CN115960873A

CN115960873A - 一种蛋白质谷氨酰胺酶及其应用

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Publication number: CN115960873A
Application number: CN202211638897.1A
Authority: CN
Inventors: 刘逸寒; 李子源; 路福平
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2022-12-20
Filing date: 2022-12-20
Publication date: 2023-04-14

Abstract

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及通过易错PCR技术体外定向进化获得酶活力提高的蛋白质谷氨酰胺酶突变体及其制备。所述突变体是在来自解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)的野生型蛋白质谷氨酰胺酶的基础上发生第144位的A144G突变获得的，具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。将上述高活力蛋白质谷氨酰胺酶在枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌表达系统内发酵酶活最高值分别为2.9U/mL和6.5U/mL。

Description

一种蛋白质谷氨酰胺酶及其应用

技术领域：

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及通过易错PCR技术体外定向进化获得酶活力提高的蛋白质谷氨酰胺酶突变体及其制备。

背景技术：

蛋白质谷氨酰胺酶(EC 3.5.1.44,protein glutaminase,PG)是近年来广泛关注的脱酰胺酶，属于酰胺基水解酶类。PG可以水解大分子蛋白质和一些小肽侧链的谷氨酰胺并生成蛋白质L-谷氨酸和氨，从而改善蛋白质的各项功能性质，降低植物蛋白酶的致敏性，在食品、生物医药以及化妆品等行业具有极大的应用价值。

PG是由日本科学家Yamaguchi S和Yokoe M在2000年首次发现，他们从土壤中分离获得产PG的菌株C.proteolyticium 9670,该菌株和大部分金黄杆菌一样，可以产生一种Flexirubin型色素，这种色素经过KOH处理会变为红色，在HCl中和后恢复原来的颜色。随后在2001年，Yamaguchi S等人研究发现PG是以pro-PG形式表达并公布其基因序列。2001年，日本学者从解阮金黄杆菌中纯化出PG，此后，很多学者相继用PG进行了应用研究。2001年，Y.S.Gu等人研究了PG对α乳蛋白的脱酰胺效果。结果表明，在天然状态下反应24h后，α乳蛋白的脱酰胺度达到55％，当α乳蛋白部分折叠形成熔球状态时，脱酰胺度明显增加，24h后即可以增加到66％，且CD光谱分析显示，α乳蛋白三级结构的稳定性与脱酰胺的程度有关。2004年，Yasuki Matsumura等人研究了PG对玉米醇溶蛋白的影响。结果显示，在40℃反应137h后，溶解度极低的玉米醇溶蛋白的脱酰胺度达到62％且脱酰胺后，玉米醇溶蛋白的溶解度和乳化性质明显提高，分子间的β-折叠数量明显降低，蛋白的二级结构发生了改变。

酶的分子改造包括理性设计和非理性设计。非理性设计一般是通过定向进化实现的，不需要了解酶蛋白分子的高级结构与功能的关系，其关键步骤是选取高效的构建突变体库的方法和条件，以及针对该突变体库选择便捷的筛选目标突变体的方法，进而获得符合实验要求的突变体。目前突变体库的构建方法主要包括易错PCR技术、DNA改组、交错延伸及体外随机引发重组技术等。非理性设计已被报道用于提高淀粉酶、β-半乳糖酶和普鲁兰酶等的热稳定性研究。另外通过物理(紫外诱变、α射线、β射线)、化学(烷化剂、抗生素、核酸碱基类似物)的诱变剂对目标菌株进行诱变，然后定向筛选获得热稳定性提高的菌株，也是常用的定向进化方法。与之不同，当已知蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等因素时，在此基础上有的放矢对基因进行改造的是定点突变，即理性设计。因它只能对天然酶蛋白质中的少数氨基酸进行替换、删除或插入，对酶功能的改造有限。因此，对于结构与功能未知的酶，定向进化可在一定程度上弥补理性设计的不足。

芽孢杆菌表达系统作为一种安全、高效、多功能和极具开发潜力的微生物菌种已广泛地应用于工业、农业、医药、卫生、食品、畜牧业、水产及科研领域。它与常用的大肠杆菌表达系统相比有着独特的优势，即可将目的基因表达的产物分泌到胞外，从而降低进一步收集、分离、纯化基因表达产物的成本和工作量。芽孢杆菌中枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等均可作为表达宿主菌。在微生物遗传学领域，芽孢杆菌属背景研究也十分清楚，具有密码子偏爱性不明显、发酵简单、生长迅速、不产生致病毒素、对培养基无特殊要求等优点。随着分子生物学技术的发展和芽孢杆菌研究的深入，使用芽孢杆菌表达系统已经克隆和表达了大量基因，有些已进行大规模工业生产，多种酶和临床需要的化学药品或者工业产品都通过芽孢杆菌来表达生产。

在本发明中，对原始蛋白质谷氨酰胺酶基因定向进化获得高活力的蛋白质谷氨酰胺酶突变基因，并且实现了其在枯草芽孢杆菌表达系统、解淀粉芽孢杆菌表达系统中的高效表达，得到了产高活力蛋白质谷氨酰胺酶的突变体菌株。

发明内容：

基于现有技术存在的问题，为了进一步推动蛋白质谷氨酰胺酶在工业领域的应用，需对其现有性质作进一步的提升，本发明的目的在于提供一种高活力蛋白质谷氨酰胺酶的突变体。

实现本发明目的的技术路线概述如下：

通过基本的分子生物学技术手段获得来自解朊金黄杆菌(Chryseobacteriumproteolyticum)的野生型蛋白质谷氨酰胺酶，通过酶切、连接等构建重组载体之后，经测序获得野生型蛋白质谷氨酰胺酶编码基因，利用易错PCR技术对野生型基因进行随机突变，利用大肠杆菌表达系统筛选得到突变体，及其编码基因，重新构建重组载体，并实现了其在枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌中的高效表达，通过发酵、提取等技术获得酶活力提高的突变体。

本发明提供的技术方案之一，是一种蛋白质谷氨酰胺酶突变体，所述突变体是在来自解朊金黄杆菌(Chryseobacterium proteolyticum)的野生型蛋白质谷氨酰胺酶的基础上发生第144位的A144G突变获得的，所述蛋白质谷氨酰胺酶突变体具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；

本发明还提供上述蛋白质谷氨酰胺酶突变体的编码基因；

进一步地，所述蛋白质谷氨酰胺酶突变体编码基因，具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；

本发明还提供包含所述突变体编码基因的重组质粒或重组菌株；

进一步地，所述重组质粒采用的的表达载体为pET-28a和pBSA43；

进一步地，所述重组菌株采用的宿主细胞可以为大肠杆菌BL21、枯草芽孢杆菌WB600、或解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218。

本发明还提供上述重组质粒或重组菌株的应用，特别是在生产SEQ ID NO.3所示蛋白质谷氨酰胺酶突变体中的应用。

本发明还提供SEQ ID NO.3所示蛋白质谷氨酰胺酶突变体的应用，特别是在提高蛋白质类食品溶解性、乳化性和发泡性等方面的应用，更特别的是在水解蛋白质中谷氨酰胺残基的酰胺基中的应用。

本发明的实验方案具体如下：

1、所述PG突变体编码基因的获得，包括如下步骤：

(1)以解朊金黄杆菌野生型PG编码基因pg(SEQ ID No.2)为模板进行易错PCR随机突变野生型PG编码基因；

(2)将随机突变后的PG编码基因，通过酶切、连接等构建重组质粒后转入大肠杆菌BL21中，筛选获得酶活力提高的PG突变体，经测序获得PG突变体编码基因pgm,将含有酶活力提高的PG突变体编码基因的质粒pET-28a-pgm保存。

2、一株含有蛋白质谷氨酰胺酶编码基因的大肠杆菌重组菌株及筛选，包括如下步骤：

(1)通过易错PCR获得突变体编码基因，将PG突变体编码基因与通过pET-28a连接得到新的重组质粒；

(2)将重组质粒转入大肠杆菌BL21中,经卡那霉素(Kan)抗性筛选，通过测试酶活对重组菌株进行筛选，得到得到酶活高的蛋白质谷氨酰胺酶。

(3)通过测序获得PG突变体编码基因pgm,将含有酶活力提高的PG突变体编码基因的质粒pET-28a-pgm保存。

3、一株含有蛋白质谷氨酰胺酶编码基因的枯草芽孢杆菌重组菌株及以其制备酶活力提高的蛋白质谷氨酰胺酶的过程，包括如下步骤：

(1)将PG突变体编码基因与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pBSA43通过连接得到新的重组质粒pBSA43-pgm；

(2)将重组质粒转入枯草芽孢杆菌WB600中，经卡那霉素(Kan)抗性筛选，酶切验证得到重组菌株，之后将重组菌株进行培养发酵，得到蛋白质谷氨酰胺酶。

4、一株含有蛋白质谷氨酰胺酶编码基因的解淀粉芽孢杆菌重组菌株及以其制备酶活力提高的蛋白质谷氨酰胺酶的过程，包括如下步骤：

(1)将重组质粒pBSA43-pgm转入解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218，得到的重组菌株经过Kan抗性筛选和蛋白质谷氨酰胺酶的酶活测定，得到蛋白质谷氨酰胺酶高产菌株；

(2)之后进行发酵，制备蛋白质谷氨酰胺酶。

所述PG野生型和突变体A144G的酶学特性如下：

(1)比活：野生型PG的比活为1.8U/mg，PG突变体A144G的比活为3.1U/mg，较野生型提高72％左右。

(2)最适反应温度：37℃。

(3)最适pH：7.0。

有益效果：

1、本发明利用易错PCR技术对野生型PG进行随机突变，得到酶活力提高的突变体A144G。高活力蛋白质谷氨酰胺酶在枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌表达系统内发酵酶活最高值分别为2.9U/mL和6.5U/mL。

2、本发明分别使用了枯草芽孢杆菌表达系统、解淀粉芽孢杆菌表达系统，实现酶活力提高的PG突变体的高效表达。

附图说明：

图1为本发明野生型pg基因的PCR扩增电泳图

其中：M为DNAMarker,1为pg基因；

图2为本发明重组质粒pBSA43-pgm酶切验证图其中：M为DNAMarker,1为枯草芽孢杆菌中重组质粒pBSA43-pgm经BamHI和NotI双酶切电泳图，2为解淀粉芽孢杆菌中重组质粒pBSA43-pgm经BamHI和NotI双酶切电泳图；

图3为野生型PG及本发明突变体A144G蛋白纯化样品的SDS-PAGE图其中：M为Protein Marker,1为野生型PG纯化样品，2为突变体A144G纯化样品；

图4为本发明NH₄ ⁺标准曲线；

图5为本发明野生型PG与突变体A144G最适温度曲线

其中：WT为本发明野生型PG，A144G为本发明突变体；

图6为本发明野生型PG与突变体A144G最适pH曲线

其中：WT为本发明野生型PG,A144G为本发明突变体；

图7为本发明A144G处理酪蛋白的脱酰胺度曲线。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，但本发明不只限于这些实施例，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

在本发明中采用如下定义：

1.氨基酸和DNA核酸序列的命名法

使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母或单字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。

2.蛋白质谷氨酰胺酶突变体的标识

采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体中突变的氨基酸。如Ala144Gly，表示位置144的氨基酸由野生型的Ala替换成Gly,位置的编号对应于SEQ IDNo.1中野生型的氨基酸序列编号。

在本发明中，小写斜体pg表示野生型PG的编码基因，小写斜体pgm表示突变体A144G的编码基因，信息如下表。

其中，A144G突变体的氨基酸序列SEQ ID NO.3如下：

MKNLFLSMMAFVTVLTFNSCADSNGNQEINGKEKLSVNDSKLKDFGKTVPV

GIDEENGMIKVSFMLTAQFYEIKPTKENEQYIGMLRQAVKNESPVHIFLKPNSN

EIGKVESASPEDVRYFKTILTKEVKGQTNKLASVIPDVGTLNSLFNQIKNQSCG

TSTASSPCITFRYPVDGCYARAHKMRQILMNNGYDCEKQFVYGNLKASTGTC

CVAWSYHVAILVSYKNASGVTEKRIIDPSLFSSGPVTDTAWRNACVNTSCGSA

SVSSYANTAGNVYYRSPSNSYLYDNNLINTNCVLTKFSLLSGCSPSPAPDVSSCGF*

以下通过具体实施方式对本发明作进一步地解释说明。

实施例1：野生型PG酶原基因pg的获得

1.野生型PG编码基因pg来自解朊金黄杆菌，基因序列从NCBI数据库中下载，通过金唯智公司合成，连接在pUC57质粒上，并在大肠杆菌JM109中保存。为了获得野生型PG酶原基因，首先提取pUC57-pg质粒作为模板，对野生型pg进行扩增，我们进行了以下操作：

(1)菌株活化：用接种环从甘油管中蘸取上述含有目的基因pg的大肠杆菌JM109菌液，接种于LB固体培养基平板，三区划线，37℃恒温培养12h；

(2)转接：从培养菌体的平板上挑取边缘整齐、表面光滑的单菌落接种于5mL液体LB培养基中，220r/min、37℃条件下培养12h；

(3)收集菌体：取适量培养菌液分装于1.5mL EP管，12000r/min离心2min,弃上清；

(4)加入250μL ddH₂O重悬菌体，吹吸混匀，12000rpm,1min,离心,弃上清；

(5)加入250μL Solution I吹吸混匀,静置1-2min；

(6)加入250μL Solution II，缓慢颠倒7-8次，混匀后开盖有拉丝；

(7)5min内加入250μL Solution III，立即颠倒混匀数次，出现白色絮状沉淀；

(8)12000rpm离心15min，将上清部分转移至吸附柱，12000rpm,1min,重复3次，弃滤液；

(9)加入500μL HBC Buffer,12000rpm,离心1min,弃滤液；

(10)加入700μL DNA Wash Buffer,12000rpm,离心1min,弃滤液；

(11)加入500μL DNA Wash Buffer,12000rpm,离心1min,弃滤液；

(12)12000rpm,空离2min,55℃金属浴10min,晾干；

(13)加入40μL ddH₂O洗脱质粒，获得pUC57-pg。

2.扩增野生型PG编码基因pg

设计野生型PG编码基因pg的扩增引物，序列如下：

上游P1(SEQ ID No.5):

CATGCCATGGAAAAATCTTTTTTTATCAATGATGGCC(划线部分为NcoI酶切位点)

下游P2(SEQ ID No.6)：

CCGCTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAAATCCACAGCTGGATACAT(划线部分为XhoI酶切位点)

PCR扩增的反应体系为50μL，其组成为：

PrimeSTAR Max	25μL
		上游引物P1(20μmol/L)	2μL
下游引物P2(20μmol/L)	2μL
		pUC57-pg质粒	2μL
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	19μL
		总体积	50μL

注：上述所需试剂来自宝生物工程有限公司Takara。

扩增程序的设置为：

a.预变性：98℃30s；

b.变性：98℃10s；

c.退火：56℃45s；

d.延伸：72℃10s；

e.b-d反应30个循环；

f.延伸：72℃10min。

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，可以看到野生型PG编码基因pg的条带，约900bp(见图1)，再由DNA切胶回收试剂盒回收PCR产物，通过酶切、连接与pET-28a质粒构建重组质粒pET-28a-pg，送测序公司进行测序，获得野生型pg基因序列(SEQ ID NO.2所示)。

实施例2：PG突变体A144G的获得

1.易错PCR：以野生型编码基因pg为模板进行易错PCR，其反应体系如下：

<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	10μL
		重组质粒pET28a-pg(5ng/μL)	2μL
上游引物P1(10μmol/L)	2μL
		下游引物P2(10μmol/L)	2μL
Taq DNA聚合酶	0.5μL
		10×Taq buffer	5μL
dATP(10mmol/L)	1μL
		dGTP(10mmol/L)	1μL
dTTP(10mmol/L)	5μL
		dCTP(10mmol/L)	5μL
<![CDATA[MgCl<sub>2</sub>(25mmol/L)]]>	14μL
		<![CDATA[MnCl<sub>2</sub>(10mmol/L)]]>	2.5μL

注：上述所需试剂来自宝生物工程有限公司Takara。

体系完成后，进行易错PCR反应，程序设置如下：

a.预变性：95℃5min；

b.变性：95℃30s；

c.退火：56℃45s；

d.延伸：72℃90s；

e.b-d反应35个循环；

f.延伸：72℃10min。

PCR反应结束后，将PCR产物与载体质粒进行NcoI和XhoI双酶切，经过纯化回收，易错PCR产物与同样经过双酶切的载体质粒pET-28a进行连接，通过转化大肠杆菌JM109，涂布于含Kan(100μg/mL)的LB固体培养基，37℃培养箱静置培养12h，得到转化子，提取重组质粒，酶切验证正确，将重组质粒转入大肠杆菌BL21中,并在96孔板中进行发酵表达，经卡那霉素(Kan)抗性筛选，对重组菌株进行筛选，得到得到酶活高的蛋白质谷氨酰胺酶，经测序获得PG突变体编码基因pgm,将含有酶活力提高的PG突变体编码基因的质粒pET-28a-pgm保存。

3.突变体文库的筛选：在96孔板中每个孔中加入200μL含Kan(100μg/mL)的LB液体培养基，随后，用灭过菌的牙签挑取每一个转化子的单克隆至96孔板中，挑取过程中尽可能使得每次都刚好沾到少量的菌。将96孔板转移至摇床培养，160rpm，37℃培养48h。然后采用低温离心机(4℃),4000rpm离心10min,倒掉上清，菌体用200μL PBS缓冲液吹吸混匀，加入10μL溶菌酶，溶解2h后，离心后取10μL上清加入到100μL底物溶液的96孔板1中，37℃反应30min,加入l00μL的CCl₃COOH溶液，混合均匀，然后加入取12μL混合液于96孔板内，再依次加入48μL蒸馏水,60μL显色剂A,30μL显色剂B和60μL显色剂C,并将其混合均匀，放置于37℃恒温培养箱中温育20min,用酶标仪测定630nm下的吸光值，根据实施例7的酶活测定方法计算其酶活。

注：

PBS(0.176M磷酸缓冲液，pH＝7.0):PBS-1:称取0.176mol的Na₂HPO₄·12H₂O,加纯水溶解，定容至1L；PBS-2:称取0.176mol的NaH₂PO₄·2H₂O,加水溶解，定容至1L,将PBS-1慢慢加入到PBS-2至pH调节为7.0。

CBZ-Gn-Gly(酶促反应底物)溶液:称取0.337g CBZ-Gln-Gly,加pH 7.0PBS溶解，定容至100mL,混匀后使用。

三氯乙酸(TCA)溶液：称取65.36g三氯乙酸，加纯水溶解，定容至1L,混匀后使用。

显色剂A：称取40.06g苯酚(60℃融化后，再称量)，0.15g硝普钠，加纯水溶解，定容至1L,混匀后使用，4℃，避光保存。

显色剂B：称取KOH 49.94g,加纯水溶解，定容至1L,混匀后使用。

显色剂C：200.4g无水K₂CO₃，8.33mL NaClO(食品级),加纯水溶解，定容至1L(现配现用)，混匀后使用。

5.选取酶活力提高的突变体。根据板1的情况，选取相较于野生型酶活力提高的突变体，将该突变体接入平板，并送出菌样进行测序。

经过上述步骤的易错PCR，选取出酶活力提高的突变体，测序后得到其中含有一个氨基酸突变，即A144G(GCG→GGG)，从而获得PG突变体A144G(SEQ ID NO.3)，及其编码基因pgm(SEQ ID NO.4)。

实施例3：蛋白质谷氨酰胺酶枯草芽孢杆菌重组菌的构建

1.构建表达质粒pBSA43-pgm

将pgm与枯草芽孢杆菌表达载体pBSA43都经BamHI和NotI双酶切，随后进行连接，构建得到重组质粒pBSA43-pgm，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性转化子，提取质粒进行酶切验证并测序，确定构建成功，即获得重组表达质粒pBSA43-pgm。

2.表达质粒pBSA43-pgm转化枯草芽孢杆菌WB600

(1)枯草芽孢杆菌WB600菌种活化，在无抗LB平板上三区划线，培养12h；

(2)挑取单菌落，接种于含有5mL LB培养基的试管中，37℃，220rpm培养12h；

(3)按2％的接种量，取100μL种子液接种于含有5mL SPI培养基的试管中，37℃，220rpm，培养3-4h至OD₆₀₀＝1.2；

(4)快速取200μL接种于2mL SPII培养基，37℃,100rpm,培养1.5h；

(5)加入20μL的10mM EGTA,37℃,100rpm,培养10min；

(6)加入1-2μL重组质粒pBSA43-pgm,37℃,100rpm,培养30min后，转速调至220rpm,继续培养1-2h；

(7)将菌液转移至已灭菌的1.5mL EP管中，5000rpm离心5min,弃上清，留50μL培养液重悬菌体，菌液涂布于含Kan的平板；

(8)挑转化子，提质粒、酶切验证(见图2中的条带1)，得到枯草芽孢杆菌重组菌株WB600/pBSA43-pgm。

实施例4：蛋白质谷氨酰胺酶解淀粉芽孢杆菌重组菌株的构建

(1)制备解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218感受态

①菌种活化，在无抗LB固体培养基上三区划线，37℃培养24h；

②挑单菌落接种于LBS培养基，37℃,220rpm,培养12h；

③以2％的接种量，将种子液接种于100mL LBS培养基中，37℃,220rpm,培养2-3h至OD₆₀₀＝0.4-0.6；

④用低温离心机(4℃),5000rpm,离心10min,弃上清；

⑤菌体用30mL洗涤缓冲液(0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％甘油)重悬，用低温离心机(4℃),5000rpm,离心10min,弃上清；

⑥重复步骤⑤，共洗涤3次；

⑦用10mL缓冲液重悬菌体(0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％甘油，14％PEG6000)；

⑧分装感受态，每管100μL,-80℃保存备用。

(2)电转解淀粉芽孢杆菌

①75％酒精清洗电转杯；

②将10ng重组质粒pBSA43-pgm和100μL感受态混匀后转移至电转杯中，冰浴2min；

③2100-2500V，电击4-6ms后，立即加入1mL复苏液(LB+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇)，37℃,220rpm复苏3h，涂布于含Kan抗性的平板；

④挑转化子，提质粒，酶切验证(见图2中的条带2)，得到解淀粉芽孢杆菌重组菌株CGMCC No.11218/pBSA43-pgm。

实施例5：酶活力提高的蛋白质谷氨酰胺酶在枯草芽孢杆菌重组菌中的表达及制备

1.将枯草芽孢杆菌重组菌株WB600/pBSA43-pgm接种于含卡纳霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃,220r/min培养过夜；

2.按1％接种量转接于50mL的LB培养基中，37℃,220r/min培养48h,离心收集发酵上清，即得到酶活力提高的A144G粗酶液；

3.将收集到的发酵液上清，先以25％饱和度的硫酸铵盐析除去杂蛋白，再把饱和度加大到65％，沉淀目的蛋白。利用0.02mol/L Tris-HCl(pH7.0)溶解，透析除盐，再将透析脱盐后得到的活性组分上样至纤维素离子交换层析柱，用同样的缓冲液先洗脱未吸附的蛋白，再用含0.1～1mol/L NaCl的0.02mol/L Tris-HCl(pH7.0)缓冲液梯度洗脱，收集目的蛋白。离子交换得到的活性组分先用含0.15mol/L NaCl的0.02mol/L Tris-HCl(pH7.0)缓冲液平衡，上样至sephadex g25凝胶层析柱后用相同的缓冲液以0.5mL/min的速度洗脱，获得纯化后的酶液，取纯化后酶液进行SDS-PAGE分析，获得大小为35kDa的单一条带(见图3中的条带1)。纯化后的酶液，经冷冻干燥制得高活力A144G酶粉。

实施例6：酶活力提高的蛋白质谷氨酰胺酶在解淀粉芽孢杆菌中的表达及制备

1.平板三区划线活化重组菌株CGMCC No.11218/pBSA43-pgm；

2.挑取单菌落接种于50mL含Kan的抗性LB培养基中，37℃、220r/min振荡培养12h；

3.以2％的接种量转接于含有卡那霉素抗性的LB培养基中，于37℃、220r/min发酵培养48h。

4.12000rpm，离心10min,收集发酵上清，即得到PG突变体A144G的粗酶液；

5.收集发酵上清，采用实施例6的方法，使用分级盐析法沉淀酶蛋白，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，获得洗脱后的酶液，取纯化后酶液进行SDS-PAGE分析，获得大小为35kDa的单一条带(见图3中的条带2)，并经过真空冷冻干燥制得高活力蛋白质谷氨酰胺酶A144G酶粉。

实施例7：蛋白质谷氨酰胺酶酶活力测定

1.蛋白质谷氨酰胺酶酶活测定原理

蛋白质谷氨酰胺酶能特异性地水解蛋白质中谷氨酰胺残基上的酰胺基，释放出游离的NH₄ ⁺。NH₄ ⁺在硝普钠的催化作用下，以次氯酸钠为氧化剂，与苯酚生成蓝绿色的靛酚蓝染料，对波长为630nm的光谱具有特异的吸收作用，通过测定OD₆₃₀即可反映蛋白质谷氨酰胺酶的相对活力。

2.本发明采用的蛋白质谷氨酰胺酶酶活测定方法与步骤

实验组：取10μL酶样品溶液(调节pH＝7.0)，37℃水浴预热l min，然后向其中加入已在37℃预热10min的底物溶液l00μl,混合液在37℃温育30min，然后加入l00μL的CCl₃COOH溶液，混合均匀,吸12μL混合物于96孔板内，再依次加入48μL ddH2O,60μL显色剂A，30μL显色剂B和60μL显色剂C，并将其混合均匀，放置于37℃恒温培养箱中温育20min，用酶标仪测定630nm下的吸光值。

对照组：取10μL酶样品溶液加入到试管中，37℃预热l min；然后向其中加入已在37℃水浴中预热10min的400mM CCl₃COOH溶液100μL，混合液在37℃水浴中温育30min。然后加入100μL的底物溶液，混合均匀。吸12μL混合物于96孔板内，再依次加入48μL ddH₂O,60μL显色剂A,30μL显色剂B和60μL显色剂C,并将其混合均匀，放置于37℃恒温培养箱中温育20min,用酶标仪测定630nm下的吸光值。

注:

PBS(0.176M磷酸缓冲液，pH＝7.0):PBS-1:称取0.176mol的Na₂HPO₄·12H₂O,加纯水溶解，定容至1L；PBS-2：称取0.176mol的NaH₂PO₄·2H₂O,加水溶解，定容至1L，将PBS-1慢慢加入到PBS-2至pH调节为7.0。

CBZ-Gln-Gly(酶促反应底物)溶液：称取0.337g CBZ-Gln-Gly,加pH7.0 PBS溶解，定容至100mL,混匀后使用。

显色剂A：称取40.06g苯酚(60℃融化后，再称量)，0.15g硝普钠，加纯水溶解，定容至1L,混匀后使用，4℃,避光保存。

显色剂B：称取KOH 49.94g,加纯水溶解，定容至1L,混匀后使用。

显色剂C：200.4g无水K₂CO₃,8.33mL NaClO(食品级)，加纯水溶解，定容至1L(现配现用)，混匀后使用。

3.NH₄ ⁺标准溶液：

称取0.314g NH₄Cl(已在烘箱里干燥1h)，加ddH₂O溶解定容至1L,作为氨标准母液，备用。按照下表进行稀释，获得不同浓度梯度的NH₄ ⁺标准溶液。

4.96孔板测定NH₄ ⁺标准曲线并计算斜率:

取不同浓度的氨标准溶液各12μL于96孔板内，再依次加入48μL ddH₂O,60μL显色剂A,30μL显色剂B和60μL显色剂C，并将其混合均匀，放置于37℃恒温培养箱中温育20min,用酶标仪测定630nm下的吸光值，绘制出NH₄ ⁺标准曲线(如图4)并计算出该曲线斜率a为0.0073。

5.蛋白质谷氨酰胺酶酶活的定义

蛋白质谷氨酰胺酶酶活定义：单位体积酶液在37℃、pH 7.0条件下每分钟水解二肽CBZ-GIn-Gly释放1μmol NH₄ ⁺为1个酶活力单位(U·mL^-1)。

酶活公式：酶活(U)＝(A-B)×(2.1/0.1)/17.03/30/a

A:实验组在630nm波长下的吸光度；

B:对照组在630nm波长下的吸光度；

a：NH₄ ⁺标准曲线的斜率。

6.酶活测定结果如下表(以实施例5或6制备的纯化后的酶液为样品)：

注：1、野生型样品是将SEQ ID NO.2所示的野生型pg基因按照实施例3或4的方法构建枯草芽孢杆菌/解淀粉芽孢杆菌重组菌株，并按照实施例5或6的方法制备野生型蛋白质谷氨酰胺酶纯化酶液所得。

2、利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定纯化酶液的蛋白浓度，通过计算(比酶活(U/mg)＝酶活(U/mL)/蛋白浓度(mg/mL))得比酶活力如下：野生型PG的比活为1.8U/mg，PG突变体A144G的比活为3.1U/mg(枯草芽孢杆菌表达系统)。

实施例8：酶学性质测定

以实施例5所采用枯草芽孢杆菌表达系统纯化酶液作为样品，及实施例7的酶活测定方法，测定野生型PG以及突变体A144G的酶学性质(如图5和图6所示，野生型样品是将SEQID NO.2所示的野生型pg基因按照实施例3的方法构建枯草芽孢杆菌重组菌株，并按实施例5的方法制备野生型蛋白质谷氨酰胺酶酶液)，结果如下:

(1)比活：PG野生型的比活为1.8U/mg，PG突变体A144G的比活为3.1U/mg。

(2)最适反应温度：37℃。

(3)最适pH：7.0。

实施例9：蛋白质谷氨酰胺酶的应用

蛋白质谷氨酰胺酶能够特异性地水解蛋白质中谷氨酰胺残基的酰胺基，从而提高蛋白质的功能性质，因此被认为在食品工业中的应用前景十分广阔。

本实施例利用蛋白质谷氨酰胺酶对酪蛋白进行脱酰胺：

首先，称取1g酪蛋白，用200mM磷酸缓冲液(pH 7.0)定容至100mL，得到1％酪蛋白悬浊液，向1％酪蛋白悬浊液中加入蛋白质谷氨酰胺酶，使酶与底物的比达到30U/克蛋白，然后将混合液置于37℃水浴中温育18h，取不同反应时间的样品，离心后取上清，测定其中的氨含量(氨含量的测试参照实施例7)，以此作为实验组。同时，在相同体积的1％酪蛋白悬浊液中加硫酸至1M，经过100℃反应18h，然后测定上清中的氨含量，为总氨含量(氨含量的测试参照实施例7)。样品中氨含量/总氨含量，得到的百分比为脱酰胺度。

结果显示(如图7)，在0-18h的反应时间里，酪蛋白的脱酰胺度迅速增加，2h时的脱酰胺度达到40％以上，在随后的2-18h的反应时间里，脱酰胺度增加速率变得缓慢。最终在18h的反应时间时，脱酰胺度达到52.56％。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

Claims

1.一种蛋白质谷氨酰胺酶突变体，其特征在于，所述蛋白质谷氨酰胺酶突变体具有SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述蛋白质谷氨酰胺酶突变体的编码基因。

3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

4.包含权利要求2所述编码基因的重组质粒或重组菌株。

5.如权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，采用的表达载体为pET-28a或pBSA43。

6.如权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，采用的宿主细胞为大肠杆菌BL21、枯草芽孢杆菌WB600、或解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218。

7.权利要求4所述重组质粒或重组菌株在生产SEQ ID NO.3所示蛋白质谷氨酰胺酶突变体中的应用。

8.权利要求1所述蛋白质谷氨酰胺酶突变体在水解蛋白质中谷氨酰胺残基的酰胺基中的应用。