CN109943515A - 一种产羧酸酯酶的重组菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产羧酸酯酶的重组菌及其应用，属于酶工程领域。本发明将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的羧酸酯酶BaCEs02在大肠杆菌中异源表达，其中粗酶液中以1‑乙酸萘酯和2‑乙酸萘酯为底物的酶活分别为13831.8U/L和8135.9U/L。纯化得到的羧酸酯酶BaCEs02纯酶液对邻苯二甲酸酯类(邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯或邻苯二甲酸二异丁酯)的降解率分别高达92.2％、95.6％、87.3％，提供了一种高效降解塑化剂邻苯二甲酸酯类的方法。

Description

一种产羧酸酯酶的重组菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种产羧酸酯酶的重组菌及其应用，属于酶工程领域。

背景技术

羧酸酯酶(carboxylesterase，EC 3.1.1.1)是指能够催化水解羧酸酯生成羧酸和醇的非特异性酯酶。羧酸酯酶在生产和实际生活中应用广泛，并且已经得到了越来越多现代药物工业、手性化合物合成以及精细化工等相关行业的青睐。利用羧酸酯酶作为催化剂催化手性分子合成，例如生产萘普生和2-芳基萘酸；同时羧酸酯酶也被作为绿色催化剂降解土壤中的农药残留及土壤、水体中的塑化剂邻苯二甲酸酯类。由于产自动植物的羧酸酯酶存在着酶活低、产量少、提取复杂、热稳定性差等缺陷，而微生物来源的羧酸酯酶具有良好的区位选择性和立体选择性，可以高效温和的催化酯类和酰胺类化合物的水解、酯合成和酯交换等反应，在食品工业、生物去污剂、医药、能源开发和环境保护等相关领域都具有广阔的应用前景。

微生物中羧酸酯酶存在于真菌、细菌及个别种类的放线菌中。真菌在其中承担着重要作用，真菌中12属23种可产生羧酸酯酶；由于真菌来源的羧酸酯酶表达量少、酶活较低，而细菌来源的羧酸酯酶容易获得，酶学性质优异，催化效率高，所以细菌来源的羧酸酯酶越来越受到人们的关注。在细菌中羧酸酯酶主要存在于包括链球菌、乳杆菌、假单胞菌中。而野生菌中羧酸酯酶的表达量较低，不能满足工业应用；随着基因工程应用于羧酸酯酶的研究中，很多羧酸酯酶基因得到了异源表达。2000年，Kademi,A.等人在环状芽孢杆菌中克隆出酶活为88.2U·mg^-1中度嗜热羧酸酯酶，2001年，Núria Prim等人在枯草芽孢杆菌中克隆出酶活为2.28U·mg^-1的B型羧酸酯酶。2003年，K.M.Fenster等人在乳酸菌克隆出酶活为564U·mg^-1的酸性羧酸酯酶。但是这些羧酸酯酶酶活任然无法达到工业上的需求。因此，获得高酶活的细菌来源的羧酸酯酶，在工业应用中将具有十分重要的价值和意义。

发明内容

本发明将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的羧酸酯酶(BaCEs02)在大肠杆菌中异源表达，粗酶液中以1-乙酸萘酯和2-乙酸萘酯为底物的酶活分别为13831.8U/L和8135.9U/L，纯化得到的羧酸酯酶(BaCEs02)以1-乙酸萘酯和2-乙酸萘酯为底物的比酶活，分别高达1680.58U·mg^-1和939.42U·mg^-1。

本发明的第一个目的是提供一种产羧酸酯酶的重组菌，以大肠杆菌为宿主，表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的羧酸酯酶基因。

在本发明的一种实施方式中，所述羧酸酯酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，是以pColdII为表达载体在大肠杆菌中表达。

本发明的第二个目的是提供一种产羧酸酯酶的方法，所述方法是应用所述重组菌进行发酵生产。

本发明的第三个目的是提供一种降解邻苯二甲酸酯类的方法，是以所述重组菌全细胞或其生产的羧酸酯酶为催化剂，降解邻苯二甲酸酯类。

在本发明的一种实施方式中，所述邻苯二甲酸酯类为：邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯或邻苯二甲酸二异丁酯。

在本发明的一种实施方式中，所述羧酸酯酶的降解条件为：pH5.0～8.0。

在本发明的一种实施方式中，所述羧酸酯酶的降解条件优选为：pH 6.5。

在本发明的一种实施方式中，所述羧酸酯酶的降解温度为：15～60℃。

在本发明的一种实施方式中，所述羧酸酯酶的降解温度优选为：45℃。

在本发明的一种实施方式中，所述降解时间为1～6h。

在本发明的一种实施方式中，所述降解具体为：将所述重组菌或其生产的羧酸酯酶酶液加入到终浓度为1～10mM的邻苯二甲酸酯类(邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯或邻苯二甲酸二异丁酯)中，在15～60℃水浴1～10h。

在本发明的一种实施方式中，所述降解更具体为：将所述羧酸酯酶酶液加入到终浓度为1mM的邻苯二甲酸酯类(邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯或邻苯二甲酸二异丁酯)中，在1.5mL的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 6.5)中，于40℃下反应1～10h。

本发明还提供所述重组菌或其生产的羧酸酯酶在环境保护领域的应用。

在一种实施方式中，所述应用是将所述羧酸酯酶加入到含有塑化剂邻苯二甲酸酯类的污水中，利用羧酸酯酶降解邻苯二甲酸酯类。

本发明的有益效果：

(1)本发明将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的羧酸酯酶BaCEs02在大肠杆菌中异源表达，其中粗酶液中以1-乙酸萘酯和2-乙酸萘酯为底物的酶活分别为13831.8U/L和8135.9U/L，纯化得到的羧酸酯酶(BaCEs02)以1-乙酸萘酯和2-乙酸萘酯为底物的比酶活，分别高达1680.58U·mg^-1和939.42U·mg^-1。

(2)纯化得到的羧酸酯酶BaCEs02纯酶液对邻苯二甲酸酯类(邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯)的降解率分别高达92.2％、95.6％、87.3％，提供了一种高效降解塑化剂邻苯二甲酸酯类的方法。

附图说明

图1：最适反应温度。

图2：最适反应pH。

图3：温度稳定性。

图4：pH稳定性。

图5：1-乙酸萘酯酶促反应动力学曲线。

图6：2-乙酸萘酯酶促反应动力学曲线。

具体实施方式

(1)以1-乙酸萘酯或2-乙酸萘酯为底物测定羧酸酯酶酶活的方法：

1％的固蓝B盐：称取1g的固蓝B盐溶于蒸馏水中定容至100mL，避光保存。

5％的SDS：称取5g的SDS溶于蒸馏水中，于37℃水浴1小时，待其完全溶解后定容至100mL，于冰箱保存。

0.6M的1-乙酸萘酯或2-乙酸萘酯：称取11.17g的1-乙酸萘酯或2-乙酸萘酯溶于95％的乙醇中，定容至100mL，避光保存。

磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液：1/15M磷酸氢二钠与1/15M磷酸二氢钾混合配置至pH7.0。

将15μL的底物1-乙酸萘酯或2-乙酸萘酯加入到1.5mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中(pH 7.0)于37℃水浴保温5min，加入250μL纯化后的酶液，反应5min，加入0.5mL终止显色液DBLS(1％固蓝B盐与5％SDS以2:5混合)，摇匀，静置10min，595/555nm下测定吸光值。

酶活定义：在最适反应条件下，1min内从0.6M的1-乙酸萘酯或2-乙酸萘酯溶液中释放1μM的1-萘酚或2-萘酚所需的酶量为一个酶活单位。

(2)羧酸酯酶蛋白浓度的测定：根据Bradford蛋白定量试剂盒方法，将稀释一定倍数的酶液与G250染色液混合，用酶标仪测定595nm处的吸光值，根据蛋白浓度标曲计算蛋白浓度。比酶活(U·mg^-1)＝酶活(U·mL^-1)×[蛋白浓度(mg·mL^-1)]^-1。

(3)邻苯二甲酸酯类高效液相色谱检测条件为：C18柱(Agilent 4.6×250mm)，波长254nm，流动相比例为甲醇：水＝80:20，检测温度为30℃。

(4)邻苯二甲酸酯类降解率计算公式：降解率＝剩余底物浓度/初始底物浓度

实施例1：工程菌株的构建

人工合成核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)的羧酸酯酶BaCEs02基因序列。将BaCEs02基因序列和质粒载体pColdII用限制性内切酶SacⅠ和XbaⅠ双酶切后连接转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，得到重组菌E.coli BL21-pColdII-BaCEs02。

实施例2：羧酸酯酶(BaCEs02)的表达与纯化

LB培养基g/L：氯化钠10，胰蛋白胨10，Yeast Extract 5，pH 7。

将重组大肠杆菌E.coli BL21-pColdII-BaCEs02接种于含有100mg·mL^-1氨苄的LB液体培养基中，以原始菌株E.coli BL21(DE3)和空载菌株(E.coli BL21(DE3)中转入pClodII质粒)作为对照，37℃，200rmp培养12h，然后将500μL上述种子液接种于含有50μL氨苄的50mL LB培养液中，37℃培养2.5h，至OD₆₀₀为0.6，将摇床降温至15℃，静置30min。每瓶加入40μL终浓度为0.4mol/L的IPTG作为诱导剂，以不加诱导剂作为对照组，于15℃200rmp培养24h。

收集菌液，4℃，8000rmp离心10min后得到菌体，加入5mL磷酸盐缓冲液(0.02mol/L，pH7.0)重悬菌体，超声破碎仪破碎，离心收集上清液得到粗酶液。将上述得到的粗酶液采用AKTA avant 150蛋白纯化系统进行镍柱纯化得到BaCEs02酶液，测得BaCEs02的浓度为29.7mg/mL，用于后续实验。

实施例3：羧酸酯酶(BaCEs02)的酶活测定

在磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 7)中，以2-乙酸萘酯为底物，15～60℃范围内，每隔5℃，测定羧酸酯酶BaCEs02酶活，可知羧酸酯酶BaCEs02的最适温度为45℃(见图1)。在最适反应温度45℃条件下，pH 5.0～8.0范围内，每隔0.5，测定酶活，确定最适反应pH为6.5(见图2)。

在最适反应条件下，即磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 6.5)中，45℃下，分别以0.6M 1-乙酸萘酯和2-乙酸萘酯为底物测定实施例2中得到的粗酶液的酶活以及纯化得到的羧酸酯酶BaCEs02的比酶活，其中粗酶液中BaCEs02的酶活分别为13831.8U/L和8135.9U/L，纯化得到的羧酸酯酶BaCEs02的比酶活分别达到1680.58U·mg^-1和939.42U·mg^-1。

温度稳定性：将羧酸酯酶(BaCEs02)酶液250μL，在pH为6.5时分别在10,20,30,40,50,60℃中保存1h后测定剩余酶活，以酶活最高的设置为100％。结果显示：羧酸酯酶BaCEs02在50℃放置一小时后酶活性依然保持在60％以上，具有良好的温度稳定性(见图3)。

表1温度稳定性

pH稳定性：将250μL羧酸酯酶(BaCEs02)酶液在温度45℃条件下，分别在pH5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0中保存1h后测定剩余酶活，以酶活最高的设置为100％。结果显示：羧酸酯酶BaCEs02在pH5.5～7.5范围内放置1小时后酶活性保持在45％以上，具有良好的pH稳定性。

表2 pH稳定性

实施例4：金属离子对羧酸酯酶(BaCEs02)的影响

在1.5mL的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 6.5)中，45℃下，加入250μLBaCEs02酶液，15μL的0.6M 2-乙酸萘酯，1mM不同金属离子(Na⁺,K⁺,Zn²⁺,NH₄ ⁺,Mg²⁺,Ca²⁺,Cu^{2 +},Fe³⁺)，测定金属离子对羧酸酯酶BaCEs02酶活的影响。结果如表3所示，可知K⁺，NH₄ ⁺，Mg²⁺对酶活有略微的促进作用，其余金属离子对酶有不同程度的抑制作用。

表3不同金属离子对羧酸酯酶酶活的影响

实施例5：羧酸酯酶(BaCEs02)的底物特异性

在1.5mL的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 6.5)中，45℃下，加入250μLBaCEs02酶液，测定羧酸酯酶BaCEs02催化0.2-3.4mmol·L^-1的1-乙酸萘酯和0.1-3.2mmol·L^-1的2-乙酸萘酯的反应速率，利用Origin软件进行非线性拟合曲线计算得到Vmax和Km值，进而计算得到Kcat/Km值。如表4所示，底物1-乙酸萘酯与2-乙酸萘酯相比，羧酸酯酶对1-乙酸萘酯的亲和力更大(K_m越低，亲和力越大)，对1-乙酸萘酯的催化效率(K_cat/K_m)更好，达到13.51。

表4不同底物动力学参数

实施例6：羧酸酯酶(BaCEs02)的应用

取50μL实施例2中纯化后的羧酸酯酶(BaCEs02)酶液加入到终浓度为1mM的邻苯二甲酸酯类(邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯或邻苯二甲酸二异丁酯)中，在1.5mL的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 6.5)中，以不加羧酸酯酶(BaCEs02)酶液作为对照组，于40℃水浴1h后，在反应体系中加入100μL浓度为1M HCl溶液终止反应，再用等体积的乙酸乙酯萃取，每组实验设置三个平行实验。通过高效液相色谱测定剩余底物的量，来判断其水解程度。计算得到羧酸酯酶BaCEs02对3种塑化剂邻苯二甲酸酯类(邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯)的降解率分别为81.2％、88.3％、75.7％。由此而知，该羧酸酯酶对低浓度的三种塑化剂的降解率均达到75％以上，在环境修复中有很大的应用价值。

表5 BaCEs02对低浓度邻苯二甲酸酯类的降解

实施例7：羧酸酯酶(BaCEs02)的应用

与实施例6中过程相同，所不同的是体系中邻苯二甲酸酯类的终浓度为10mM。

将50μL实施例2中纯化后的羧酸酯酶(BaCEs02)酶液加入到终浓度为10mM的邻苯二甲酸酯类(邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯或邻苯二甲酸二异丁酯)中，在1.5mL的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 6.5)中，以不加羧酸酯酶(BaCEs02)酶液作为对照组，于40℃水浴1h后，在反应体系中加入100μL浓度为1M HCl溶液终止反应，再用等体积的乙酸乙酯萃取，每组实验设置三个平行实验。通过高效液相色谱测定剩余底物的量，来判断其水解程度，计算得到该羧酸酯酶对3种塑化剂邻苯二甲酸酯类(邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯)的降解率分别为55.5％、60.4％、43.1％。由此结果可知，在不增加酶量的情况下，该羧酸酯酶对高浓度的3种塑化剂的降解率都达到了40％以上。

表6 BaCEs02对高浓度邻苯二甲酸酯类的降解

实施例8：羧酸酯酶(BaCEs02)的应用

与实施例6中过程相同，所不同的水解时间延长至6h。

将50μL纯化后的酶液加入到终浓度为1mM的邻苯二甲酸酯类(邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯或邻苯二甲酸二异丁酯)中，以不加酶液作为对照组，在1.5mL的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 6.5)中,于40℃水浴6h后，加入100μL浓度为1M HCl溶液终止反应，再用等体积的乙酸乙酯萃取，每组实验设置三个平行实验。通过高效液相色谱测定剩余底物的量，来判断其水解程度，计算得到该羧酸酯酶对3种塑化剂的降解率分别为87.4％、92.4％、80.6％。该结果说明延长反应时间，该羧酸酯酶对3种塑化剂邻苯二甲酸酯类(邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯)的降解率均达到了80％以上，说明延长反应时间能够提高降解率。

表7 BaCEs02对低浓度邻苯二甲酸酯类的降解

实施例9：羧酸酯酶(BaCEs02)的应用

与实施例6中过程相同，所不同的是羧酸酯酶(BaCEs02)酶液的添加量加大为100μL。

将100μL纯化后的酶液加入到终浓度为1mM的邻苯二甲酸酯类(邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯)中，以不加酶液作为对照组，在1.5mL的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 6.5)中，于40℃水浴1h后，加入100μL浓度为1M HCl溶液终止反应，再用等体积的乙酸乙酯萃取，每组实验设置三个平行实验。通过高效液相色谱测定剩余底物的量，来判断其水解程度。经高效液相色谱测定分析剩余底物的量，计算得到该羧酸酯酶对3种塑化剂的降解率分别为92.2％、95.6％、87.3％。该结果说明增加酶量增加降解率。

表8 BaCEs02对低浓度邻苯二甲酸酯类的降解

实施例10：重组菌E.coli BL21-pColdII-BaCEs02全细胞催化反应

将实施例1中得到的重组菌E.coli BL21-pColdII-BaCEs02收集后用磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 6.5)重悬稀释至OD₆₀₀为1.0，分别加入100μL菌液到终浓度1mM邻苯二甲酸酯类(邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯或邻苯二甲酸二异丁酯)中，于40℃水浴1h后，加入100μL浓度为1M HCl溶液终止反应，再用等体积的乙酸乙酯萃取，每组实验设置三个平行实验。通过高效液相色谱测定剩余底物的量，来判断其水解程度，计算得到重组菌E.coli BL21-pColdII-BaCEs02对3种塑化剂的降解率分别为28.8％、42.1％和31.7％。

表9 BaCEs02对低浓度邻苯二甲酸酯类的降解

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种产羧酸酯酶的重组菌及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 482

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Thr Lys Leu Thr Val Gln Thr Arg Cys Gly Ala Leu Lys Gly Thr

1 5 10 15

Ala Gly Arg Gly Ala Arg Thr Trp Lys Gly Ile Pro Tyr Ala Lys Pro

20 25 30

Pro Val Gly Glu Leu Arg Phe Lys Ala Pro Glu Pro Pro Ala Pro Trp

35 40 45

Asp Gly Val Lys His Ala Asp Ser Phe Gly Pro Val Cys Pro Gln Pro

50 55 60

Asp Asp Met Leu Ser Ile Ser Phe Ser Gly Asp Ile Pro Pro Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Val Phe Ala Pro Asp Ser Glu Gly Glu

85 90 95

Lys Lys Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Tyr Leu Gly

100 105 110

Ala Gly Ser Glu Pro Leu Tyr Asp Gly Ser Ala Leu Ala Ala Glu Gly

115 120 125

Asp Val Ile Val Val Thr Leu Asn Tyr Arg Leu Gly Pro Phe Gly Phe

130 135 140

Leu His Leu Ser Ser Ile His Asp Ala Tyr Ser Ala Asn Ile Gly Leu

145 150 155 160

Leu Asp Gln Ile Ala Ala Leu Arg Trp Val Lys Asp Asn Ile Ser Glu

165 170 175

Phe Gly Gly Asp Pro Asp Asn Val Thr Ile Phe Gly Glu Ser Ala Gly

180 185 190

Gly Met Ser Ile Ala Ala Leu Met Ala Met Pro Asp Ala Lys Gly Leu

195 200 205

Phe His Lys Ala Ile Leu Glu Ser Gly Ala Ser His Thr Ile Pro Ala

210 215 220

Asp Met Ala Lys Asp Ile Ala Ala Ala Phe Ile His Glu Ala Gly Thr

225 230 235 240

Asp Gln Leu Gln Glu Leu Ser Val Asn Asp Leu Leu Lys Thr Ala Asp

245 250 255

Lys Val Arg Arg Ser Leu Asp Gln Asn Ile Phe Gln Leu Leu Phe Gln

260 265 270

Pro Ala Ile Asp Pro Ala Thr Leu Pro Ala Glu Pro Val Lys Ala Ile

275 280 285

Ala Asp Gly Ala Ala Glu Gly Ile Pro Met Ile Ile Gly Thr Asn Arg

290 295 300

Asp Glu Ala Tyr Leu Phe Phe Thr Pro Asp Thr Asp Ile His Ser Glu

305 310 315 320

Lys Lys Gln Gln Asp Tyr Leu His Tyr His Leu Gly Glu Asn Cys Thr

325 330 335

Glu Gln Ala Ala Asp Leu Tyr Pro His Ser Leu Thr Gly Gln Ile Asp

340 345 350

Met Met Thr Asp Leu Ile Phe Trp Arg Pro Ala Val Ala Phe Ala Gln

355 360 365

Gly Gln Ser Gln His Ala Pro Val Trp Met Tyr Arg Phe Asp Trp His

370 375 380

Gly Glu Thr Pro Pro Phe His Lys Ala Val His Ala Leu Glu Leu Pro

385 390 395 400

Phe Val Phe Gly Asn Phe Asp Ser Leu Arg Lys Thr Leu Gln Glu Pro

405 410 415

Leu Gly Asp Asp Ala Glu Gln Leu Ser Lys Gln Ile Gln Ser Ala Trp

420 425 430

Leu Ala Phe Ala Lys Thr Gly Asn Pro Asn Thr Ser His Phe Asn Trp

435 440 445

Pro Glu Tyr Glu Thr Asp Ser Arg Glu Thr Leu Leu Phe Asn Thr Asp

450 455 460

Thr Ala Val Glu Ser Asp Pro Asp Ser Ala Lys Arg Arg Ile Leu Phe

465 470 475 480

Gln Ala

<210> 2

<211> 1449

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atgacaaaac ttaccgttca aacccgctgc ggcgcactga aaggaactgc cggccgcggt 60

gcccgcacat ggaagggcat accgtacgcg aagccgcccg tcggagagct gagatttaaa 120

gcgccggagc cgcccgcacc ttgggacggc gtaaaacatg ccgattcgtt cgggccggtt 180

tgtccgcagc cggatgatat gctgtccata tcgttttccg gggatatacc gcctcaatct 240

gaagattgcc tttacctcaa cgtttttgcc cccgattcag agggcgaaaa aaagcctgtc 300

atggtatgga tacacggcgg ggcattttat ttaggtgccg gaagcgaacc gctttacgac 360

ggatctgccc ttgccgctga gggagatgtc attgtcgtga cactcaatta caggctcgga 420

ccgttcggct ttttacattt gtcttctatt catgacgcgt attccgccaa tatcgggctg 480

ctcgatcaga tcgccgcgct gcgctgggtg aaggacaata tctccgaatt cggaggagac 540

ccggataacg tcacgatatt tggtgaatcg gcaggcggca tgagcatcgc cgcgcttatg 600

gcaatgcctg acgcaaaagg cctgtttcat aaagccattt tagaaagcgg cgcctctcat 660

acgatcccgg cggacatggc aaaagacatc gcggcggcat ttattcatga agccggcact 720

gatcaattgc aggagctttc cgttaatgac ctgcttaaga ctgcggataa agtgcggcgc 780

tcactggatc aaaacatttt tcagcttttg tttcagcccg ccatcgatcc ggccacattg 840

cctgcggaac cggtgaaagc catagcagac ggggccgcag aaggcatacc tatgatcatc 900

ggaaccaatc gtgatgaagc atatttgttt ttcacccctg acacagacat tcattccgag 960

aaaaagcagc aagattattt gcattatcat cttggagaga actgcaccga gcaagcggca 1020

gatttatatc cgcattcatt aacgggacaa atcgatatga tgacggatct gattttctgg 1080

cggccggctg tcgctttcgc acaaggacag tcgcaacacg caccggtctg gatgtaccgc 1140

tttgattggc atggcgaaac accgccgttt cataaagccg ttcacgctct ggaattgccg 1200

tttgtgttcg gaaactttga ttctttgaga aagacgctgc aagagccgct cggtgatgac 1260

gcagaacagc tttccaaaca aatccaatcc gcatggctcg cttttgcaaa aaccggaaac 1320

ccgaacacct ctcacttcaa ttggcctgaa tatgaaaccg attcacgcga aactttgctt 1380

ttcaacacgg ataccgctgt cgaaagtgat cccgattcag caaaacgccg catcctgttt 1440

caagcctaa 1449

Claims (10)

1.一种产羧酸酯酶的重组菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，表达氨基酸序列如SEQID NO.1所示的羧酸酯酶基因。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述羧酸酯酶基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，是以pColdII为表达载体在大肠杆菌中表达。

4.一种产羧酸酯酶的方法，其特征在于，所述方法是应用权利要求1～3任一所述的重组菌进行发酵生产。

5.一种降解邻苯二甲酸酯类的方法，其特征在于，是以权利要求1～3任一所述重组菌全细胞或其生产的羧酸酯酶为催化剂，降解邻苯二甲酸酯类。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述邻苯二甲酸酯类为：邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯或邻苯二甲酸二异丁酯。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述羧酸酯酶的降解条件为：pH5.0～8.0。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述羧酸酯酶的降解温度为：15～60℃。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述降解时间为1～6h。

10.权利要求1～3任一所述的重组菌或其生产的羧酸酯酶在环境保护领域的应用。