CN118126990A - 一种铜绿假单胞菌4-3（Pseudomonas aeruginosa 4-3）来源的角蛋白酶突变体及其应用 - Google Patents
一种铜绿假单胞菌4-3（Pseudomonas aeruginosa 4-3）来源的角蛋白酶突变体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118126990A CN118126990A CN202410342717.8A CN202410342717A CN118126990A CN 118126990 A CN118126990 A CN 118126990A CN 202410342717 A CN202410342717 A CN 202410342717A CN 118126990 A CN118126990 A CN 118126990A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- keratinase
- mutant
- seq
- mutated
- keratin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010059345 keratinase Proteins 0.000 title claims abstract description 82
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 title claims abstract description 20
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 101710200191 Feather keratin Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 244000144977 poultry Species 0.000 claims abstract description 6
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 22
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 22
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 20
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 20
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 9
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 9
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 9
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 8
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 8
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 8
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 7
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 7
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 7
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 5
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 5
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 28
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 25
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 abstract description 22
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 20
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 20
- 239000005018 casein Substances 0.000 abstract description 13
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 13
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 abstract description 13
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 abstract 1
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 description 22
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 11
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 6
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 5
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N kanamycin A sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N 0.000 description 3
- 229960002064 kanamycin sulfate Drugs 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- GEHJBWKLJVFKPS-UHFFFAOYSA-N bromochloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)Br GEHJBWKLJVFKPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 108010049062 beta-Keratins Proteins 0.000 description 1
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000003262 industrial enzyme Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000005067 remediation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L sodium thiosulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=S AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019345 sodium thiosulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002268 wool Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K10/00—Animal feeding-stuffs
- A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
- A23K10/14—Pretreatment of feeding-stuffs with enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K10/00—Animal feeding-stuffs
- A23K10/20—Animal feeding-stuffs from material of animal origin
- A23K10/26—Animal feeding-stuffs from material of animal origin from waste material, e.g. feathers, bones or skin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体是一种铜绿假单胞菌4‑3(Pseudomonas aeruginosa 4‑3)来源的角蛋白酶突变体及其应用，其亲本氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。对序列SEQ ID NO.1所示的野生型酶中分别引入单点突变和组合突变，获得单点突变体对底物角蛋白和酪蛋白的催化比率均高于角蛋白酶定义的临界值。组合突变体对底物角蛋白的活力提高了79.51％‑99.46％，对于催化底物角蛋白与酪蛋白活力比值上升至0.96‑1.04，且半失活温度也增加到67.63℃‑69.08℃。是一种催化活性、底物特异性和热稳定性均提高的角蛋白酶突变体，更加适用于工业应用，特别是能够充分利用生物降解禽类羽毛角蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及酶工程技术领域，具体是一种铜绿假单胞菌4-3(Pseudomonasaeruginosa 4-3)来源的角蛋白酶突变体及其应用。
背景技术
羽毛是禽类屠宰过程中的副产品，主要由角蛋白组成。全球每年产生的禽类羽毛超过800万吨，代表了可观的生物资源储量。羽毛角蛋白以β-角蛋白为主，它们通过半胱氨酸残基之间的二硫键交联形成高抗拉强度的细丝结构。大量疏水性氨基酸的存在使羽毛角蛋白不溶于水及抗蛋白酶降解。这些特性极大限制了羽毛角蛋白的利用，导致大量羽毛被作为废物丢弃，这种宝贵的蛋白资源遭到了巨大浪费。尽管高温高压的物理或化学处理可以打断羽毛角蛋白的刚性结构，提高其溶解性，但这些技术存在耗能高、污染严重和营养流失等缺点。因此，通过更安全和绿色的生物学方法提高羽毛角蛋白在动物饲料中的利用率和应用价值一直是研究的重点。
角蛋白酶(EC 3.4.4.25)是微生物所产生的一种特殊蛋白酶，可以降解难溶性角蛋白废料，包括羽毛、羊毛和动物毛发。由于其能处理这些难降解底物的独特能力，角蛋白酶在食品加工、动物饲料、皮革、制药和环境修复等行业中展现了广阔的应用前景。尽管已经识别出几个蛋白酶家族中的角蛋白酶，但至今研究最为充分并商业化的是来源于地衣芽孢杆菌PWD-1的角蛋白酶A(Ker A)。然而，在工业应用中Ker A同样面临一系列挑战，例如低热稳定性、底物特异性和有机溶剂耐受差等。特别是在动物饲料加工中，饲用蛋白酶需要同时具备高活性和高热稳定性，而这正是Ker A所欠缺的。尽管通过蛋白工程方法在一定程度上提高了其热稳定性，但距离理想的工业化酶的目标还有较大的改进空间。因此，发掘和制备同时兼具高底物特异性和高热稳定性的角蛋白酶，是当前迫在眉睫的重要任务。
发明内容
本发明的目的在于提供一种Pseudomonas aeruginosa 4-3来源的角蛋白酶突变体及其应用，本申请人在实验室前期从屠宰场中分离获得了一株可高效降解羽毛的Pseudomonas aeruginosa 4-3。该菌株分泌的角蛋白酶(4-3Ker)表现出降解角蛋白的活性，且在55℃下加热1h几乎不损失催化活性，这远超目前广泛研究的地衣芽孢杆菌来源的角蛋白酶。同时，它还具有有机溶剂耐受性，是理想的商业饲用蛋白酶候选者。然而，4-3Ker对角蛋白的催化活力不足其对酪蛋白的一半，低于角蛋白酶的定义阈值(角蛋白/酪蛋白活性比值>0.5)。因此，通过基因工程制备、蛋白质工程改造4-3Ker的底物特异性，创制出富有商用价值的角蛋白酶具有重要的意义。
本发明提供一种Pseudomonas aeruginosa 4-3来源的角蛋白酶突变体，其亲本氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述的Pseudomonas aeruginosa 4-3来源的角蛋白酶突变体，它是以SEQ IDNO.1所示的角蛋白酶为亲本，分别将亲本角蛋白酶第114位酪氨酸突变为丙氨酸(SEQ IDNO.3)、第128位甲硫氨酸突变为精氨酸(SEQ ID NO.4)、第128位甲硫氨酸突变为天冬酰胺(SEQ ID NO.5)、第129位苯丙氨酸突变为亮氨酸(SEQ ID NO.6)、第129位苯丙氨酸突变为苏氨酸(SEQ ID NO.7)、第138位丙氨酸突变为缬氨酸(SEQ ID NO.8)、第142位缬氨酸突变为亮氨酸(SEQ ID NO.9)、第142位缬氨酸突变为异亮氨酸(SEQ ID NO.10)，或者同时将第128位甲硫氨酸突变为精氨酸、第138位丙氨酸突变为缬氨酸(SEQ ID NO.11)，或第128位甲硫氨酸突变为精氨酸、第142位缬氨酸突变为异亮氨酸(SEQ ID NO.12)，或第138位丙氨酸突变为缬氨酸、第142位缬氨酸突变为异亮氨酸(SEQ ID NO.13)，或第128位甲硫氨酸突变为精氨酸、第138位丙氨酸突变为缬氨酸、第142位缬氨酸突变为异亮氨酸(SEQ ID NO.14)。
所述的角蛋白酶突变体在降解角蛋白中的应用。
所述降解角蛋白是指降解家禽类羽毛角蛋白，尤其是鸡羽毛角蛋白。
所述降解家禽类羽毛角蛋白在制备饲料中的应用。
所述亲本角蛋白酶所示的氨基酸序列包含信号肽、前导肽和成熟酶。其中，突变体是以SEQ ID NO.1所示的亲本角蛋白酶氨基酸序列第202位开始计算，即编码成熟酶的第一个氨基酸记为第1位。本发明将亲本角蛋白酶的第114位、第128位、第129位、第138位、第142位中的一个或多个位点的氨基酸突变。
本发明提供了编码所述突变体的基因。
本发明提供了携带所述突变体基因的重组质粒。
本发明提供了携带所述重组质粒的微生物细胞，所述微生物细胞以枯草芽孢杆菌WB600为宿主。
另外，本发明还提供了所述Pseudomonas aeruginosa 4-3来源的角蛋白酶突变体的制备方法，具体是将编码所述Pseudomonas aeruginosa 4-3来源的角蛋白酶突变体的核酸分子导入大肠杆菌进行质粒扩增。将扩增后的质粒化转到宿主细胞枯草芽孢杆菌WB600中。以LB为基础培养基，并向其补充1.5％的酵母粉和蔗糖，在37℃，220rpm条件下连续发酵48h，将发酵液离心后的上清液即为角蛋白酶突变体的粗酶液。
本发明突出的有益效果在于：
(1)本发明公开的单点突变体Y114A、M128R、M128N、F129L、F129T、A138V、V142I和V142L对底物角蛋白和酪蛋白的催化比率，相较于野生型的0.48，分别提升至0.62、0.86、0.71、0.70、0.72、0.82、0.70和0.73，均高于角蛋白酶定义的临界值(0.5)，属于典型的新角蛋白酶。M128R、A138V和V142I，对底物角蛋白的活力分别提高了53.49％、46.81％、34.61％。此外，M128R和V142I的半失活温度分别为68.08℃和67.78℃，明显高于野生型的65.94℃。
(2)本发明公开的组合突变体M128R/A138V、M128R/V142I、A138V/V142I和M128R/A138V/V142I，对底物角蛋白的活力为野生型的1.93、2.03、1.79和1.99倍。对于催化底物角蛋白与酪蛋白活力比值也分别上升至0.96、1.04、0.98和1.01。另一方面，M128R/A138V、M128R/V142I、A138V/V142和M128R/A138V/V142I的半失活温度分别为68.42℃、68.07℃、67.63℃和69.08℃。其中M128R/A138V/V142I的半失活温度相较于突变体M128R、A138V、V142I分别增加了1.00℃、4.16℃和1.30℃。这表明组合突变可进一步提高角蛋白酶的催化活性、底物特异性和热稳定性。对比亲本角蛋白酶，单点突变体M128R、A138V和V142I，以及组合突变体M128R/A138V、M128R/V142I、A138V/V142I和M128R/A138V/V142I的最适反应pH和最适反应温度均未发生明显变化，且在55℃孵育4小时，均能保持80％以上的催化活力，远高于当前研究最深入的芽孢杆菌来源的角蛋白酶。
(3)通过比较M128R/A138V/V142I与商品化角蛋白酶对羽毛的降解实验发现，M128R/A138V/V142I能够实现等同于商品化角蛋白酶(Ker A)的羽毛降解效率,但具有Ker A无法实现的热稳定性和有机溶剂耐受性。
附图说明
图1为亲本角蛋白酶及单点突变体分别对底物酪蛋白和角蛋白的催化活力图；
图2为亲本角蛋白酶及单点突变体的SDS-PAGE图；
图3为亲本角蛋白酶及单点突变体在不同温度、不同pH和热稳定性的催化活力图；
图4为组合突变体分别对底物酪蛋白和角蛋白的催化活力图；
图5为组合突变体的SDS-PAGE图；
图6为组合突变体在不同温度、不同pH和热稳定性的催化活力图；
图7为亲本角蛋白酶、商品化角蛋白酶及突变体对羽毛的降解效率图。
具体实施方式
结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但不作为本发明的限定内容或范围。
实施例1
Pseudomonas aeruginosa 4-3来源的角蛋白酶突变体构建
(1)选择Pseudomonas aeruginosa 4-3来源的角蛋白酶(4-3Ker)作为野生型酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。委托擎科生物技术有限公司按照枯草芽孢杆菌的密码子偏好性合成4-3Ker的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)，并将其插入至载体pMA5(+)的NdeⅠ和BamHⅠ酶切位点之间，记为pMA5-4-3Ker。
(2)选择表1中每个位点的单点饱和突变引物，以pMA5-4-3Ker为模板，进行PCR扩增。反应条件为：95℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火10s，65℃延伸9min，循环30次；75℃终延伸5min，在降温至12℃，获得最终的PCR产物。
表1角蛋白酶单点突变引物序列
(3)将PCR产物经DpnI酶消化后，取10μL化转到大肠杆菌DH5a感受态细胞，将化转产物涂布在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB固体平板上，37℃下培养12h。挑选单菌落至5mL含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB液体培养基，培养12h后提质粒，交由上海生工有限公司测序验证。
(4)将2μg测序验证正确的质粒化转到枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞。在37℃，250rpm条件下培养1h后，将化转产物涂布在含有硫酸卡那霉素(50μg/mL)的LB固体平板上，37℃下培养24h，获得单菌落，并将其标记为枯草芽孢杆菌WB600/pMA5-4-3Ker表达菌株。
实施例2
Pseudomonas aeruginosa 4-3来源的角蛋白酶突变体的表达与纯化
(1)将重组枯草芽孢杆菌WB600/pMA5-4-3Ker按照2％接种于5mL含有硫酸卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基，37℃，250rpm振荡过夜培养，作为种子液。将种子液以2％接种量接种于50mL含有添加1.5％酵母粉和1.5％蔗糖的LB液体培养基(含50μg/mL的硫酸卡那霉素)中连续培养48h，在8000rpm和4℃下离心10min，将上清液记为粗酶液。
(2)向粗酶液中缓慢加入不同饱和度的硫酸铵(10-80％)，在4℃进行分级沉淀。将不同饱和度沉淀的粗酶液(10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％)孵育4h后，在12000rpm和4℃下离心20分钟，沉淀即为角蛋白酶突变体。用50mM的磷酸盐缓冲液重悬角蛋白酶突变体，并用SDS-PAGE分析经硫酸铵沉淀后的纯化情况。如图2和图5所示，经饱和度60％的硫酸铵沉淀后，可获得单一条带的角蛋白酶突变体(纯度≥95％)。
实施例3
Pseudomonas aeruginosa 4-3来源的角蛋白酶突变体的酶学性质
(1)角蛋白酶单点突变体催化活力测定
将含有200μL 2％底物(酪蛋白或可溶性角蛋白)、200μL稀释的粗酶液、600μL50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)的混合物在55℃下孵育20min。随后，向反应体系中加入400μL10％三氯乙酸(TCA)终止反应，在8000rpm下室温离心3min。取上清液150μL与0.4MNa2CO3750μL和200μL福林酚试剂混合，55℃孵育20min，在660nm处测定吸光度。将吸光度差异0.001记为角蛋白酶的一个活力单位(U)。同时，将角蛋白酶催化底物角蛋白和酪蛋白的活力比值，记为K:C，K:C数值越大，表明角蛋白酶对底物角蛋白的特异性越高。
由图1所示，单点突变体Y114A、M128R、M128N、F129L、F129T、A138、V142I和V142L均可不同程度的改变角蛋白酶的催化活性和底物特异性。相较于野生型，M128R、A138V和V142I在几乎不损失对底物酪蛋白催化活力的情况下，对底物角蛋白的催化活力分别提高了53.49％，46.81％和34.61％。另一方面，突变体Y114A、M128R、M128N、F129L、F129T、A138V、V142I和V142L对底物角蛋白和酪蛋白的催化比率，相较于野生型的0.48，分别提升至0.62、0.86、0.71、0.70、0.72、0.822、0.70和0.73，均高于角蛋白酶定义的临界值(0.5),这表明通过改造底物结合口袋的关键氨基酸可增强角蛋白酶的底物偏好性。
(2)角蛋白酶单点突变体最适温度及温度耐受性测定
为测定每个突变体的最佳温度，分别在35、40、45、50、55、60、65和70℃下测量其酶活性，以产生最高酶活性的温度作为最佳温度。此外，为评估突变体的热稳定性，先在35-70℃下预孵育各突变体30min，再在55℃下测量残余酶活性。为确定突变体的半衰期，延长在55℃下的孵育时间(0.5-4h)后测量剩余余酶活性。剩余酶活性使用预处理前的原始酶活性的百分比进行表示。
如图3A所示，与野生型相比，突变体M128R、F129L、A138V的最适温度由最初的50℃提升至55℃。而其他突变体与野生型相差不大，均能在45-60℃范围内维持80％以上的催化活力。通过在不同温度下孵育30min，检测突变体的剩余活力发现M128R和V142I的半失活温度分别为68.08℃和67.78℃，明显高于野生型的65.94℃(图3B)。相比之下，F129L的半失活温度下滑至60.50℃，且在65℃下，剩余活力基本为0。这表明改变F129L位点会严重破坏角蛋白酶的热稳定性。这可能是因为129位的苯丙氨酸芳香基侧链较大，可形成较强的疏水相互作用和范德华力，同时较强的刚性又限制了侧链的运动灵活性，更有利于维持蛋白结构的内部疏水性和稳定性。突变为亮氨酸后，打破了原本的内部稳态，导致热稳定性下降。
此外，突变体的半衰期实验显示，突变体M128R、A138V和V142I能保持与野生型几乎一致的优异的热稳定性，在55℃孵育4h仍能保持80％以上的剩余活力(图3D)，远高于目前研究最多的地衣芽孢杆菌来源的角蛋白酶。
(3)角蛋白酶单点突变体最适pH测定
为确定角蛋白酶突变体的最适反应pH，分别测定pH区间为3.0-12.0的酶角蛋白酶活性。采用的缓冲体系按pH范围选择如下：pH 3.0-5.0，使用50mM醋酸钠缓冲液；pH 5.0-8.0，使用50mM磷酸钠缓冲液；pH 8.0-9.5，使用50mM Tris-HCl缓冲液；pH 9.5-12.0，使用50mM碳酸盐缓冲液。在不同pH值下出现角蛋白酶活性峰值的pH值为最佳pH值。
如图3C所示，与野生型相比，各突变体的最适反应pH没有发生明显变化，所有突变体在pH6.5-8.5范围内都保持80％以上相对酶活性，且均在pH 8.5的Tris-HCl缓冲液中表现出最大酶活性。
(4)角蛋白酶组合突变体的酶学性质测定
按照上述检测方法，分别对角蛋白酶组合突变体(M128R/A138V、M128R/V142I、A138V/V142及M128R/A138V/V142I)的酶学性质进行测定。
如图4所示，相较于单点突变，组合突变体M128R/A138V、M128R/V142I、A138V/V142I和M128R/A138V/V142I对底物酪蛋白的催化活力基本保持不变。但对于底物角蛋白来说，突变体M128R/A138V、M128R/V142I、A138V/V142I、和M128R/A138V/V142I，相较于单点突变中的最大值，分别提高了25.95％、32.44％、16.74％和29.85％。此外，对于催化底物角蛋白与酪蛋白活力比值，也分别上升至0.96、1.04、0.98、1.01。
组合突变体的最适温度和温度耐受性结果如图6所示，突变体M128R/A138V、M128R/V142I、A138V/V142I、和M128R/A138V/V142I在最适温度下展现出几乎相同的趋势，在45-60℃范围内保持90％的催化活力。另一方面，M128R/A138V、M128R/V142I、A138V/V142I、和M128R/A138V/V142I的半失活温度分别为68.42℃、68.07℃、67.63℃和69.08℃。其中M128R/A138V/V142I的半失活温度相较于突变体M128R、A138V、V142I分别增加了1.00℃、4.16℃，和1.30℃。
在半期实验中，不同突变体M128R/A138V、M128R/V142I、A138V/V142I和M128R/A138V/V142I在热孵育4h后，仍能保持80％以上的剩余活力。同样的，组合突变后几乎不影响突变体的最适pH。总而言之，组合突变无论对角蛋白酶的底物特异性还是热稳定性都产生积极的影响，这对于提高高温条件下角蛋白酶的降解效率具有重要意义。
实施例4
Pseudomonas aeruginosa 4-3来源的角蛋白酶突变体在降解角蛋白中的应用
羽毛是一种优质的蛋白质资源，其中角蛋白的占比超过80％。因此，对羽毛的有效降解可利于羽毛角蛋白资源的回收和利用。以鸡羽毛为例，验证Pseudomonas aeruginosa4-3来源的角蛋白酶及突变体M128R/A138V/V142I的降解活性。取0.1克干鸡毛,加入10mL适当稀释的亲本角蛋白酶、商品化角蛋白酶(Ker A)和突变体M128R/A138V/V142I及1％硫代硫酸钠,在55℃、120rpm条件下反应6h，通过测定降解前后鸡羽毛的干重来确定对羽毛的降解效率。羽毛降解率的计算公式如下:
鸡毛降解率＝(M1-M2)/M1*100％
其中M1为鸡毛降解前的干重,M2为鸡毛降解后的干重。
如图7所示，与对照组相比，经亲本角蛋白酶、Ker A、及突变体均出现不同程度的羽毛降解(图7A)。通过比较降解前后羽毛的干重发现，亲本角蛋白酶、Ker A及突变体对羽毛的降解率分别为53.50％、69.25％和71.08％。相较于亲本角蛋白酶，突变体的降解效率提高了32.85％。(Ker A)是一种来自地衣芽孢杆菌PWD-1的商业化角化酶(Bioresource International INC,United States),值得注意的是，突变体M128R/A138V/V142I可实现等同于Ker A的降解效率。然而，突变体M128R/A138V/V142I所展现的热稳定性和有机溶剂耐受性是Ker A无法实现的。因此，Pseudomonas aeruginosa 4-3来源的角蛋白酶突变体可作为一种强大的绿色生物催化剂，实现羽毛角蛋白资源的有效降解。
以上所述实施例仅表达了本发明的优选实施方式，但并非因此理解为对本发明专利范围的限制。值得注意的是，采用本领域熟知的技术，在不脱离本发明的精神和范围内，所做出的任何改动与修饰，或根据以上描述的技术方案以及构思，做出其他各种相应的改变以及变形都属于本发明权利要求书中界定保护的范围。
Claims (9)
1.一种铜绿假单胞菌4-3(Pseudomonas aeruginosa 4-3)来源的角蛋白酶突变体，其特征在于：其亲本氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的Pseudomonas aeruginosa 4-3角蛋白酶突变体，其特征在于：它是以SEQ ID NO.1所示的角蛋白酶为亲本，分别将亲本角蛋白酶第114位酪氨酸突变为丙氨酸(SEQ ID NO.3)、第128位甲硫氨酸突变为精氨酸(SEQ ID NO.4)、第128位甲硫氨酸突变为天冬酰胺(SEQ ID NO.5)、第129位苯丙氨酸突变为亮氨酸(SEQ ID NO.6)、第129位苯丙氨酸突变为苏氨酸(SEQ ID NO.7)、第138位丙氨酸突变为缬氨酸(SEQ ID NO.8)、第142位缬氨酸突变为亮氨酸(SEQ ID NO.9)、第142位缬氨酸突变为异亮氨酸(SEQ ID NO.10)，或者同时将第128位甲硫氨酸突变为精氨酸、第138位丙氨酸突变为缬氨酸(SEQ ID NO.11)，或第128位甲硫氨酸突变为精氨酸、第142位缬氨酸突变为异亮氨酸(SEQ ID NO.12)，或第138位丙氨酸突变为缬氨酸、第142位缬氨酸突变为异亮氨酸(SEQ ID NO.13)，或第128位甲硫氨酸突变为精氨酸、第138位丙氨酸突变为缬氨酸、第142位缬氨酸突变为异亮氨酸(SEQ IDNO.14)。
3.编码权利要求1所述角蛋白酶突变体的DNA分子。
4.携带权利要求3所述DNA分子的重组质粒。
5.表达权利要求1所述突变体的宿主细胞或微生物细胞。
6.一种制备权利要求1所述突变体的方法，是将权利要4中含有突变体重组质粒导入微生物细胞，通过对含有重组质粒的微生物细胞发酵培养和蛋白纯化，获得所述角蛋白酶突变体。
7.权利要求1所述的角蛋白酶突变体在降解角蛋白中的应用。
8.权利要求7所述的角蛋白酶突变体在降解角蛋白中的应用，其特征在于：所述降解角蛋白是指降解家禽类羽毛角蛋白，尤其是鸡羽毛角蛋白。
9.权利要求8所述的角蛋白酶突变体在降解角蛋白中的应用，其特征在于：所述降解家禽类羽毛角蛋白在制备饲料中的应用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2023118590286 | 2023-12-30 | ||
| CN202311859028 | 2023-12-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118126990A true CN118126990A (zh) | 2024-06-04 |
Family
ID=91237448
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410342717.8A Pending CN118126990A (zh) | 2023-12-30 | 2024-03-25 | 一种铜绿假单胞菌4-3（Pseudomonas aeruginosa 4-3）来源的角蛋白酶突变体及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN118126990A (zh) |
-
2024
- 2024-03-25 CN CN202410342717.8A patent/CN118126990A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11225675B2 (en) | D-lactate dehydrogenase, engineered strain containing D-lactate dehydrogenase and construction method and use of engineered strain | |
| CN111621482B (zh) | 一种草铵膦脱氢酶突变体、基因工程菌及一锅法多酶同步定向进化方法 | |
| CN110546255B (zh) | 对赖氨酸脱羧酶酶类的修饰 | |
| CN113862233B (zh) | 提高葡萄糖氧化酶的酸稳定性的方法及突变体q241e/r499e、基因和应用 | |
| CN104342406A (zh) | 热稳定性增强的甲酸脱氢酶突变体及其制备方法 | |
| CN112662653B (zh) | 一种低温酶解性能提高的角蛋白酶突变体及其应用 | |
| CN117625581B (zh) | 一种N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体Ea2F及其应用 | |
| WO2023236638A1 (zh) | 热稳定性改善的葡萄糖氧化酶GoxM10突变体E361P及其衍生突变体和应用 | |
| CN116731989B (zh) | 漆酶突变体、基因工程菌及其应用 | |
| Luo et al. | Gene cloning, overexpression, and characterization of the nitrilase from Rhodococcus rhodochrous tg1-A6 in E. coli | |
| CN114736880B (zh) | 酸稳定性提高葡萄糖氧化酶GoxM10的突变体D497N及其衍生突变体和应用 | |
| CN110592109A (zh) | 一种spoT基因改造的重组菌株及其构建方法与应用 | |
| CN115960873A (zh) | 一种蛋白质谷氨酰胺酶及其应用 | |
| CN118126990A (zh) | 一种铜绿假单胞菌4-3（Pseudomonas aeruginosa 4-3）来源的角蛋白酶突变体及其应用 | |
| US20200140833A1 (en) | Phytase variants yeappa having improed pepsin resistance and acid resistance, and increased catalytic efficiency | |
| CN114736881A (zh) | 酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶GoxM10突变体A4D及其衍生突变体和应用 | |
| KR102230151B1 (ko) | 이산화탄소 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소 스크리닝 시스템과 이의 용도 | |
| CN1223676C (zh) | 一种高温α－淀粉酶,及其编码基因 | |
| JP5260941B2 (ja) | 新規なコラーゲン分解酵素とその利用 | |
| CN114621944B (zh) | 酶活提高的精氨酸脱亚胺酶突变体 | |
| CN116179521B (zh) | 一种精氨酸酶突变体、其重组体及其在连续催化中的应用 | |
| AU2021100409A4 (en) | Recombinant low-temperature catalase, recombinant vector and engineered strain thereof | |
| CN115820612B (zh) | 一种角蛋白酶、含角蛋白酶的胆汁酸酶制剂及其应用 | |
| Kiribayeva et al. | Cloning, purification and study of the biochemical properties of α-amylase from Bacillus licheniformis T5 strain | |
| Sharma et al. | Thermostable Lipase Production by Aneurinibacillus thermoaerophilus MB 2 Strain Isolated from Indian Hot Water Spring. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |