KR20170044575A - 바이오-기반 n-아세틸-l-메티오닌 및 이의 용도 - Google Patents

바이오-기반 n-아세틸-l-메티오닌 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20170044575A
KR20170044575A KR1020160092089A KR20160092089A KR20170044575A KR 20170044575 A KR20170044575 A KR 20170044575A KR 1020160092089 A KR1020160092089 A KR 1020160092089A KR 20160092089 A KR20160092089 A KR 20160092089A KR 20170044575 A KR20170044575 A KR 20170044575A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
methionine
acetyl
bio
producing
puctk
Prior art date
Application number
KR1020160092089A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101821050B1 (ko
Inventor
전진우
문준옥
박진승
최수진
홍국기
김정현
박혜민
홍소연
Original Assignee
씨제이제일제당 (주)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 씨제이제일제당 (주) filed Critical 씨제이제일제당 (주)
Priority to NZ741423A priority Critical patent/NZ741423A/en
Priority to CN201680069978.0A priority patent/CN108603206B/zh
Priority to MX2018004416A priority patent/MX2018004416A/es
Priority to EP16855784.1A priority patent/EP3362573A4/en
Priority to CA3001675A priority patent/CA3001675C/en
Priority to UY0001036952A priority patent/UY36952A/es
Priority to BR112018007579-5A priority patent/BR112018007579B1/pt
Priority to US15/766,325 priority patent/US10750762B2/en
Priority to PCT/KR2016/011577 priority patent/WO2017065567A1/en
Priority to TW105133230A priority patent/TWI642359B/zh
Priority to JP2018519350A priority patent/JP7045987B2/ja
Publication of KR20170044575A publication Critical patent/KR20170044575A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101821050B1 publication Critical patent/KR101821050B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/142—Amino acids; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/12—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes by fermentation of natural products, e.g. of vegetable material, animal waste material or biomass
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/14—Pretreatment of feeding-stuffs with enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/10—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for ruminants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01001—Amino-acid N-acetyltransferase (2.3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01048—Cystathionine gamma-synthase (2.5.1.48)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01049—O-acetylhomoserine aminocarboxypropyltransferase (2.5.1.49)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Birds (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 출원은 바이오-기반 N-아세틸-L-메티오닌 및 이의 생산방법에 관한 것이다. 또한 본 출원은 상기 N-아세틸-L-메티오닌을 포함하는 사료 첨가제, 상기 사료 첨가제를 포함하는 사료 조성물 및 상기 사료 조성물을 동물에게 급여하는 단계를 포함하는 동물의 사육방법에 관한 것이다.

Description

바이오-기반 N-아세틸-L-메티오닌 및 이의 용도 {Bio-based N-acetyl-L-methionine and use thereof}
본 출원은 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌 및 이의 생산방법에 관한 것이다. 또한 본 출원은 상기 N-아세틸-L-메티오닌, 및 이를 포함하는 사료 첨가제, 및 사료 조성물에 관한 것이다.
생명을 유지하고 새로운 조직을 형성하거나 젖, 고기, 알 등을 생산하는 활동을 이어가기 위하여 동물은 적절한 영양분을 체외로부터 계속적으로 공급받아야 한다. 따라서, 동물에게 사료 외에도 필수적인 영양성분인 아미노산을 직접 급여하여 증체율 및 육질 등의 특성을 개선시키려는 노력이 지속되어 왔다. 하지만 반추동물이 섭취한 대부분의 아미노산은 반추위 내 미생물들의 소화과정을 통해 60 - 70 %가 자체적으로 소비되고 일부 소화가 덜 된 아미노산만 소장에서 소화, 흡수된다. 따라서, 아미노산을 반추동물의 사료에 첨가하여도 양돈, 양계에서와 같은 효과를 얻을 수 없으므로, 반추위를 우회 (bypass)하고 반추동물이 사용할 수 있는 반추위 보호 아미노산의 개발이 필요하다.
즉, 반추동물의 사료에 아미노산을 첨가하고자 하는 경우, 반추위 내 미생물들에 의한 분해 과정을 회피하고 소장에 안정적으로 도달 및 흡수되어야만 하기 때문에, 반추위 내 보호 효과 또는 반추위 우회 (bypass) 효과가 향상된 신규 기술 및 물질에 대한 필요성이 높아지고 있는 추세이다.
한편, N-아세틸-L-메티오닌은 식품 첨가제 및 사료 용도로 기능이 밝혀져 있는 물질이나 제조 비용이 높아 수요가 제한적이다. 또한, 현재까지 이의 제조법은 석유 유래 물질을 원료로 이용하는 것으로, 이에 따라 유한 자원의 고갈 및 환경적인 이슈가 발생하게 된다 (미국등록특허 제7960575호).
기존 N-아세틸-L-메티오닌 제조방법의 구체적 일례로, 석유로부터 D/L-메티오닌을 화학적 합성한 다음 L-메티오닌을 분리한 뒤 아세틸화 과정을 통해 N-아세틸-L-메티오닌을 생산하는 방법이 있으나, D/L-메티오닌 혼합물에서 L-메티오닌만을 분리하는데 비용이 많이 든다는 단점이 있다.
또한, 메티오닌 생산 균주에 아세틸화 효소를 과발현시켜 L-형만 수득할 수 있는 직접 발효 방법 (미국등록특허 제8143031호)이 있으나, DTNB 분석법을 통하여 YncA가 아세틸조효소 에이 (acetyl-CoA)를 이용하는 것을 간접적으로 확인하였을 뿐 효소반응 산물 또는 상기 유전자의 형질전환체가 생산하는 산물로서 N-아세틸-L-메티오닌이 실제로 생성되는지는 확인하지 않았다. 또한, 상기 방법은 수율이 낮아 결국 고비용으로 상업화에 어려움이 있다.
이에, 본 발명자들은 전체 공정에서 이산화탄소의 발생이 적어 친환경적이면서도 고효율 및 경제성이 있는 N-아세틸-L-메티오닌의 생산방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 바이오 기반 L-메티오닌을 고수율로 생산하고, 이를 아세틸화함으로써 환경오염 우려 없이 경제적으로 N-아세틸-L-메티오닌을 생산할 수 있는 방법을 개발하여 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은 (a) (i) 미생물 발효를 통한 L-메티오닌 전구체를 생산하는 단계; 및 (ii) 효소 전환 과정을 통해 상기 L-메티오닌 전구체로부터 L-메티오닌을 생산하는 단계; 및 (b) 상기 L-메티오닌을 아세틸화하는 단계를 포함하는, 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌 생산방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 (a) 미생물 발효를 통해 L-메티오닌을 생산하는 단계; 및 (b) 상기 L-메티오닌을 아세틸화하는 단계를 포함하는, 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌 생산방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 아세틸화 효소 활성을 가지는 N-아세틸-L-메티오닌을 생산하는 미생물의 발효를 통해 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌을 직접 생산하는 단계를 포함하는, 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌 생산방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 바이오 자원 유래 탄소를 포함하는, 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 N-아세틸-L-메티오닌의 집단을 구성하는 탄소의 50 % 내지 100 %가 바이오 자원 유래 탄소인, 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌의 집단을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌 또는 이의 염을 포함하는 사료 첨가제를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌 또는 이의 염을 포함하는 사료 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 사료첨가제 또는 사료 조성물을 동물에게 급여하는 단계를 포함하는 동물의 우유생산량, 유지방 또는 유단백의 증진, 또는 증체 효과를 개선시키는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한, 본 출원의 하나의 양태는 (a) (i) 미생물 발효를 통한 L-메티오닌 전구체를 생산하는 단계; 및 (ii) 효소 전환 과정을 통해 상기 L-메티오닌 전구체로부터 L-메티오닌을 생산하는 단계; 및 (b) 상기 L-메티오닌을 아세틸화하는 단계를 포함하는, 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌 생산방법이다.
본 출원의 다른 양태는 (a) 미생물 발효를 통해 L-메티오닌을 생산하는 단계; 및 (b) 상기 L-메티오닌을 아세틸화하는 단계를 포함하는, 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌 생산방법이다.
본 출원에서 용어 "바이오-기반(bio-based)"은 바이오 자원 (bio resource) 유래의 물질을 의미한다. 용어 "바이오 자원"은 광합성에 의하여 생성되는 다양한 조류 및 식물 자원, 즉 나무, 풀, 농작물의 가지, 잎, 뿌리, 열매 등과 이로부터 얻을 수 있는 모든 물질을 포함하며, 특히 석유 자원을 제외한 친환경적 자원을 의미한다.
본 출원의 N-아세틸-L-메티오닌 생산방법은 석유 유래 물질이 아닌 바이오 탄소원을 발효시켜 L-메티오닌의 전구체를 고효율로 생산하고, 이로부터 N-아세틸-L-메티오닌 (N-acetyl-L-methionine, NALM)을 생산하기 때문에, 친환경적이고 경제적인 방법으로서 산업적으로 매우 유용하다.
이하 본 출원의 N-아세틸-L-메티오닌 생산방법을 상세히 설명한다.
(a) 단계는 (i) 미생물 발효를 통한 L-메티오닌 전구체를 생산하는 단계 및 (ii) 효소 전환 과정을 통해 상기 L-메티오닌 전구체로부터 L-메티오닌을 생산하는 단계를 포함한다.
상기 L-메티오닌 전구체는 바이오 탄소원을 발효하여 생산되는 물질 중 L-메티오닌으로 전환될 수 있는 것을 의미하며, O-아세틸-L-호모세린 (O-acetyl-L-homoserine) 또는 O-석시닐-L-호모세린 (O-succinyl-L-homoserine)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 발효에 이용되는 미생물은 L-메티오닌 전구체를 생산할 수 있는 균주를 말하며, 본 출원에서 사용되는 용어, "L-메티오닌 전구체를 생산할 수 있는 균주"란, L-메티오닌 전구체를 생물체 내에서 생산할 수 있는 원핵 또는 진핵 미생물 균주로서, L-메티오닌 전구체를 균주 내에 축적할 수 있는 균주를 말한다. 상기 L-메티오닌 전구체를 생산할 수 있는 균주는 O-아세틸-L-호모세린 또는 O-석시닐-L-호모세린 생산 균주일 수 있다.
예를 들어, 상기 균주는 에스케리치아 속 (Escherichia sp .), 어위니아 속 (Erwinia sp .), 세라티아 속 (Serratia sp .), 프로비덴시아 속 (Providencia sp .), 코리네박테리움 속 (Corynebacteria sp .), 슈도모나스 속 (Pseudomonas sp .), 렙토스피라 속 (Leptospira sp .), 살모넬라 속 (Salmonellar sp .), 브레비박테리아 속 (Brevibacteria sp .), 하이포모노나스 속 (Hypomononas sp .), 크로모박테리움 속 (Chromobacterium sp .), 노카디아 속 (Norcardia sp .), 곰팡이류 (fungi) 또는 효모류 (yeast)에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있다. 구체적으로는, 에스케리치아 속, 코리네박테리움 속, 렙토스피라 속의 미생물 균주와 효모일 수 있다. 더 구체적으로는, 에스케리치아 속의 미생물 균주일 수 있고, 가장 구체적으로는, 대장균 (Escherichia coli .)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 참고로 상기 균주는 본 발명자들의 선행 특허인 미국등록특허 제8609396호 및 제7851180호에 개시된 균주를 포함할 수 있다.
본 출원에서 용어 "발효"는, 보다 간단한 유기 화합물의 생산을 야기하는 미생물에 의한 유기 물질의 분해를 말한다. 상기 발효는 혐기성 조건 또는 산소 존재 하에 일어날 수 있다. 특히, 본 출원에서 상기 발효는 L-메티오닌 전구체를 생산할 수 있는 균주를 배양함으로써 수행되는 것일 수 있다.
상기에서 제조된 L-메티오닌 전구체 생산 균주의 배양 과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양 방법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다.
배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다. 상기 배지는 다양한 탄소원을 포함할 수 있으며, 기타 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다. 상기 탄소원은 특히 바이오 기반 물질을 포함하는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 상기 바이오 탄소원은 설탕, 포도당 (glucose), 젖당 (lactose), 자당 (sucrose), 유당, 과당 (fructose), 맥아당 (maltose), 녹말 (starch) 및 섬유소 (cellulose)와 같은 탄수화물; 콩 기름 (soybean oil), 해바라기 기름 (sunflower oil), 피마자 기름, 베버 기름 (castor oil) 및 코코넛 기름 (coconut oil)과 같은 지방; 팔미트산 (palmitic acid), 스테아르산 (stearic acid) 및 리놀레산 (linoleic acid)과 같은 지방산; 글리세롤 (glycerol) 및 에탄올 (ethanol)과 같은 알코올과 아세트산 (acetic acid)과 같은 유기산 (organic acid)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 질소원으로는 펩톤 (peptone), 효모추출액 (yeast extract), 육수 (gravy), 맥아추출액 (malt extract), 옥수수침출액 (corn steep liquor (CLS)) 및 콩가루 (bean flour)와 같은 유기 질소원 및 요소 (urea), 암모늄 설페이트 (ammonium sulfate), 암모늄 클로라이드 (chloride), 암모늄 포스페이트 (phosphate), 암모늄 카보네이트 (carbonate) 및 암모늄 니트레이트 (nitrate)와 같은 무기 질소원을 포함한다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인산원으로서 추가적으로 포타슘 디히드로겐 포스페이트 (potassium dihydrogen phosphate), 포타슘 히드로겐 포스페이트 (potassium hydrogen phosphate) 및 상응하는 소듐 포함 염들 (sodium-containing salts)을 포함할 수 있다. 또한 배지는 마그네슘 설페이트 (magnesium sulfate) 또는 아이언 설페이트 (iron sulfate)와 같은 금속을 포함할 수 있다. 또한, 아미노산, 비타민 및 적합한 전구체 등이 첨가될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
또한, 배양 중에 암모늄 히드록사이드 (ammonium hydroxide), 포타슘 히드록사이드 (potassium hydroxide), 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 적절한 방식으로 첨가함으로써 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르 (polyglycol ester)와 같은 소포제를 사용함으로써 배양하는 동안 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양액의 호기성 (aerobic) 조건을 유지하기 위해서, 배양액 내로 산소 또는 산소를 포함한 가스 (예, 공기)가 배양액에 주입될 수 있다. 배양물의 온도는 일반적으로 20 내지 45 ℃, 구체적으로는 25 내지 40 ℃일 수 있다. 배양의 기간은 L-메티오닌 전구체의 생산이 원하는 수준에 도달할 때까지 계속 될 수 있고, 배양시간은 10 내지 160 시간일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 효소 전환 과정은 L-메티오닌 전구체를 효소를 이용하여 L-메티오닌으로 전환하는 과정을 말한다. 구체적으로 효소 전환 과정에서 이용되는 효소는 시스타티오닌-γ-합성효소 (cystathionine-γ-synthase), O-아세틸 호모세린 설프히드릴라제 (O-acetyl homoserine sulfhydrylase) 및 O-석시닐 호모세린 설프히드릴라제 (O-succinyl homoserine sulfhydrylase)로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 효소에 의해 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특히, 상기 효소 전환 과정은 L-메티오닌 전구체 또는 이를 포함하는 발효액 자체에 메틸-머캅탄 (methyl-mercaptan)을 첨가하여 효소와 반응시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 (a) 단계는 미생물 발효를 통해 L-메티오닌을 직접 생산하는 단계일 수 있다. 이 경우 상기 발효에 이용되는 미생물은 L-메티오닌을 생산할 수 있는 균주를 말하며, 본 출원에서 사용되는 용어, "L-메티오닌을 생산할 수 있는 균주"란, L-메티오닌을 생물체 내에서 생산할 수 있는 원핵 또는 진핵 미생물 균주로서, L-메티오닌을 균주 내에 축적할 수 있는 균주를 말한다.
예를 들어, 상기 균주는 에스케리치아 속 (Escherichia sp .), 어위니아 속 (Erwinia sp .), 세라티아 속 (Serratia sp .), 프로비덴시아 속 (Providencia sp .), 코리네박테리움 속 (Corynebacteria sp .), 슈도모나스 속 (Pseudomonas sp .), 렙토스피라 속 (Leptospira sp .), 살모넬라 속 (Salmonellar sp .), 브레비박테리아 속 (Brevibacteria sp .), 하이포모노나스 속 (Hypomononas sp .), 크로모박테리움 속 (Chromobacterium sp .), 노카디아 속 (Norcardia sp .), 곰팡이류 (fungi) 또는 효모류 (yeast)에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있다. 구체적으로는, 에스케리치아 속, 코리네박테리움 속, 렙토스피라 속의 미생물 균주와 효모일 수 있다. 더 구체적으로는, 에스케리치아 속의 미생물 균주일 수 있고, 가장 구체적으로는, 대장균 (Escherichia coli .)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 참고로 상기 균주는 본 발명자들의 선행 특허인 대한민국 등록특허 제10-1140906호에 개시된 균주를 포함할 수 있다.
(b) 단계는 상기 L-메티오닌을 아세틸화하는 단계이다.
상기 L-메티오닌을 아세틸화하는 방법은 화학 합성 방법, 미생물에 의한 생산 방법, 또는 아세틸화 효소에 의해 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 L-메티오닌을 아세틸화 할 수 있는 방법이라면 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
상기 화학 합성 방법은 L-메티오닌의 아민기를 아세틸화 할 수 있는 아세틸화 화합물을 주입하여 상온 또는 고온에서 반응시키는 공정이다. L-메티오닌의 아세틸화 반응에 사용될 수 있는 원료로는 일반적으로 무수초산 (acetic anhydride)이 사용될 수 있으며, 이외에도 전이금속 계열의 촉매를 수반한 아세트산 (acetic acid)이 사용되거나, 비양자성 용매가 적용된 온건한 반응조건의 경우 할로겐화 아세틸 (acetyl halide)이 아세틸화 화합물로 사용될 수 있다. 여기서 고온은 70 내지 100 ℃, 구체적으로는 80 내지 90 ℃일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 아세틸화는 L-메티오닌 및 아세틸-CoA를 포함하는 혼합물에 정제된 아세틸화 효소 또는 아세틸화 효소를 발현하는 미생물을 파쇄하여 수득한 상등액을 첨가하여 수행되는 것일 수 있다. 상기 아세틸화 효소는 L-메티오닌을 N-아세틸-L-메티오닌으로 전환할 수 있는 아실트랜스퍼라제를 포함하며, 예를 들어 YncA (L-amino acid N-acyltransferase MnaT), ArgA (N-acetylglutamate synthase), YjdJ (Putative acetyltransferase), YfaP (Putative acetyltransferase), YedL (Putative acetyltransferase) 또는 YjhQ (Putative acetyltransferase)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 아세틸화 효소는 상기 효소를 발현하도록 형질전환된 대장균, 코리네박테리움 또는 효모로부터 수득한 것일 수 있다. 즉 각각의 아세틸화 효소를 코딩하는 유전자를 이용하여 대장균, 효모, 또는 코리네박테리움을 형질전환시킨 후 이를 배양하여 아세틸화 효소를 정제한 후 이용하거나 상기 형질전환 균주를 파쇄한 뒤 상등액을 수거하여 이용할 수 있다. 또한 상기 형질전환 균주를 파쇄하지 않고 자일렌 등을 이용한 전처리 과정을 거쳐 균주의 세포벽 투과성을 높인 뒤, L-메티오닌을 공급하여 아세틸화 반응을 유도할 수 있다.
나아가, 상기 아세틸화는 미생물 발효를 통해 균주의 배양과 동시에 균주 내 아세틸화 효소 반응을 이용하여 수행될 수 있다. 미생물 직접 발효는 L-메티오닌을 직접 아세틸화 할 수 있는 효소를 포함하고 있는 야생형 균주를 사용하거나, 인공돌연변이를 통해 아세틸화 효소의 활성이 강화된 특징을 가지는 돌연변이체를 사용하거나, L-메티오닌의 아세틸화를 유도할 수 있는 효소를 과발현하여 아세틸화 반응이 개선된 형질전환 균주를 사용할 수 있다. 즉, 아세틸화 효소 활성을 가지는 N-아세틸-L-메티오닌을 생산하는 미생물이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 또한 미생물 내에서 생합성 되는 L-메티오닌 뿐만 아니라 발효 중에 외부에서 공급되는 L-메티오닌을 사용하여 아세틸화 반응을 통한 N-아세틸-L-메티오닌의 생산도 가능하다.
상기 L-메티오닌을 아세틸화하는 단계에서 아세틸화 효소 또는 이를 생산하는 미생물을 이용하는 경우, 아세틸-CoA를 공급하는 단계를 포함하는 것일 수 있는데, 이는 아세틸-CoA를 직접 공급하거나, 미생물 내부에 충분한 양의 아세틸-CoA가 공급되도록 포도당 또는 초산 등을 첨가하여 수행되는 것일 수 있다.
본 출원은 발효를 통해 L-메티오닌 전구체를 제조한 뒤 효소 전환과정을 통해 L-메티오닌을 고수율로 제조하거나, 또는 발효를 통해 직접 L-메티오닌을 고수율로 제조한 후, 다양한 아세틸화 방법을 통해, N-아세틸-L-메티오닌을 제조하는 것으로, 기존 석유 화학 기반의 N-아세틸-L-메티오닌 제조 방법과는 전혀 다른 새로운 패러다임을 제시할 수 있다.
나아가, 본 출원을 통해 N-아세틸-L-메티오닌의 직접 생산이 가능한 야생형 미생물, 그의 인공돌연변이체, 또는 아세틸화 효소의 도입을 통해 N-아세틸-L-메티오닌의 생산능이 향상된 형질전환 균주를 사용하여 직접 발효 또는 전환 반응을 통한 N-아세틸-L-메티오닌의 생산능을 현격히 증가시킬 수 있으며, 이를 통해 현재까지 낮은 생산능을 보이는 N-아세틸-L-메티오닌의 생물학적 생산 방법의 효율을 현격히 개선할 수 있다.
상기 N-아세틸-L-메티오닌은 이를 구성하는 탄소의 적어도 50 % 이상이 바이오 자원 유래 탄소인 것일 수 있다. 예컨대, 상기 N-아세틸-L-메티오닌 생산방법을 통해 생산된 N-아세틸-L-메티오닌을 구성하는 탄소 중 50 % 이상이 바이오 탄소원을 발효하여 얻어진 L-메티오닌 전구체인 O-아세틸-L-호모세린 (O-acetyl-L-homoserine) 또는 O-석시닐-L-호모세린 (O-succinyl-L-homoserine) 유래인 것일 수 있다.
상기 N-아세틸-L-메티오닌이 적어도 50 % 이상의 바이오 자원 유래 탄소를 포함할 수 있는 이유는 분자 구성의 원료가 바이오 자원 유래 탄소에서 오기 때문이다. N-아세틸-L-메티오닌의 분자량은 191.25 g/mol로서 L-호모세린 (119.12 g/mol), 메틸-머캅탄 (48.11 g/mol) 그리고 아세트산 (acetic acid, 59.04 g/mol)으로 구성된다. 결합 시 L-호모세린의 하이드록시기와 메틸-머캅탄의 수소가 떨어지고, 아세트산의 하이드록시기와 L-호모세린의 수소가 떨어져 최종 N-아세틸-L-메티오닌이 만들어진다. L-호모세린은 바이오 자원을 이용한 발효를 통해 얻어지며, N-아세틸-L-메티오닌 전체 분자량의 50 % 이상을 차지한다 (L-호모세린 119. 12 g/mol - 물 (H2O) 18.01 g/mol = 101.11 g/mol, 이 수치는 N-아세틸-L-메티오닌 분자량의 50 % 이상임). 또한, 아세틸화 효소를 이용할 경우 아세트산의 유래도 바이오 자원이므로, N-아세틸-L-메티오닌의 바이오 유래 탄소 함량은 더 커질 수 있다 (물 제거된 L-호모세린 101.11 g/mol + 하이드록시 제거된 아세트산 42.04 g/mol = 143.15 g/mol, N-아세틸-L-메티오닌의 약 75 %를 차지함).
한편, 물질이 석유 유래인지 바이오 유래인지는 방사성 탄소를 측정하는 것으로 가능하다. 즉, 탄소에는 세 종류 (12C, 13C, 14C)의 동위원소가 존재하는데, 석유계 물질의 탄소원에는 14C (방사성 탄소)이 거의 존재하지 않고, 바이오 유래에만 14C이 존재하는 과학적 사실에 근거하여, 14C의 함량 분석을 통해 바이오 유래 여부를 판단할 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 바이오 자원 유래 탄소를 포함하는, 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌이다.
상기 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌은 구성하는 탄소의 50 % 내지 100 %가 바이오 자원 유래 탄소인 것일 수 있다.
본 출원의 또 다른 양태는 N-아세틸-L-메티오닌을 구성하는 탄소의 50 % 내지 100 %가 바이오 자원 유래 탄소인, 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌의 집단이다.
상기 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌은 상기 생산방법을 통해 생산된 것일 수 있다.
바이오 자원, 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌 및 이의 생산방법에 대하여는 상기 설명한 바와 같다.
본 출원은 다른 하나의 양태로서 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌 또는 이의 염을 포함하는 사료 첨가제를 제공한다.
본 출원은 다른 하나의 양태로서 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌 또는 이의 염을 포함하는 사료 조성물을 제공한다.
상기 N-아세틸-L-메티오닌에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 출원에서 용어, "사료 첨가제"는 사료 조성물에 첨가되는 물질을 의미한다. 상기 사료 첨가제는 대상 동물의 생산성 향상이나 건강을 증진시키기 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 사료 첨가제는 반추동물용일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서는 상기 N-아세틸-L-메티오닌 또는 이의 염을 포함하는 사료 첨가제를 사용하며, 상기 사료 첨가제는 상기 N-아세틸-L-메티오닌 또는 이의 염 이외에도 대상 동물의 생산성 또는 건강 증진을 위한 뉴클레오티드류, 아미노산, 칼슘, 인산, 유기산 등의 영양소를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "사료 조성물"은 동물에게 주는 먹이를 말한다. 상기 사료 조성물은 동물의 생명을 유지, 또는 고기, 젖 등을 생산하는데 필요한 유기 또는 무기 영양소를 공급하는 물질을 말한다. 상기 사료 조성물은 사료 첨가제를 포함할 수 있으며, 본 출원의 사료 첨가제는 사료 관리법 상의 보조사료에 해당할 수 있다.
상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
본 출원의 사료용 조성물을 적용할 수 있는 개체는 특별히 한정되지 않고, 어떠한 형태의 것이든 적용 가능하다. 예를 들면, 소, 양, 기린, 낙타, 사슴, 염소 등과 같은 동물에 제한없이 적용가능하며, 특히 바람직하게는 반추위를 가지는 반추동물에 적용가능하고, 대표적인 예로 축우를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 일 구현예에 따르면, 상기 N-아세틸-L-메티오닌 또는 이의 염은 반추위 미생물에 의한 분해 정도가 낮아 반추위 보호 펩타이드 유도체로 이용될 수 있다. 따라서, 상기 N-아세틸-L-메티오닌 또는 이의 염은 반추동물용 사료 첨가제로서 효과적으로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 용어, "반추위"란 포유류 소목의 일부 동물에서 볼 수 있는 특수한 소화관으로, 일명 되새김을 하기 위해 혹위, 벌집위, 겹주름위, 및 주름위의 4 개의 방으로 나뉘어 있다. 일명 되새김위라고도 하며, 한번 삼킨 음식물을 다시 입안으로 토하여 잘 씹은 후에 삼키는 것을 반추라고 하고, 이런 반추를 가능하게 하는 위를 반추위라고 한다. 반추위에는 미생물이 공생하고 있어서 일반적인 동물들이 소화하지 못하는 식물의 셀룰로스를 분해하여 에너지화할 수 있는 능력을 갖게 된다.
본 출원의 용어, "반추동물"이란 상기 설명한 반추위를 갖는 동물을 의미하며, 이에는 낙타과, 애기사슴과, 사슴과, 기린과 및 소과의 동물들이 포함된다. 다만, 낙타과와 애기사슴과는 겹주름위와 주름위가 완벽하게 분화되지 않아 3 개의 방으로 이루어진 반추위를 가지고 있는 것으로 알려져 있다.
상기 사료 첨가제는 사료 총 중량에 대하여 0.01 내지 90 중량 %로 상기 N-아세틸-L-메티오닌 또는 이의 염이 포함되도록 사료 조성물에 첨가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 출원에 따른 사료 첨가제는 개별적으로 사용될 수 있고, 종래 공지된 사료 첨가제와 병용하여 사용될 수 있으며, 종래의 사료 첨가제와 순차적 또는 동시에 사용될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 출원의 또 다른 양태는, 상기 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌 또는 이를 생산하는 미생물을 포함하는 과립제제이다.
바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌 및 이를 생산하는 미생물은 상기 설명한 바와 같다.
상기 과립제제는 N-아세틸-L-메티오닌 생산능을 갖는 미생물의 발효배양액으로부터 직접 과립을 형성시켜 제조할 수 있고, 또는 상기 미생물을 포함하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 발효배양액 및 미생물을 모두 포함하여 제조할 수 있다. 과립 형성 공정은 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
과립건조기 운전 방법 최적화와 비규격 제품의 리사이클 공정을 통해 최종 제품에서 입자의 크기가 500 ㎛ 이하는 0 내지 5 %이고, 500 ㎛ 초과 1000 ㎛ 이하는 20 - 30 %이며, 1000 ㎛ 초과 1300 ㎛ 이하는 60 - 70 %이고, 1300 ㎛ 초과는 5 % 이하의 범위인 제품이 제공될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 한 실시예에 따르면, N-아세틸-L-메티오닌 발효배양액을 총 고형분 (total solid) 40 ~ 50 중량%로 농축하는 단계; 상기 농축액에 부형제 및 자유 N-아세틸-L-메티오닌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 혼합하여 혼합 농축액을 형성하는 단계; 및 과립기에 200 ~ 500 ㎛ 크기의 미립자 시드를 투입하고, 상기 과립기 하부로부터 상기 혼합 농축액을 분사하여 상기 미립자 시드를 코팅하며 상기 미립자 시드의 크기를 증가시켜 양파모양의 과립을 형성시켜, 입자의 크기는 500 ㎛ 이하는 0 내지 5 %이고, 500 ㎛ 초과 1000 ㎛ 이하는 20 - 30 %이며, 1000 ㎛ 초과 1300 ㎛ 이하는 60 - 70 %이고 1300 ㎛ 초과는 5 %이하의 범위가 되도록 과립화하는 단계로 이루어진 과립제제의 제조 방법이 제공된다.
일례로, 본 출원에 따른 과립제제는, 하기 조성과 특성을 가지는 과립화에 의한 N-아세틸-L-메티오닌 발효배양액을 주성분으로 하는 것일 수 있다.
함량 N-아세틸-L-메티오닌 50 중량% 이상;
입자 크기 500 ㎛ 이하 0 내지 5 %, 500 ㎛ 초과 1000 ㎛ 이하 20 - 30 %, 1000 ㎛ 초과 1300 ㎛ 이하 60 - 70 %, 1300 ㎛ 초과 5 %이하 (wt.대비);
겉보기 밀도 670 ± 50 kg/㎥;
단백질 10 ~ 15 중량%;
총당 1 중량% 이하;
무기물 3 중량% 이하;
수분 3 중량% 이하.
상기 혼합 농축액을 형성하는 단계에서 자유 N-아세틸-L-메티오닌 또는 부형제의 첨가량을 조절하여 과립제품의 최종 함량을 원하는 목표 함량으로 조절할 수 있다. 상기 과립화는 상기 과립기 하부에서 혼합 농축액을 노즐로 분사하고, 열풍을 가하여 유동층을 형성하면서 수행되는 것일 수 있다.
상기 과립화하는 단계에서 얻어지는 입자의 크기는 혼합 농축액의 유속, 노즐압 또는 열풍의 풍량을 조절하여 이루어질 수 있다.
상기 부형제는 녹말, 카라기난 및 한천으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 과립제제의 제조에 사용되는 N-아세틸-L-메티오닌을 생산하는 미생물은 GRAS (Generally Recognized as Safe)로 분류되는 미생물일 수 있고, 구체적으로는 단백질 함량이 높은 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp .), 또는 지방 함량이 높은 야로위아 속 (Yarrowia sp .) 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
미생물의 발효 조건은 특별하게 제한되는 것은 아니나, 발효배양액 중의 N-아세틸-L-메티오닌이 많은 양으로 축적되고, 균체량은 적게 축적되는 조건에서 배양하는 것이 바람직하다. 또한, 발효액 중의 당분은 발효액의 건조를 방해하고, 얻어지는 제품의 흡습성을 상승시키기 때문에 그 양을 감소시키는 조건에서 배양하는 것이 바람직하다. 그러나 본 출원에서는 혼합 과정을 통하여 N-아세틸-L-메티오닌의 함량을 조절할 수 있으며 과립 공정의 특성상 제품 겉면이 조밀하기 때문에 발효 조건이 상기 예와 같은 조건에 반드시 한정될 필요는 없다.
본 출원에서는 흡습 방지제는 첨가되지 않아도 흡습 저감 효과가 있으나, 필요한 경우 흡습 방지제로서 실리카, 중합체 등, 바람직하게는 유동 파라핀이 첨가될 수도 있다.
본 출원의 또 다른 양태는, 상기 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌 또는 이의 염을 포함하는 사료첨가제 또는 사료 조성물을 동물에게 급여하는 단계를 포함하는, 동물의 우유생산량, 유지방 또는 유단백의 증진, 또는 증체 효과를 개선시키는 방법이다. 상기 사료첨가제 또는 사료 조성물에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 방법은 자세하게는 (a) 상기 사료 첨가제 또는 사료 조성물을 동물용 사료에 혼합하는 단계; 및 (b) 상기의 사료를 동물에 급여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 출원에 따른 상기 (a) 단계는 본 출원의 N-아세틸-L-메티오닌 또는 이의 염을 포함하는 사료용 조성물을 가축용 일반사료에 혼합하는 단계로, 혼합사료내 0.01 내지 90 중량 %, 바람직하게는 0.1 내지 10 중량 %로 혼합하여 급여할 수 있다.
본 출원에 따른 상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계에서 제조된 사료를 동물에게 급여하는 단계로, 급여할 수 있는 가축은 상기 설명한 바와 같이 특별히 제한되지 않으며, 특히 반추동물일 수 있다.
본 출원에 따른 사료 첨가제 또는 사료 조성물을 동물에 급여할 경우, 동물의 우유생산량, 유지방 또는 유단백의 증진, 또는 증체 효과 등 우수한 효과를 기대할 수 있다.
본 출원의 바이오-기반 N-아세틸-L-메티오닌 생산방법은 바이오 자원을 이용하여 생산한 것으로 환경 오염이 적고, 고수율로 생산 가능하여 경제적인 것으로 산업적으로 매우 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 상기 생산방법으로 생산된 N-아세틸-L-메티오닌은 반추위 우회 (bypass)가 가능하므로 사료 첨가제로서 우수한 효과가 있다.
도 1은 N-아세틸-L-메티오닌의 반추위 우회율 (%)을 그래프로 나타낸 것이다.
이하 실시예를 통하여 본 출원을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 출원을 예시하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 바이오 기반 L-메티오닌 (L- methionine ) 생산
실시예 1-1. L-메티오닌 전구체 생산 균주의 발효
L-메티오닌 전구체 생산 균주로서 O-아세틸 호모세린 생산 균주인 대장균 CJM-BTJA/pCJ-MetXlme-CL (대한민국 등록특허 제10-0905381호)을 이용하여 L-메티오닌 전구체 (O-아세틸 호모세린)를 대량 생산하기 위하여 5 L 발효조 배양을 실시하였다. 항생제가 함유된 평판 LB 배지에 상기 균주를 접종하여 31 ℃에서 하룻밤 배양하였다. 그 후, 단일 콜로니를 항생제가 포함된 10 ml LB 배지에 접종한 후 31 ℃에서 5 시간 배양하고, 다시 200 ml L-메티오닌 전구체 Seed 배지를 포함하는 1000 ml 삼각플라스크에 100 배 희석하여 31 ℃, 200 rpm에서 3 내지 10 시간 배양 후, 5 L 발효조에 접종하여 유가식 배양 (Fed batch) 발효법으로 50 내지 100 시간 배양하였다. 주 배양 발효 배지의 조성을 하기 표 1에 나타내었다.
L-메티오닌 전구체 생산 발효 배지 조성
조성 Seed 배지
(seed media)		 주 배지
(main media)		 Feed 배지
(feed media)
글루코스 (g/L) 10.1 40 600
MgSO4 ㆍ7H20(g/L) 0.5 4.2
Yeast extract(g/L) 10 3.2
KH2PO4 3 3 8
Ammonium sulfate(g/L) 6.3
NH4Cl(g/L) 1
NaCl(g/L) 0.5
Na2HPO4 ㆍ 12H2O(g/L) 5.07
DL-Methionine(g/L) 0.5 0.5
L-Isoleucine(g/L) 0.05 0.5 0.5
L-Threonine(g/L) 0.5 0.5
실시예 1-2. L-메티오닌 전환반응
상기 실시예 1에서 생산된 발효 배양액을 막 여과(membrane filtration)를 이용하여 여과함으로써, O-아세틸 호모세린 배양액과 세포를 분리하였다. 0.1 ㎛의 막을 이용하여 통과된 액체, 즉 세포를 분리한 나머지를 투과액 (permeate)이라 하고, 세포 슬러지 (cell sludge)를 보유액 (retentate)이라 하였다.
상기 보유액에 탈이온수 (deionized water)를 첨가하여 남아있는 O-아세틸 호모세린을 재회수하였다.
상기 투과액에 O-아세틸 호모세린 설피드릴라아제 (O-acetylhomoserine sulfhydrylase) 활성을 가지는 효소 또는 상기 효소를 포함한 균주를 이용하여 메팁머캅탄과 L-메티오닌 전환효소인 O-아세틸 호모세린 설피드릴라아제 또는 로도박터 스페로이드 (Rhodobacter sphaeroides) 유래 O-아세틸 호모세린 설피드랄라아제 (O-acetylhomoserine sulfhydrylase, 대한민국 등록특허 제10-1250651호)를 첨가하여 효소전환반응을 수행하였다.
반응 중 잔존 O-아세틸 호모세린의 농도를 측정하고 메틸머캅탄을 공급하여 6 시간 동안 효소전환 반응을 수행하여 O-아세틸 호모세린의 농도가 측정되지 않을 때 반응을 종료하였다.
실시예 1-3. L-메티오닌의 결정화 공정
상기 L-메티오닌 전환액을 그대로 사용하여도 무방하나, L-메티오닌의 함량이 높은 조성물을 얻기 위하여, 상기 실시예 1-2에서 제조된 L-메티오닌 전환액을 농축하여 결정을 분리할 수도 있고, 황산을 투입하여 pH 4.0 내지 5.5로 적정한 후 농축할 수도 있다. 본 실시예에서는 보다 높은 순도의 L-메티오닌을 얻기 위하여, 황산을 투입하여 pH 4.0 내지 5.5로 적정한 후, L-메티오닌 총량의 0.5 내지 2 중량 %의 활성탄 (active carbon)을 첨가하여 50 ℃에서 1 내지 2 시간 동안 혼합한 후 여과하여 활성탄 및 불순물을 제거하였다. 여과액은 L-메티오닌의 농도가 150 내지 200 g/L가 될 때까지 농축하였고, 결정 분리기를 이용해 결정을 획득하였다. 결정을 분리하고 회수된 모액은 다시 농축하여 2 차 결정을 회수하였고, 획득된 2 차 결정은 용해하여 pH 4.0 내지 5.5로 적정된 L-메티오닌 반응액에 재투입하여 상기 과정을 반복하여 사용하였다. 이렇게 하여 95.0 ~ 99.9 중량%의 L-메티오닌을 수득하였다.
실시예 2: 화학 합성 방법을 이용한 N-아세틸-L-메티오닌 (N-acetyl-L-methionine)의 합성
250 ml 플라스크에 상기 실시예 1에서 제조한 L-메티오닌 20 g (0.134 몰)을 에틸아세테이트 30 g과 혼합하여 넣은 뒤, 교반을 진행하여 현탁액 상태의 L-메티오닌 용액을 제조하였다. 30 분 동안 교반을 진행하여 L-메티오닌 입자를 고르게 분산시킨 후 진한 황산 (98.5 %) 0.133 g과 증류수 0.666 g을 투입하면 하얀색 결정이 석출되면서 반응물의 상이 슬러리 상태로 전환된다. 이때 교반을 유지 하면서 L-메티오닌의 아민기를 아세틸화 할 수 있는 아세틸화 화합물 (무수초산 (acetic anhydride, 97 %) 14.4 g (0.141 몰))을 천천히 주입하고, 플라스크에 응축관을 장착하여 가열을 진행하였다. 칠러 냉각기를 이용하여 응축관의 온도를 0 ℃ 이하로 유지하면서 가열을 진행하면 기화된 에틸아세테이트가 응축관 내에서 응축되면서 플라스크 내로 환류되고 이때 반응물의 온도는 83 ℃로 유지된다. 20 분간 반응을 진행하면 슬러리 상태의 반응물이 색이 점차 바뀌어 이내 노란색의 투명한 액체로 전환되며 이때 반응물을 회수하여 급냉을 진행하였다.
상기 반응 생성물을 1 내지 2 시간 정도 강하게 교반하면 액체 내 하얀색 N-아세틸-L-메티오닌 결정이 생기기 시작하며, 결정이 완전히 형성된 이후 진공 필터를 이용하여 노란색 상등액을 제거하였다. 회수된 N-아세틸-L-메티오닌을 0 ℃로 냉각된 에틸아세테이트를 이용해 세척한 후 진공 필터를 이용하여 다시 한 번 정제하였으며 감압 건조 장치를 이용하여 50 ℃, -0.1 Mpa에서 1 시간 동안 건조하였다. 건조 이후 회수된 N-아세틸-L-메티오닌의 질량은 19.448 g (정제 수율 = 77.8 %)로 확인되었고, HPLC 분석을 통해 확인한 순도는 95.8 %, 잔존 L-메티오닌은 0.6 %로 확인되었다.
또한, 상기 화학 합성 방법을 이용한 N-아세틸-L-메티오닌의 바이오 유래 함량 평가를 위해 미국등록특허 제8946472호의 “바이오-기반 함량 (Bio-based content)” 측정 방법을 참고하여 분석을 진행하였으며, 하기의 공식을 이용하여 바이오-기반 함량을 도출하였다.
Bio-Based Content = 14C/12C ratio sampe / 14C/12C ratio modern / 1.075
평가 결과 화학 합성을 통해 생산된 N-아세틸-L-메티오닌의 평균 바이오-기반 함량 (MEAN BIO-BASED CONTENT)은 51.9%로 확인되었다.
실시예 3: 효소 반응을 기반으로 한 L-메티오닌의 N-아세틸-L-메티오닌 전환
L-메티오닌을 이용하여 효소 반응을 기반으로 한 N-아세틸-L-메티오닌 전환 연구를 수행하였다.
아세틸화 효소 반응을 통해 N-아세틸-L-메티오닌을 생산하기 위해서 슈도모나스 푸티다 유래 N-아실트랜스퍼라제 (N-acyltransferase, ppmat), 바실러스 서브틸리스 유래 N-아실트랜스퍼라제 (bsmat), 엔테로박터 sp. 638 유래 N-아실트랜스퍼라제 (entmat), 슈도비브리오 sp. FO-BEG1 유래 N-아실트랜스퍼라제 (pvmat), 야로위아 리포라이티카 유래 N-아실트랜스퍼라제 (ylmat), 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 N-아실트랜스퍼라제 (cgmat), 대장균 유래 N-아실트랜스퍼라제 (yncA) 효소를 사용하였다. 상기 N-아실트랜스퍼라제 효소는 아세틸-CoA로부터 아세틸 그룹을 기질에 전달해주는 역할을 한다. 이러한 효소 반응은 추가적으로 ArgA (N-acetylglutamate synthase), YjdJ (Putative acetyltransferase), YfaP (Putative acetyltransferase), YedL (Putative acetyltransferase), YjhQ (Putative acetyltransferase) 등의 효소들을 통해서도 적용이 가능하며, 더 나아가 서열 기반 상동성이 높은 다른 아실트랜스퍼라제 기능을 갖는 효소의 적용도 가능하다.
상기 7 종의 N-아실트랜스퍼라제를 코딩하는 DNA 단편들을 각각 제한효소 NdeI 및 XbaI 말단을 갖도록 준비한 후, 동일한 제한효소로 처리된 pUCtk 벡터에 라이게이션하였다. 상기 제작된 재조합 플라스미드를 대장균 DH5α에 형질전환시킨 후, 이를 카나마이신 함유 LB 고체 배지에 도말하여 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 상기 배양에서 얻어진 콜로니 하나를 카나마이신 함유 LB 액체 배지 3 ml에 접종하여 밤새 배양한 후, 플라스미드 미니프렙키트 (Bioneer, Korea)를 이용하여 재조합 플라스미드를 회수하였다. 회수한 재조합 플라스미드의 서열정보를 시퀀싱 (Macrogen社, Korea)을 통하여 확인하였고, 각각 pUCtk-ppmat, pUCtk-bsmat, pUCtk-entmat, pUCtk-pvmat, pUCtk-ylmat, pUCtk-cgmat, pUCtk-yncA로 명명하였다.
상기 재조합 플라스미드를 도입해 형질전환된 대장균 BL21(DE3)을 카나마이신 함유 LB 고체 배지에서 선택하였다. 선택된 형질전환체는 각각 BL21(DE3)/pUCtk-ppmat, BL21(DE3)/pUCtk-bsmat, BL21(DE3)/pUCtk-entmat, BL21(DE3)/pUCtk-pvmat, BL21(DE3)/pUCtk-ylmat, BL21(DE3)/pUCtk-cgmat, BL21(DE3)/pUCtk-yncA로 명명하였다.
상기 제작한 형질전환체 BL21(DE3)/pUCtk-ppmat, BL21(DE3)/pUCtk-bsmat, BL21(DE3)/pUCtk-entmat, BL21(DE3)/pUCtk-pvmat, BL21(DE3)/pUCtk-ylmat, BL21(DE3)/pUCtk-cgmat, BL21(DE3)/pUCtk-yncA의 각 콜로니 하나를 카나마이신 25 mg/L, 포도당 1 % (w/v)가 함유된 LB 액체 배지 3 ml에 접종하여 37 ℃에서 8 시간 배양한 후, 동일배지 50 ml에 접종하여 밤새 배양하였다. 상기 배양액을 원심분리하여 펠렛을 얻고 인산완충액 (pH 7.0, 50 mM) 5 ml에 현탁한 후 소니케이션 (sonication)을 이용해 세포를 파쇄하였다. 세포 찌꺼기 (debris)는 14,000 rpm에서 30 분 원심분리하여 제거하고 상등액을 수득하였다. 상기 아실트랜스퍼라제의 크기가 모두 19 kDa 근처임을 감안해 Amicon Ultra (Milipore, Ireland) 30-kDa cut-off membrane을 통과한 여과액을 10-kDa cut-off membrane에 통과시켜 필터 위에 남은 농축액을 얻었다. 상기 농축액을 Q sepharose가 충진된 HiTrap Q FF 칼럼 (GE, USA)에 충진하고 NaCl 농도 구배 (80, 100, 150, 200, 300, 500 mM 순서)를 이용하여 상기 아실트랜스퍼라제를 순수하게 분리하였다. 희석된 효소는 Amicon Ultra 10-kDa cut-off membrane을 통하여 재농축하였다. 상기 아실트랜스퍼라제의 과발현 정도와 정제 정도는 SDS-PAGE를 통하여 확인하였다.
상기 정제된 아실트랜스퍼라제를 통한 N-아세틸-L-메티오닌의 생산량을 확인하기 위하여, 20 mM 아세틸-CoA, 20 mM 메티오닌을 함유한 인산완충액 (pH 7.0, 50 mM)에 효소 농축액을 넣어 37 ℃에서 1 시간 반응한 후, 생성된 N-아세틸-L-메티오닌 양을 HPLC 이용하여 측정하였다.
신규 아실트랜스퍼라제 전환 반응을 통한 N-아세틸-L-메티오닌 생산
아실트랜스퍼라제 전환 반응액의 N-아세틸-L-메티오닌 농도 (g/L)
BL21(DE3)/pUCtk-ppmat 2.9
BL21(DE3)/pUCtk-bsmat 1.4
BL21(DE3)/pUCtk-entmat 1.9
BL21(DE3)/pUCtk-pvmat 0.5
BL21(DE3)/pUCtk-ylmat 0.3
BL21(DE3)/pUCtk-cgmat 1.1
BL21(DE3)/ pUCtk - yncA 1.3
상기 결과로부터, L-메티오닌은 아실트랜스퍼라제에 의해 N-아세틸-L-메티오닌으로 전환됨을 확인하였다. 상기 전환 반응은 완충액 용액에 희석된 L-메티오닌 뿐만 아니라 발효 및 효소 전환 반응을 통해 생산된 배양액 내의 정제되지 않은 L-메티오닌도 가능하다. 한편, 포도당 또는 초산 등의 첨가를 통해서 아실트랜스퍼라제의 효소균 내부에 충분한 양의 아세틸-CoA 공급을 위한 대사공학적 접근이 가능하며, 또는 발효 공정의 개량을 통해 N-아세틸-L-메티오닌의 생산 수율을 개선할 수 있다.
바이오-기반의 L-메티오닌을 이용한 N-아세틸화 방법에 관한 상기 실시예는 예시적인 것이며 한정적이지 않은 것으로 이해되어야 한다. 즉, 본 출원의 바이오 기반 N-아세틸-L-메티오닌의 생산방법은 바이오 기반 원료를 발효하여 고수율로 L-메티오닌을 생산하고, 이를 다양한 아세틸화 공정을 통해 손쉽고 간단한 방법으로 N-아세틸-L-메티오닌을 제조하는 것이다. 상기 실시예는 이를 대표적으로 수행한 것이다.
실시예 4 : N- 아실트랜스퍼라제 도입 형질전환체를 이용한 N-아세틸-L-메티오닌 생산
상기 실시예 3에서 제작한 형질전환체 BL21(DE3)/pUCtk-ppmat, BL21(DE3)/pUCtk-bsmat, BL21(DE3)/pUCtk-entmat, BL21(DE3)/pUCtk- pvmat, BL21(DE3)/pUCtk-ylmat, BL21(DE3)/pUCtk-cgmat, 및 BL21(DE3)/pUCtk-yncA의 각 콜로니 하나를 카나마이신 25 mg/L, 포도당 1 % (w/v)가 함유된 LB 액체 배지 3 ml에 접종하여 37 ℃에서 8 시간 배양한 후, 배양액 500 ㎕를 카나마이신 25 mg/L, 포도당 1 % (w/v), 메티오닌 2 % (w/v)가 함유된 LB 액체 배지 50 ml에 접종하여 밤새 배양하였다. 이때 대조군은 목적유전자가 삽입되지 않은 pUCtk 벡터만을 BL21 (DE3)에 형질전환하여 사용하였다. 배양액 내 세포를 원심분리로 제거하고 HPLC를 이용해 생성된 N-아세틸-L-메티오닌을 분석하였다.
그 결과, BL21(DE3)/pUCtk-ppmat의 경우 가장 높은 3.03 g/L의 농도로 N-아세틸-L-메티오닌을 생산하였고, BL21(DE3)/pUCtk-entmat가 2.23 g/L로 두 번째로 높은 N-아세틸-L-메티오닌 농도를 보였다. 대조군의 경우도 미량의 N-아세틸-L-메티오닌이 검출되었는데, 이는 대장균이 보유하고 있는 YncA 효소의 역할인 것으로 추정되며, 이를 야생형 대장균에서 과발현시킬 경우 야생형 대장균 대비 N-아세틸-L-메티오닌의 생산량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (표 3).
아실트랜스퍼라제로 형질전환된 대장균의 N-아세틸-L-메티오닌 생산능
형질전환체 배양액의 N-아세틸-L-메티오닌 농도 (g/L)
BL21(DE3)/ pUCtk < 0.1
BL21(DE3)/pUCtk-ppmat 3.03
BL21(DE3)/pUCtk-bsmat 1.60
BL21(DE3)/pUCtk-entmat 2.23
BL21(DE3)/pUCtk-pvmat 0.17
BL21(DE3)/pUCtk-ylmat 0.13
BL21(DE3)/pUCtk-cgmat 0.58
BL21(DE3)/ pUCtk - yncA 1.15
또한, 형질전환 대장균을 기반으로 생산한 N-아세틸-L-메티오닌의 바이오 유래 함량 평가를 위해, 미국등록특허 제8946472호의 “바이오-기반 함량 (Bio-based content)” 측정 방법을 참고하여 분석을 진행하였다. 평가 결과 형질 전환 대장균 통해 생산된 N-아세틸-L-메티오닌의 평균 바이오-기반 함량 (MEAN BIO-BASED CONTENT)은 76.6%로 확인되었다.
이로부터 화학합성 공정, 또는 아세틸화효소 또는 이를 생산하는 미생물에 의해 L-메티오닌을 아세틸화할 수 있음을 확인하였고, 특히 아세틸화 효소 반응을 통해 바이오 기반 N-아세틸-L-메티오닌의 친환경적, 고효율 생산이 가능함을 확인하였다.
실시예 5 : 형질 전환 된 L-메티오닌 생산 균주의 발효를 통한 N-아세틸-L-메티오닌 생산
실시예 5-1. L-메티오닌 생산 균주를 이용한 직접 발효 및 이의 효소 전환반응
L-메티오닌 생산 균주로서, 대장균 TF4076BJF metA#10 + metYX (Lm) (대한민국 등록특허 제10-1140906호; 이하 metA10YXLm)를 이용하여 L-메티오닌을 생산하기 위한 삼각플라스크 배양을 실시하였다. 평판 LB 배지에 상기 균주를 접종하여 31 ℃에서 하룻밤 배양하였다. 형성된 단일 콜로니를 10 ml L-메티오닌 Seed 배지에 접종한 후 31 ℃ 에서 6 시간 배양한 후 Seed 배양액 1 ml을 L-메티오닌 주 발효 배지 20 ml을 포함하는 250 ml 삼각플라스크에 접종하여 31 ℃, 200 rpm에서 78 시간 배양하였다. Seed 배지 및 주 발효 배지의 조성은 하기 표 4에 나타내었다.
L-메티오닌 생산 플라스크 발효 배지 조성
조성
(g/L)		 Seed 배지
(seed media)		 주 배지
(main media)
포도당 2 40
MgSO4·7H20 0.49 1
Yeast extract 10 2
KH2PO4 3 2
Ammonium sulfate 17
CaCl2·2H2O 0.015
CaCO3 30
NaCl 0.5
Na2HPO4·12H2O 6
MnSO4·7H2O 0.01
FeSO4·7H2O 0.01
ZnSO4·7H2O 0.01
L-Threonine 0.3
상기 L-메티오닌 배양액 중의 L-메티오닌 농도를 HPLC를 이용하여 분석한 결과, 6.6 g/L의 L-메티오닌이 생성되었음을 확인하였다.
또한, 상기 L-메티오닌 직접 발효 균주로부터 생산된 L-메티오닌을 대상으로 아실트랜스퍼라제를 사용하여 N-아세틸-L-메티오닌의 생산을 수행하였다. 실시예 3과 동일한 방법으로 확보된 정제 아실트랜스퍼라제를 활용하여 평가를 진행하였으며, 실험 방법 중 L-메티오닌은 상기 직접 발효를 통해 확보된 배양액을 첨가하여 진행하였다. 즉, 20 mM 아세틸-CoA 및 L-메티오닌 직접 발효 배양액을 인산완충액 (pH 7.0, 50 mM)과 혼합한 뒤 효소 농축액을 넣어 37 ℃에서 1 시간 반응한 후 생성된 N-아세틸-L-메티오닌 양을 HPLC를 이용하여 측정하였으며, 실험 결과는 다음과 같다.
L-메티오닌 직접 발효 배양액 기반 아실트랜스퍼라제 전환 반응을 통한 N-아세틸-L-메티오닌 생산능
아실트랜스퍼라제 L-메티오닌 직접 발효 배양액을 통해 생산된 N-아세틸-L-메티오닌 농도 (g/L)
BL21(DE3)/pUCtk-ppmat 3.73
BL21(DE3)/pUCtk-bsmat 1.92
BL21(DE3)/pUCtk-entmat 2.87
BL21(DE3)/pUCtk-pvmat 0.75
BL21(DE3)/pUCtk-ylmat 0.39
BL21(DE3)/pUCtk-cgmat 1.23
BL21(DE3)/ pUCtk - yncA 1.63
상기 실시예는 직접 발효로 생산된 L-메티오닌 배양액을 대상으로 N-아세틸-L-메티오닌의 생산능이 평가되었지만, 실시예 3과 동일하게 직접 발효를 통해 생산된 L-메티오닌의 정제 분말을 사용해서도 N-아세틸-L-메티오닌의 생산이 가능하다.
실시예 5-2. N- 아실트랜스퍼라제가 도입된 L-메티오닌 직접 생산 균주 유래 형질전환체 (N-아세틸-L-메티오닌 직접 생산 균주)의 발효를 통한 N-아세틸-L-메티오닌 생산
L-메티오닌 생산 균주로서, 대장균 TF4076BJF metA#10 + metYX (Lm) (대한민국 등록특허 제10-1140906호; 이하 metA10YXLm)을 활용하여 발효를 통한 N-아세틸-L-메티오닌의 직접 생산을 시도하였다. 실시예 3에서 제작된 pUCtk-ppmat, pUCtk-bsmat, pUCtk-entmat, pUCtk-pvmat, pUCtk-ylmat, pUCtk-cgmat, pUCtk-yncA를 각각 도입하여 형질전환된 대장균 metA10YXLm 유래 형질전환체들을 카나마이신 함유 LB 고체 배지에서 선별하였다. 선별된 형질전환체는 각각 metA10YXLm/pUCtk-ppmat, metA10YXLm/pUCtk-bsmat, metA10YXLm/pUCtk-entmat, metA10YXLm/pUCtk-pvmat, metA10YXLm/pUCtk-ylmat, metA10YXLm/pUCtk-cgmat, metA10YXLm/pUCtk-yncA로 명명하였다. 상기 형질 전환된 균주를 대상으로 실시예 5-1에 기술된 발효 조건에 따라 배양 및 분석을 진행하였다. 분석 결과 metA10YXLm/pUCtk-ppmat의 경우 가장 높은 8.32 g/L의 농도로 N-아세틸-L-메티오닌을 생산하였고, metA10YXLm/pUCtk-entmat가 6.19 g/L로 두 번째로 높은 N-아세틸-L-메티오닌 농도를 보였다 (표 6).
또한, 상기 구축된 형질전환체를 대상으로 N-아세틸-L-메티오닌의 직접 생산능 향상을 위해 외부에서 추가적인 L-메티오닌을 공급하여 비교 평가를 진행하였다. 이를 위해 2 %의 L-메티오닌을 상기 발효 조건에 추가적으로 첨가하였다. 분석 결과 모든 형질 전환체의 N-아세틸-L-메티오닌의 생산량 증가를 확인하였으며, 특히 L-메티오닌 미첨가시에도 가장 높은 생산량을 보였던 metA10YXLm/pUCtk-ppmat 균주에서 가장 높은 N-아세틸-L-메티오닌 생산량 (14.1 g/L)을 확인하였다 (표 6). 이러한 결과를 통해 L-메티오닌의 생산능이 더욱 향상된 균주를 활용하여 N-아세틸-L-메티오닌을 생산할 경우 더 높은 생산량을 기대할 수 있으며, 동시에 외부에서의 L-메티오닌 추가 공급을 통해서 N-아세틸-L-메티오닌의 생산량 증가 또한 기대할 수 있다. 특히 야생형 대장균의 경우 YncA 효소를 가지고 있기 때문에 극미량의 N-아세틸-L-메티오닌의 생산능이 확인된 반면 (실시예 4), L-메티오닌의 생산능이 증가된 N-아세틸-L-메티오닌 생산 균주의 경우 대조군에서도 N-아세틸-L-메티오닌의 생산량이 증가하는 것을 확인하였다. 이는 균주 내에서 생산되거나 외부에서 공급된 L-메티오닌으로 인해 N-아세틸-L-메티오닌의 생산량이 증가한 것으로 판단된다.
아실트랜스퍼라제로 형질전환된 N-아세틸-L-메티오닌 직접 생산 균주의 N-아세틸-L-메티오닌 생산능
형질전환체 배양액의 N-아세틸-L-메티오닌 농도 (g/L)
외부 L-메티오닌 미첨가 외부 L-메티오닌 첨가
metA10YXLm / pUCtk 0.11 0.25
metA10YXLm/pUCtk-ppmat 8.32 14.1
metA10YXLm/pUCtk-bsmat 4.17 7.35
metA10YXLm/pUCtk-entmat 6.19 10.9
metA10YXLm/pUCtk-pvmat 0.76 1.33
metA10YXLm/pUCtk-ylmat 0.39 0.69
metA10YXLm/pUCtk-cgmat 2.02 3.12
metA10YXLm/pUCtk-yncA 3.18 5.29
또한, 직접발효를 통해 생산된 N-아세틸-L-메티오닌의 바이오 유래 함량 평가를 위해, 미국등록특허 제8946472호의 "바이오-기반 함량 (Bio-based content)" 측정 방법을 참고하여 분석을 진행하였다. 평가 결과 직접발효를 통해 생산된 N-아세틸-L-메티오닌의 평균 바이오-기반 함량 (MEAN BIO-BASED CONTENT)은 99.3%로 확인되었다.
실시예 6: 생체 외 반추위 발효를 통한 바이오-기반 N-아세틸-L-메티오닌의 우회 (bypass) 효율 측정 실험
6-1. 반추위액 채취
반추위 캐뉼라 장착 홀스테인 (Holstein) 거세우 (체중 630~650 kg 내외) 1 두를 공시하였으며, 공시축은 하루에 2 회 (오전 7 시 30 분, 오후 3 시) 시판사료(밀크젠TM, CJ제일제당社) 및 볏짚을 급여하여 사육하였다.
반추위액의 채취는 실험 당일 오전 10 시경에 진행하였으며, 캐뉼라를 통해 반추위 내용물을 꺼낸 뒤 거즈로 위액을 짜서 추출한 다음, 보온병에 담아 CO2로 버블링 (bubbling)하여, 산소의 침입을 차단한 상태로 실험실로 운반한 뒤 사용하였다. 실험실까지 운반하는데 1 시간 이내로 소요되었다.
6-2. 혐기배양 진행
실험실로 운반된 반추위액은 2 겹의 거즈로 여과 후 반추위 실험에서 일반적으로 사용되고 있는 McDougall's 완충액 (Troelsen and Donna, 1966)의 모사액과 1 : 3의 비율로 혼합하여 혐기 배양액으로 사용하였다. McDougall's 완충액의 모사액 조성은 하기 표 7에서 보는 것과 같다.
McDougall's 완충액 모사액의 조성
buffer (1L 기준)
NaH2PO4·2H2O 9.3 g
NaHCO3 9.8 g
NaCl 0.47 g
KCl 0.57 g
MgCl2 0.256 g
Cacl2 0.106 g
EZMIX N-ZAMIN 2.5 g
resazulin (0.1 %) 1.5 ml
시험사료는 실제로 소 사육 시 사용하고 있는 시판사료(밀크젠TM)를 기초사료로 사용하였고, 기초사료에 시험물질을 혼합하여 시험사료를 제조하였다. 시험물질은 N-아세틸-L-메티오닌이고, 이를 실험군 1로 하여, 시험물질 없이 기초사료로만 이루어진 대조군 1과 L-메티오닌을 시험물질로 사용한 대조군 2를 비교하였다. 각 실험군 마다 3 반복으로 배양을 진행하였다.
기초사료와 시험물질을 4 : 1의 비율로 혼합하였고 (기초사료 0.4 g, 시험물질 0.1 g, 단, 대조군 1은 기초사료만 0.5 g), 125 ml 배양병에 혼합된 시험사료 0.5 g을 첨가한 다음, 준비된 혐기 배양액 50 ml을 혼합한 뒤 밀폐하여 40 ℃ 인큐베이터에 정치함으로써 배양을 개시하였다.
반추위액 희석을 포함한 배양개시까지의 전 과정 동안 O2 free CO2를 분사하여 반추위액이 산소에 노출되지 않도록 혐기 상태를 유지하고자 하였다.
6-3. 샘플링 (sampling) 및 시험물질의 반추위 우회 (bypass) 효율 측정 결과
배양은 최종적으로 48 시간 동안 진행되었고, 배양액 샘플링 (sampling)은 배양 개시 후, 총 4 차례 (0 h, 24 h, 36 h, 48 h) 진행하였다. 각 샘플링 시, 40 ℃ 인큐베이터에 정치시킨 표본을 꺼내 뚜껑을 연 후, 배양액을 원심분리 (4000 rpm, 10 분)하여 상층액 내에 존재하는 시험물질의 양을 측정하였다.
시험물질의 LC 정량분석 결과를 토대로 반추위 우회율 (%)을 계산했고, 값은 하기 표 8에서 보이는 것과 같았다.
N-아세틸-L-메티오닌의 반추위 우회율 (%)
반추위 우회율 (%)
　 0 h 24 h
　 1 2 3 평균값 SD 1 2 3 평균값 SD
대조군 2(L-methionine) 100 100 100 100 0.0 51.2 62.6 62.7 58.8 6.7
실험군 1(N-acetyl-L-methionine) 100 100 100 100 0.0 87.5 90.5 89.4 89.1 1.5
　
　 36h 48h
　 1 2 3 평균값 SD 1 2 3 평균값 SD
대조군 2(L-methionine) 29.4 42.3 36.2 36.0 6.5 1.9 1.5 0.9 1.5 0.5
실험군 1(N-acetyl-L-methionine) 72.5 80.1 76.0 76.2 3.8 52.6 57.2 56.5 55.4 2.5
우회율 (%)은 0 h 샘플링 시점의 시험 물질의 잔존량을 100 %로 환산했을 때 24 h, 36 h, 48 h 표본의 상대적인 잔존량 (%)으로 나타냈다. 도 1은 반추위 우회율(%)을 그래프로 나타낸 것이다.
결과적으로, 대조군인 L-메티오닌은 0 h 대비, 48 h 이후의 반추위 우회율 (%)이 1.5 %로, 반추위 미생물에 의해 거의 대부분 소화된 것을 확인할 수 있었고, 시험물질인 N-아세틸-L-메티오닌은 0 h 대비, 24 h에 89.1 %, 36 h에 76.2 % 그리고 48 h에 55.4 %의 반추위 우회율 (%)을 보였다.
실시예 7: 생체 외 소장 및 간 추출액을 통한 바이오-기반 N-아세틸-L-메티오닌의 소화 분해율 측정 실험
반추위 내 미생물에 의해 분해되지 않은 영양 성분들은 소장에서 흡수되어 단백질 합성, 에너지 대사 등에 활용된다. N-아세틸-L-메티오닌의 경우 높은 bypass 효율로 소장으로 전달될 것으로 예상된다. 이에, 소장 및 간에 존재하는 분해 효소의 적용을 통해 메티오닌 형태로 전환될 수 있으므로, 반추위 동물의 소장에서 용이하게 흡수 이용될 것이다. 이러한 이유로 실제 소의 소장 및 간에 존재하는 효소들을 대상으로 N-아세틸-L-메티오닌의 소화 분해 가능성을 확인하였다.
실시예 7-1. 소장 추출액 확보
농협중앙회 부천축산물공판장에서 도축된 한우 (이력변호: KOR005078680400)의 소장을 40 m 구매하였다. 소장을 1 m 내외로 자른 후에, 자른 소장 안에 20 mM 소듐 포스페이트 완충액 (pH 7.4) 5 ml를 넣고 소장의 양쪽 끝을 잡은 후에 좌우, 상하로 소장을 움직여서 최대한 소장 안의 효소가 소듐 포스페이트 완충액에 녹아날 수 있도록 하였다. 소장 40 m로부터 대략 200 ml의 소장 효소액을 확보하였으며, 4 ℃에서 원심분리 (14000 rpm, 10 분)하여 상층액을 확보하고, 이를 20 mM 소듐 포스페이트 완충액 (pH 7.4)에 2 배 희석하여 사용하였다.
실시예 7-2. 간 추출액 확보
농협중앙회 부천축산물공판장에서 도축된 한우(이력변호: KOR005078680400)의 간을 구매하였다. 간 조직 0.125 g과 20 mM 소듐 포스페이트 완충액 (pH 7.4) 1 ml을 섞은 후에 Glass bead (Sigma G1145)를 2 ml 용량의 튜브에 약 1/10로 채운 후, beadbeater (MPTM FastPrep)를 이용하여 20 초씩 3 회 반응하여 간 조직을 파쇄하고, 4 ℃에서 원심분리 (14000 rpm, 10 분)하여 상층액을 확보한 후, 이를 사용하였다.
실시예 7-3. 확보한 소장 및 간 추출액의 효소능 평가
확보한 소장과 간 추출액의 효소군에 대한 활성 비교군으로 돼지의 신장에서 추출된 아실라아제 I (sigma A3010)을 활용하였다. N-아세틸-L-메티오닌은 아실라아제 I에 의해 분해가 잘 되는 것으로 알려져 있다 (Chem. Res. Toxicol. 1998, 11(7):800-809). 상기 아실라아제 I과의 활성 정도 비교를 통해 소장 및 간 추출액에 의한 N-아세틸-L-메티오닌의 소화분해율을 확인하였다. 실험 조건은 하기 표 9와 같으며 반응은 40 ℃에 정치된 상태로 24 시간 진행하였다.
소의 소장 및 간 추출액에 의한 N-아세틸-L-메티오닌의 소화분해율 평가 조건
　 아실라아제 I (1 mg/ml) 소장 추출액 간 추출액
N-아세틸-L-메티오닌 (4 g/L) 500 500 500
아실라아제 I (1 mg/ml) 100 　 　
소장 추출액 (2 배 희석) 　 100 　
간 추출액 　 　 100
20 mM 소듐 포스페이트 완충액
(pH 7.4)		 400 400 400
최종 반응 부피 (㎕) 1000 1000 1000
반응이 끝나고 난 샘플 내 단백질을 제거하기 위해서 0.5 % 과염소산 (DEA JUNG, 순도 60 ~ 62 %)을 첨가하여 10 배 희석한 뒤, 원심분리 (14000 rpm, 10 분)를 통해 상층액 내에 존재하는 N-아세틸-L-메티오닌과 L-메티오닌을 정량분석하였다 (HPLC). 전환율 (%)은 반응 전 N-아세틸-L-메티오닌의 몰농도 (mM)와 반응 후의 L-메티오닌 몰농도 (mM) 비율을 백분율 (%)로 환산하여 계산하였다 (N-아세틸-L-메티오닌 분자량: 191.25 g/L, L-메티오닌 분자량: 149.25 g/L).
분석 결과, 비교군인 아실라아제 I의 경우 문헌에 보고된 것과 유사하게 높은 소화분해율 (98.9 % 몰전환율)을 나타내는 것을 확인하였다. 이와 유사하게 소장 추출액 반응 (97.5 % 몰전환율) 및 간 추출액 반응 (99.1 % 몰전환율)에서도 매우 높은 소화분해율을 확인하였다.
아실라아제 I, 소장 및 간 추출액에 의한 N-아세틸-L-메티오닌의 소화분해율
N-아세틸-L-메티오닌 (mM) L-메티오닌 (mM) 소화분해율 (%)
아실라아제 I (0.1 mg/ml) 11.4 11.1 98.9
소장 추출액 11.2 10.9 97.5
간 추출액 11.2 11.1 99.1
* 소화분해율: 생성물질 (메티오닌) mM 농도/기질 (N-아세틸-L-메티오닌) mM 농도 x 100
결론적으로, 상기 실시예를 통해 소장과 간 추출액의 in vitro 반응에서 N-아세틸-L-메티오닌이 L-메티오닌으로 전환되는 것을 확인하였다. 이러한 결과로부터 N-아세틸-L-메티오닌이 반추위를 거쳐 소장에 도달할 경우 소장 내 소화/분해 효소로 인해 대부분 L-메티오닌으로 전환이 가능하다는 것을 확인하였으며, 미분해된 극소량의 N-아세틸-L-메티오닌 또한 소장에서 흡수된 뒤 혈액을 통해 간으로 유입된 후 L-메티오닌으로 전환되는 것을 예상할 수 있다. 이는 사료 첨가제로써 제공된 N-아세틸-L-메티오닌이 실질적으로 반추동물의 체내에서 아미노산 형태인 L-메티오닌으로 직접 활용 가능하다는 것을 의미한다.
실시예 8: 생체 외 소장 및 간 추출액을 통한 N-아세틸-L-메티오닌 및 N-아세틸-D,L-메티오닌의 소화분해율 비교 평가
실시예 8-1. 소장 및 간 추출액에 의한 소화분해율 평가
실시예 7을 통해 확보한 소장 및 간 추출액을 이용하여 N-아세틸-메티오닌의 광학이성질체에 따른 소화분해율을 비교 평가하였다. 평가는 실시예 7-3과 동일한 방법으로 진행하였으며, 평가 결과는 다음과 같다.
소장 및 간 추출액에 의한 N-아세틸-L-메티오닌 및 N-아세틸-D,L-메티오닌의 소화분해율
N-아세틸-L-메티오닌
(mM)		 L-메티오닌
(mM)		 소화 분해율
(%)		 N-아세틸-
D,L-메티오닌
(mM)		 L-메티오닌
(mM)		 소화분해율(%)
소장 추출액 11.2 10.9 97.50 12.7 5.82 45.82
간 추출액 11.2 11.1 99.10 12.7 6.36 50.08
소장과 간 추출액의 in vitro 반응에서, 약 50 %의 D-형을 포함하고 있는 N-아세틸-D,L-메티오닌은 소장 추출액을 통해 약 46 %, 간 추출액을 통해 약 50 %가 L-메티오닌으로 전환되는 것을 확인하였다. 즉, 생체 내에서 N-아세틸-메티오닌의 소화분해율은 광학 이성질체 중 L-형이 D-형에 비해 월등히 높은 것을 확인하였으며, 상기 결과를 통해 N-아세틸-D,L-메티오닌을 사용할 경우 동일한 양의 N-아세틸-L-메티오닌 대비, 현저히 낮은 소화분해율을 보일 것으로 예상할 수 있다.
실시예 9: N-아세틸-L-메티오닌 급여를 통한 우유 성분 분석
In vitro 평가를 바탕으로 높은 반추위 bypass 및 소장 내 소화 분해율이 확인된 N-아세틸-L-메티오닌을 대상으로 실제 낙농우 사양평가를 통한 효능 검증을 진행하였다. 이를 위해 본 평가에서는 소를 2 군으로 나누고, N-아세틸-L-메티오닌 의 첨가 유무에 따른 우유 성분의 변화를 분석하였다. 이를 위해 총 8 마리의 낙농우를 대상으로 1 군에 4 마리씩 하기 사료 성분에 N-아세틸-L-메티오닌 (1 일 소 1 마리 당, 30 g)을 첨가하여 84 일간 평가를 진행하였다.
- 처리구 1: N-아세틸-L-메티오닌 미첨가
- 처리구 2: N-아세틸-L-메티오닌 첨가
사료 성분
사료 성분 (% of DM) N-아세틸-L-메티오닌 미첨가 N-아세틸-L-메티오닌 첨가
Alfalfa hay 25.8 25.7
Wheat straw 2.38 2.38
Corn silage 31.0 31.0
Corn, steam-flaked 11.1 11.1
Corn, high moisture 5.90 5.89
Cottonseed, whole 4.66 4.65
Canola meal 5.68 5.68
Soybean meal 5.27 5.27
Beet pulp, shreds 4.71 4.70
N-아세틸-L-메티오닌 - 0.13
Sodium bicarbonate 1.03 1.03
Vitamin and mineral mix2 2.43 2.42
상기 사양 평가를 통해 생산된 우유의 유성분 분석 결과를 하기 표 13에 나타내었다.
우유 생산에 관한 결과
주요 항목 N-아세틸-L-메티오닌 미첨가 N-아세틸-L-메티오닌 첨가 증가율
(%)
사료 섭취량 (DMI), kg/d 25.4 25.4 0.0
생산량, kg/d 3.5% FCM
(지방 수정 우유)		 40.4 43.4 7.4
ECM
(에너지 수정 우유)		 40.2 42.9 6.7
우유 성분 비율, % 유지방 3.34 3.70 10.8
유단백 2.78 2.83 1.8
우유 성분 생산량, kg/d 유지방 1.39 1.56 12.2
유단백 1.14 1.18 3.5
사료 효율 우유생산량/사료섭취량
(Milk yield/DMI)		 1.61 1.66 3.1
3.5% FCM yield/DMI 1.57 1.72 9.6
ECM yield/DMI 1.57 1.70 8.3
상기 사양 평가를 통해 확인할 수 있듯이 N-아세틸-L-메티오닌의 첨가 유무에 따른 총 사료 섭취량 (DMI)의 변화는 관찰되지 않았다. 하지만, N-아세틸-L-메티오닌을 첨가한 경우 우유 성분 중 유지방 (12.2 %) 및 유단백 (3.5 %)의 증가가 확인되었다. 또한 에너지 수정 우유 (ECM)의 경우 미첨가 대비 6.7 %가 증가하는 것을 확인하였으며, 사료 효율 (ECM yield/DMI) 역시 8.3 % 증가하는 것을 확인하였다. 즉, 상기 결과로부터 알 수 있듯이, N-아세틸-L-메티오닌을 낙농우의 사료 성분으로 첨가할 경우, 우유 내 지방 함량 및 단백질 함량 증가, 사료 효율 증가 등 다양한 효과를 확인할 수 있다.
실시예 10: N-아세틸-L-메티오닌 급여를 통한 증체 효과 분석
N-아세틸-L-메티오닌 급여를 통한 비육우의 증체 효과를 검증하였다. 이를 위해 24 마리의 비육우 (Beef steer)를 대상으로 각 12 마리씩 소를 2 군으로 나눈 뒤, N-아세틸-L-메티오닌의 첨가 유무 (1 일 소 1 마리 당, 30 g)에 따른 증체 효과를 90 일간 비교하였다.
기본적인 사료 성분은 표 12에 기재된 조성과 동일하며, 사양 평가를 통한 증체 효과는 다음과 같다.
증체 효과에 관한 결과
주요 항목 N-아세틸-L-메티오닌 미첨가 N-아세틸-L-메티오닌 첨가 증가율
(%)
비육우 무게
(kg)		 급여 전 252.7 249.2 -
3 개월 급여 후 369.1 382.1 -
증체량 (kg) 116.4 132.9 14.2
일 평균 증체량 (kg/d) 1.29 1.48 14.7
상기 비육우를 통한 사양 평가에서 확인할 수 있듯이 N-아세틸-L-메티오닌이 추가 급여된 경우 약 132.9 kg의 증체 효과를 확인하였으며, 이는 미첨가 대비 16.5 kg의 추가 증체에 해당한다. 또한 일 평균 증체량 역시 미첨가 대비 약 14.7 %의 개선 효과를 확인하였다. 즉, 상기 결과로부터 알 수 있듯이, N-아세틸-L-메티오닌의 사료 첨가제 적용을 통해서 낙농우의 우유 내 지방 함량 및 단백질 함량 증가, 사료 효율 증가 등의 개선 효과 (실시예 9) 뿐만 아니라 비육우의 증체 개선 효과를 확인하였으며, 이러한 결과를 바탕으로 다양한 반추동물의 사료 첨가제로서 N-아세틸-L-메티오닌의 가능성을 확인하였다.
실시예 11. 바이오-기반 N-아세틸-L-메티오닌 발효배양액 준비
실시예 11-1. 코리네박테리움 글루타미쿰을 이용한 N-아세틸-L-메티오닌 발효배양액 준비
본 실시예에서는 N-아세틸-L-메티오닌 생산능을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 (ATCC13032)을 L-메티오닌을 포함하는 배지 (조성 (1 L 기준): L-메티오닌 20 g, 포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모 추출물 10 g, 요소 5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4ㆍ7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1,000 ㎍) 1 L에서, 35 ℃, pH 6.0 ~ 8.0 범위에서 72 시간 동안 배양하여 N-아세틸-L-메티오닌 농도가 1.07 g/L인 발효배양액을 확보하였다.
실시예 11-2. 야로위아 리포라이티카를 이용한 N-아세틸-L-메티오닌 발효배양액 준비
본 실시예에서는 N-아세틸-L-메티오닌 생산능을 갖는 야로위아 리포라이티카 PO1f (ATCC MYA-2613TM)를 L-메티오닌을 포함하는 배지 (조성 (1 L 기준): L-메티오닌 20 g, 포도당 20 g, Na2HPO4 3.28 g, NaH2PO4 3.22 g, 효모추출물 2 g, Proteose-peptone 50 g) 1 L에서, 30 ℃, pH 6.0 ~ 8.0 범위에서 72 시간 동안 배양하여 N-아세틸-L-메티오닌 농도가 1.02 g/L인 발효배양액을 확보하였다.
L-메티오닌을 포함하는 배지의 경우, N-아세틸-L-메티오닌의 생산량을 증가시킬 수 있으며, 미생물 발효를 통해 생산된 L-메티오닌 발효 모액을 사용할 수 있다.
실시예 12. 발효배양액으로부터 직접 과립 형성
발효배양액 또는 발효배양액 여과액을 감압농축 방식으로 총 고형분 40 ~ 60 중량%까지 농축한 후, pH를 3.5 ~ 3.6으로 조절하였다. pH 조절은 황산을 이용하여 행하였고, pH 조절 후에는 농축액을 60 ℃에서 2.5 시간 동안 방치하였다. gDNA 분해과정까지 거친 농축액은 과립기 (GR Engineering, Fluid Bed Spray Dryer Batch type Pilot) 하부 노즐을 통해 바닥 스프레이 (bottom spray) 방식으로 과립기 내에 투입하였다. 이때 과립기 운전 조건은 히터 온도 170 ℃, 입구 온도 140 ~ 160 ℃, 출구 온도 60 ~ 70 ℃, 스프레이 압력 1.8 ~ 2.0 bar으로 하였다. 사용하는 시드는 Spray Dry 방법으로 제조하였고 그 크기는 300 ㎛로 하였다. 과립기 내로 투입된 농축액은 열풍에 의해 건조되어 고화되고 유동층 내를 유동하면서 새로 투입된 농축액에 의하여 크기가 커지게 된다. 과립 입자가 원하는 크기만큼 커지면 과립기 운전을 중지하고 제품을 회수하여 함량을 비롯한 제품 성분을 분석하였다.
본 실시예를 통해 얻어진 코리네박테리움 글루타미쿰 발효배양액 과립 및 야로위아 리폴리티카 발효배양액 과립의 특성을 하기 표 15에 나타내었다.
코리네박테리움 글루타미쿰 발효배양액 과립 야로위아 리폴리티카 발효배양액 과립
N-아세틸-L-메티오닌 함량 50 % 40 %
단백질 함량 14 % 18 %
조지방 함량 - 10 %
수분 함량 2 % 2 %
겉보기 밀도 665.1 kg/m3 667.5 kg/m3
무기물 함량 1.6 % 1 %
입자크기 500 ㎛ 이하 5 % 5 %
입자크기 500 ㎛ 초과 1000 ㎛ 이하 28.6 % 24.6 %
입자크기 1000 ㎛ 초과 1300 ㎛ 이하 63.4 % 66.4 %
입자크기 1300 ㎛ 초과 3 % 4 %
실시예 13. 발효배양액에 자유 N-아세틸-L-메티오닌 첨가하여 함량 조절
실시예 11과 동일한 조건에서 발효배양 과정을 거쳐 생산된 발효배양액을 총 고형분 40 ~ 60 중량 %까지 농축하였다. 여기에, 당사에서 개발한 자유 N-아세틸-L-메티오닌을 혼합탱크에 첨가하고 혼합한 후, 실시예 12와 동일한 조건으로 과립화하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 및 야로위아 리폴리티카를 이용하여 최종적으로 얻어진 제품의 특성을 하기 표 16에 나타내었으며, 결론적으로 단백질 및 지방 함량이 증가된 과립제품을 확보할 수 있었다.
코리네박테리움 글루타미쿰 과립화를 통해 얻어진 최종 제품 야로위아 리폴리티카 과립화를 통해 얻어진 최종 제품
N-아세틸-L-메티오닌 함량 66 % 55 %
단백질 함량 15 % 19.8 %
조지방 함량 - 12.8 %
수분 함량 0.5 % 0.12 %
겉보기 밀도 665.5 kg/m3 668.3 kg/m3
무기물 함량 2.5 % 1.5 %
입자크기 500 ㎛ 이하 3 % 2 %
입자크기 500 ㎛ 초과 1000 ㎛ 이하 28 % 27 %
입자크기 1000 ㎛ 초과 1300 ㎛ 이하 67 % 67 %
입자크기 1300 ㎛ 초과 2 % 4 %
실시예 14. 발효배양액에 부형제 첨가하여 함량 조절
상기 발효배양액을 농축한 후, 농축액에 부형제로서 옥수수 전분 0.22 kg을 물 0.5 L에 녹인 수분 함량이 9.0 %인 것을 혼합탱크에 첨가하고 혼합하였다. 발효배양액 여과액을 감압농축 방식으로 총 고형분 50.5 중량%까지 농축한 후, 실시예 12와 동일한 조건으로 과립화하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 및 야로위아 리폴리티카를 이용하여 최종적으로 얻어진 제품의 특성을 하기 표 17에 나타내었다.
코리네박테리움 글루타미쿰 과립화를 통해 얻어진 최종 제품 야로위아 리폴리티카 과립화를 통해 얻어진 최종 제품
N-아세틸-L-메티오닌 함량 68 % 65 %
단백질 함량 15 % 19 %
조지방 함량 - 11 %
수분 함량 0.24 % 0.24 %
겉보기 밀도 682.5 kg/m3 682.5 kg/m3
무기물 함량 1.88 % 1.88 %
입자크기 500 ㎛ 이하 2 % 4 %
입자크기 500 ㎛ 초과 1000 ㎛ 이하 28 % 29 %
입자크기 1000 ㎛ 초과 1300 ㎛ 이하 66 % 63 %
입자크기 1300 ㎛ 초과 4 % 4 %
따라서, 본 출원에서 제조한 N-아세틸-L-메티오닌은 L-메티오닌 대비, 반추위 내 미생물에 의해 상대적으로 적게 분해되어 우회율이 높은 것으로 판단할 수 있으며, 높은 소화 분해율을 보이며, 실제 낙농우 급여를 통한 유지방 및 유단백의 증진 효과를 확인하였다. 이러한 결과는, 본 출원의 제조방법을 통해 제조한 N-아세틸-L-메티오닌이 반추동물을 위한 사료 첨가제로서 매우 유용하게 이용될 수 있음을 시사하는 것이다. 또한, 바이오 기반 N-아세틸-L-메티오닌을 반추동물에 급여함으로써, 석유 유래 물질 대비 친환경적인 효과도 얻을 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (17)

  1. 바이오 자원 유래 탄소를 포함하는, 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌.
  2. 제1항에 있어서, 상기 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌은 구성하는 탄소의 50 % 내지 100 %가 바이오 자원 유래 탄소인 것인, 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌.
  3. 하기 집단을 구성하는 탄소의 50 % 내지 100 %가 바이오 자원 유래 탄소인, 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌의 집단.
  4. 제1항의 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌 또는 이의 염을 포함하는 사료 첨가제.
  5. 제1항의 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌 또는 이의 염을 포함하는 사료 조성물.
  6. 제1항의 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌 또는 이를 생산하는 미생물을 포함하는 과립제제.
  7. 제6항에 있어서, 상기 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌을 생산하는 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 야로위아 리포라이티카인 과립제제.
  8. 제1항의 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌 또는 이의 염을 포함하는 사료첨가제 또는 사료 조성물을 동물에게 급여하는 단계를 포함하는, 동물의 우유생산량, 유지방 또는 유단백의 증진, 또는 증체 효과를 개선시키는 방법.
  9. (a) (i) 미생물 발효를 통한 L-메티오닌 전구체를 생산하는 단계; 및
    (ii) 효소 전환 과정을 통해 상기 L-메티오닌 전구체로부터 L-메티오닌을 생산하는 단계; 및
    (b) 상기 L-메티오닌을 아세틸화하는 단계를 포함하는, 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌 생산방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 L-메티오닌 전구체는 O-아세틸-L-호모세린 (O-acetyl-L-homoserine) 또는 O-석시닐-L-호모세린 (O-succinyl-L-homoserine)인 것인, 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌 생산방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 효소 전환 과정은 시스타티오닌-γ-합성효소 (cystathionine-γ-synthase), O-아세틸 호모세린 설프히드릴라제 (O-acetyl homoserine sulfhydrylase) 및 O-석시닐 호모세린 설프히드릴라제 (O-succinyl homoserine sulfhydrylase)로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 효소에 의해 수행되는 것인, 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌 생산방법.
  12. (a) 미생물 발효를 통해 L-메티오닌을 생산하는 단계; 및
    (b) 상기 L-메티오닌을 아세틸화하는 단계를 포함하는, 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌 생산방법.
  13. 제9항 또는 제12항에 있어서, 상기 L-메티오닌을 아세틸화하는 단계는 화학 합성 공정, 또는 아세틸화 효소 또는 이를 생산하는 미생물에 의해 수행되는 것인, 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌 생산방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 L-메티오닌을 아세틸화하는 단계에서 아세틸화 효소 또는 이를 생산하는 미생물을 이용하는 경우, 아세틸-CoA를 공급하는 단계를 포함하는 것인, 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌 생산방법.
  15. 아세틸화 효소 활성을 가지는 N-아세틸-L-메티오닌을 생산하는 미생물의 발효를 통해 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌을 직접 생산하는 단계를 포함하는, 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌 생산방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 미생물 발효시 바이오기반 L-메티오닌을 배지에 공급하는 단계를 포함하는, 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌 생산방법.
  17. 제9항, 제12항 및 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌은 이를 구성하는 탄소의 50 % 내지 100 %가 바이오 자원 유래 탄소인 것인, 바이오기반 N-아세틸-L-메티오닌 생산방법.
KR1020160092089A 2015-10-14 2016-07-20 바이오-기반 n-아세틸-l-메티오닌 및 이의 용도 KR101821050B1 (ko)

Priority Applications (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US15/766,325 US10750762B2 (en) 2015-10-14 2016-10-14 Bio-based N-acetyl-L-methionine and use thereof
MX2018004416A MX2018004416A (es) 2015-10-14 2016-10-14 N-acetil-l-metionina de base biologica y uso de la misma.
EP16855784.1A EP3362573A4 (en) 2015-10-14 2016-10-14 BIOBASED N-ACETYL-L-METHIONINE AND USE THEREOF
CA3001675A CA3001675C (en) 2015-10-14 2016-10-14 Bio-based n-acetyl-l-methionine and use thereof
NZ741423A NZ741423A (en) 2015-10-14 2016-10-14 Bio-based n-acetyl-l-methionine and use thereof
BR112018007579-5A BR112018007579B1 (pt) 2015-10-14 2016-10-14 Métodos para produzir n-acetil-l-metionina de base biológica, bem como para aumentar a produção de leite, gordura de leite ou proteínas de leite de um animal, e uso de n-acetil-lmetionina de base biológica ou de um sal da mesma
CN201680069978.0A CN108603206B (zh) 2015-10-14 2016-10-14 生物基n-乙酰基-l-蛋氨酸及其用途
PCT/KR2016/011577 WO2017065567A1 (en) 2015-10-14 2016-10-14 Bio-based n-acetyl-l-methionine and use thereof
TW105133230A TWI642359B (zh) 2015-10-14 2016-10-14 生質ｎ－乙醯基－ｌ－甲硫胺酸及其用途
JP2018519350A JP7045987B2 (ja) 2015-10-14 2016-10-14 バイオベースのｎ－アセチル－ｌ－メチオニン及びその用途
UY0001036952A UY36952A (es) 2015-10-14 2016-10-14 N-acetil-l-metionina bioderivada y uso de la misma

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20150143428 2015-10-14
KR1020150143428 2015-10-14

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170044575A true KR20170044575A (ko) 2017-04-25
KR101821050B1 KR101821050B1 (ko) 2018-03-09

Family

ID=58703413

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020160092089A KR101821050B1 (ko) 2015-10-14 2016-07-20 바이오-기반 n-아세틸-l-메티오닌 및 이의 용도

Country Status (11)

Country Link
US (1) US10750762B2 (ko)
EP (1) EP3362573A4 (ko)
JP (1) JP7045987B2 (ko)
KR (1) KR101821050B1 (ko)
CN (1) CN108603206B (ko)
AR (1) AR107501A1 (ko)
CA (1) CA3001675C (ko)
MX (1) MX2018004416A (ko)
NZ (1) NZ741423A (ko)
TW (1) TWI642359B (ko)
UY (1) UY36952A (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020101074A1 (ko) * 2018-11-15 2020-05-22 씨제이제일제당 (주) N-아세틸-l-트립토판을 유효성분으로 포함하는 젖소용 사료첨가제

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101941745B1 (ko) * 2016-07-20 2019-01-24 씨제이제일제당 (주) 아실전이효소의 활성을 갖는 미생물 및 이의 용도
JP2024529564A (ja) * 2021-08-03 2024-08-06 フィードアップ・リミテッド 蛋白質のバイパス率増加用組成物および蛋白質のバイパス率増加方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3878305A (en) 1972-05-25 1975-04-15 Procter & Gamble Fortification of foodstuffs with n-acyl derivatives of sulphur-containing l-amino acids
JPS5039023B2 (ko) * 1972-09-14 1975-12-13
DE2529854C3 (de) 1975-07-04 1980-01-10 Deutsche Gold- Und Silber-Scheideanstalt Vormals Roessler, 6000 Frankfurt Verfahren zur Herstellung von N-Acetyl-L-methionin
CA1067334A (en) * 1976-12-22 1979-12-04 Agrimel Limited Methionine hydroxy analog-containing feed for lactating cows
JPS5871892A (ja) * 1981-10-20 1983-04-28 Tanabe Seiyaku Co Ltd Ｎ−アセチル−ｌ−メチオニンの製造法
KR890001236B1 (ko) 1985-10-02 1989-04-28 화이자 인코포레이티드 소염제 조성물의 제조방법
KR100388109B1 (ko) * 2000-12-14 2003-06-25 대한민국(경북대학교총장) 타우린이 강화된 우유의 생산 방법
KR100905381B1 (ko) * 2006-07-28 2009-06-30 씨제이제일제당 (주) Ｌ-메치오닌 전구체 생산 균주 및 상기 ｌ-메치오닌전구체로부터의 ｌ-메치오닌 및 유기산의 생산방법
WO2010020289A1 (en) * 2008-08-22 2010-02-25 Metabolic Explorer Production of n-acetylated sulphur-containing amino acids with microorganisms having enhanced n-acetyltransferase enzymatic activity
US20100115661A1 (en) 2008-10-30 2010-05-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for the modulation of amino acid biosynthesis
WO2012090021A1 (en) * 2010-12-30 2012-07-05 Metabolic Explorer Recombinant microorganism for the fermentative production of methionine
FR2983870B1 (fr) * 2011-12-08 2015-07-17 Roquette Freres Composition en methionine destinee a l'alimentation animale

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020101074A1 (ko) * 2018-11-15 2020-05-22 씨제이제일제당 (주) N-아세틸-l-트립토판을 유효성분으로 포함하는 젖소용 사료첨가제
CN113163805A (zh) * 2018-11-15 2021-07-23 Cj第一制糖株式会社 包含n-乙酰基-l-色氨酸作为活性成分的用于乳牛的饲料添加剂

Also Published As

Publication number Publication date
CA3001675C (en) 2023-06-06
CA3001675A1 (en) 2017-04-20
UY36952A (es) 2017-04-28
EP3362573A1 (en) 2018-08-22
BR112018007579A2 (pt) 2018-10-23
AR107501A1 (es) 2018-05-09
US20180317522A1 (en) 2018-11-08
JP7045987B2 (ja) 2022-04-01
CN108603206B (zh) 2022-03-18
EP3362573A4 (en) 2019-09-04
JP2018531602A (ja) 2018-11-01
KR101821050B1 (ko) 2018-03-09
TW201720312A (zh) 2017-06-16
TWI642359B (zh) 2018-12-01
NZ741423A (en) 2019-12-20
MX2018004416A (es) 2018-08-01
CN108603206A (zh) 2018-09-28
US10750762B2 (en) 2020-08-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6913033B2 (ja) タンパク質または飼料の生産のためのガス発酵
EP2665826B1 (de) Verfahren zur fermentativen herstellung schwefelhaltiger aminosäuren
ES2363332T3 (es) Secuencias nucleotídicas que codifican el gen metd.
KR101821050B1 (ko) 바이오-기반 n-아세틸-l-메티오닌 및 이의 용도
US8338141B2 (en) Methionine recovery processes
KR20080024226A (ko) Ｌ-트레오닌의 생산 방법
US20050266535A1 (en) Nucleotide sequences which code for the metE gene
DE60133752T2 (de) Verfahren zur Herstellung von L-Lysine unter Verwendung von CYSD, CYSN, CYSK, CYSE und/oder CYSH VON C. GLUTAMICUM
DE10109690A1 (de) Neue für das metY-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
KR20220080593A (ko) 단일 미세조류로부터 단백질 및 오메가-3 지방산을 포함하는 바이오매스를 제조하는 방법 및 이에 의해 제조된 바이오매스
US6822085B2 (en) Nucleotide sequences which code for the cysD, cysN, cysK, cysE and cysH genes
JPS61212249A (ja) 飼料用組成物
US20020049305A1 (en) Nucleotide sequences which code for the metF gene
CN110004192A (zh) 一种制取颗粒型苏氨酸的方法
RU2692656C2 (ru) Композиция кормовой добавки и содержащая ее композиция корма для животных
RU2450051C1 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СИМБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ Escherichia coli VL-613
US20020048793A1 (en) Nucleotide sequence which code for the metH gene
CN109355325A (zh) 颗粒苏氨酸和颗粒蛋白的共生产工艺
KR101866884B1 (ko) 사료 첨가제용 조성물 및 이를 포함하는 동물 사료 조성물
BR112018007579B1 (pt) Métodos para produzir n-acetil-l-metionina de base biológica, bem como para aumentar a produção de leite, gordura de leite ou proteínas de leite de um animal, e uso de n-acetil-lmetionina de base biológica ou de um sal da mesma
DE60113441T2 (de) Sahh (s-adenosyl homocysteinase) kodierende nukleotidsequenzen
KR20190067647A (ko) 반추동물의 부티레이트 생산능을 증대시킬 수 있는 미생물 및 이를 이용한 반추동물 사료 첨가제
DE10109689A1 (de) Neue für das metE-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
DE10109687A1 (de) Neue für das metH-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
DE10109686A1 (de) Neue für das metf-Gen kodierende Nukleotidsequenzen

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant