。
结果，BL21(DE3)/pUCtk-ppmat以3.03g/L的最高浓度产生N-乙酰基-L-蛋氨酸，BL21(DE3)/pUCtk-entmat以2.23g/L的第二高浓度产生N-乙酰基-L-蛋氨酸。在对照中检测到痕量的N-乙酰基-L-蛋氨酸，并假定对照中的N-乙酰基-L-蛋氨酸是由大肠杆菌中固有表达的YncA酶产生的。此外观察到，当YncA在野生型大肠杆菌中过表达时，与对照相比，N-乙酰基-L-蛋氨酸的产生能力增加(表3)。
[表3]
转化有酰基转移酶的大肠杆菌的N-乙酰基-L-蛋氨酸产生能力
转化体 培养基的N-乙酰基-L-蛋氨酸浓度(g/L)
BL21(DE3)/pUCtk <0.1
BL21(DE3)/pUCtk-ppmat 3.03
BL21(DE3)/pUCtk-bsmat 1.60
BL21(DE3)/pUCtk-entmat 2.23
BL21(DE3)/pUCtk-pvmat 0.17
BL21(DE3)/pUCtk-ylmat 0.13
BL21(DE3)/pUCtk-cgmat 0.58
BL21(DE3)/pUCtk-yncA 1.15
另外，为了评价以转化的大肠杆菌为基础产生的N-乙酰基-L-蛋氨酸的生物衍生含量，根据美国专利8946472号中的“生物基含量”的测量方法进行分析。作为评估的结果，确认由转化的大肠杆菌产生的N-乙酰基-L-蛋氨酸的平均生物基含量为76.6％。
因此，确认了通过化学合成法、乙酰化酶或产生乙酰化酶的微生物能够将L-蛋氨酸乙酰化，特别是确认了通过乙酰化酶促反应，高效率、环保地产生生物基N-乙酰-L-蛋氨酸是可能的。
实施例5：通过发酵转化的产L-蛋氨酸菌株产生N-乙酰基-L-蛋氨酸
实施例5-1.使用产L-蛋氨酸菌株的直接发酵及其酶促转化作用
使用大肠杆菌TF4076BJF metA#10+metYX(Lm)(韩国专利号10-1140906；以下称为metA10YXLm)作为产L-蛋氨酸菌株进行锥形瓶培养，以产生L-蛋氨酸。将菌株接种在LB平板培养基上，并在31℃培养过夜。然后将形成的单菌落接种在种子培养基(10mL)中，并在31℃下培养6小时。之后，将种子培养基(1mL)接种到含有主要发酵培养基(20mL)的锥形瓶(250mL)中，在31℃、200rpm下培养78小时。种子培养基和主要发酵培养基的组成在下表4中描述。
[表4]
组成(g/L) 种子培养基 主要培养基
葡萄糖 2 40
MgSO4·7H2O 0.49 1
酵母提取物 10 2
KH2PO4 3 2
硫酸铵 17
CaCl2·2H2O 0.015
CaCO3 30
NaCl 0.5
Na2HPO4·12H2O 6
MnSO4·7H2O 0.01
FeSO4·7H2O 0.01
ZnSO4·7H2O 0.01
L-苏氨酸 0.3
使用培养基中的L-蛋氨酸浓度进行分析的结果是，产生了6.6g/L的L-蛋氨酸。
此外，使用酰基转移酶和通过产L-蛋氨酸菌株的发酵直接产生的L-蛋氨酸，进行N-甲酰-L-蛋氨酸的产生。通过应用由与实施例3相对应的方法获得的纯化酰基转移酶来进行评价，并且通过使用在直接发酵获得的培养基中L-蛋氨酸来进行实验。即，将乙酰辅酶A(20mM)和L-蛋氨酸的直接发酵培养基与磷酸缓冲液(pH7.0,50mM)混合，加入酶浓缩物。之后，将混合的L-蛋氨酸溶液在37℃下反应1小时，并使用HPLC测量由此产生的N-乙酰基-L-蛋氨酸的量，实验结果如下。
[表5]
通过基于直接发酵L-蛋氨酸的培养基的酰基转移酶的转化反应来产生N-乙酰基-L-蛋氨酸的能力
尽管在上述实施例中对由直接发酵产生的L-蛋氨酸的培养基评价了产生N-乙酰基-L-蛋氨酸的能力，但使用对应于实施例3的直接发酵产生的L-蛋氨酸的纯化粉末也能产生N-乙酰基-L-蛋氨酸。
实施例5-2.通过发酵来源于引入N-乙酰基转移酶的、直接产生L-蛋氨酸的菌株的转化体来产生N-乙酰基-L-蛋氨酸(直接产生N-乙酰基-L-蛋氨酸的菌株)
通过利用大肠杆菌TF4076BJF metA#10+metYX(Lm)(韩国专利号10-1140906；下文中称为metA10YXLm)作为产生L-蛋氨酸的菌株，尝试通过发酵直接产生N-乙酰基-L-蛋氨酸。分别导入由实施例3制备的重组质粒pUCtk-ppmat、pUCtk-bsmat、pUCtk-entmat、pUCtk-pvmat、pUCtk-ylmat、pUCtk-cgmat和pUCtk-yncA，从含有卡那霉素的LB平板培养基中选择来自转化的大肠杆菌metA10YXLm的转化体。所选转化体分别命名为：metA10YXLm/pUCtk-ppmat、metA10YXLm/pUCtk-bsmat、metA10YXLm/pUCtk-entmat、metA10YXLm/pUCtk-pvmat、metA10YXLm/pUCtk-ylmat、metA10YXLm/pUCtk-cgmat和metA10YXLm/pUCtk-yncA。基于实施例5-1中描述的发酵条件，进行转化菌株的培养和分析。作为分析的结果，metA10YXLm/pUCtk-ppmat以8.32g/L的最高浓度产生N-乙酰基-L-蛋氨酸，而metA10YXLm/pUCtk-entmat以6.19g/L的第二高浓度产生N-乙酰基-L-蛋氨酸(表6)。
另外，为了改善N-乙酰基-L-蛋氨酸的直接产生，通过从外部来源供应额外的L-蛋氨酸来进行制备的转化体的比较评估。为此，在发酵条件中额外添加2％的L-蛋氨酸。从分析结果可以确认，转化体的N-乙酰基-L-蛋氨酸的产生增加，特别是确认了在不添加L-蛋氨酸时N-乙酰基-L-蛋氨酸的产生量最高的metA10YXLm/pUCtk-ppmat菌株也显示N-乙酰基-L-蛋氨酸的最高产量(14.1g/L)(表6)。由此可见，当使用产生L-蛋氨酸的能力得到进一步改善的菌株来产生N-乙酰基-L-蛋氨酸时，可以预期其产量的增加，而同时通过额外提供来自外部来源的L-蛋氨酸来，也可以预期乙酰-L-蛋氨酸产量的增加。特别地，野生型大肠杆菌具有固有的YncA酶，因此显示出痕量的N-乙酰基-L-蛋氨酸产量(实施例4)。然而，经证实，产生L-蛋氨酸能力增加的产生N-乙酰基-L-蛋氨酸的菌株，在对照中表现出N-乙酰基-L-蛋氨酸产量增加。据信，这种增加的产量是由于菌株中产生的L-蛋氨酸或由于从外部来源提供的L-蛋氨酸造成的。
[表6]
直接产生N-乙酰基-L-蛋氨酸的酰基转移酶转化菌株的N-乙酰基-L-蛋氨酸的产生能力
另外，为了评价使用直接发酵生成的N-乙酰基-L-蛋氨酸的生物衍生含量，基于美国专利第8946472号中的“生物基含量”的测定方法进行分析。由评估结果证实，使用直接发酵产生的N-乙酰基-L-蛋氨酸的平均生物基含量为99.3％。
实施例6：通过瘤胃微生物群落的体外发酵来测试生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸的过瘤胃效率
6-1.收集瘤胃液
为实验目的，提供了一头配备有瘤胃套管的荷斯坦(Holstein)阉牛(重约630kg至650kg)，并且通过将商业饲料(MilkgenTM,CJ CheilJedang)和稻草一天两次饲喂(上午7:30，凌晨3点)。
在实验当天上午10点进行瘤胃液的收集。通过套管去除瘤胃中的内容物，并通过挤压胃液用纱布提取胃液。之后，将提取的胃液置于真空瓶中，并用CO2鼓泡。然后将含有胃液的真空瓶运送至实验室，同时阻止氧气的渗透。将瘤胃液运送至实验室的时间少于1小时。
6-2.厌氧培养的进展
将运送至实验室的瘤胃液用两层纱布过滤，然后通过将其与McDougall缓冲液的仿生溶液(Troelsen and Donna，1966)以1：3比例混合用作厌氧培养基，该仿生溶液常用于体外过瘤胃试验。McDougall缓冲液的仿生溶液的组成如下表7所示。
[表7]
McDougall缓冲液的仿生溶液的组成
实验中使用的饲料是商业饲料(MilkgenTM)，这是一种基本上用于养牛的饲料，并且该饲料也被用作基础饲料。此外，通过将基础膳食与测试材料混合来制备实验样品。本实验中使用的测试材料是N-乙酰基-L-蛋氨酸，将其作为实验组1。将实验组1与仅由基础膳食组成而没有测试材料的对照组1进行比较，还与由测试材料L-蛋氨酸组成的对照组2进行比较。对每个实验组进行三个平行样品的培养。
将基础膳食和测试材料以4：1的比例(基础膳食(0.4g)，测试材料(0.1g)；但对照组1中仅含0.5g基础膳食)混合。将混合的试验材料(0.5g)加入到培养瓶(125mL)，然后将其与制备的厌氧培养基(50mL)混合，再将其密封置于40℃培养箱中开始进行培养。
在包括稀释瘤胃液直到开始培养的整个过程期间喷洒不含O2的CO2，以使得瘤胃液不暴露于氧气。因此，保持厌氧条件。
6-3.测量测试材料的体外过瘤胃效率的取样和结果
培养最终进行48小时，并且在培养开始时对培养基进行总共4次取样(0小时，24小时，36小时，48小时)。每次取样时，将置于40℃培养箱中的样品从培养箱中移出并打开盖子。此后，通过以4000rpm离心培养基10分钟获得上清液，然后测量存在于上清液中的测试材料的量。
基于测试材料的HPLC定量分析结果，计算过瘤胃率(％)，并计算值示于下表8中。
[表8]
N-乙酰基-L-蛋氨酸体外过瘤胃率(％)
基于0小时(100％)时间点的测试材料的量，过瘤胃率(％)表示为在24小时、36小时和48小时的时间点的剩余量(％)。图1显示过瘤胃率(％)。
结果显示：对照组L-蛋氨酸显示，与0小时的时间点的过瘤胃率相比，48小时后的过瘤胃率(％)为1.5％，因此证实大部分被瘤胃微生物消化。另外，与0小时的时间点的过瘤胃率相比，测试材料N-乙酰基-L-蛋氨酸在24小时后显示的过瘤胃率(％)为89.1％，在36小时后为76.2％，甚至在48小时后为55.4％。
实施例7：通过体外小肠和肝脏提取物进行测量生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸的消化能力的实验
未被瘤胃微生物降解的营养物质在小肠中被吸收，因此可用于蛋白质合成、能量代谢等。对于N-乙酰基-L-蛋氨酸，预计以高的过瘤胃率到达小肠。相应地，小肠和肝脏中存在的消化酶可以将其转化为蛋氨酸，因此可以容易地被反刍动物的小肠吸收。由于这个原因，用牛小肠和肝脏中存在的酶观察N-乙酰基-L-蛋氨酸潜在的消化降解。
实施例7-1.从小肠获取提取物
购买了在全国农业合作联盟的富川畜产品市场屠宰的韩国本土牛的小肠(记录号：KOR005078680400)的小肠(40m)。在将小肠切成约1m后，将20mM磷酸钠缓冲液(pH7.4,5mL)加入切过的小肠中。之后，在保持小肠的两端的同时，反复摇动小肠以帮助小肠中的大部分酶被磷酸钠缓冲液溶解。通过这样做，从小肠(40m)获得约200mL的酶溶液，并且通过在4℃以14,000rpm离心10分钟获得上清液，然后将所得物于20mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)中稀释2倍。
实施例7-2.从肝脏获取提取物
购买了全国农业合作联盟富川畜产品市场屠宰的韩国本土牛(记录号：KOR005078680400)的肝脏。在将肝脏组织(0.125g)与20mM磷酸钠缓冲液(pH7.4,1mL)混合后，将玻璃珠(Sigma G1145)装入约1/10管(2mL)中。使用珠磨式组织研磨器(MPTMFastPrep)将细胞组织破碎3次，每次20秒，并将所得物在4℃以14,000rpm离心10分钟以获得上清液。
实施例7-3.评估从小肠和肝脏获得的提取物的酶活性
为了确认从小肠和肝获得的提取物的酶活性，使用从猪肾提取的酰化酶I(SigmaA3010)。已知N-酰基-L-蛋氨酸可以被酰化酶I很好地降解(Chem.Res.Toxicol.1998,11(7):800-809)。通过与酰化酶I的相对活性的比较，观察小肠和肝脏提取物对N-乙酰基-L-蛋氨酸的消化降解率。实验条件与下表9所示的相同，反应在40℃下进行24小时。
[表9]
牛小肠和肝脏提取物对N-乙酰基-L-蛋氨酸消化降解率的评价条件
为了除去反应结束后的样品中的蛋白质，向其中加入高氯酸(0.5％)并稀释10倍。之后，定量分析(HPLC)以14,000离心10分钟所分离的上清液中存在的N-乙酰基-L-蛋氨酸和L-蛋氨酸。通过比较反应前N-乙酰基-L-蛋氨酸和反应后L-蛋氨酸之间的摩尔浓度(mM)，计算转化率(％)，以百分比(％)表示(N-乙酰基-L-蛋氨酸分子量：191.25g/L，L-蛋氨酸分子量：149.25g/L)。
作为分析的结果，观察到酰化酶I表现出高的消化降解速率(98.9％，摩尔转化率)，其与文献中的速率相似。类似地，还观察到使用小肠提取物的反应(97.5％摩尔转化率)和使用肝脏提取物的反应(99.1％摩尔转化率)表现出非常高的消化降解速率。
[表10]
酰化酶I以及小肠和肝脏的提取物对N-乙酰基-L-蛋氨酸的消化降解率
*消化降解率：产生物质(蛋氨酸)mM浓度/底物(N-乙酰基-L-蛋氨酸)mM浓度×100
结果显示：从上面的实施例，在小肠和肝脏提取物的体外反应中，N-乙酰基-L-蛋氨酸被转化为L-蛋氨酸。根据该结果，当N-乙酰基-L-蛋氨酸到达小肠时，大部分N-乙酰基-L-蛋氨酸被小肠中的消化酶转化为L-蛋氨酸，并且可以预期痕量未降解的N-乙酰基-L-蛋氨酸在小肠中被吸收，通过血液流入肝脏并转化为L-蛋氨酸。这表示作为饲料添加剂提供的N-乙酰基-L-蛋氨酸可以直接用作L-蛋氨酸，其实质上用作反刍动物体内的氨基酸。
实施例8：小肠和肝脏提取物对N-乙酰基-L-蛋氨酸和N-乙酰基-D,L-蛋氨酸体外消化降解率的比较评估
实施例8-1.小肠和肝脏提取物的消化降解率的评估。
使用由实施例7得到的小肠和肝的提取物，进行N-乙酰基-L-蛋氨酸的光学异构体的消化降解率的比较评价。按照与实施例7-3同样的方法进行评价，评估结果如下。
[表11]
小肠和肝脏提取物对N-乙酰基-L-蛋氨酸和N-乙酰基-D,L-蛋氨酸的消化降解率
在小肠和肝脏提取物的体外反应中，含约50％D-型的N-乙酰基-D,L-蛋氨酸中大约46％被小肠提取物转化为L-蛋氨酸，而N-乙酰基-D,L-蛋氨酸中大约50％被肝脏提取物转化为L-蛋氨酸。即，在体内，在光学异构体之间，与N-乙酰基-D-蛋氨酸(D-型)相比，N-乙酰基-L-蛋氨酸(L-型)的消化降解率显著高。此外，从上述结果可以预料，相比使用相同量的N-乙酰基-L-蛋氨酸，当使用N-乙酰基-D,L-蛋氨酸时，会表现出显著更低的消化降解率。
实施例9：通过饲喂N-乙酰基-L-蛋氨酸的乳组成分析
基于体外评估，对于N-乙酰基-L-蛋氨酸已经观察到小肠中高消化降解率和过瘤胃率，通过利用奶牛进行实质性评估来验证其效率。为此，将牛分成两个分别的组，并且在评估过程中分析了取决于N-乙酰基-L-蛋氨酸存在或不存在的乳组成的变化。为此，8头奶牛分成两组，每组分别由4头奶牛组成。此外，将N-乙酰基-L-蛋氨酸加入饲料组合物中(表12)，所述饲料组合物饲喂给一组4头奶牛(每头奶牛每天30g的N-乙酰基-L-蛋氨酸)，进行了84天。
—第1组：不添加N-乙酰基-L-蛋氨酸
—第2组：添加N-乙酰基-L-蛋氨酸
[表12]
饲料组成
下表13中示出了所测试奶牛的乳组成的分析结果。
[表13]
乳奶量和组成结果
如上述规格评估所示，未观察到根据N-乙酰基-L-蛋氨酸的存在或不存在而改变的总采食量(干物质采食量，DMI)。然而，添加N-乙酰基-L-蛋氨酸时，观察到乳脂增加(12.2％)和乳蛋白增加(3.5％)。此外，与未添加N-乙酰基-L-蛋氨酸相比，校正能量的乳(ECM)增加了6.7％。此外，饲料效率(ECM产量/DMI)也增加了8.3％。也就是说，从上述结果可以看出，在添加N-乙酰基-L-蛋氨酸作为奶牛饲料添加剂时，观察到各种效果，例如乳中脂肪和蛋白质含量的增加以及饲料效率提高。
实施例10：通过饲喂N-乙酰基-L-蛋氨酸分析体重增加效应
通过饲喂N-乙酰基-L-蛋氨酸来验证肉用阉牛的增重效果。为进行该验证，将24头肉用阉牛分成两组，每组由12只肉用阉牛组成。此后，90天中根据N-乙酰基-L-蛋氨酸的存在或不存在观察增重效果。在加入N-乙酰基-L-蛋氨酸的组中，每只肉用阉牛每天喂食N-乙酰基-L-蛋氨酸(30g)。
基本饲料组成与表12中所示的相同，通过评估得到的增重效果如下。
[表14]
体重增加效果的结果
从肉用阉牛评估中可以看出，当将N-乙酰基-L-蛋氨酸进一步饲喂肉用阉牛时，观察到约132.9kg的增重效应，相比没有添加N-乙酰基-L-蛋氨酸的肉用阉牛，这相当于另外增加16.5kg的重量。另外，与没有添加N-乙酰基-L-蛋氨酸的情况相比，平均日增重也显示约14.7％的提高效果。即，通过应用N-乙酰基-L-蛋氨酸的饲料添加剂(实施例9)，不仅可以观察到奶牛乳中脂肪和蛋白质含量的增加以及饲料效率提高等各种效果，而且从上面的结果中也观察到了提高的肉用阉牛增重效果。基于这些结果，确认N-乙酰基-L-蛋氨酸作为各种反刍动物的饲料添加剂的可能性。
实施例11：制备生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸的发酵培养基
实施例11-1.用谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)制备N-乙酰基-L-蛋氨酸发酵培养基
在本实施例中，将具有固有产生N-乙酰基-L-蛋氨酸能力的谷氨酸棒状杆菌(ATCC13032)，于含有L-蛋氨酸的培养基(1L)中(组成(基于1L)：L-蛋氨酸(20g)、葡萄糖(20g)、蛋白胨(10g)、酵母提取物(10g)、尿素(5g)、KH2PO4(4g)、K2HPO4(8g)、MgSO4·7H2O(0.5g)、生物素(100μg)、硫胺素HCl(1,000μg))，在pH6.0至8.0范围内于35℃培养72小时。因此，获得N-乙酰基-L-蛋氨酸浓度为1.07g/L的发酵培养基。
实施例11-2.使用解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)制备N-乙酰基-L-蛋氨酸的发酵培养基
在该实施例中，将具有固有产生N-乙酰基-L-蛋氨酸能力的解脂耶氏酵母PO1f(ATCC MYA-2613TM)，在含有L-蛋氨酸的培养基(1L)中(组成(基于1L)：L-蛋氨酸(20g)、葡萄糖(20g)、Na2HPO4(3.28g)、NaH2PO4(3.22g)、酵母提取物(2g)、蛋白胨(50g))，在pH 6.0-8.0范围内于30℃培养72小时。因此，获得N-乙酰基-L-蛋氨酸浓度为1.02g/L的发酵培养基。对于含有L-蛋氨酸的培养基，它增加了N-乙酰基-L-蛋氨酸的产生，并且可以使用由微生物发酵产生的L-蛋氨酸的母液。
实施例12：从发酵培养基直接造粒
将发酵培养基或其滤液浓缩至总固体含量为40wt.％至60wt.％，并将pH调节至3.5至3.6。使用硫酸进行pH调整，调整pH后，将浓缩液在60℃下放置2.5小时。在gDNA降解过程之后，使用底部喷雾法通过造粒机的下部喷嘴(GR Engineering，流化床喷雾干燥机间歇式引导器)将浓缩物注入到造粒机中。操作造粒机的条件如下：加热器温度(170℃)、入口温度(140℃至160℃)、出口温度(60℃至70℃)和喷雾压力(1.8巴至2.0巴)。造粒用种子通过喷雾干燥法制备，其大小为300μm。注入造粒机的浓缩物用热空气干燥，然后固化。此后，在流入流化床的同时，新注入的浓缩物使其尺寸增大。当颗粒的尺寸达到所需尺寸时，停止造粒机的操作，回收产物以分析产物的组成和其含量。
由该实施例获得的谷氨酸棒杆菌发酵培养基颗粒和解脂耶氏酵母发酵培养基颗粒的特征示于下表15中。
[表15]
实施例13.通过向发酵培养基中加入游离的N-乙酰基-L-蛋氨酸的含量调节
在与实施例11相同的条件下，将由发酵培养过程产生的发酵培养基浓缩至总固体含量为40wt.％至60wt.％。进一步在混合罐中加入游离的N-乙酰基-L-蛋氨酸并混合。之后，根据实施例12中的相同条件形成颗粒。
使用谷氨酸棒状杆菌和解脂耶氏酵母最终获得的产物的特征显示在下表16中。因此，可以获得具有增加的蛋白质和脂肪含量的颗粒产品。
[表16]
实施例14.通过向发酵培养基添加稀释剂的含量调节
浓缩发酵培养基后，将溶于0.5L水中并导致水分含量为9.0％的玉米淀粉(0.22kg)作为稀释剂加入混合罐中，然后混合。通过在减压下的浓缩方法将发酵培养基的滤液浓缩至总固体含量为50.5wt.％，并且根据与实施例12中相同的条件形成颗粒。
使用谷氨酸棒状杆菌和解脂耶氏酵母最终获得的产品的特征显示在下表17中。
[表17]
因此，由于瘤胃微生物降解的N-乙酰基-L-蛋氨酸的量相对较小，本申请中制备的N-乙酰基-L-蛋氨酸与L-蛋氨酸相比，可表现出高过瘤胃率。另外，N-乙酰基-L-蛋氨酸表现出高消化率降解率，并且观察到由于实质上将N-乙酰基-L-蛋氨酸供给到奶牛所致的乳脂和乳蛋白的提高效果。这些结果表明，基于本申请的制备方法所制备的N-乙酰基-L-蛋氨酸可以非常有用地用作反刍动物的饲料添加剂。另外，通过将生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸饲喂反刍动物，可以获得与石油衍生材料相比的环保效应。
从以上所述，本申请所属领域的普通技术人员将能够理解，在不修改本申请的技术概念或基本特征的情况下，本申请可以以其他具体形式来实施。就此而言，本申请的示例性实施方案仅用于举例说明目的，而不应被解释为限制本申请的范围。相反，本申请旨在不仅覆盖示例性实施方案，而且覆盖可包括在由所附权利要求限定的本申请的实质和范围内的各种替代方案、改型方案、等同物和其他实施方案。

Claims (17)

1.生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸，其包含源自生物资源的碳。
2.如权利要求1所述的生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸，其中构成生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸的碳中的50％至100％是源自生物资源的碳。
3.生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸的群体，其中构成所述群体的碳中的50％至100％是源自生物资源的碳。
4.饲料添加剂，其包含权利要求1所述的生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸或其盐。
5.饲料组合物，其包含权利要求1所述的生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸或其盐。
6.颗粒制剂，其包含权利要求1所述的生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸或产生权利要求1所述的生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸的微生物。
7.如权利要求6所述的颗粒制剂，其中产生所述生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸的微生物是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)或解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。
8.提高动物的产乳量、乳脂或乳蛋白、或体重增加效果的方法，包括将含有权利要求1所述的生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸或其盐的饲料添加剂或饲料组合物饲喂给动物。
9.产生生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸的方法，其包括：
(a)(i)通过微生物发酵产生L-蛋氨酸前体；和
(ii)通过酶促转化从所述L-蛋氨酸前体产生L-蛋氨酸；以及
(b)乙酰化所述L-蛋氨酸。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述L-蛋氨酸前体是O-乙酰基-L-高丝氨酸或O-琥珀酰基-L-高丝氨酸。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述酶促转化通过选自以下的至少一种酶来进行：胱硫醚-γ-合酶、O-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶和O-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶。
12.产生生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸的方法，其包括：
(a)通过微生物发酵产生L-蛋氨酸；和
(b)乙酰化所述L-蛋氨酸。
13.如权利要求9或12所述的方法，其中通过化学合成或乙酰化酶或产生该酶的微生物进行L-蛋氨酸的乙酰化。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述方法包括在通过乙酰化酶或产生该酶的微生物对L-蛋氨酸进行乙酰化的情况下，供给乙酰辅酶A。
15.产生生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸的方法，其包括通过直接发酵具有乙酰化酶活性的、产生N-乙酰基-L-蛋氨酸的微生物来产生所述生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸。
16.如权利要求15所述的方法，其包括在微生物发酵过程中将生物基L-蛋氨酸供给至培养基。
17.如权利要求9、12和15中任一项所述的方法，其中构成所述生物基N-乙酰基-L-蛋氨酸的碳中的50％至100％是源自生物资源的碳。
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