CN113337495A

CN113337495A - 一种提高唾液酸产量的方法与应用

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Publication number: CN113337495A
Application number: CN202110620019.6A
Authority: CN
Inventors: 陈献忠; 杨海泉; 沈微; 周俊波
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-06-03
Filing date: 2021-06-03
Publication date: 2021-09-03
Anticipated expiration: 2041-06-03
Also published as: CN113337495B

Abstract

本发明公开了一种提高唾液酸产量的方法与应用，属于酶工程、微生物工程领域。本发明对N‑乙酰葡萄糖胺‑2‑差向异构酶的酶催化活性关键氨基酸位点Gly371进行饱和突变，筛选提高催化效率的酶突变体。通过过量表达催化效率提高的N‑乙酰葡萄糖胺‑2‑差向异构酶突变体和N‑乙酰神经氨酸醛缩酶，提高重组大肠杆菌催化生产唾液酸的生产效率；采用本发明构建的含有G371C的重组大肠杆菌和含有G371A的重组大肠杆菌全细胞催化制备得到Neu5Ac产量分别为352.0和353.6mmol·L^‑1，显著高于野生型重组菌，同时，含有突变体的重组菌株催化GlcNAc转化生成Neu5Ac的转化效率，显著高于对照菌株。

Description

一种提高唾液酸产量的方法与应用

技术领域

本发明涉及一种提高唾液酸产量的方法与应用，属于酶工程和微生物工程领域。

背景技术

迄今为止，在已发现的五十多种唾液酸中，Neu5Ac(N-乙酰神经氨酸)是其中最主要的一种，其含量占所有唾液酸的99％以上。Neu5Ac作为唾液酸的主要种类，该物质主要以α-糖苷的形式位于糖蛋白或糖脂类等非还原性寡聚糖的末端。Neu5Ac的是一种酸性氨基糖，Neu5Ac易溶于水，微溶于甲醇，在水溶液中很稳定，能够保存较长时间，但在酸性溶液或碱性溶液中，其稳定性会受到很大的影响。Neu5Ac在食品、医药和疾病快速检测领域有着广泛的应用前景。Neu5Ac能调节IgG的抗炎活性，增强婴儿免疫力，影响神经细胞的完整性、渗透性及活性，促进婴儿大脑的发育。

Neu5Ac的制备方法有从天然材料中提取、化学法合成、微生物发酵制备、酶法合成和全细胞催化法合成。Neu5Ac广泛存在于动物细胞表面中，主要存在形式是糖复合物，但含量相当低。近年来，有研究者发现红色肉类和乳制品中Neu5Ac含量较高，并考察了对儿童健康的影响。但是绝大多数天然产物中Neu5Ac含量低，而且组份非常复杂，从中提取Neu5Ac伴随着复杂的过程，回收率低，很难满足大规模生产的要求。化学合成可以实现Neu5Ac的大规模生产，但其反应条件复杂，而且需要催化剂(例如铟等贵重金属)。另一方面，化学合成包含一系列保护和去保护的过程，同时伴随着许多中间产物和手性异构体的出现，对于后期的分离纯化过程和环境保护非常不利，而且合成产率偏低。

微生物界中的某些大肠杆菌菌株由于其自身带有K1抗原能够在特定组分的培养基中培养生产聚唾液酸，聚唾液酸通过酸或酶的水解可以获得Neu5Ac。利用发酵法生产Neu5Ac成本较低，但产量不高，而且副产物较多，仅限于较小规模试验。Neu5Ac酶法合成的途径主要有两种，一种方法是以磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvic acid,PEP)和N-乙酰甘露糖胺(N-acetylmannose amine,ManNAc)为底物，在N-乙酰神经氨酸合成酶(N-acetylneuraminic acid synthetase，NeuB)催化下合成Neu5Ac，该反应不可逆；另一种是以GlcNAc为底物，通过N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶(N-acetylglucosamine 2-epimerase,AGE)的作用异构化为ManNAc，ManNAc与丙酮酸在N-乙酰神经氨酸醛缩酶(Neu5Ac aldolase,NanA)的作用下缩合形成Neu5Ac，该反应可逆。由于丙酮酸比PEP更容易获取价格也更便宜，且NeuB催化反应需要能源的消耗，一般选择使用丙酮酸和ManNAc来合成Neu5Ac。但是GIcNAc异构生成ManNAc需要价格昂贵，易于降解，并且不可重复利用的ATP参与，这额外增加了酶法生产Neu5Ac的成本。另一方面酶在反应溶液中不能够稳定存在，其活性易受到酸、碱、热及有机溶液等条件的影响，存留在溶液中的酶蛋白也会给最终产品的分离提纯操作增加困难，使得酶法合成Neu5Ac的大规模发展应用受到极大的限制。

随着生物学技术的发展，全细胞催化合成Neu5Ac的技术也越来越成熟，逐渐成为合成Neu5Ac的理想方式。全细胞催化法与微生物发酵法相比，其生产周期更短，操作条件更易于控制。与化学合成法相比，其反应条件温和、对环境污染小，副产物较少，易于产物的分离提纯。与酶法合成相比，在细胞内有更加适合酶稳定存在的条件，同时也可省去酶纯化的过程，并且可以直接利用微生物在代谢过程产生的ATP合成ManNAc，从而降低了催化反应过程的成本。

在全细胞催化过程中，高效表达具有高效催化活性的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的重组大肠杆菌对于唾液酸Neu5Ac的高效合成具有重要意义，因此，如何得到一种能够高效生产唾液酸Neu5Ac的方法称为研究的热点和难点。

发明内容

为解决现有技术当中存在的唾液酸产量低，N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的催化效率低等的问题，对N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶进行分子改造提高其催化效率，通过在重组大肠杆菌中高效表达具有高效催化活性的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶突变体和N-乙酰神经氨酸醛缩酶，并采用该菌株全细胞高效合成唾液酸Neu5Ac，促进其在食品、医药等领域中的应用。

本发明提供了一种N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶突变体，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的第371位氨基酸进行突变得到的(三维结构如图1所示)。

在本发明的一种实施方式中，编码所述N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶亲本酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的第371位氨基酸由甘氨酸突变为半胱氨酸得到的；命名为G371C，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的第371位氨基酸由甘氨酸突变为丙氨酸得到的；命名为G371A，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明还提供了编码上述突变体的基因。

本发明还提供了携带上述基因的重组质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒以pET28a、pET28b、pET28c或pET22b为表达载体。

本发明还提供了携带上述基因，或上述重组质粒的重组细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以真菌或细菌为宿主细胞。

本发明还提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌过表达上述突变体和N-乙酰神经氨酸醛缩酶。

在本发明的一种实施方式中，所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌以E.coli BL21(DE3)为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌以敲除了E.coli BL21(DE3)基因组上的nanT基因和/或nagE基因的菌株为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌以敲除了E.coli BL21(DE3)基因组上的nanT和nagE基因基因的菌株命名为E.coliΔNTE；敲除了E.coli BL21(DE3)基因组上的nanT基因的菌株命名为E.coliΔNT；敲除了E.coli BL21(DE3)基因组上的nagE基因的菌株命名为E.coliΔNE。

在本发明的一种实施方式中，以pET28a、pET28b、pET28c或pET22b为表达载体。

本发明还提供了一种唾液酸的制备方法，所述方法为，向含有GlcNAc和丙酮酸的体系中添加上述重组大肠杆菌，全细胞催化制备得到唾液酸。

在本发明的一种实施方式中，反应体系中底物GlcNAc终浓度为：300～1000mmol·L^-1。

在本发明的一种实施方式中，反应体系中底物丙酮酸终浓度为500～3000mmol·L^-1。

在本发明的一种实施方式中，向体系中添加的重组大肠杆菌的量为：OD₆₀₀＝10～60。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为：

(1)收集诱导后的重组大肠杆菌菌体，用pH 6.6～8.5，10～200mmol·L^-1Tris-HCl缓冲液重悬；

(2)向含有终浓度为100～1000mmol·L^-1GlcNAc和终浓度为500～3000mmol·L^-1丙酮酸的反应体系中添加步骤(1)制备得到的菌体，添加菌体的OD₆₀₀＝10～60，并底物中添加0.1～1.2％的Triton X-100。将反应体系置于30℃，200r·min^-1反应一定时间，每隔一定时间取样及调节pH，用高效液相色谱分析转化的底物、中间产物、产物的量。

本发明还提供了上述突变体，或上述基因，或上述重组质粒，或上述重组细胞，或上述重组大肠杆菌，或上述方法在制备含有唾液酸化学品中的应用。

有益效果

(1)本发明提供了一种具有高效催化活性的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶突变体，通过对酶蛋白三级结构进行解析，确定关键氨基酸残基G371，对其进行定点突变，获得具有高效催化活性的突变体G371C和G371A。在重组大肠杆菌中过量表达N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶突变体，全细胞催化底物，高效生产唾液酸Neu5Ac。

(2)采用本发明获得的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶突变体及方法在重组大肠杆菌中高效表达后可高效生产唾液酸Neu5Ac，可促进其在食品、医药等领域中的应用。

(3)本发明的突变体G371A针对N-乙酰氨基葡萄糖的催化效率常数k_cat/K_m为263L·mmol^-1·min^-1，与野生酶的催化效率常数(104L·mmol^-1·min^-1)相比，得到了显著提高；本发明的突变体G371C针对N-乙酰氨基葡萄糖的催化效率常数k_cat/K_m为251L·mmol^-1·min^-1，与野生酶的催化效率(104L·mmol^-1·min^-1)相比，得到了显著提高。

(4)采用本发明构建的重组大肠杆菌E.coli△NTE pET28a-shnal-G371C和E.coli△NTE pET28a-shnal-G371A全细胞催化制备得到Neu5Ac产量分别为352.0和353.6mmol·L^-1，显著高于野生型重组菌(328.2mmol·L^-1)。同时，含有G371A和G371C的E.coli重组菌株催化GlcNAc转化生成Neu5Ac的转化效率，显著高于对照菌株。

附图说明

图1：N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶三级结构图。

图2：N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶及突变体SDS-PAGE图。

图3：N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶突变体催化效率图。

图4：重组大肠杆菌唾液酸Neu5Ac生产图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

下述实施例中所涉及的大肠杆菌E.coli△NTE，E.coli△NT，E.coli△NE公开于“周俊波，全细胞催化生产N-乙酰神经氨酸的重组大肠杆菌构建，江南大学”论文中。

下述实施例中所涉及的培养基如下：

LB液体培养基：酵母粉5g·L^-1，蛋白胨10g·L^-1，氯化钠10g·L^-1。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的酶活测定(500μL反应体系)：5mmol·L^-1ATP，50mmol·L^-1GlcNAc(ManNAc)，10mmol·L^-1MgCl₂，pH 7.5，100mmol·L^-1Tris-HCl，250μL纯酶液。在37℃下反应30min后沸水浴5min终止反应，10000r·min^-1离心8min后收集上清液经0.22μm孔径滤膜过滤后用HPLC分析，根据结果计算N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的酶活。

N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的酶活定义：在37℃，pH 7.5的条件下，每分钟转化底物GlcNAc生成1μmol产物ManNAc所需的酶量为一个酶活单位。

实施例1：含有N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶突变体的重组菌的构建

具体方法如下：

(1)化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的编码N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的基因；

(2)采用Extaq酶扩增N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶基因，将其与T载体连接，转化大肠杆菌JM109，筛选获得重组菌，提取获得含有N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶基因的T载体。

(3)利用引物序列，以含有N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶基因的T载体为模板PCR，针对N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶基因进行定点突变；所涉及的引物序列如下：

G371C-FW:AAATGGAAATGTTGCTTCCAC；

G371C-RS:TGGAAGCAACATTTCCATTT；

G371A-FW:AAATGGAAAGCTTGCTTCCAC；

G371A-RS:GTGGAAGCAAGCTTTCCATTT。

PCR反应体系(50μL)：5μL 10×Buffer、0.5μL模板、0.5μL Ex Taq、5μL dNTPs、下游引物各1μL、加去离子水至50μL。PCR扩增条件为：95℃ 4min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃4min、29个循环；72℃ 10min。

将PCR获得的基因片段，采用DpnI对模板进行消化后，转化大肠杆菌JM109，筛选阳性克隆，测序验证是否突变成功。

(4)分别提取突变成功的含有N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶突变体G371C基因和G371A基因的载体，与质粒pET28a分别采用限制性内切酶Bgl II酶切位点酶切后，分别将N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶突变体G371C基因和G371A基因连接至质粒pET28a，获得重组质粒pET28a-G371C，重组质粒pET28a-G371A；

(5)分别将重组质粒pET28a-G371C，重组质粒pET28a-G371A转化入大肠杆菌BL21(DE3)，分别获得含有N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶突变体的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-G371C、E.coli BL21(DE3)/pET28a-G371A。

(6)含有野生型N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的重组菌株的构建：

按照上述方法，将核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶WT与重组质粒pET28a采用限制性内切酶Bgl II酶切位点酶切后连接，制备得到重组质粒pET28a-WT，将重组质粒转化如入大肠杆菌BL21(DE3)中，制备得到重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-WT。

实施例2：N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的表达、纯化及分析

具体步骤如下：

(1)分别挑取实施例1制备得到的E.coli BL21(DE3)/pET28a-G371C、E.coli BL21(DE3)/pET28a-G371A、E.coli BL21(DE3)/pET28a-WT的单菌落接种到含50μg·mL^-1卡那霉素的液体LB培养基中，37℃，200r·min^-1培养12h，制备得到种子液。

(2)将制备得到的种子液以体积百分比为1％的接种量接种至LB液体培养基，在37℃，200r·min^-1继续培养至OD₆₀₀为0.8时，加入1.0mmol·L^-1IPTG于28℃培养8h诱导重组蛋白表达，分别得到含有N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶突变体的粗酶液：即分别得到含有G371A的粗酶液、含有G371C的粗酶液，和含有N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶野生酶的粗酶液(含有WT的粗酶液)。

检测粗酶液的酶活如下：

其中，突变体G371A粗酶液的酶活为：4.78U/mL；

突变体G371C粗酶液的酶活为：5.36U/mL；

野生型酶WT粗酶液的酶活为：4.51U/mL。

(3)采用镍柱分别对含有WT的粗酶液、含有G371A的粗酶液和含有G371C的粗酶液进行纯化，纯化方法如下：收集诱导后的细胞，加入pH 7.4，500mmol·L^-1NaCl，50mmol·L^-1磷酸缓冲液，低温下超声波破碎12min后，5000r·min^-1，离心8min，收集上清作为粗酶液。用pH 7.4，500mmol·L^-1NaCl，50mmol·L^-1磷酸缓冲平衡Ni柱(HisTrap HP)，液粗酶液用0.22μm滤膜过滤后上样，然后用pH 7.4，500mmol·L^-1咪唑，500mmol·L^-1NaCl，50mmol·L^-1磷酸缓冲液洗脱，流速1.0mL·min^-1，收集样品。

分别制备得到含有WT的纯酶液、含有G371A的纯酶液和含有G371C的纯酶液，将制备得到的纯酶液进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图2所示，结果显示，显示单一目的条带，为电泳纯样品；并且在44.3kDa处有蛋白条带，证明N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶得到了表达。

(4)N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶突变体蛋白浓度

采用试剂盒Bradford蛋白浓度测定试剂盒(Bradford Protein Assay Kit)，测定纯化后样品的蛋白浓度。蛋白浓度是指：配制1mL浓度分别为0，0.1，0.2，0.3，0.4和0.5mg·mL^-1的牛血清白蛋白(BSA)溶液，与4mL考马斯亮蓝溶液G-250混匀，室温静置3min后测定吸光值(595nm)。以对应蛋白浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，制作标准曲线。取稀释至适当浓度的样品100μL，加水至1mL，与4mL考马斯亮蓝G-250混匀，室温静置3min后测定吸光值(595nm)。根据标准曲线，从测得的吸光值可计算出样品的蛋白含量。

结果显示：野生型的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的蛋白浓度为：6.13U·mg^-1；

突变体G371C对N-乙酰氨基葡萄糖的比酶活由对照的6.13U·mg^-1提高至7.05U·mg^-1；

突变体G371A对N-乙酰氨基葡萄糖的比酶活由对照的6.13U·mg^-1提高至7.32U·mg^-1。

(5)N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶突变体的动力学参数

分别将步骤(3)中得到的含有WT的纯酶液、含有G371A的纯酶液和含有G371C的纯酶液对于底物N-乙酰氨基葡萄糖的动力学参数，检测方法如下：

以GlcNAc为底物，底物浓度为2.5-400mmol·L^-1，在Tris-HCl缓冲液(50mM pH7.5)中进行的，纯酶液的加酶量为：5μL，反应条件是30℃，底物2-酮酸的浓度从0.1mM到10mM范围，NADH的浓度为0.025mM到0.2mM。从Lineweaver-Burk双倒数图确定kcat和Km的值。

结果如表1所示：

表1:N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶及突变体的动力学参数

酶	K<sub>m</sub>(mmol·L<sup>-1</sup>)	k<sub>cat</sub>(*10<sup>3</sup>min<sup>-1</sup>)	k<sub>cat</sub>/K<sub>m</sub>(L·mmol<sup>-1</sup>·min<sup>-1</sup>)
				G371A	31	8.6	263
G371C	28	7.0	251
				WT	39	4.1	104

结果显示，测定G371A针对N-乙酰氨基葡萄糖的催化效率常数k_cat/K_m为263L·mmol^-1·min^-1，与野生酶的催化效率常数(104L·mmol^-1·min^-1)显著提高，相比野生型提高了1.52倍(如图3所示)。

测定G371C针对N-乙酰氨基葡萄糖的催化效率常数k_cat/K_m为251L·mmol^-1·min^-1，与野生酶的催化效率(104L·mmol^-1·min^-1)常数显著提高，相比野生型提高了1.41倍(如图3所示)。

实施例3：唾液酸的制备

具体步骤如下：

1、构建重组大肠杆菌

(1)化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因shnal，通过其两端增加NdeI和EcoRI酶切位点，合成后插入载体质粒pET28a多克隆位点EcoRI和NdeI之间，得到重组质粒pET28a-shnal。

(2)分别将实施例2的步骤(4)中获得的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶突变体G371C基因和G371A基因及核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶WT，通过限制性内切酶NdeI和EcoRI酶切之后连接至步骤(1)制备得到的重组质粒pET28a-shnal上，分别制备得到重组质粒pET28a-shnal-G371C、pET28a-shnal-G371A和pET28a-shnal-WT。

(3)重组大肠杆菌的构建

分别将步骤(2)制备得到的重组质粒pET28a-shnal-G371C、pET28a-shnal-G371A和pET28a-shnal-WT分别转化至大肠杆菌E.coli△NTE中，制备得到重组大肠杆菌E.coli△NTE/pET28a-shnal-G371C、E.coli△NTE/pET28a-shnal-G371A、E.coli△NTE/pET28a-shnal-WT。

2、全细胞催化制备唾液酸

(1)分别将步骤1制备得到的重组大肠杆菌E.coli△NTE/pET28a-shnal-G371C、E.coli△NTE/pET28a-shnal-G371A、E.coli△NTE/pET28a-shnal-WT单菌落接种到含50μg·mL^-1卡那霉素的液体LB培养基中，37℃，200r·min^-1培养12h，制备得到种子液；

分别将制备得到的种子液以体积百分比为1％的接种量接种至LB液体培养基，在37℃，200r·min^-1继续培养至OD₆₀₀为0.8时，加入1.0mmol·L^-1IPTG于28℃培养8h，得到发酵液，分别将发酵液离心获得含有重组大肠杆菌E.coli△NTE/pET28a-shnal-G371C、E.coli△NTE/pET28a-shnal-G371A、E.coli△NTE/pET28a-shnal-WT的全细胞菌体催化剂，分别命名为shnal-G371C，shnal-G371A、shnal-WT。

(2)分别向含有终浓度为600mmol·L^-1的底物GlcNAc的反应体系中，添加全细胞菌体催化剂shnal-G371C，shnal-G371A、shnal-WT，添加量为终浓度OD₆₀₀＝30，添加全细胞催化剂之后分别添加终浓度为1600mmol·L^-1丙酮酸，添加0.2％(v/v)Triton X-100。

反应温度：30℃，pH 7.5，反应12h，分别检测底物GlcNAc、中间产物ManNAc和终产物Neu5Ac的含量，结果如表2和图4所示：

表2：全细胞催化制备唾液酸的底物、中间产物和终产物的产量

全细胞催化剂	Neu5Ac(mmol·L<sup>-1</sup>)	ManNAc(mmol·L<sup>-1</sup>)	GlcNAc(mmol·L<sup>-1</sup>)
				shnal-G371A	353.6	49.0	125.2
shnal-G371C	352.0	46.5	113.8
				shnal-WT	328.2	45.2	130.1

结果显示：E.coli△NTE pET28a-shnal-G371C和E.coli△NTE pET28a-shnal-G371A的Neu5Ac产量分别为352.0和353.6mmol·L^-1，显著高于野生型重组菌(328.2mmol·L^-1)。同时，含有shnal-G371A和shnal-G371C的E.coli重组菌株催化GlcNAc转化生成Neu5Ac的转化效率，显著高于对照菌株shnal-WT；

其中含有shnal-G371A的重组菌株催化GlcNAc转化生成Neu5Ac的转化效率为：59.6％；含有shnal-G371C的重组菌株催化GlcNAc转化生成Neu5Ac的转化效率为：59.1％；含有shnal-WT的重组菌株催化GlcNAc转化生成Neu5Ac的转化效率为：55.3％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种提高唾液酸产量的方法与应用

<130> BAA210619A

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 391

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ile Ala His Arg Arg Gln Glu Leu Ala Gln Gln Tyr Tyr Gln Ala

1 5 10 15

Leu His Gln Asp Val Leu Pro Phe Trp Glu Lys Tyr Ser Leu Asp Arg

20 25 30

Gln Gly Gly Gly Tyr Phe Thr Cys Leu Asp Arg Lys Gly Gln Val Phe

35 40 45

Asp Thr Asp Lys Phe Ile Trp Leu Gln Asn Arg Gln Val Trp Gln Phe

50 55 60

Ala Val Phe Tyr Asn Arg Leu Glu Pro Lys Pro Gln Trp Leu Glu Ile

65 70 75 80

Ala Arg His Gly Ala Asp Phe Leu Ala Arg His Gly Arg Asp Gln Asp

85 90 95

Gly Asn Trp Tyr Phe Ala Leu Asp Gln Glu Gly Lys Pro Leu Arg Gln

100 105 110

Pro Tyr Asn Val Phe Ser Asp Cys Phe Ala Ala Met Ala Phe Ser Gln

115 120 125

Tyr Ala Leu Ala Ser Gly Ala Gln Glu Ala Lys Ala Ile Ala Leu Gln

130 135 140

Ala Tyr Asn Asn Val Leu Arg Arg Gln His Asn Pro Lys Gly Gln Tyr

145 150 155 160

Glu Lys Ser Tyr Pro Gly Thr Arg Pro Leu Lys Ser Leu Ala Val Pro

165 170 175

Met Ile Leu Ala Asn Leu Thr Leu Glu Met Glu Trp Leu Leu Pro Pro

180 185 190

Thr Thr Val Glu Glu Val Leu Ala Gln Thr Val Arg Glu Val Met Thr

195 200 205

Asp Phe Leu Asp Pro Glu Ile Gly Leu Met Arg Glu Ala Val Thr Pro

210 215 220

Thr Gly Glu Phe Val Asp Ser Phe Glu Gly Arg Leu Leu Asn Pro Gly

225 230 235 240

His Gly Ile Glu Ala Met Trp Phe Met Met Asp Ile Ala Gln Arg Ser

245 250 255

Gly Asp Arg Gln Leu Gln Glu Gln Ala Ile Ala Val Val Leu Asn Thr

260 265 270

Leu Glu Tyr Ala Trp Asp Glu Glu Phe Gly Gly Ile Phe Tyr Phe Leu

275 280 285

Asp Arg Gln Gly His Pro Pro Gln Gln Leu Glu Trp Asp Gln Lys Leu

290 295 300

Trp Trp Val His Leu Glu Thr Leu Val Ala Leu Ala Lys Gly His Gln

305 310 315 320

Ala Thr Gly Gln Glu Lys Cys Trp Gln Trp Phe Glu Arg Val His Asp

325 330 335

Tyr Ala Trp Ser His Phe Ala Asp Pro Glu Tyr Gly Glu Trp Phe Gly

340 345 350

Tyr Leu Asn Arg Arg Gly Glu Val Leu Leu Asn Leu Lys Gly Gly Lys

355 360 365

Trp Lys Gly Cys Phe His Val Pro Arg Ala Leu Trp Leu Cys Ala Glu

370 375 380

Thr Leu Gln Leu Pro Val Ser

385 390

<210> 2

<211> 293

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Glu Glu Gln Leu Lys Gly Leu Tyr Ala Ala Leu Leu Val Pro Phe

1 5 10 15

Asp Glu Asn Gly Gln Val Lys Glu Glu Gly Leu Lys Gln Ile Ala Lys

20 25 30

Asn Ala Ile Glu Val Glu Gln Leu Asp Gly Leu Tyr Val Asn Gly Ser

35 40 45

Ser Gly Glu Asn Phe Leu Ile Ser Lys Glu Gln Lys Lys Gln Ile Phe

50 55 60

Lys Val Val Lys Glu Ala Val Gly Asn Asp Val Lys Leu Ile Ala Gln

65 70 75 80

Val Gly Ser Leu Asp Leu Asn Glu Ala Ile Glu Leu Gly Lys Tyr Ala

85 90 95

Thr Asn Leu Gly Tyr Asp Ala Leu Ser Ala Val Thr Pro Phe Tyr Tyr

100 105 110

Pro Phe Ser Phe Glu Glu Ile Lys Gln Tyr Tyr Phe Asp Ile Ile Glu

115 120 125

Ala Thr Gln Asn Lys Met Ile Ile Tyr Ala Ile Pro Asp Leu Thr Gly

130 135 140

Val Asn Ile Ser Ile Asn Gln Phe Glu Glu Leu Phe Asp Asn Glu Lys

145 150 155 160

Ile Val Gly Val Lys Tyr Thr Ala Pro Asn Phe Phe Leu Leu Glu Arg

165 170 175

Ile Arg Lys Ala Phe Pro Asp Lys Leu Ile Leu Ser Gly Phe Asp Glu

180 185 190

Met Leu Val Gln Ala Val Ile Ser Gly Val Asp Gly Ala Ile Gly Ser

195 200 205

Thr Tyr Asn Val Asn Gly Arg Arg Ala Arg Gln Ile Tyr Asp Leu Ala

210 215 220

Arg Glu Gly Lys Val Glu Glu Ala Tyr Lys Ile Gln His Asp Thr Asn

225 230 235 240

Asn Ile Ile Glu Thr Val Leu Ser Met Gly Ile Tyr Pro Thr Leu Lys

245 250 255

Glu Ile Leu Lys Thr Arg Gly Ile Asp Gly Gly Val Pro Lys Arg Pro

260 265 270

Phe Ser Pro Phe Asn Glu Ala Asn Arg Lys Glu Leu Asn Gln Leu Ile

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Glu Thr Tyr Asn Leu

290

<210> 3

<211> 1176

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgattgccc atcgccgtca ggagctggcc cagcaatatt accaggctct gcaccaggac 60

gtactgccgt tttgggaaaa atattccctg gatcgccagg gtggcggtta ctttacctgc 120

ctggaccgta aaggccaggt ttttgacacc gataaattca tttggctgca aaaccgtcag 180

gtatggcagt ttgccgtttt ctacaaccgt ctggaaccaa aaccgcaatg gctggaaatt 240

gcccgccatg gtgctgattt tctggctcgc cacggccgtg atcaagacgg taactggtat 300

tttgctctgg atcaggaagg caaaccgctg cgtcaaccgt ataacgtttt ttccgattgc 360

ttcgccgcca tggccttttc tcaatatgcc ctggcctctg gtgcgcagga agctaaagcc 420

attgccctgc aggcctacaa caacgttctg cgccgtcagc acaacccgaa aggtcaatac 480

gagaagtcct atccaggtac tcgtccgctg aaatccctgg cggtgccgat gattctggcc 540

aacctgaccc tggagatgga atggctgctg ccgccgacta ccgtggaaga ggtgctggcc 600

caaaccgttc gtgaagtgat gaccgatttc ctggacccag aaatcggtct gatgcgtgaa 660

gcggtgaccc cgaccggtga atttgttgat tcttttgaag gtcgtctgct gaacccaggt 720

cacggcattg aagccatgtg gttcatgatg gacattgccc aacgctccgg cgatcgccag 780

ctgcaggagc aagccattgc agtggtgctg aacaccctgg aatatgcctg ggatgaagaa 840

tttggtggca tcttttattt cctggatcgc cagggccacc cgccgcaaca actggaatgg 900

gaccaaaagc tgtggtgggt acatctggaa accctggttg ccctggccaa gggccaccaa 960

gccactggcc aagaaaaatg ttggcaatgg tttgagcgtg ttcatgatta cgcctggtct 1020

catttcgccg atccggagta tggtgaatgg tttggctacc tgaaccgccg tggtgaggtg 1080

ctgctgaacc tgaaaggtgg taaatggaaa ggttgcttcc acgtgccgcg tgctctgtgg 1140

ctgtgtgcgg aaactctgca actgccggtt tcttaa 1176

<210> 4

<211> 391

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Ile Ala His Arg Arg Gln Glu Leu Ala Gln Gln Tyr Tyr Gln Ala

1 5 10 15

Leu His Gln Asp Val Leu Pro Phe Trp Glu Lys Tyr Ser Leu Asp Arg

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Asp Thr Asp Lys Phe Ile Trp Leu Gln Asn Arg Gln Val Trp Gln Phe

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Pro Tyr Asn Val Phe Ser Asp Cys Phe Ala Ala Met Ala Phe Ser Gln

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Ala Tyr Asn Asn Val Leu Arg Arg Gln His Asn Pro Lys Gly Gln Tyr

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Glu Lys Ser Tyr Pro Gly Thr Arg Pro Leu Lys Ser Leu Ala Val Pro

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Met Ile Leu Ala Asn Leu Thr Leu Glu Met Glu Trp Leu Leu Pro Pro

180 185 190

Thr Thr Val Glu Glu Val Leu Ala Gln Thr Val Arg Glu Val Met Thr

195 200 205

Asp Phe Leu Asp Pro Glu Ile Gly Leu Met Arg Glu Ala Val Thr Pro

210 215 220

Thr Gly Glu Phe Val Asp Ser Phe Glu Gly Arg Leu Leu Asn Pro Gly

225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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Ala Thr Gly Gln Glu Lys Cys Trp Gln Trp Phe Glu Arg Val His Asp

325 330 335

Tyr Ala Trp Ser His Phe Ala Asp Pro Glu Tyr Gly Glu Trp Phe Gly

340 345 350

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370 375 380

Thr Leu Gln Leu Pro Val Ser

385 390

<210> 5

<211> 391

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Ile Ala His Arg Arg Gln Glu Leu Ala Gln Gln Tyr Tyr Gln Ala

1 5 10 15

Leu His Gln Asp Val Leu Pro Phe Trp Glu Lys Tyr Ser Leu Asp Arg

20 25 30

Gln Gly Gly Gly Tyr Phe Thr Cys Leu Asp Arg Lys Gly Gln Val Phe

35 40 45

Asp Thr Asp Lys Phe Ile Trp Leu Gln Asn Arg Gln Val Trp Gln Phe

50 55 60

Ala Val Phe Tyr Asn Arg Leu Glu Pro Lys Pro Gln Trp Leu Glu Ile

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Ala Arg His Gly Ala Asp Phe Leu Ala Arg His Gly Arg Asp Gln Asp

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100 105 110

Pro Tyr Asn Val Phe Ser Asp Cys Phe Ala Ala Met Ala Phe Ser Gln

115 120 125

Tyr Ala Leu Ala Ser Gly Ala Gln Glu Ala Lys Ala Ile Ala Leu Gln

130 135 140

Ala Tyr Asn Asn Val Leu Arg Arg Gln His Asn Pro Lys Gly Gln Tyr

145 150 155 160

Glu Lys Ser Tyr Pro Gly Thr Arg Pro Leu Lys Ser Leu Ala Val Pro

165 170 175

Met Ile Leu Ala Asn Leu Thr Leu Glu Met Glu Trp Leu Leu Pro Pro

180 185 190

Thr Thr Val Glu Glu Val Leu Ala Gln Thr Val Arg Glu Val Met Thr

195 200 205

Asp Phe Leu Asp Pro Glu Ile Gly Leu Met Arg Glu Ala Val Thr Pro

210 215 220

Thr Gly Glu Phe Val Asp Ser Phe Glu Gly Arg Leu Leu Asn Pro Gly

225 230 235 240

His Gly Ile Glu Ala Met Trp Phe Met Met Asp Ile Ala Gln Arg Ser

245 250 255

Gly Asp Arg Gln Leu Gln Glu Gln Ala Ile Ala Val Val Leu Asn Thr

260 265 270

Leu Glu Tyr Ala Trp Asp Glu Glu Phe Gly Gly Ile Phe Tyr Phe Leu

275 280 285

Asp Arg Gln Gly His Pro Pro Gln Gln Leu Glu Trp Asp Gln Lys Leu

290 295 300

Trp Trp Val His Leu Glu Thr Leu Val Ala Leu Ala Lys Gly His Gln

305 310 315 320

Ala Thr Gly Gln Glu Lys Cys Trp Gln Trp Phe Glu Arg Val His Asp

325 330 335

Tyr Ala Trp Ser His Phe Ala Asp Pro Glu Tyr Gly Glu Trp Phe Gly

340 345 350

Tyr Leu Asn Arg Arg Gly Glu Val Leu Leu Asn Leu Lys Gly Gly Lys

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370 375 380

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<210> 6

<211> 1176

<212> DNA

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<211> 1176

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgattgccc atcgccgtca ggagctggcc cagcaatatt accaggctct gcaccaggac 60

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<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atggaggaac agttaaaggg cctttatgcg gctctgttag tacctttcga cgagaatgga 60

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tatgatgccc tgtctgccgt cacgccgttc tactacccgt tttcctttga agagattaaa 360

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attgtcggtg ttaagtacac cgctccgaac ttctttttgt tagaacgtat ccgtaaggct 540

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ggagtagacg gagcgatcgg cagcacctac aatgtaaatg gtcgtcgtgc gcgccagatt 660

tacgaccttg cccgtgaggg aaaagtcgaa gaggcgtata aaattcagca cgacaccaac 720

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cgcaaggaat taaaccagct gatcgagact tataatctgt aa 882

Claims

1.一种N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶突变体，其特征在于，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的第371位氨基酸进行突变得到的。

2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的第371位氨基酸由甘氨酸突变为半胱氨酸或丙氨酸得到的。

3.编码权利要求1或2所述突变体的基因。

4.携带权利要求3所述基因的重组质粒。

5.携带权利要求3所述基因，或权利要求4所述重组质粒的重组细胞。

6.一种重组大肠杆菌，其特征在于，过表达了权利要求1或2所述的突变体和N-乙酰神经氨酸醛缩酶。

7.如权利要求6所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

8.如权利要求6或7所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组菌以E.coli BL21(DE3)为宿主，或以敲除了E.coli BL21(DE3)基因组上的nanT基因和/或nagE基因的菌株为宿主。

9.一种唾液酸的制备方法，其特征在于，向含有N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸的反应体系中添加权利要求6～8任一所述的重组大肠杆菌，全细胞催化制备得到唾液酸。

10.权利要求1或2所述的突变体，或权利要求3所述的基因，或权利要求4所述的重组质粒，或权利要求5所述的重组细胞，或权利要求6～8任一所述的重组大肠杆菌，或权利要求9所述的方法在制备含有唾液酸化学品中的应用。