CN111334494A - 新型高稳定性碱性蛋白酶突变体的筛选 - Google Patents

新型高稳定性碱性蛋白酶突变体的筛选 Download PDF

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Abstract

本发明属于酶的基因工程技术领域，涉及新型的高稳定性碱性蛋白酶突变体的筛选。本发明通过易错PCR技术筛选获得了克劳氏芽孢杆菌来源碱性蛋白酶的高稳定性突变体。这些突变体基因经测序发现分别在第747‑749位为GAT，第859‑861位为GTT，第955‑957位为CTG，相应的氨基酸序列突变分别是在第165位突变为Asp，第203位为Val和第235位为Leu。发酵48h后，突变体发酵液的酶活力分别为30U/mL、41U/mL和35U/mL，比野生型碱性蛋白酶aprE重组菌株表达的发酵液的酶活力分别提高了11％、51％和30％。将得到的发酵液进行超滤纯化后在40℃恒温孵育48h后，碱性蛋白酶突变体的酶活保留率比野生型碱性蛋白酶的酶活提高了30％、88％、42％。这些高稳定性碱性蛋白酶突变体的筛选，有助于改善碱性蛋白酶的储存和应用效果。

Description

新型高稳定性碱性蛋白酶突变体的筛选
技术领域
本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及新型的高稳定性碱性蛋白酶突变体的筛选。
背景技术
碱性蛋白酶(alkaline protease)，是指在pH值偏碱性范围内水解蛋白质肽键的一类酶，其最适pH一般为9～11，属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类。与动、植物源蛋白酶制剂相比，微生物来源的蛋白酶制剂为胞外酶，适合工业化高效生产，成本更低廉，而且易于实施酶分子进化和菌种改造。克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)或者迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)来源的枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin)，水解活力强，最适pH值高(pH＞10)，是目前产量最大的蛋白酶种类，广泛应用于加酶洗涤剂、纺织和食品等行业。该蛋白酶原始序列，见Uniprot蛋白质数据库，蛋白质编号为P29600或者P41362，两者蛋白质序列相同。
该碱性蛋白酶虽然酶解活力强，但是储存过程中稳定性相对较差，并且使用过程中由于自我降解导致酶活力损失速度较快，影响了该酶的稳定储存和高效使用，因此需要进一步通过定向进化筛选获得储存和使用稳定性更强的的新型碱性蛋白酶分子。
发明内容
本发明的目的在于通过定向进化提供一种稳定性更高的碱性蛋白酶突变体。本发明以来源于克劳氏芽孢杆菌的碱性蛋白酶aprE为基础，通过易错PCR技术获得了四个碱性蛋白酶突变体pQY-1、pQY-2、pQY-3，并分别构建表达上述突变体的重组菌枯草芽孢杆菌QY-1，QY-2 和QY-3，发酵48h后发酵液的酶活力分别为30U/mL、41U/mL和35U/mL，比对照发酵液的酶活力分别提高了11％、51％和30％。将得到的发酵液进行超滤纯化后在40℃恒温孵育48h 后，碱性蛋白酶突变体的酶活保留率比野生型碱性蛋白酶提高了30％、88％、42％。
实现本发明目的技术路线概述如下：
克劳氏芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶基因aprE的野生型序列(SEQ ID NO：1)，通过易错 PCR技术对该基因进行随机突变，将突变体基因构建在质粒pWB980上获得重组载体并转化枯草芽孢杆菌WB600，然后进行发酵产酶实验验证，最终筛选获得高稳定性的碱性蛋白酶突变体，突变体基因测序后获得突变体基因(SEQ ID NO：3，5，7)。
在本发明中采用如下定义：
1.氨基酸和DNA核酸序列的命名法
使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC 命名法。
2.碱性蛋白酶突变体的标识
采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示碱性蛋白酶突变体中突变的氨基酸。如 Leu161Ala，表示位置161的氨基酸由野生型碱性蛋白酶的Leu替换成Ala。位置的编号对应于SEQ ID NO：2中野生型碱性蛋白酶的氨基酸序列编号。核苷酸的变化同样采用“原始核苷酸位置替换的核苷酸”来表示，位置编号对应SEQ ID NO：1中野生型碱性蛋白酶的核苷酸序列编号。
在本发明中，aprE表示野生型碱性蛋白酶的基因序列，即原始序列(如SEQ ID NO：1所示)，aprEm则表示碱性蛋白酶突变体的基因序列(如SEQ ID NO：3，7，9所示)；APRE表示野生型碱性蛋白酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)，APREM表示碱性蛋白酶突变体(其氨基酸序列如SEQ ID NO：4，8，10所示)
碱性蛋白酶突变体 碱基突变 氨基酸突变
APREM-1 第747-749位为GAT 第165位为Asp
APREM-3 第859-861位为GTT 第203位为Val
APREM-4 第955-957位为CTG 第235位为Leu
所述的碱性蛋白酶突变体的表达宿主为枯草芽孢杆菌WB600，表达载体为pWB980。
本发明的技术方案如下：
1.通过易错PCR对来自克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)的野生型碱性蛋白酶基因进行随机突变，得到碱性蛋白酶突变体编码基因；
2.构建分别含有碱性蛋白酶突变体基因和野生型基因的枯草芽孢杆菌重组菌株：
(1)将扩增得到的野生型碱性蛋白酶编码基因aprE和易错PCR随机突变获得的碱性蛋白酶突变体编码基因aprEm进行酶切，将酶切后的aprE和aprEm基因分别与表达载体pWB980 通过连接得到新的重组载体；
(2)将重组载体转化入枯草芽孢杆菌WB600中，经过抗性筛选得到重组菌株，将重组菌株经过48孔板发酵并测定酶活力，获得酶活力较高的碱性蛋白酶突变体的表达菌株。
3.发酵制备野生型碱性蛋白酶和突变型碱性蛋白酶；
4.通过稳定性考察实验比较不同突变体的酶活保持率，获得酶活力稳定性更高的突变体。
5.将上述获得的酶活力稳定性更高的突变体菌株质粒送去测序，获得高稳定性的碱性蛋白酶突变体基因序列。
本发明的有益效果是：克劳氏芽孢杆菌来源的野生型碱性蛋白酶，虽然酶解活力强，但是储存过程中稳定性相对较差，并且使用过程中由于自我降解导致酶活力损失速度较快，影响了该酶的稳定储存和高效使用，本发明通过易错PCR引入基因突变并筛选到了稳定性更好的突变基因，该发明有利于提高碱性蛋白酶的应用水平。
附图说明
图1为本发明野生型碱性蛋白酶基因的PCR扩增电泳图
其中：M为DNA Marker，1为aprE基因；
图2为本发明重组质粒pWB980-aprE和pWB980-aprEm酶切验证图
其中：M为DNA Marker，1为pWB980--aprE经BamHI和XbaI双酶切；
图3为本发明重组质粒pWB980-aprEm酶切验证图
其中：M为DNA Marker，1为pWB980-aprEm经BamHI和XbaI双酶切。
图4野生型碱性蛋白酶和碱性蛋白酶突变体酶活
图5野生型碱性蛋白酶和碱性蛋白酶突变体酶活保留率
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，但本发明不只限于这些实施例，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
实施例1：野生型碱性蛋白酶aprE重组菌株的构建
1.合成并扩增野生型碱性蛋白酶基因aprE
根据GenBank：FJ940727.1获得克劳氏芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶基因aprE的野生型序列 (SEQ ID NO：1)，委托第三方合成其序列，并通过PCR进行扩增，引物序列如下：
引物1：F 5’-CGGGATCCCGGCTGAAGAAGCAAAAGAAAAATATTTAATTG-3’
引物2：R 5’-GCTCTAGAGCTTAGCGTGTTGCCGCTTC-3’
扩增程序的设置为：预变性：95℃5min；变性：95℃30s；退火：57℃45s；延伸：72℃2min；反应30个循环；延伸：72℃10min。
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，可以看到野生型碱性蛋白酶基因的条带，共1062bp (见图1)，再由小量DNA回收试剂盒回收PCR产物，得到了野生型碱性蛋白酶基因，即aprE。
2.表达载体的线性化
提取pWB980质粒，其提取过程参照试剂盒的操作手册。经BamHI和XbaI双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，可以看到野生型碱性蛋白酶基因的条带，共5080bp(见图2)，再由小量DNA回收试剂盒回收产物，得到了线性化载体序列。
3.将经BamHI和XbaI双酶切的目标片段(aprE)和载体片段连接形成重组载体，连接条件为16℃，4h。
4.将重组载体转化进枯草芽孢杆菌WB600宿主菌中，筛选阳性转化子，得到表达野生型碱性蛋白酶aprE的重组菌株，命名为枯草芽孢杆菌QY。提取枯草芽孢杆菌里的重组质粒，将其命名为pQY(含有野生型aprE基因)。
实施例2：利用易错PCR方法获得碱性蛋白酶突变体
1.基于易错PCR技术进行随机突变获得目的基因
易错PCR的反应条件为：10×PCR Buffer(不含MgCl2)5μL，dCTP(25mmol/L)2μL，dTTP(25mmol/L)2μL，dGTP(10mmol/L)1μL，dATP(10mmol/L)1μL，F(10pmol/μL)1μL， R(10pmol/μL)1μL，Mg2+(20mM)14μL，Mn2+(3mM)1.5μL，pQC67 0.5μL，Taq DNA polymerase(2.5U)1μL，ddH2O 20μL。
引物3：F 5’-CGGGATCCCGGCTGAAGAAGCAAAAGAAAAATATTTAATTG-3’
引物4：R 5’-GCTCTAGAGCTTAGCGTGTTGCCGCTTC-3’
以引物5及引物6分别为上游引物和下游引物，扩增条件为：94℃10min；94℃60s，58℃1.5min，72℃2min，30个循环；72℃10min。
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，可以看到野生型碱性蛋白酶基因的条带，共1062bp (见图1)，再由小量DNA回收试剂盒回收PCR产物，得到了碱性蛋白酶基因突变体基因库，即aprEm。
2.将易错PCR获得的碱性蛋白酶突变体基因经BamHI和XbaI双酶切，与同样经过的BamHI和XbaI双酶切的载体片段连接形成重组载体，连接条件为16℃，4h。
3.将重组载体转化进枯草芽孢杆菌WB600宿主菌中，筛选阳性转化子，即为能表达碱性蛋白酶突变体的重组菌株。同时再以突变体为模板，进行多轮易错PCR，构建更多碱性蛋白酶突变体文库。
实施例3：碱性蛋白酶突变体的筛选
1.48孔板初筛
将实施例2获得的表达碱性蛋白酶突变体的重组菌株与野生型枯草芽孢杆菌QY接种与卡那霉素抗性平板上，37℃培养12h，挑取单菌落接种于5mL LB培养基(卡那霉素抗性)，37℃、 220r/min振荡培养12h，之后以2％的接种量接种于48孔板，37℃、220r/min振荡培养48h。
以AAPF为底物，测定发酵上清液中碱性蛋白酶的酶活，最终共筛选到4株发酵液酶活力显著高于枯草芽孢杆菌QY的菌株，并将其分别命名为枯草芽孢杆菌QY-1，QY-2，QY-3。
2.摇瓶复筛和稳定性考察
将上述筛选到的4株菌株(QY-1，QY-2，QY-3，QY-4)和对照菌枯草芽孢杆菌QY，接种与卡那霉素抗性平板上，37℃培养12h，挑取单菌落接种于5mL LB培养基(卡那霉素抗性)中，37℃振荡培养12h，以2％的接种量接种于100mL LB培养基(卡那霉素抗性)中，37℃振荡培养48h。将得到的发酵液进行超滤纯化后在40℃恒温孵育48h，定点取样并测定酶活。
3.酶活测定
以AAPF为底物，分别检测上述3株菌株(QY-1，QY-2，QY-3)和对照菌枯草芽孢杆菌QY 发酵上清液的碱性蛋白酶酶活，发酵48h后发酵液的酶活力分别为30U/mL、41U/mL和35U/mL，比野生型碱性蛋白酶aprE重组菌株表达的发酵液的酶活力分别提高了11％、51％和30％。将得到的发酵液进行超滤纯化后在40℃恒温孵育48h后，碱性蛋白酶突变体的酶活保留率比野生型碱性蛋白酶的酶活提高了30％、88％、42％。
实施例4：碱性蛋白酶突变体序列的确定
利用试剂盒分别提取枯草芽孢杆菌QY-1，QY-2，QY-3中的质粒；然后利用实施例1中所述引物3和引物4，由金唯智基因公司对上述质粒分别进行基因测序。
测序结果显示：枯草芽孢杆菌QY-1中的质粒携带的碱性蛋白酶基因的核苷酸序列为 SEQ ID NO：3，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：4，申请人将该碱性蛋白酶命名为aprE-M1；枯草芽孢杆菌QY-2中的质粒携带的碱性蛋白酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：5，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：6，申请人将该碱性蛋白酶命名为aprE-M2；枯草芽孢杆菌QY-3中的质粒携带的碱性蛋白酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：7，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：8，申请人将该碱性蛋白酶命名为aprE-M3。
进一步，申请人将上述获得的碱性蛋白酶aprE-M1、aprE-M2、aprE-M3和aprE-M4的氨基酸序列分别与野生型碱性蛋白酶aprE的氨基酸序列SEQ ID NO：1进行对比分析。结果显示：与野生型碱性蛋白酶aprE相比，碱性蛋白酶aprE-M1的第165位氨基酸由Tyr突变为Asp；碱性蛋白酶aprE-M2第203位氨基酸由Tyr突变为Val；碱性蛋白酶aprE-M3的第235位氨基酸Trp突变为Leu。
Figure ISA0000191641790000011
Figure ISA0000191641790000021
Figure ISA0000191641790000031
Figure ISA0000191641790000041

Claims (3)

1.新型高稳定性碱性蛋白酶突变体的筛选，其特征在于：通过易错PCR技术筛选获得了克劳氏芽孢杆菌来源碱性蛋白酶的高稳定性突变体。
2.如权利要求1所述的新型高稳定性碱性蛋白酶突变体，其特征在于具有以下突变中的一种或者几种：基因序列的第747-749位为GAT，第859-861位为GTT，第955-957位为CTG，相应的氨基酸序列突变分别是在第165位突变为Asp，第203位为Val和第235位为Leu，。
3.如权利要求1所述的新型高稳定性碱性蛋白酶突变体，其特征在于：高稳定性碱性蛋白酶突变体的酶活比野生型碱性蛋白酶分别提高了11％、51％和30％，酶活保留率相比野生型碱性蛋白酶分别提高了30％、88％、42％。
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