CN110923221A - 一种新型的来源于地衣芽孢杆菌的碱性蛋白酶高温突变体 - Google Patents

一种新型的来源于地衣芽孢杆菌的碱性蛋白酶高温突变体 Download PDF

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    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus

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Abstract

本发明提供一种新型的碱性蛋白酶突变体，以来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)碱性蛋白酶基因subC为基础，通过定点突变PCR技术获得了2个碱性蛋白酶突变体subCMtemp1和subCMtemp2，并分别构建了表达上述突变体的重组菌枯草芽孢杆菌，其发酵上清液酶活在45℃条件下处理10min后酶活残留水平分别为57％和67％，比表达野生型碱性蛋白酶subC的枯草芽孢杆菌酶活残留水平(17％)有了显著的提高。

Description

一种新型的来源于地衣芽孢杆菌的碱性蛋白酶高温突变体
技术领域
本发明属于蛋白中工程改造领域，具体涉及一种新型的碱性蛋白酶突变体蛋白。
背景技术
碱性蛋白酶(alkaline protease)指在碱性条件下(pH在9～11范围内)能够水解蛋白质肽键的酶，其主要成分是一种内切蛋白酶，催化部位为丝氨酸，广泛应用于洗涤剂、食品、医疗、酿造、丝绸、制革等行业。目前所采用的碱性蛋白酶多是经细菌原生质体诱变方法造育的来源于枯草芽孢杆菌2709通过深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，属于一种丝氨酸碱性蛋白酶，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力。生产工艺是采用微滤超滤膜分离、喷雾干燥或真空冷冻干燥等先进技术。碱性蛋白酶是目前市场上流行的洗涤添加剂，能大幅度提高洗涤去污能力，特别对血渍、汗渍、奶渍、油渍等蛋白类污垢,具有独特的洗涤效果，，是工业用酶中占据比例最大的酶类，约占全世界每年总销售量的60％左右。
定点突变是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向编码目的蛋白的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化)，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。体外定点突变技术是当前生物、医学各领域研究中的一种重要实验手段，是改造、优化基因的便捷方案，也是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。近几年酶的定点突变技术应用主要集中于提高酶的催化活性、改善底物特异性、提高热稳定性、对映立体选择等方面。酶的定点突变技术为酶的结构和功能开辟了崭新的途径，在工业、农业、食品业、环境等领域取得巨大成功。
发明内容
本发明为解决现有技术问题提供了一种在较高温度条件下酶活力得到显著提高的碱性蛋白酶突变体。所述突变体是由地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)碱性蛋白酶基因subC的成熟肽出发，运用定点突变技术获得的，并在枯草芽孢杆菌中进行表达。
本发明一方面提供了一种碱性蛋白酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的碱性蛋白酶的第283位氨基酸由Ala变为Ile，突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
本发明一方面提供了一种碱性蛋白酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO:2的碱性蛋白酶的第306位氨基酸由Gly变为Cys，突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
本发明以来源于地衣芽孢杆菌的碱性蛋白酶subC为基础，通过定点突变技术获得了两个碱性蛋白酶突变体subCMtemp1和subCMtemp2，并在枯草芽孢杆菌中对上述突变体进行了发酵，其发酵上清液酶活在45℃条件下处理10min后酶活残留水平分别为57％和67％，比表达野生型碱性蛋白酶subC的枯草芽孢杆菌酶活残留水平(17％)有了显著的提高。
附图说明
图1：碱性蛋白酶表达载体的质粒图谱；
图2：碱性蛋白酶突变体经热处理后的相对酶活柱形图。
具体实施方式
下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，实现本发明的方法不应限于本发明实施例所记载的具体方法步骤。
对于本发明所涉及的术语及相关测定方法解释如下：
1、蛋白酶酶活测定方法：采用中华人民共和国国家标准蛋白酶制剂测定方法(GB/T 25327-2009)。
2、酶活单位的定义：1g固体酶粉(或1mL液体酶)，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，即为1个酶活力单位，以U/g(U/mL)表示。
3、碱性蛋白酶运用福林法测定蛋白酶的活力，使用到的溶液包括：福林使用溶液(一份市售福林溶液与两份水混合，摇匀)，碳酸钠溶液(42.4g/L)，三氯乙酸(65.4g/L)，梯度pH值缓冲液，酪蛋白溶液(10.0g/L)。反应过程如下：试管中加入1mL酶液，40℃温浴2min，加入酪蛋白溶液1mL，摇匀后40℃温浴10min，加入2mL三氯乙酸溶液，摇匀(空白对照先加入三氯乙酸，再加入酪蛋白溶液)。取出静止10min，慢速定性滤纸过滤。取1mL滤液，加碳酸钠溶液5mL，加福林试剂使用溶液1mL，40℃显色20min，于680nm波长，用10mm比色皿测定吸光度。
4、、碱性蛋白酶突变体的标识采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示碱性蛋白酶突变体中突变的氨基酸。如Ala283Ile，表示位置283的氨基酸由亲本碱性蛋白酶的Ala替换成Ile，位置的编号对应于附件序列表SEQ ID NO:1中的编号。如Ala283Ile/Gly306Cys，表示位置283和位置306的氨基酸都发生了突变。
实施例1碱性蛋白酶subC表达载体及重组菌株的构建
以pMA5质粒作为模板，通过pMA5上游引物5’-taataaatgagttatgcagtttgtagaatgc-3’和pMA5下游引物5’-taaatcgctcctttttaggtggcaca-3’PCR扩增载体DNA序列，从而获得待克隆的载体骨架序列。以地衣芽孢杆菌基因组DNA作为模板，通过subC上游引物5’-ATGATGCGCAAAAAAAGCTTCTGGC-3’和subC下游引物5’-CTGGGCGGCAGCTTCAACGTTGAT-3’PCR扩增subC完整基因，从而获得携带信号肽及成熟肽的碱性蛋白酶序列，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。上述PCR扩增条件为：94℃10min；94℃60s，58℃60s，72℃2min，30个循环；72℃10min。利用E.Z.N.A.GelExtraction Kit回收PCR扩增产物。将回收获得的酶基因序列及载体骨架序列重叠延伸PCR形成多聚体，扩增体系如下：5×Phusion HF Buffer 10μL，2.5mM dNTPs 8μL，基因片段(subC片段)4μL，载体骨架片段(pMA5)6μL，Phusion DNA Polymerase 1μL，ddH2O 21μL。扩增条件为98℃10min；98℃10s，72℃3min，20个循环；98℃10s，72℃6min，15个循环；72℃10min。将多聚体转化Bacillus subtilis 1A751(来源于BGSC)宿主菌，筛选阳性转化子，得到表达野生型碱性蛋白酶subC的重组菌株，命名为枯草芽孢杆菌subC(Bacillus subtilissubC)。提取枯草芽孢杆菌subC里的质粒，将其命名为pMA5-subC(含有野生型subC基因)，其质粒图谱如附图1所示。
上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1A751是利用感受态方法进行转化，具体转化过程如下：将新鲜活化的B.subtilis 1A751由LB(胰蛋白胨1％，酵母粉0.5％，NaCl1％)平板接种到5ml GMⅠ(GM I配制方法为：1*最低盐溶液95.6ml，20％葡萄糖2.5ml，5％水解酪蛋白0.4ml，10％酵母粉汁1ml；其中1*最低盐溶液的配制方法为：K2HPO4 14g/L，KH2PO46g/L，(NH4)2SO42g/L，柠檬酸三钠1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，在蒸馏水中依次溶解溶液，在30℃、125rpm振荡培养过夜。第二天取2ml转接到18ml GMⅠ中，37℃、250rpm培养3.5h。再取10ml上一步骤的培养液转接到90ml GMⅡ(GMII配制方法为：1*最低盐溶液96.98ml，20％葡萄糖2.5ml，5％水解酪蛋白0.08ml，10％酵母粉汁0.04ml，1M MgCl20.25ml，1MCaCl20.05ml中，37℃、125rpm培养90min后，5000g、10min离心收集菌体。用10ml原培养液上清液轻轻悬浮菌体，悬浮后的菌体即为感受态细胞。然后在0.5ml感受态中加入适量DNA于37℃、200rpm振荡培养30min后涂板，再在37℃培养过夜，次日检查和验证转化子。
实施例2利用点突变技术构建碱性蛋白酶突变体
利用点突变技术向地衣芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶subC基因中引入核苷酸突变，Ala283Ile位点突变PCR的扩增体系为：5×Phusion HF Buffer 10μL，2.5mM dNTPs 8μL，模板DNA pMA5-subC质粒(100ng/μL)1μL，Phusion DNA Polymerase 1μL，ddH2O 28μL，上游突变引物5’-gccttggcgcaaaccgtagtttacggcgaacctctcattaaagcggacaa-3’，下游突变引物5’-ttgtccgctttaatgagaggttcgccgtaagtgagggtttgcgccaaggc-3’。反应条件为：98℃10min；98℃10s，55℃20s，72℃3min，20个循环；72℃10min。将PCR产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到阳性转化子后通过E.Z.N.A.Plasmid Extraction Kit提取质粒，命名为pMA5-subCMtemp1。Ala283Ile/Gly306Cys叠加位点突变PCR的扩增体系为：5×Phusion HFBuffer 10μL，2.5mM dNTPs8μL，模板DNA pMA5-subCMtemp1质粒(100ng/μL)1μL，PhusionDNA Polymerase 1μL，ddH2O 28μL，上游突变引物5’-gccgtcctgcatcaggagagctaacaagcttctcatccggactt-3’，下游突变引物5’-aagtccggatgagaagcatgctagccctgtatccaggacggc-3’。反应条件为：98℃10min；98℃10s，55℃20s，72℃3min，20个循环；72℃10min。将PCR产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到阳性转化子后通过E.Z.N.A.Plasmid Extraction Kit提取质粒，命名为pMA5-subCMtemp2。将质粒pMA5-subCMtemp1和pMA5-subCMtemp2转化Bacillus subtilis 1A751宿主菌，筛选阳性转化子，得到表达野生型碱性蛋白酶subC突变体的重组菌株，分别命名为枯草芽孢杆菌subCMtemp1(Bacillus subtilis subCMtemp1)和subCMtemp2(Bacillus subtilis subCMtemp2)。
实施例3碱性蛋白酶突变体的评价
3.1摇瓶发酵
将上述构建的2株碱性蛋白酶突变体重组菌株(subCMtemp1和subCMtemp2)和对照菌枯草芽孢杆菌subC，分别接种于50mL种子培养基(酵母浸粉0.5％，胰蛋白胨0.5％，葡萄糖1％，K2HPO41.8％，卡纳霉素25μg/mL)中，34℃、210rpm振荡培养8h。然后分别取2.5mL发酵液接种到50mL发酵培养基(酵母粉1～2％，豆饼粉2～5％，麦芽糊精5～10％，柠檬酸钠0.1～0.5％，CaCl20.1～0.5％，MgSO40.1～0.5％，K2HPO40.5～2％)中，34℃、250rpm振荡培养72h；离心取上清液。
3.2酶活测定
采用中华人民共和国国家标准蛋白酶制剂测定方法(GB/T 25327-2009)，在pH7.0条件下，分别检测上述2株重组菌株(subCM1和subCM2)和对照菌枯草芽孢杆菌subC发酵上清液在经过45℃热处理后的碱性蛋白酶酶活，其发酵上清液酶活在45℃条件下处理10min后酶活残留水平分别为57％和67％，比表达野生型碱性蛋白酶subC的枯草芽孢杆菌酶活残留水平(17％)有了显著的提高，酶活数据见图2。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种新型的来源于地衣芽孢杆菌的碱性蛋白酶 高温突变体
<130> 2019
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 379
<212> PRT
<213> Bacillus licheniformis
<400> 1
Met Met Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Phe Met
1 5 10 15
Leu Val Phe Thr Met Ala Phe Ser Asp Ser Ala Ser Ala Ala Gln Pro
20 25 30
Ala Lys Asn Val Glu Lys Asp Tyr Ile Val Gly Phe Lys Ser Gly Val
35 40 45
Lys Thr Ala Ser Val Lys Lys Asp Ile Ile Lys Glu Ser Gly Gly Lys
50 55 60
Val Asp Lys Gln Phe Arg Ile Ile Asn Ala Ala Lys Ala Lys Leu Asp
65 70 75 80
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Glu Glu Asp His Val Ala His Ala Leu Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly
100 105 110
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115 120 125
Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile Gln Ala Ser His
130 135 140
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145 150 155 160
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210 215 220
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ala Glu Leu Glu Val Met Ala
290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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<210> 2
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Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala Ala Gln
370 375

Claims (5)

1.一种碱性蛋白酶突变体，其特征在于所述的碱性蛋白酶突变体的第283位氨基酸由Ala变为Ile，突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
2.一种碱性蛋白酶突变体，其特征在于，所述的碱性蛋白酶突变体是权利要求1所述的碱性蛋白酶突变体的第306位氨基酸由Gly变为Cys，突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
3.一种重组表达载体，其特征在于所述的重组表达载体携带有编码权利要求1或2所述的碱性蛋白酶突变体的基因。
4.一种重组宿主细胞，其特征在于所述的重组宿主细胞为转化/转染有权利要求3所述的重组表达载体的宿主细胞。
5.如权利要求4所述的重组宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
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