CN104342406A - 热稳定性增强的甲酸脱氢酶突变体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种热稳定性增强的甲酸脱氢酶突变体及其制备方法，该突变体源于博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)的野生型甲酸脱氢酶，能够催化辅酶NADH循环再生，与野生型甲酸脱氢酶相比表现出更高的热稳定性，具有I98V、V152I、A154D、D158R中的一个或多个突变特征。本发明的重组甲酸脱氢酶突变体具有更好的热稳定性，适用于较高温度下的NADH的循环再生，与目前发现的甲酸脱氢酶相比，本发明的甲酸脱氢酶突变体在50℃－55℃之间活性没有明显降低，具有更好的热稳定性，因此更适合于工业化应用。

Description

热稳定性增强的甲酸脱氢酶突变体及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种甲酸脱氢气酶突变体，特别涉及一种热稳定性增强的甲酸脱氢酶突变体及其制备方法。

背景技术

氧化还原酶在制备手性醇、氨基酸及羟基酸等方面的应用越来越多。但在其催化的反应中，90％需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，NADH），或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP，NADPH）做为辅酶。因为在氧化还原酶的应用中，还需要低成本、高效的辅酶再生体系。甲酸脱氢酶（Formate Dehydrogenase，FDH）是最成功的辅酶再生体系之一，已应用于工业生产中。其优势在于反应不可逆，并只产生一种副产物－二氧化碳，对酶的活性没有任何影响。Kula等在2002年因为发现这一体系而被授予德国未来奖。但目前发现的FDH热稳定性较差，在55℃－60℃之间迅速失活。

发明内容

本发明的目的是提供一种与野生型甲酸脱氢酶相比热稳定性增强的甲酸脱氢酶突变体、编码序列及其制备方法。

实现本发明目的的技术方案是：本发明提供一种甲酸脱氢酶突变体，其源于博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)的野生型甲酸脱氢酶，能够催化辅酶NADH循环再生。所述甲酸脱氢酶突变体，与SEQ ID NO.2的野生型甲酸脱氢酶相比表现出更强的热稳定性。甲酸脱氢酶突变体和编码这种突变体的多核苷酸可以使用本领域技术人员通常使用的方法制备。突变体可以通过使编码该酶的体外重组、多核苷酸诱变、DNA改组、易错PCR和定向进化方法等获得。

上述甲酸脱氢酶突变体，具有选自以下特征中的一个或多个突变：I98V，V152I，A154D，D158R。

上述甲酸脱氢酶突变体，优选自序列SEQ ID NO.4。全长突变的甲酸脱氢酶对于保持酶的活性和热稳定性并不是必需的。相应地，应考虑甲酸脱氢酶突变体的截短的类似物和有催化活性的片段。例如，在一些实施方案中，C端或N端的数个氨基酸可以被删去。任何特定的截短的类似物或片段可以利用相应的试验来评估催化活性。同样的，额外的氨基酸残基可以被添加到一个或两个末端而不影响催化活性。额外序列可以是功能性的或非功能性的。例如，额外氨基酸序列可以被用来帮助纯化，做为标记，或执行一些其它的功能。因此，本公开内容的甲酸脱氢酶突变体可以是融合蛋白的形式，其中甲酸脱氢酶突变体(或其片段 )诸如通过助溶标签 (如SUMO蛋白 )、纯化标签 (如结合金属的 His标签 )和细菌定位信号 (如分泌信号 )的实例而非限制的方式被融合到其它蛋白质。

上述甲酸脱氢酶突变体，其甲酸脱氢酶比野生型甲酸脱氢酶具有更好的热稳定性。

本发明提供一种编码甲酸脱氢酶突变体的基因，其优选自SEQ ID NO.3，其已经过序列优化以适于在大肠杆菌中表达。在一些实施方案中，多核苷酸包括被优化用于在特定类型的宿主细胞中表达的密码子。用于各种不同类型的微生物的密码子的使用和偏好性是已知的，因为其是用于在这些微生物的表达特定的氨基酸的优化的密码子。

本发明提供一种重组质粒，其源自SEQ ID NO.5，比pET系列及pQE系列表达载体相比其具有更严谨的表达控制。在一些实施方案中，控制序列包括启动子、前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列和转录终止子等。对于细菌宿主细胞，指导编码序列的转录的适合的启动子包括但不限于从噬菌体T5、噬菌体T7、噬菌体lambda、大肠杆菌 lacUV5操纵子、大肠杆菌 trp操纵子、大肠杆菌 tac操纵子等。

本发明提供一种宿主细胞，优选自大肠杆菌W3110，DH1，和JM109中的一种。表达甲酸脱氢酶突变体的表达载体可以包含允许载体整合到宿主细胞基因组中或者载体在细菌中独立于基因组自主复制的元件。为整合到宿主细胞基因组中，载体可以通过recombineering重组工程使载体整合到基因组中。

本发明提供一种制备甲酸脱氢酶突变体的方法，其特征在于包括以下步骤：(a)构建表达甲酸脱氢酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌包括宿主细胞，表达载体以及甲酸脱氢酶突变体基因；(b)筛选得到所述基因工程菌；(c)培养所述基因工程菌；(d)诱导表达所述基因工程菌；(e)收集和制备甲酸脱氢酶突变体。

所述步骤a为将来自博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)的编码野生型甲酸脱氢酶的多核苷酸(SEQ ID NO：1)进行序列优化后通过全基因合成的方式获得。将优化后的编码甲酸脱氢酶的多核苷酸克隆到改进后的表达载体（SEQ ID NO. 5）的启动子的控制下，得到可以表达野生型甲酸脱氢酶的质粒。将所得质粒通过标准方法转化到大肠杆菌中。所用克隆方法为同源重组的方式，所用到的扩增引物为：

F：5' TAACTTTTAGGAGGTAAAACATATGAAAATCGTTCTGGTTCTGTACG  3'；

R：5' AACAGGAGTCCAAGCTCAGCTTATTATTTTTTGTCGTGTTTACCGTAAGC3'

类似的，将编码甲酸脱氢酶突变体的多核苷酸(SEQ ID NO：3)克隆到表达载体（SEQ ID NO. 5）的启动子的控制下，得到可以表达甲酸脱氢酶突变体的质粒。将所得质粒通过标准方法转化到大肠杆菌DH1中。

所述步骤c为挑取含有目的表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10ml 高压灭菌后的第一培养基中30℃，250rpm过夜培养，次日取三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的于30℃中培养至菌体OD5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1h，加入IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养12h；

所述第一培养基为：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，磷酸氢二钠3.55 g/L，磷酸二氢钾3.4 g/L，氯化铵2.68 g/L，硫酸钠0.71 g/L，七水硫酸镁0.493 g/L，六水氯化铁0.027 g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，灭菌后添加氨苄青霉素至100mg/L；

所述第二培养基为：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，磷酸氢二钠3.55 g/L，磷酸二氢钾3.4 g/L，氯化铵2.68 g/L，硫酸钠0.71 g/L，七水硫酸镁0.493 g/L，六水氯化铁0.027 g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L。灭菌后添加卡那霉素至50mg/L。

本发明具有积极的效果：（1）本发明的重组甲酸脱氢酶突变体具有更好的热稳定性，适用于较高温度下的NADH的循环再生，与目前发现的甲酸脱氢酶相比，本发明的甲酸脱氢酶突变体在50℃－55℃之间活性没有明显降低，具有更好的热稳定性，因此更适合于工业化应用。

具体实施方式

（实施例1）

将来自博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)的编码野生型甲酸脱氢酶的多核苷酸(SEQ ID NO：1)进行序列优化后通过全基因合成的方式获得。将优化后的编码甲酸脱氢酶的多核苷酸克隆到改进后的表达载体（SEQ ID NO. 5）的启动子的控制下，得到可以表达野生型甲酸脱氢酶的质粒。将所得质粒通过标准方法转化到大肠杆菌 DH1中。所用克隆方法为同源重组的方式，所用到的扩增引物为：

F：5' TAACTTTTAGGAGGTAAAACATATGAAAATCGTTCTGGTTCTGTACG  3'；

R：5' AACAGGAGTCCAAGCTCAGCTTATTATTTTTTGTCGTGTTTACCGTAAGC3'

类似的，将编码甲酸脱氢酶突变体的多核苷酸(SEQ ID NO：3)克隆到表达载体（SEQ ID NO. 5）的启动子的控制下，得到可以表达甲酸脱氢酶突变体的质粒。将所得质粒通过标准方法转化到大肠杆菌DH1中。

甲酸脱氢酶突变体的制备：

挑取含有目的表达载体的大肠杆菌DH1单菌落接种于10ml 高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，磷酸氢二钠3.55 g/L，磷酸二氢钾3.4 g/L，氯化铵2.68 g/L，硫酸钠0.71 g/L，七水硫酸镁0.493 g/L，六水氯化铁0.027 g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，灭菌后添加氨苄青霉素至100mg/L。30℃，250rpm过夜培养。次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，磷酸氢二钠3.55 g/L，磷酸二氢钾3.4 g/L，氯化铵2.68 g/L，硫酸钠0.71 g/L，七水硫酸镁0.493 g/L，六水氯化铁0.027 g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L。灭菌后添加卡那霉素至50mg/L。于30℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1h。加入IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养12h。

培养结束后，将培养液于4℃，6000g下离心30min最终得到湿菌体2.8g。然后将沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体。再次用蒸馏水重悬，在超声破碎仪下破碎至澄清。破碎后于4℃，12000g下离心30min，收集上清，预冷至-70℃后用冷冻干燥机制备冻干粉。最终得到粗酶冻干粉0.45g。

将前步中制备的甲酸脱氢酶干粉按适当的比例稀释后，各取500ul 加入52℃，55℃，58℃水浴锅中温育25分钟。取出后置于4℃保存。

甲酸脱氢酶活性的测定：

由于NADH在340nm处有吸收峰，而NAD在340nm处无吸收峰，故可通过检测反应过程中NADH吸光值的变化，而计算甲酸脱氢酶的活性。甲酸脱氢酶活力测定体系为：2ml反应体系中，依次加入0.5ml 100mM pH7.0 PBS缓冲液，加入终浓度1mM NAD，20 mM甲酸铵 ，加双蒸水补至1.9ml ，充分混匀后置于25℃水浴中。将实施3中处理过的甲酸脱氢酶按适当的比例稀释后，取100ul 加入反应体系中，混匀后于340nm处检测每分钟的吸光度变化值。参照NADH标准曲线计算甲酸脱氢酶的酶活。

单位酶活(U)定义为每分钟生成1μmol NAD所需要的酶量。用同样方法检测野生型甲酸脱氢酶的酶活。根据检测的结果进行计算，发现对比如下：

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种热稳定性增强的甲酸脱氢酶突变体，其源于博伊丁假丝酵母的野生型甲酸脱氢酶，能够催化辅酶NADH循环再生，与野生型甲酸脱氢酶相比表现出更高的热稳定性，具有选自以下特征中的一个或多个突变：I98V、V152I、A154D、D158R。

2.根据权利要求2所述热稳定性增强的甲酸脱氢酶突变体，其特征在于：其序列为SEQ ID NO.4。

3.一种多核苷酸，其编码如权利要求1-2中任一项所述的重组多肽。

4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于：其序列为SEQ ID NO.3。

5.一种重组质粒，其包括表达载体连接权利要求4所述的多核苷酸，所述载体序列为SEQ ID NO.5。

6.一种宿主细胞，其包含权利要求5所述的重组质粒。

7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其中所述细胞是大肠杆菌，为大肠杆菌W3110，DH1，和JM109中的一种。

8.根据权利要求6或7所述的宿主细胞，其中所述重组质粒的密码子已经为在所述宿主细胞中表达而进行了优化。

9.一种如权利要求1~8所述甲酸脱氢酶突变体的制备方法，包括以下步骤：(a)采用博伊丁假丝酵母构建表达甲酸脱氢酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌包括宿主细胞，表达载体以及甲酸脱氢酶突变体基因，所述宿主细胞为大肠杆菌W3110，DH1，和JM109中的一种；(b)筛选得到所述基因工程菌；(c)培养所述基因工程菌；(d)诱导表达所述基因工程菌；(e)收集和制备甲酸脱氢酶突变体。

10.根据权利要求9所述的甲酸脱氢酶突变体的制备方法，其特征在于：所述步骤(c)为挑取含有目的表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10ml 高压灭菌后的第一培养基中30℃，250rpm过夜培养，次日取三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的于30℃中培养至菌体OD5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1h，加入IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养12h；

所述第一培养基为：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，磷酸氢二钠3.55 g/L，磷酸二氢钾3.4 g/L，氯化铵2.68 g/L，硫酸钠0.71 g/L，七水硫酸镁0.493 g/L，六水氯化铁0.027 g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，灭菌后添加氨苄青霉素至100mg/L；

所述第二培养基为：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物5 g/L，磷酸氢二钠3.55 g/L，磷酸二氢钾3.4 g/L，氯化铵2.68 g/L，硫酸钠0.71 g/L，七水硫酸镁0.493 g/L，六水氯化铁0.027 g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L。灭菌后添加卡那霉素至50mg/L。

11.一种NADH循环再生方法，包括在与权利要求1-2任一项所述的甲酸脱氢酶突变体的存在下，将NAD催化生成NADH。