CN111778229A

CN111778229A - 环己烯甲酸酯水解酶及其突变体、编码基因、表达载体、重组菌与应用

Info

Publication number: CN111778229A
Application number: CN202010719130.6A
Authority: CN
Inventors: 倪晔; 窦哲; 许国超
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-07-23
Filing date: 2020-07-23
Publication date: 2020-10-16
Anticipated expiration: 2040-07-23
Also published as: US12123029B2; CN111778229B; US20220396781A1; WO2022016597A1

Abstract

本发明公开了一种环己烯甲酸酯水解酶及其突变体、编码基因、表达载体、重组菌与应用，本发明环己烯甲酸酯水解酶AcEst1及其突变体具有高效对映选择性拆分3‑环己烯‑1‑甲酸酯，制备光学活性(S)‑3‑环己烯‑1‑甲酸的功能。在底物浓度高达2000mM(约280g/L)时，产物的光学纯度高于99％，底物/催化剂高达3500g/g。相对于其它制备方法，使用本发明方法制备所得的产物浓度高，光学纯度好，催化剂效率高，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，因此具有很好的工业应用前景。

Description

环己烯甲酸酯水解酶及其突变体、编码基因、表达载体、重组菌与应用

技术领域

本发明涉及一种环己烯甲酸酯水解酶及其突变体、编码基因、表达载体、重组菌与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

(S)-3-环己烯-1-甲酸[(S)-3-cyclohexene-1-carboxylic acid，(S)-CHCA]，分子式：C₇H₁₀O₂，分子量：126.15，沸点：118℃/6mmHg(lit.)，CAS号为5708-19-0。

手性3-环己烯-1-甲酸是构建多种天然产物、手性药物和农用化学品的重要砌块单元，可用于合成许多天然产物和药物如新型免疫抑制剂他克莫司，抗肿瘤药(+)-Phyllanthocin，昆虫防治引诱剂(–)-哌拉平-B，神经氨酸酶抑制剂磷酸奥司他韦，和凝血因子Xa抑制剂依度沙班等，随着手性药物市场的不断扩大，手性环己烯-1-甲酸的需求迅速增加。3-环己烯-1-甲酸的不饱和六元环具有高度的对称性，手性碳两侧基团的差异非常小，实现其高对映选择性合成充满挑战。因此，建立高对映选择性的酶法合成手性3-环己烯-1-甲酸的工艺具有重要的应用价值。

目前手性3-环己烯-1-甲酸的合成方法主要有狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)反应，化学法外消旋酸拆分法和酶法不对称水解拆分3-环己烯-1-甲酸酯。其中Diels-Alder反应是目前合成手性3-环己烯-1-甲酸的主要方法，然而由于丁二烯为气体且产物为不易于分离，反应步骤繁琐，收率较低，仍然需要进一步改进(Synlett,1990,1,38–39.]。化学拆分过程需要在丙酮中进行至少六次重结晶才可分离出光学纯的对映异构体，导致丙酮的大量使用，拆分收率仅20～30％，原子经济性低(Drugs&Clinic,2013,28,126–128)。由此可见，化学法合成手性3-环己烯-1-甲酸面临操作繁琐、收率较低和丙酮的大量使用等诸多问题。生物催化法合成手性化合物具有反应条件温和、立体选择性高、环境友好、操作简便等优势，使其成为可持续发展过程中替代或拓展传统化学合成的重要方法。

2004年，Cihangir T等考察了猪肝酯酶PLE，马肝酯酶HLE和猪胰脂肪酶PPL水解外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯的效果，PLE和HLE的水解产物为(S)-3-环己烯-1-甲酸，ee值分别为>99％和97％；PPL的水解产物为(R)-3-环己烯-1-甲酸，ee值为91％(TetrahedronAsymmetry,2004,15,2057–2060)。然而，上述酶为动物来源的商品酶，其实际应用的过程中存在：价格昂贵、同工酶干扰、批次间差异较大和引入病毒的风险等。2019年，Xiafen Wu等对大肠杆菌来源的羧酯酶BioH进行分子改造以提高其对(S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯的对映选择性(Biosci.Biotechnol.Biochem.,2019,83,1263–1269)。通过降低空间位阻和芳香堆积作用的组合突变，获得了具有较高S-选择性的突变体Mu3(L24A/W81A/L209A)，其水解外消旋-3-环己烯-1-羧酸甲酯的ee值由32.3％至70.9％。进一步优化反应条件，在30℃和含有2.5％吐温80的磷酸盐缓冲液(pH8.0)中，Mu3可水解40mM底物，转化率是优化前的2倍。重组酶BioH虽然具有水解3-环己烯-1-甲酸甲酯的活性，但对映选择性较低。2019年，窦哲等以3-环己烯-1-甲酸甲酯为底物进行野生菌的筛选，发现Acinetobacter sp.JNU9335能够选择性地水解底物生成(S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯，通过在碱性条件下水解得到(S)-3-环己烯-1-甲酸。其中在50mL反应中添加了3.50g(R,S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯，反应12h后，最终产物的收率为40％，ee_s为99％(中国发明专利，申请公开号CN 110272839 A)。

与传统化学合成法相比，生物催化制备手性环己烯甲酸的方法具有环境友好、反应条件温和、操作简单等优点，但是目前以上方法仅限于实验室规模，且存在酶自身活力低，产物浓度不高，反应时间较长等缺陷，不适合工业化生产。采用野生菌法制备手性环己烯甲酸存在酶上载量过高，导致催化剂成本高、反应液乳化严重、收率较低等问题。因此，需要筛选活力高、稳定性好、选择性高且能在较短反应时间获得较高浓度产物的酶，以满足工业化生产手性环己烯甲酸的需求。

发明内容

本发明针对酶法拆分制备(S)-3-环己烯-1-甲酸中现有技术上的不足，提供了一种催化活力高、对映选择性好、底物耐受性好的环己烯甲酸酯水解酶及其突变体，含有该酶及突变体基因的重组表达载体及重组表达转化体，该重组酶的制备方法，以及该环己烯甲酸酯水解酶用于拆分制备(S)-3-环己烯-1-甲酸的方法。

本发明的第一个目的是提供一种环己烯甲酸酯水解酶，所述的环己烯甲酸酯水解酶为：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质；

(b)氨基酸序列由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过替换、缺失或添加一个或多个氨基酸，且具有3-环己烯-1-甲酸酯水解活性的蛋白质。

进一步地，所述的环己烯甲酸酯水解酶是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第202位丙氨酸残基替换为赖氨酸残基，同时第326位甘氨酸残基替换为丙氨酸残基后形成的新氨基酸序列的蛋白质。

进一步地，所述的环己烯甲酸酯水解酶是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第78位苯丙氨酸残基替换为缬氨酸残基，同时第202位的丙氨酸残基替换为赖氨酸残基，同时第326位甘氨酸残基替换为丙氨酸残基后形成的新氨基酸序列的蛋白质。

本发明的第二个目的是提供一种所述的环己烯甲酸酯水解酶的编码基因。

本发明的第三个目的是提供一种重组表达载体，包含所述的编码基因。

进一步地，所述的重组表达载体通过本领域常规方法将本发明的环己烯甲酸酯水解酶基因的核酸序列或突变体核酸序列连接于各种合适载体上构建而成。所述载体优选质粒，更优选质粒pET-28a(+)。所述环己烯甲酸酯水解酶基因可以操作性地连接于适合表达的调控序列的下游，以实现所述环己烯甲酸酯水解酶的组成型或诱导型表达。

本发明的第四个目的是提供一种表达所述的环己烯甲酸酯水解酶的重组菌。

进一步地，所述的重组菌是通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞中来制得所述重组菌。所述宿主细胞可以是本领域的各种常规宿主细胞，前提是能使所述重组表达载体稳定地自行复制，且其所携带的环己烯甲酸酯水解酶基因可被有效表达。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)或大肠杆菌E.coli DH5α。

本发明的第五个目的是提供一种环己烯甲酸酯水解酶在催化3-环己烯-1-甲酸酯制备光学活性(S)-3-环己烯-1-甲酸中的应用。

进一步地，所述的应用是采用环己烯甲酸酯水解酶在缓冲液中催化3-环己烯-1-甲酸酯对映选择性水解制备(S)-3-环己烯-1-甲酯，然后在碱性条件下加热水解得到(S)-3-环己烯-1-甲酸。

进一步地，所述的缓冲液为柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或甘氨酸-NaOH缓冲液，所述缓冲液的pH为5.0～10.0。

进一步地，所述的碱性条件为0.5～1.5M氢氧化钠溶液。

进一步地，所述的3-环己烯-1-甲酸酯为3-环己烯-1-甲酸甲酯、3-环己烯-1-甲酸乙酯、3-环己烯-1-甲酸异丙酯或3-环己烯-1-甲酸丁酯。

本发明的有益效果：

本发明环己烯甲酸酯水解酶AcEst1及其突变体具有高效对映选择性拆分3-环己烯-1-甲酸酯，制备光学活性(S)-3-环己烯-1-甲酸的功能。在底物浓度高达2000mM(约280g/L)时，产物的光学纯度高于99％，底物/催化剂高达3500g/g。相对于其它制备方法，使用本发明方法制备所得的产物浓度高，光学纯度好，催化剂效率高，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，因此具有很好的工业应用前景。

附图说明

图1为环己烯甲酸酯水解酶AcEst1的表达及纯化结果，从左到右依次为，标准蛋白marker，AcEst1粗酶上清液和AcEst1纯化后的蛋白。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1：环己烯甲酸酯水解酶AcEst1基因的克隆

将菌株Acinetobacter sp.JNU9335在LB培养基中进行培养，采用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取高纯度、大片段的基因组总DNA。将适量Acinetobacter sp.JNU9335菌体加入液氮冷冻，研磨成粉，加入适量2×CTAB提取缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，pH8.0，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，2％(w/v)CTAB，40mmol/L巯基乙醇)，65℃保温10min，间歇摇动。随后加入等体积的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒离心管混匀，室温下，8000rpm离心10min，将上清液转入另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒离心管混匀，室温下8000rpm离心10min。将上层水相转入新的离心管中，加入等体积异丙醇混匀，室温放置30min。4000rpm离心10min，移去上清液，用70％乙醇洗两次，烘干后加入20μL的TE缓冲液(100mM Tris-HCl，10mM EDTApH 8.0，)溶解DNA，-20℃保存备用。采用Sau3AI对总DNA进行部分酶切，酶切后的DNA片段通过电泳进行纯化，采用胶回收纯化试剂盒回收大约2～6kb的片段，回收的DNA溶解于ddH₂O中，置于-20℃保藏。

按如下反应体系与载体pUC118进行连接：

表1连接反应体系

16℃温育12h，取10μL酶连接产物转化至200μL E.coli DH5α感受态细胞，得到的重组子诱导表达后，加入底物3-环己烯-1-甲酸甲酯反应，若有产物3-环己烯-1-甲酸生成，根据溴百里酚蓝和酚红双指示剂的在不同pH下的颜色变化进行高通量筛选。将具有明显颜色变化，即由棕绿色变为黄色的菌落进行二次筛选，将产物进行HPLC检测，将有明显产物峰的重组子委托天霖生物科技有限公司进行序列测定，获得如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，根据该核苷酸序列所推导的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，将该序列表达的环己烯甲酸酯水解酶命名为AcEst1。

实施例2：重组AcEst1的质粒以及重组菌、重组酶的制备

以正向引物5’-gtgccgcgcggcagccatatgATGGGCGTGTTGAATCAAACTT-3’(SEQ IDNO.3)，反向引物5’-gtggtggtggtggtgctcgagTTA-TTTGGCATTCTTATCCCAAAA-3’(SEQ IDNO.4)，利用聚合酶链式反应技术对实施例1中获得的AcEst1的核苷酸序列进行扩增，将获得的含有AcEst1序列的DNA片段分别用NdeI和XhoI双酶切，随后与同样经过NdeI和XhoI双酶切的质粒pET-28a(+)进行连接，获得重组质粒pET-28a(+)-AcEst1。

将获得的重组质粒pET-28a(+)-AcEst1转化到大肠杆菌E.coli BL21中，构建含环己烯甲酸酯水解酶AcEst1的重组大肠杆菌并接种至含50μg/mL卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0)中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有600mL LB培养基的2L三角瓶中，置37℃，180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.6～2.0时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG作为诱导剂，16℃诱导16h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于Tris-HCl缓冲液(20mM，pH 8.0)中，高压匀浆机破碎，冷冻干燥即得AcEst1重组酶。

实施例3：突变体A202K/G326A的获得

突变体A202K/G326A为随机突变体，通过易错PCR技术建立AcEst1的随机突变体库，利用实施例1所述指示剂在不同pH环境下颜色的变化作为高通量筛选的手段。首先设计两端引物：正向引物5’-gtgccgcgcggcagccatatgATGGGCGTGTTGAATCAAACTT-3’(SEQ IDNO.5)反向引物5’-gtggtggtggtggtgctcgagTTATTTGGCATTCTTATCCCAAAA-3’(SEQ IDNO.6)，PCR体系(50μL)：rTaq polymerase 0.25μL，10×rTaq Buffer 5μL，dNTP 5μL，MgSO₄2μL，模板质粒约100ng，正向引物2μL，反向引物2μL，MnCl₂(10mM)0.5μL，ddH₂O补足至50μL。

PCR反应程序：(1)98℃变性5min；(2)98℃变性30s，(3)55℃退火30s，(4)72℃延伸1min，步骤(2)～(4)共进行30个循环，最后72℃延伸10min，-20℃保藏PCR产物。

含有随机突变位点的PCR片段经NdeI和XhoI双酶切后与具有相同酶切位点的pET-28a(+)质粒连接后转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，并均匀涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板。37℃过夜培养后，挑选单克隆至深孔板进行培养及诱导表达。根据pH指示剂显色的方法进行突变库的活力筛选得到活性提高的突变体，送天霖生物科技有限公司进行测序。测序结果用DNAMAN软件与环己烯甲酸酯水解酶基因(AcEst1)序列进行比对，202位丙氨酸突变为赖氨酸，326位甘氨酸突变为丙氨酸。获得的突变体命名为A202K/G326A。

将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第202位的丙氨酸残基替换为赖氨酸残基，同时第326位的甘氨酸残基替换为丙氨酸残基获得的突变体蛋白A202K/G326A对3-环己烯-1-甲酸甲酯的水解活性提高了3倍。催化相同的底物浓度，突变体A202K/G326A仅需反应2h就可达到与WT相近的转化率，反应时间缩短了3倍。

实施例4：突变体A202K/G326A的质粒以及重组菌、重组酶的制备

提取如实施例3中所获得的质粒pET-28a(+)-A202K/G326A，将其转化到大肠杆菌E.coli BL21中，接种至含50μg/mL卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，pH 7.0)中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有600mL LB培养基的2L三角瓶中，置37℃，180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.6～2.0时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG作为诱导剂，16℃诱导16h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于Tris-HCl缓冲液(20mM，pH 8.0)中，高压匀浆机破碎，冷冻干燥即得A202K/G326A重组酶。

实施例5：突变体F78V/A202K/G326A的获得

对A202K/G326A进行定点突变，采用Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene，Catalog#200522)所述方案进行操作。

首先设计含有突变点的简并引物：F：5’-TCGCGTAAATTGNDTGATCATCAAATT-3’(SEQID NO.7)，R：5’-AATTTGATGATCAHNCAATTTACGCGA-3’(SEQ ID NO.8)。

其中N代表A、T、C、G四种碱基的混合；D代表A、G、T三种碱基的混合，H代表A、C、T三种碱基的混合。

PCR反应体系(50μL)：KOD plus Neo 0.25μL，模板0.5～20ng，5μL 10×KOD plusNeo buffer，5μL dNTP(各2.0mM)，2μL MgSO₄(25mM)，正向引物2μL，反向引物2μL，ddH₂O补足至50μL。

其中所述的模板为实施例3获得环己烯甲酸酯水解酶突变体质粒pET-28a(+)-A202K/G326A。

PCR反应程序：(1)98℃变性5min；(2)98℃变性30s，(3)55℃退火30s，(4)68℃延伸3.5min，步骤(2)～(4)重复进行20个循环，最后68℃延伸10min，-20℃保藏PCR产物。

扩增得到的PCR产物在37℃经内切酶DpnI消化2h后转化E.coli BL21感受态细胞，并均匀涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板。37℃过夜培养后，挑选单克隆200株至深孔板进行培养及诱导表达。根据pH指示剂显色的方法进行突变库的活力筛选，得到的活力提高的突变体，送天霖生物科技有限公司进行测序。测序结果用DNAMAN软件与环己烯甲酸酯水解酶基因(AcEst1)序列进行比对，78位突变为缬氨酸，202位突变为赖氨酸，326位突变为丙氨酸。得到的突变体命名为F78V/A202K/G326A。

将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第78位的苯丙氨酸残基替换为缬氨酸残基，同时第202位的丙氨酸残基替换为赖氨酸残基，同时第326位的甘氨酸残基突变为丙氨酸残基获得的突变体蛋白F78V/A202K/G326A对3-环己烯-1-甲酸甲酯的水解活性提高了6倍。催化相同的底物浓度，突变体F78V/A202K/G326A仅需反应1h就可达到与WT相近的转化率，反应时间缩短了6倍。

实施例6：突变体F78V/A202K/G326A的质粒以及重组菌、重组酶的制备

提取如实施例5中所获得的质粒pET-28a(+)-F78V/A202K/G326A，将其转化到大肠杆菌E.coli BL21中，接种至含50μg/mL卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0)中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有600mL LB培养基的2L三角瓶中，置37℃，180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.6～2.0时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG作为诱导剂，16℃诱导16h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于Tris-HCl缓冲液(20mM，pH 8.0)中，高压匀浆机破碎，冷冻干燥即得F78V/A202K/G326A重组酶。

实施例7：重组酶AcESt1的催化特性

将本发明的环己烯甲酸酯水解酶应用于外消旋3-环己烯-1-甲酸酯的酶法水解以制备光学活性的(S)-3-环己烯-1-甲酸。

在不同温度(20～65℃)下，以磷酸钠(100mM，pH 7.0)为缓冲液，1mM对硝基苯酚环己烯甲酸酯为测活底物，根据分光光度计405nm处吸光值的变化考察了环己烯甲酸酯水解酶AcEst1的活性。结果如表2所示，AcEst1在40℃时催化活性最高。当温度继续升高后，酶活性开始下降。

表2环己烯甲酸酯水解酶AcEst1在不同温度下的活性

反应温度为30℃时，以1mM对硝基苯酚环己烯甲酸酯为测活底物，根据分光光度计405nm处吸光值的变化，考察了AcEst1在不同pH值缓冲液中的活性。所用的缓冲液体系为：柠檬酸钠缓冲液(pH 5.0～6.0)；磷酸钠缓冲液(pH6.0～8.0)；Tris-HCl缓冲液(pH 8.0～9.0)和甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 9.0～10.0)。结果如表3所示，AcEst1的最适pH在pH 9.0的Tris-HCl缓冲液。

表3环己烯甲酸酯水解酶AcEst1在不同pH缓冲液中的活性

实施例8：重组酶AcESt1催化不同3-环己烯-1-甲酸酯水解拆分

重组AcEst1可以催化多种3-环己烯-1-甲酸酯的对映选择性水解，生成高光学纯度的(S)-3-环己烯-1-甲酸。分别考察了AcEst1对3-环己烯-1-甲酸甲酯、3-环己烯-1-甲酸乙酯、3-环己烯-1-甲酸异丙酯和3-环己烯-1-甲酸丁酯的活性以及水解产物的光学纯度，利用实施例3获得的野生型AcEst1催化3-环己烯-1-甲酸酯水解反应。称取5mg重组AcEst1粗酶粉，溶解于10mL Tris-HCl缓冲液(200mM，pH 9.0)中，加入底物3-环己烯-1-甲酸酯至终浓度为50mM，反应在30℃下进行。结果见表4。

表4 AcEst1对不同3-环己烯-1-甲酸酯的活性和产物光学纯度

实施例9：重组酶AcEst1催化3-环己烯-1-甲酸甲酯水解拆分

典型的酶促3-环己烯-1-甲酸酯水解拆分反应的条件如下：16mg重组AcEst1冻干酶粉，溶解于200mL Tris-HCl缓冲液(200mM，pH 9.0)中，加入底物3-环己烯-1-甲酸甲酯至终浓度为200-2000mM(28-280g/L)，对应的S/C分别为350-3500g/g。反应在30℃下进行，200rpm机械搅拌，通过补充1.0M Na₂CO₃将pH控制在9.0，直至底物e.e.>99％。反应结束后用2M NaOH调pH至12，然后用二氯甲烷萃取三次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜。旋转蒸发除去溶剂即可得到(S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯。用气相色谱(手性毛细管柱B-DM)分析测定转化率和水解产物的ee值。具体分析条件为：以N₂为载气，进样口温度280℃，检测器温度280℃，初始柱温50℃，2℃/min至100℃保持10min。结果见表5。然后将(S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯加入1M NaOH水溶液50℃加热回流搅拌反应6h，再加入1M HCl水溶液调节pH至5.0，加入等体积二氯甲烷萃取3次，合并有机层，用无水Na₂SO₄干燥，过滤，旋转蒸发得到(S)-3-环己烯-1-甲酸，所得产物为具有特殊气味的液体，分离后总得率为38％，光学纯度为99％e.e.。

表5重组酶AcEst1催化3-环己烯-1-甲酸甲酯不对称拆分的结果

实施例10：AcEst1及其突变体催化3-环己烯-1-甲酸酯水解拆分

实施例3获得的野生型AcEst1、实施例4获得的突变体A202K/G326A与实施例5获得的突变体F78V/A202K/G326A分别催化3-环己烯-1-甲酸甲酯水解反应。称取5mg重组AcEst1或突变体粗酶粉，溶解于10mL Tris-HCl缓冲液(200mM，pH 9.0)中，加入底物3-环己烯-1-甲酸甲酯至终浓度为50mM，反应在30℃下进行。从反应情况看(如表6)，突变体转化率达到50％左右所需的时间明显减少。

表6重组酶AcEst1及其突变体催化3-环己烯-1-甲酸甲酯不对称拆分的结果

实施例11：(S)-3-环己烯-1-甲酸的制备

反应在1L三口烧瓶中进行，加入200mL pH 9.0的Tris-HCl缓冲液，16mg如实施例5制备的F78V/A202K/G326A粗酶粉以及58.7g消旋3-环己烯-1-甲酸甲酯，在30℃，200rpm机械搅拌下反应，流加1M Na₂CO₃控制反应液pH维持在9.0。反应12h后，转化率达到61.1％，此时(S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯的光学纯度>99％。反应结束后用2M NaOH调pH至12，然后用二氯甲烷萃取三次，合并萃取液，加无水Na₂SO₄干燥过夜。旋转蒸发除去溶剂即可得到(S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯。然后将(S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯加入1M NaOH水溶液50℃加热回流搅拌反应6h，再加入1M HCl水溶液调节pH至5.0，加入等体积二氯甲烷萃取3次，合并有机层，用无水Na₂SO₄干燥，过滤，旋转蒸发得到(S)-3-环己烯-1-甲酸22.3g，收率为38.0％，GC纯度为99.0％，光学纯度为99.5％e.e.。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 环己烯甲酸酯水解酶及其突变体、编码基因、表达载体、重组菌与应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1074

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

atgggcgtgt tgaatcaaac tttacaacaa tggatggaac aaggccaagg cagtgcggca 60

cgattaattg atcgcttacc gacagtagca caagaaggct tggtgaaagc gctgggttat 120

cctcaccagt ttgaacaact ggaccccttt attaaatgct taatggcggc tcaatataag 180

caaggcaaat cgggctttat ttttgaagac taccatcgtt cgcgtaaatt gtttgatcat 240

caaattcaaa tgttgaccgc caaacccagc gcgataaaac aagtggaaga tttacgtcta 300

cctttacaaa gtggaactgt gtttgcacgg cattatcatc ctgcaccgaa taagaaactt 360

ccgatgctgg tgttttatca tggcggcggc tttgtggttg gcagcctcga cagccatgat 420

gaagtctgtc gcttacttgc aatccatgcc aaagtgcagg tgctcagtat tgactatcct 480

ttggcgccag aagttggccc gaatgtactg attcaatctt gtgaagatgc tttggcttgg 540

gtctatcaaa accgtcgtca gttcaaaatt ttgaaaaacc gaattgcggt ggctggcgat 600

agtgcaggtg gtaatatcag tgccgtagtg gcgcagcgaa ctgctgcaaa agcttatgcg 660

ccaagtgcac aactgttaat ttaccccgtg gtcgatttca aaagtcgcca tccatcgttc 720

tttgcttata aggatggact gaccttaact gggcaagatg ttgatagggt gacatcgttg 780

tatgctgaac aacatcaagt ggctttagat aatcctattg tttcgccaac ctacggcgta 840

ttaaaaagta tcgctcccgc ttttgtcatc accgcaggtc atgatttatt gcatgatgaa 900

ggtgaaattt acgccatcaa attaaagcag cagggtaata aggtttatta tcagaattat 960

ctagatcaac cccatgggtt tgtgaacttc accatcattt ctcgtcgagc aaaaaaaatc 1020

accatagaaa tggcaaagag ctttagaaaa ttttgggata agaatgccaa ataa 1074

<210> 2

<211> 357

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 2

Met Gly Val Leu Asn Gln Thr Leu Gln Gln Trp Met Glu Gln Gly Gln

1 5 10 15

Gly Ser Ala Ala Arg Leu Ile Asp Arg Leu Pro Thr Val Ala Gln Glu

20 25 30

Gly Leu Val Lys Ala Leu Gly Tyr Pro His Gln Phe Glu Gln Leu Asp

35 40 45

Pro Phe Ile Lys Cys Leu Met Ala Ala Gln Tyr Lys Gln Gly Lys Ser

50 55 60

Gly Phe Ile Phe Glu Asp Tyr His Arg Ser Arg Lys Leu Phe Asp His

65 70 75 80

Gln Ile Gln Met Leu Thr Ala Lys Pro Ser Ala Ile Lys Gln Val Glu

85 90 95

Asp Leu Arg Leu Pro Leu Gln Ser Gly Thr Val Phe Ala Arg His Tyr

100 105 110

His Pro Ala Pro Asn Lys Lys Leu Pro Met Leu Val Phe Tyr His Gly

115 120 125

Gly Gly Phe Val Val Gly Ser Leu Asp Ser His Asp Glu Val Cys Arg

130 135 140

Leu Leu Ala Ile His Ala Lys Val Gln Val Leu Ser Ile Asp Tyr Pro

145 150 155 160

Leu Ala Pro Glu Val Gly Pro Asn Val Leu Ile Gln Ser Cys Glu Asp

165 170 175

Ala Leu Ala Trp Val Tyr Gln Asn Arg Arg Gln Phe Lys Ile Leu Lys

180 185 190

Asn Arg Ile Ala Val Ala Gly Asp Ser Ala Gly Gly Asn Ile Ser Ala

195 200 205

Val Val Ala Gln Arg Thr Ala Ala Lys Ala Tyr Ala Pro Ser Ala Gln

210 215 220

Leu Leu Ile Tyr Pro Val Val Asp Phe Lys Ser Arg His Pro Ser Phe

225 230 235 240

Phe Ala Tyr Lys Asp Gly Leu Thr Leu Thr Gly Gln Asp Val Asp Arg

245 250 255

Val Thr Ser Leu Tyr Ala Glu Gln His Gln Val Ala Leu Asp Asn Pro

260 265 270

Ile Val Ser Pro Thr Tyr Gly Val Leu Lys Ser Ile Ala Pro Ala Phe

275 280 285

Val Ile Thr Ala Gly His Asp Leu Leu His Asp Glu Gly Glu Ile Tyr

290 295 300

Ala Ile Lys Leu Lys Gln Gln Gly Asn Lys Val Tyr Tyr Gln Asn Tyr

305 310 315 320

Leu Asp Gln Pro His Gly Phe Val Asn Phe Thr Ile Ile Ser Arg Arg

325 330 335

Ala Lys Lys Ile Thr Ile Glu Met Ala Lys Ser Phe Arg Lys Phe Trp

340 345 350

Asp Lys Asn Ala Lys

355

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

gtgccgcgcg gcagccatat gatgggcgtg ttgaatcaaa ctt 43

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 4

gtggtggtgg tggtgctcga gttatttggc attcttatcc caaaa 45

<210> 5

<211> 43

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 5

gtgccgcgcg gcagccatat gatgggcgtg ttgaatcaaa ctt 43

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 6

gtggtggtgg tggtgctcga gttatttggc attcttatcc caaaa 45

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> （人工序列）

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 7

tcgcgtaaat tgndtgatca tcaaatt 27

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> （人工序列）

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 8

aatttgatga tcahncaatt tacgcga 27

Claims

1.一种环己烯甲酸酯水解酶，其特征在于，所述的环己烯甲酸酯水解酶为：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质；或，

2.根据权利要求1所述的环己烯甲酸酯水解酶，其特征在于，所述的环己烯甲酸酯水解酶是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第202位丙氨酸残基替换为赖氨酸残基，同时第326位甘氨酸残基替换为丙氨酸残基后形成的新氨基酸序列的蛋白质。

3.根据权利要求1所述的环己烯甲酸酯水解酶，其特征在于，所述的环己烯甲酸酯水解酶是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第78位苯丙氨酸残基替换为缬氨酸残基，同时第202位的丙氨酸残基替换为赖氨酸残基，同时第326位甘氨酸残基替换为丙氨酸残基后形成的新氨基酸序列的蛋白质。

4.一种权利要求1-3任一项所述的环己烯甲酸酯水解酶的编码基因。

5.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求4所述的编码基因。

6.一种表达权利要求1-3任一项所述的环己烯甲酸酯水解酶的重组菌。

7.一种权利要求1-3任一项所述的环己烯甲酸酯水解酶在催化3-环己烯-1-甲酸酯制备光学活性(S)-3-环己烯-1-甲酸中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的应用是采用环己烯甲酸酯水解酶在缓冲液中催化3-环己烯-1-甲酸酯对映选择性水解制备(S)-3-环己烯-1-甲酯，然后在碱性条件下加热水解得到(S)-3-环己烯-1-甲酸。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的缓冲液为柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或甘氨酸-NaOH缓冲液，所述缓冲液的pH为5.0～10.0。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的碱性条件为0.5～1.5M氢氧化钠溶液。