JPS5871892A - Ｎ−アセチル−ｌ−メチオニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニンの製　２− 過性に関し、更に詳しくは酵素を利用してＮ−アセチル
−ＤＬ−メチオニンアミドよりＮ−アセチル−Ｌ−メチ
オニンを製造する方法に関する。

本発明の目的化合物であるＮ−アセチル−Ｌ　−メチオ
ニンは、輸液成分などの医薬化合物あるいは食品添加物
等として有用な化合物である。

従来、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニンの製造法としては
、は）　Ｎ−アセチル−ＤＬ−メチオニンに光学活性リ
ジンを作用させて塩を形成させた後。

分別結晶法により所望のＬ一体を得る方法（特開昭４８
−２２４１８号）、１２）Ｌ−メチオニンを無水酢酸で
アセチル化する方法（特公昭５５−４２９８６号）が知
られているが、（１）の製造法では光学純度の高い化合
物を得るためには再結晶をくり返す必要があるため収率
が急く、一方、１２）の製造法は反応中暑こラセミ化が
起きやすく、そのため反応条件を厳密にｌｉ１節しなけ
ればならないという難点を有する。また近年、酵素の持
つ鏡像体区別加水分解能を利用し、Ｎ−アセチル−ＤＬ
−メチオニンのエステルにセリンプロテアーゼやスルフ
−　３− 特開昭５１−１４２５９５号）、シかし、この方法は酵
素反応の進行にともな°いＮ−アセチル−Ｌ−メチオニ
ンエステルが加水分解されて生成する目的物Ｎ−アセチ
ル−Ｌ−メチオニンのため９反応液の一値が低下する。

従うて酵素反応を維持継続するためには絶えず反応液の
−を至適範ｍ１ｍ１整しなければならないという難点が
ある。

かかる状況下１本発明者等は前記技術的、経済的難点を
克服すべく鋭意研究を重ねた結果、全く意外にも化学合
成で得られる安価なＮ−アセチル−ＤＬ−メチオニンア
ミドにエルウィニア（Ｅｒｗｉｍｉａ　）属に属する微
生物を培養して得られる培養液、該培養液から採取した
一体また４よ該一体の処理物を作用させた場合には、こ
れ卯こ含まれる酵素が触媒する鏡像体区別加水分解反応
基こより。

Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニンアミドの１位のアミド結
合のみが特異的に加水分解されてＮ−アセチル−Ｌ−メ
チオニンが生成することを見出し九持Ｉｌ昭５８−７１
ｄ９２（２） 本発明は、エルウィニア属に属し、Ｎ−アセチル−ＤＬ
−メチオニンアミドからＮ−アセチル−Ｌ−メチオニン
を生成せしめる能力を有する微生物の培養液、該培養液
から採取した一体または該一体の処理物をＮ−アセチル
−ＤＬ−メチオニンアミドに作用せしめ、生成したＮ−
アセチル−Ｌ−メチオニン讐採取するＮ−アセチル−Ｌ
−メチオニンの新規製造法である。

以−ト９本発明方法を詳細に説明する。

本発明において使用する微生物は、エルウィニア属に属
し、Ｎ−アセチル−ＤＬ−メチオニンアミドからＮ−ア
セチル−Ｌ−メチオニンを生成せしめる能力を有する微
生物であり、その例としては例えばエルウィニア・カロ
トボラ（Ｅｒｗｉｍｉａｔａｒｍｔａｗａｒａ　）　　
３０５７　（微工研薗寄第ｂ／７６号）などをあげるこ
とができる。

本発明の鏡像体区別加水分解反応を触媒する酵素含有培
養液は、上記微生物を通常の方法で培養することにより
調製することができる。即ち、栄養培地の炭素源として
は、上記微生物の利用可能　５− なものならばいずれも使用することができ１例えハクル
コース、フラクトース、シュクロース。マルトース、デ
キストリンなどの糖類、グリセロール、ソルビトールな
どの糖アルコール、フマール酸、クエン酸などの有機酸
等を好適に使用することができる。培地中に添加する量
は通常α１〜１０％程度で十分である。また、窒素源と
しては。

例えば塩化アンモニウム、リン綾アンモニウム。

フマール酸アンモニウムなどの各種無機酸、有機酸のア
ンモニウム塩や肉エキス、酵母エキス、コーンステイー
プリカー、カゼイン加水分解物などの天然有機窒素源等
があげられ、特に天然有機窒素源は多くの場合炭素源と
して兼用することもできる。さらに、無機塩類としては
例えばリン酸カリウム、リン酸ナトリウム、塩化カリウ
ム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸ｊｌｌ鉄
などが使用できる。前記微生物の培養条件としては。

温度約２０〜４０℃、ｌ１Ｍ約５〜８の範囲を採りうる
が。より好ましくは約３０〜３５℃、−約６〜７におい
て約１６〜７２時間好気的な条件下に培−〇　− 養を行うのが好都合である。

かくして得られる培養液は、そのまま本発明方法に使用
してもよく、また、培養液中の成分が本発明方法の障害
となる場合や繭体量を多く使用したい場合には培養液か
ら遠心分離等により一旦菌体を分離し、その分離した一
体を用いてもよい。

ｆ さらに、該Ｓ褥の処理物９例えば凍結乾燥菌体。

アセトン乾燥菌体、菌体磨砕物、菌体養棒抽出物や該一
体もしくはその処理物を公知の方法で固定化したもの等
も使用できる。

本発明の鏡像体区別加水分解反応は９通常基質たるＮ−
アセチル−ＤＬ−メチオニンアミドと上記培養液、該培
養液から採取した一体またはその処理物とを水性媒体中
で混合するととｋより実施するのが好ましい。反応溶液
中での基質濃度は約０．１乃至２０％程度の高濃度まで
用いることができ、高濃度基質で反応させる場合反応液
中に基質、が不溶のまま残っていても反応の進行につれ
て溶解してゆくので反応の進行には何ら支障とならない
。基質と培養液等との混合方法は回分式方法で−７− も、カラムを用いる連続方法でもいずれも可能である。

反応は１反応液の−が約５〜９．より好ましくは約５．
５〜７．５て０反応温度が通常的２０〜６０℃、より好
ましくは約３０〜４０℃であるときスムースに進行する
。

上記の如くして得られる本発明の目的化合物Ｎ−アセチ
ル−Ｌ−メチオニンの確認、同定は１例えば反応液より
目的物をイオン交換樹脂処理により取出し、インプロパ
ツールより褥結晶後、得られる結晶を元素分析すると共
に、各種展開溶媒による薄層クロマトグラフィーのＲ／
値、融点、旋光［、ＮＭＲスペクトル、ＩＲスペクトル
等を標準物質のそれらと比較することにより実施した。

また、目的物の定量は９例えば反応液の一部を採り、一
方はそのまま、他方には市販のかびのアシラーゼ（Ｎ−
アセチル−Ｌ−メチオニンのみに特異的に作用する）を
加えて３７℃で反応させ、Ｎ−アセチルーＬ−メチオニ
ンを完全にＬ−メチオニンに転換させ１両試料中のＬ−
メチオニンをロイコノストック・メゼンテロイデス　Ｐ
−６０に１４開昭５８−７１８Ｅ１２（３ン よる微生物定量法で定置し、アシラーゼ操作で増加した
Ｌ−メチオニンの量よりＮ−アセチル−Ｌ−メチオニン
の生成量を換算した。

以上詳記した通り２本発明方法によれば、Ｎ−アセチル
−Ｌ−メチオニンアミドの１位のアミド部の加水分解に
よりＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンが生成するあ同時に
当モルのアンモニアが副生ずるため１本質的に反応溶液
中での−の変動はなく、全反応期間を通じて反応液の−
を調整する必豐がないので操作が極めて簡単であり、し
かも反応が酵素反応であるので光学異性体に対する特異
性が極めて高く、得られるＮ−アセチル−Ｌ−メチオニ
ンの光学純度が非常に高いなど幾多の利点がある。ちな
みに、上記の新しい酵素反応を触媒する酵素が、エルウ
ィニア　カロトボラの培養液、培養液より採取した菌体
および菌体処理物に存在することは現在まで全く知られ
ておらず、さらに酵素をＮ−アセチル−ＤＬ−メチオニ
ンアミドに作用し゛てＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンを
生成せしめる酵素反応についても全く軸台されていな　
９　− い。また、公知酵素であるアシルアミダーゼ戚はＤＬ−
アミノ酸アミドに作用してＬ−アミノ酸を生成させる酵
素９例えばロイシンアミノペプチダーゼ、アミノアシル
アミダーゼなどは全くＮ−アセチル−ＤＬ−メチオニン
アミドには作用しない。

従って、Ｎ−アセチル−ＤＬ−メチオニンアミドに作用
してＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンを生成させる本発明
の酵素反応を触媒する酵素は全く新しい酵素である。

実施例１ 第ニリン酸ナトリウム・１２水塩α８７５％。

第一リン酸カリウムα３４％、硫酸アンモニウムＯ１％
、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５８％。

塩化カルシウム・２水塩α００６％、硫酸第−鉄・７水
塩α００２％、硫酸マンガン・６水塩０．０００２％、
Ｌ−アスパラギン０．２％およびイーストエキス１．０
％からなる培地（ｐＨ１７，０）の１００−を５００−
容坂ロフラスコに仕込み、１２０℃で１０分間滅菌した
後、予め栄養寒天培地上で３０℃、２０時間培養したエ
ルウィニア・カロトボ１０− ラ３０５７（微工研菌寄第１．．／’７ｂ号）を−白金
耳接種し、３０℃で２４時間振とう培養（回転数１４０
ｒｐｗｔ、振幅８ａｌ）して得た培養液を種培養液とす
る。

グリセロール２％、塩化アンモニウムα１％。

第一りン駿カリウムα１％、硫酸マグネシウム・７水塩
α０５％、コーンステイープリカー１％。

ミースト０．５％の組成からなる栄養液体培地（ｐｍ１
７．０）５０ｓｄを５００ｄ容坂ロフラスコに仕込み。

１２０℃で１０分間滅菌した後、上記種培養液を１−接
種し２３０℃で２０時間振とう培養する。

培養液５０ｄから遠心分離により集菌し、一度５０ｆの
生理的食塩水で洗浄後、０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，
５）２５ｍ／中にけん濁し、別に同緩衝液で１００７ψ
讐になるように溶かしたＮ−アセチル−ＤＬ−メチオニ
ンアミド溶液２５−を加え３０℃でＳ票反応を行なわせ
る。

適宜反応液から０，５−サンプリングし、１００℃、５
分間の加熱により反応を停止させた後、水４５ｍを加え
て遠心分離により菌を除去する。上−１１− 澄の一部を適当に希釈して、標品のＮ−アセチル−Ｌ−
メチオニンと同時に薄層クロマトグラフィー（溶１１；
クロロホルム：メタノール：酢酸；８５：１５：３）を
行い、ヨウ素発色によりＮ−ア希釈後、その１ｗｌ１に
市販のアスペルギルス・オリザエのアシラーゼを１０岬
加えて３７℃で１時間反応させ、Ｎ−アセチル−Ｌ−メ
チオニンをＬ　−メチオニンに加水分解する。この溶液
を５０〜１００倍希釈し、ロイコノストック・メゼンテ
ロイデスＰ−６０を用いる微生物定量法によりＬ−メチ
オニンを定置し、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニン量を求
めた。

反応時間に対するＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンの生成
量は、１００ｗＩＩ／ｗｌのＮ−アセチル−ＤＬ−メチ
オニンアミドより２０時間後には５０１ｎＩ／ＴＩＩｔ
のＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンが生成し、その時間的
経過は第１表に示す通りである。

特開昭５ｇ−７１８９２（４） 第　　　　１　　　　　表 実施例２ 実施例１と同様に種培養したエルウィニア・カロトボラ
３０５７（徽工研繭寄第ｂｔ’７ｂ号）をグリセロール
２％、塩化アンモニウムα１％、ポリペプトン２％、第
一リン酸カリウムα１％、硫酸マグネシウム・７水塩α
０５％の組成からなる栄養液体培地（ｐＨ７，０）　＃
ｃ１　％接種し、３０℃で２８時間振とう培養した。

培養液２００ｄから遠心分離で集画し、一度生理食塩水
で洗浄後、純水にけん濁して１００ｄとした。そこへ、
Ｎ−アセチル−ＤＬ−メチオニンアミド１５Ｉを含む水
溶波１００−を加え、酢酸にて−を６．０に調製した。

３０℃で２４時間反応させた後、遠心分離で１体を除い
た上澄区分に含１３− まれるＮ−アセチル−Ｌ−メチオニン量は実施例１と同
様の方法て定量すると７．２　ｆ　（転換率９８％）で
あった。

この上澄を塩酸でＩａ２とした後９弱塩基性イオン交換
樹脂ｗＡ−１０（□ｆｆ−ｆｆ−型化三菱化成製名）カ
ラムに通し、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニンを吸着させ
る。カラムを充分水洗後、３％アンモニア水でＮ−アセ
チル−Ｌ−メチオニンを溶出させる。減圧下に過剰のア
ンモニアを除いた溶出液を強酸性イオン交換樹脂ＩＲ−
１２０ＣＭ”型、ロームアンドハース社製の商品名）カ
ラムに通し１通過液を濃縮してＮ−アセチル−Ｌ−メチ
オニンの粗結晶を得る。これを少量のインプロパツール
より再結晶することｋよりＮ−アセチル−Ｌ−メチオニ
ン五８ｔを得る６本品の融点は１０４℃で、比旋光度は
（α）Ｄ−２０，２″’（Ｃ＝　４　、水）である。

実施例３ 実施例２と同様に鋼製したエルウィニア・カロトボラ３
０５７（微工研繭嵜第ｂｔ７１．　　号）の生１４− 一体２Ｉに生理食塩水２ｄを加えてけんだくシ。

そこへ予め調製した５％カラギーナンゾル＆５ｍ／−を
加える。氷冷してゲル化させ、２％塩化カリウム水溶液
＆ｃ３０分間浸漬後、３Ｘ３Ｘ３■の立方体に成型する
。この成型ゲル６ｄを３０’Ｃの水が循環している外と
う管材カラムに充填し、５ｏ１１ｆ／−のＮ−アセチル
−ＤＬ−メチオニンアミド水溶液（２％酢酸アンモニウ
ム共存、４ａＯＫ酢酸で調製）をＳＶ＝α２で流下させ
る。流下液中のＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンを実施例
１と同様の方法で定量すると２表９岬〜（転換率９９％
）含まれている。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （ｌ）　　エルウィニア（Ｅｒｗｉｍｉａ　）属に属し
   、Ｎ−アセチル−ＤＬ−メチオニンアミドからＮ−アセ
   チル−Ｌ−メチオニンを生成せしめる能力を有する微生
   物の培養液、該培養液から採取した一体または該菌体の
   処理物をＮ−アセチル−ＤＬ−メチオニンアミドに作用
   せしめ、生成したＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンを採取
   することを特徴とするＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンの
   製造法。 （２）　　微生物がＮ−アセチル−ＤＬ−メチオニンア
   ミドからＮ−アセチル−Ｌ−メチオニンを生成せしめる
   能力を有するエルウィニア・カロトボラ（Ｅｒｗ／ｗｉ
   ｇ　ｅａｒａｌｍｖｅｒａ　）　　３０５７である特許
   請求の範囲ｊ１１項記載の製造法。