具体实施方式
本发明公开了碱性蛋白酶2018突变体及其制备方法,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
根据本发明的数据,野生型碱性蛋白酶2018的比酶活是5325.50U/mg,而本发明提供的A253K突变体的比酶活是6290.17U/mg,该位点的突变能够提高碱性蛋白酶2018活性的结果之前未见报道。本发明的关键创新点是发现碱性蛋白酶2018的A253K突变体的活性比野生型提高约18%,同时不影响该酶在毕赤酵母中的表达量。因此可以取代现有野生型碱性蛋白酶2018来进行工业化生产、应用。
本发明提供的碱性蛋白酶2018突变体及其制备方法中,所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1碱性蛋白酶2018突变体表达质粒的构建
(1)A253K突变体的获得:以SEQ ID No.1所示序列为模板,F primer、A253K-Rprimer;A253K-F primer、R primer为引物,进行PCR即得到以突变点为两端的两段基因序列。再以两段为模板,F primer和R primer为引物将其连接起来,得到SEQ IDNo.3所示的重组基因。
F primer:5’-gtagaattaagatcccgacacatggctccagccgttgaacaaagatc-3’(如SEQID No.5所示)
A253K-R primer:5’-caaatcacccttattagctgtatcCTTaatatatctgca-3’(如SEQ IDNo.6所示)
A253K-F primer:5’-ctaacgcttgcagatatattAAGgatacagctaat-3’(如SEQ IDNo.7所示)
R primer:5’-gtctaaggcgaattaattcgcacttaatggtgatggtgatggtgagctt-3’(如SEQ ID No.8所示)
下划线处为突变位点。
(2)将毕赤酵母表达载体pHBM905BDM用NotⅠ、CpoⅠ双酶切,回收后与PCR获得的目的片段用T5核酸外切酶在冰水混合物上处理3-5min。再将其转入大肠杆菌XL10-Gold感受态细胞。转化液涂布含氨苄青霉素(100mg/L)的LB平板,提取质粒,菌落PCR验证构建的重组质粒,命名为pHBM905BDM-A253K。测序工作由上海生工完成。
菌落PCR-F primer:5’-gcatcttctgctttggctgctc-3’(如SEQ ID No.9所示)
菌落PCR-R primer:5’-cgagataggctgatcaggagcaag-3’(如SEQ ID No.10所示)
实施例2重组碱性蛋白酶2018突变体质粒在毕赤酵母中的转化及筛选
(1)将重组碱性蛋白酶2018突变体表达载体pHBM905BDM-A253K转化到毕赤酵母GS115感受态细胞。利用限制性内切酶SalI酶切重组碱性蛋白酶2018突变体载体pHBM905BDM-A253K,再对其做胶回收,取10μL线性片段与100μL GS115酵母感受态细胞混匀,转移至冰预冷的电转杯(两极间隙2mm)中,放入电转仪中电击,电击参数:1500V,25μF,200Ω;之后迅速向电转杯中加入200μL 1M山梨醇,再加入200μL MD培养基,混匀后转至1.5mL EP管中,28℃摇床活化2h;将菌体悬液离心去上清,加入80μL MD培养基重悬,涂布于MD平板(葡萄糖20.0g/L,(NH4)2SO4 10.0g/L,YNB 13.4g/L,琼脂2%,500×Biotin(0.02%)2mL,倒置于28℃培养箱中,培养至出现单个菌落。
(2)将转化得到的酵母单菌落同时点到BMGY平板和MD平板上,同一单菌落标记一致;约36-48小时后,将BMGY平板上的菌落对应点到1%酪素BMMY平板,标记保持一致;每12小时加入200μL甲醇于滤纸上进行诱导;诱导48-60小时后观察酪素平板上的水解圈,出现水解圈对应的单菌落即为碱性蛋白酶2018重组菌落;将重组菌落用YPD培养基培养至OD600为0.2-0.3,取500μL菌液与等体积50%甘油于冻干管中混匀,储存于-80℃冰箱。
实施例3碱性蛋白酶2018基因及其突变体在毕赤酵母中的摇瓶表达
(1)将野生型和A253K突变体表达菌株分别接种于l00mL BMGY培养基中,28℃摇床培养至OD600为6-10。之后3000rpm离心5min,弃上清,收集菌体,再用50mL BMMY培养基重悬。28℃摇床培养,每隔12小时添加甲醇至终浓度为1%,持续诱导约120小时,期间定时取样品检测。诱导120小时后,将诱导后的菌液,离心(4000rpm,5min),上清用0.22μm滤膜过滤,滤液存放于无菌50mL离心管中,暂存于4℃冰箱。
(2)蛋白超滤换液,将过滤后的蛋白转移到10kD超滤管中,4000rpm,4℃离心,并用3倍体积的PBS缓冲液换液,最后浓缩的样品放置4℃保存备用。同时利用Bradford蛋白浓度测定试剂盒绘制标准曲线,并计算出相应的蛋白浓度。
实施例4碱性蛋白酶2018及其突变体的酶学性质测定
(1)酶活定义:在一定温度和pH条件下,在1min内水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的酶量为一个酶活单位,以U表示。
(2)碱性蛋白酶2018酶活测定方法:主要参考国标BG/T 28715-2012,但是缩小了反应体系。反应过程如下:1.5mL EP管中加入100μL酶液,55℃水浴预热3min,加入同样预热的1%酪蛋白溶液100μL,摇匀后55℃水浴10min,加入200μL三氯乙酸溶液,摇匀(空白对照先加入三氯乙酸,再加入酪蛋白溶液)。取出冷却至室温,12000rpm离心10min。取上清液100μL,加碳酸钠溶液500μL,加稀福林试剂(商品化Folin:ddH2O=1:2)100μL,40℃显色20min,于680nm波长用酶标仪测定吸光度。
酶活测定结果如下所示:
表1
由SDS-PAGE胶图以及酶活数据可见,本发明制备得到的重组碱性蛋白酶2018突变体A253K表达量与原始碱性蛋白酶2018并没有太大差别,而其酶活提高了约18%,具有显著差异。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 湖南夏盛酶技术有限公司
<120> 碱性蛋白酶2018突变体及其制备方法
<130> MP21002987
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 279
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Ala Gln Thr Asn Ala Pro Trp Gly Leu Ala Arg Ile Ser Ser Thr
1 5 10 15
Ser Pro Gly Thr Ser Thr Tyr Tyr Tyr Asn Glu Ser Ala Gly Gln Gly
20 25 30
Ser Cys Val Tyr Val Ile Asp Thr Gly Ile Glu Ala Ser His Pro Glu
35 40 45
Phe Glu Gly Arg Ala Gln Met Val Lys Thr Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg
50 55 60
Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Cys Ala Gly Thr Val Gly Ser Arg
65 70 75 80
Thr Tyr Gly Val Ala Lys Lys Thr Gln Leu Phe Gly Val Lys Val Leu
85 90 95
Asp Asp Asn Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Thr Ile Ile Ala Gly Met Asp
100 105 110
Phe Val Ala Ser Asp His Asn Asn Arg Asn Cys Pro Lys Gly Val Val
115 120 125
Ala Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Val Asn Ser Ala
130 135 140
Ala Ala Arg Leu Gln Ser Ser Gly Val Met Val Ala Val Ala Ala Gly
145 150 155 160
Asn Asn Asn Ala Asp Ala Arg Asn Tyr Ser Pro Ala Ser Glu Pro Ser
165 170 175
Val Cys Thr Val Gly Ala Thr Asp Arg Tyr Asp Arg Arg Ser Ser Phe
180 185 190
Ser Asn Tyr Gly Ser Val Leu Asp Ile Phe Ala Pro Gly Thr Ser Ile
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Leu Ser Thr Trp Ile Gly Gly Ser Thr Arg Ser Ile Ser Gly Thr Ser
210 215 220
Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Leu Ala Ala Tyr Leu Met Thr Leu
225 230 235 240
Gly Arg Thr Thr Ala Ala Asn Ala Cys Arg Tyr Ile Ala Asp Thr Ala
245 250 255
Asn Lys Gly Asp Leu Ser Asn Ile Pro Phe Gly Thr Val Asn Leu Leu
260 265 270
Ala Tyr Asn Asn Tyr Gln Ala
275
<210> 2
<211> 840
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctgcacaaa ctaacgctcc atggggattg gctagaattt cttctacttc tccaggtact 60
tcaacatact actatgatga atctgcaggt cagggtagtt gtgtttacgt tattgatact 120
ggtattgagg cttctcatcc agaatttgaa ggtagggctc aaatggtgaa gacttattac 180
gcttcatcaa gagatggtaa cggtcatggt actcattgtg ctggtaccgt tggttctagg 240
acttacggtg ttgctaagaa gactcaactg tttggtgtta aggttttgga tgataatggc 300
agtggtcaat attctactat tattgcaggt atggattttg ttgcatctga tcataacaac 360
agaaactgtc caaagggtgt tgttgcttct ttgtctttgg gcggtggtta ctcttcttct 420
gtgaactctg ccgcagcccg tttgcagtct agtggtgtaa tggtcgctgt tgcagcaggt 480
aacaacaacg cagatgctag aaattactct cccgcttctg agccatctgt atgcacggtt 540
ggagccactg acagatacga tagacgttct agtttttcta actacggctc tgttcttgac 600
atttttgctc caggaacttc tattttgtct acttggattg gaggctctac aaggtctata 660
tcaggtacat ctatggctac tccacacgtt gccggtttgg ctgcctactt aatgactttg 720
ggtagaacta ctgctgctaa cgcttgcaga tatattgccg atacagctaa taagggtgat 780
ttgagtaaca ttccatttgg tactgtcaat ttgttggctt acaataacta ccaagcttaa 840
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<212> PRT
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