TWI478936B

TWI478936B - 具提升酶活性之植酸酶

Info

Publication number: TWI478936B
Application number: TW102126555A
Authority: TW
Inventors: Rey Ting Guo; Tzu Hui Wu; Ya Shan Cheng; Jian Wen Huang; hui lin Lai; Cheng Yen Lin; Ting Yung Huang
Original assignee: Genozyme Biotech Inc
Priority date: 2013-07-24
Filing date: 2013-07-24
Publication date: 2015-04-01
Also published as: US20150031110A1; TW201504260A; US9194010B2

Description

具提升酶活性之植酸酶

本案係關於一種植酸酶，尤指一種具提升酶活性之植酸酶。

植酸(phytic acid)又稱為肌醇六磷酸(myo-inositol(1,2,3,4,5,6)hexakisphosphate)，為植物中儲存磷的主要形式，在種子中含量尤其豐富，而種子如穀類及豆類乃是動物飼料的主要原料。雖然種子中的植酸可成為飼養動物所需磷的重要來源，但只有反芻動物才能代謝植酸以利用其中的磷；對於非反芻動物，不能被消化代謝的植酸反而被視為抗營養物質。而植酸被視為抗營養物質的原因是植酸帶有豐富的負電，易與帶有正電的離子，如鈣離子、鎂離子、鋅離子、錳離子、銅離子、鐵離子螯合，再進一步與蛋白質及澱粉形成複合物，此複合物不僅阻礙金屬離子的消化吸收，也影響消化酵素作用而阻礙營養物質吸收。

無法代謝植酸的非反芻動物須在飲食中添加無機磷或添加植酸酶(phytase)。以添加無機磷的方式，不僅成本高，無法消除抗營養反應，動物排泄物中未被代謝的植酸還會造成水質汙染，破壞生態平衡。而經由植酸酶在飼料中的添加，則可降低磷酸的抗營養現象提高營養吸收，增加動物對飼料中磷的可利用性達到60%之外，還能降低磷的排出達50%。

植酸酶是能夠從植酸中水解出磷酸根的酵素泛稱，在動物、植物、微生物中皆可找到植酸酶基因的存在。植酸酶能夠將植酸上的六個磷酸根依序水解出來，不同植酸酶的水解最終程度不一，水解機制也不同，若依此做為分類，植酸酶可分為組氨酸酸性磷酸酶(histidine acid phophatase)、紫色酸性磷酸酶(purple acid phosphatase)、β螺旋槳植酸酶(β-propeller phytase)，以及半胱氨酸磷酸酶(cysteine phytase)，其中組氨酸酸性磷酸酶因為其最適pH值及作用條件較適合用於飼料添加，因此被廣泛的研究。組氨酸酸性磷酸酶催化機制是藉由酸鹼反應，將連接肌醇環及磷酸根的磷酸單脂鍵進行水解作用，釋放出磷酸根，其水解步驟分為兩個階段，首先組氨酸酸性磷酸酶會利用活性區的組氨酸攻擊植酸中的一個磷酸單脂鍵，形成磷酸-組氨酸中間體，再由活性區的天冬氨酸利用一個水分子提供質子給磷酸-組氨酸中間體中磷酸根的氧離子，釋放出一個磷酸根。

儘管於飼料中添加植酸酶在動物飼養上已顯示可增加生產力，且使用500-1000單位活性的植酸酶可代替1克的無機磷添加及減少30-50%磷的排出，但在工業上如何使占有飼料市場60%的植酸酶能具有經濟效益，為酵素改造持續的目標及需求。植酸酶在飼料工業的製程及應用上，必須符合以下特性：最適酸鹼值為pH 2-6.5、抗酸性及抗胃蛋白酶及抗胰蛋白酶分解的特性、產品製粒時的耐熱性、產品具有高活性；符合以上條件才能有效降低生產成本，應用於工業上。

適合工業用的酵素的取得可由自然界的生物篩選而來，但需要耗費大量時間及人力，往往獲得的酵素也不符合工業應用條件，需要再加以改造，而運用現有的酵素再加以加強改造為較經濟的方式。酵素改造的策略可分為兩種，一是利用定向進化，一是利用理論性的設計。定向進化包括兩個步驟，一是製造具有豐富多樣性的突變基因庫，其次再從基因庫中篩選具有特定優化特性的突變株。突變基因庫的製造方法常用的有易錯聚合酶鏈式反應(error-prone PCR)及DNA重組反應(DNA shuffling)，但龐大的突變基因庫需要有大量篩選的方法，否則對於篩選上是相當耗費人力及時間的。近年來，隨著可利用的蛋白質結構及序列增加，還有電腦計算軟體技術的發展，可識別出蛋白質中與底物結合、活性區域、穩定結構的氨基酸，因此以此理論基礎建立的有限突變基因庫能更有效地篩選出優化的酵素特性。

因此，本案欲藉由植酸酶的序列比對及結構分析，對一些特定的胺基酸進行基因突變，進而有效提升植酸酶在工業上應用的產業價值。

本案之目的在於改造現有植酸酶，利用序列比對、結構分析及定點突變技術，有效提升植酸酶之作用活性，藉以增加植酸酶之工業應用價值。

為達上述目的，本案之一較佳實施態樣為提供一種植酸酶，其胺基酸序列係為將序列編號2第90個位置的纈胺酸突變成蘇胺酸之胺基酸序列。編碼該序列編號2之基因係從大腸桿菌(Escherichia coli )所篩選出來的EcAppA基因，其所表現的蛋白酶為組氨酸酸性磷酸酶。該植酸酶之胺基酸序列係為序列編號4之胺基酸序列。

為達上述目的，本案之一較佳實施態樣為提供一種植酸酶，其胺基酸序列係為將序列編號6第204個位置的天冬酰胺突變成丙胺酸或將第206個位置的絲胺酸突變成丙胺酸之胺基酸序列，以藉此移除植酸酶活性區的醣基化位點。編碼該序列編號6之基因係從大腸桿菌(Escherichia coli )所篩選出來的EcAppA基因進一步經過密碼子使用序列優化所得之基因，其所表現的蛋白酶為組氨酸酸性磷酸酶。該植酸酶之胺基酸序列係為序列編號8或序列編號10之胺基酸序列。

第1圖顯示植酸酶EcAppA蛋白質立體結構及改造點的位置

第2圖顯示植酸酶EcAppA的基因及胺基酸序列。

第3圖顯示定點突變所採用的引子序列。

第4圖顯示植酸酶EcAppA之Ec-V90T突變株的基因及胺基酸序列。

第5圖顯示植酸酶r-AppA的基因及胺基酸序列。

第6圖顯示植酸酶r-AppA之r-N204A突變株的基因及胺基酸序列。

第7圖顯示植酸酶r-AppA之r-S206A突變株的基因及胺基酸序列。

第8圖顯示野生型Ec-AppA與突變株Ec-V90T的植酸酶活性分析測試。

第9圖顯示野生型r-AppA與突變株r-N204A及r-S206A的植酸酶活性分析測試。

體現本案特徵與優點的一些典型實施例將在後段的說明中詳細敘述。應理解的是本案能夠在不同的態樣上具有各種的變化，然其皆不脫離本案的範圍，且其中的說明及圖式在本質上係當作說明之用，而非用以限制本案。

本案中的植酸酶基因(EcAppA)是從大腸桿菌(Escherichia coli )所篩選出來的，其所表現的蛋白酶為組氨酸酸性磷酸酶。因為它的高活性及高度底物專一性及最適作用pH範圍，皆符合飼料的應用，因此具有高產業應用價值，另外，此基因已能成功的在工業生產菌株畢赤酵母(Pichia pastoris )中表達，且此酵素已解出蛋白質結構。因此，此植酸酶是相當好做為進一步酵素改良的目標，故本案欲對此活性已經相當高的植酸酶EcAppA進行改造，以進一步提升其活性。

對於高活性的EcAppA，在改造上要找到增加活性的突變，機率比活性低的酵素來的低，因此使用隨機點突變大量篩選的成功率相對來的低；再者，即使活性增加也難有乘與倍率的增加，在篩選上不易與野生型植酸酶做區別，因此增加篩選上的困難度，所以本案使用理智設計(rational design)來提升EcAppA的活性，運用資料庫可得的結構及序列加以分析，縮小篩選的目標範圍，有效找到活性增加的突變株。

首先，將EcAppA與同樣具有高植酸酶活性的CaAppA(來自Citrobacter amalonaticus 的植酸酶)及CbAppA(來自Citrobacter brakii 的植酸酶)進行序列比對，比對結果發現，CaAppA及CbAppA分別與EcAPPA有60%的一致度及70%的相似度，且互相有70%的一致度及80%的相似度。利用這三個具有高度相似性的序列且皆有高活性的植酸酶，可將所要突變的範圍縮小，減少需要篩選的活性優化突變。

接著，將在CaAppA及CbAppA有一致性但在EcAppA不同的氨基酸位點挑出，再利用已知的EcAppA蛋白質立體結構分析這些位點的位置，保留在活性區附近的氨基酸位點，因為在活性區附近位點造成活性改變的機率較大，以此找出活性有增加的突變株。根據前述分析，胺基酸序列上第90個位置的纈胺酸(Valine)即被選擇作為進行定點突變的位置。

此外，利用已知的EcAppA蛋白質立體結構分析畢赤酵母表達時可能產生天冬酰胺(Asparagine)醣基化的位點，亦即在序列上天冬酰胺後第二個氨基酸出現絲胺酸(Serine)或酪胺酸(Tyrosine)，而天冬酰胺後的氨基酸不為脯胺酸(Proline)時。從序列上來看，EcAppA有三個可能形成醣基化的位置，利用已知的EcAppA蛋白質立體結構分析觀察到其中一個醣基化的位置在植酸酶活性區週圍，因此可將此醣基化位置的天冬酰胺(原始胺基酸序列第205個位置)或是天冬酰胺後第二個氨基酸位置的絲胺酸(原始胺基酸序列第207個位置)進行點突變，以製造移除醣基化位點的突變株。

請參閱第1圖，其係顯示EcAppA蛋白質立體結構及改造點的位置。EcAppA屬於組氨酸酸性磷酸酶家族中的植酸酶，此組氨酸酸性磷酸酶家族結構皆有類似的結構，大致分為上下兩部份，上半部由α-helix組成，具有多變性，下半部由α-helix及β-sheet組成，結構較為固定。IHS為植酸中的磷以硫取代的合成物質，在做植酸酶蛋白質立體結構時用來指示植酸在酵素中結合的位置。本案的目標改造點V90、N205、S207亦顯示於第1圖之結構中。

以下將詳述本案改造植酸酶EcAppA之方法，包括定點突變、蛋白表現及活性測試方法，及其所得到之改良植酸酶蛋白。

首先，本案所使用的植酸酶EcAppA基因序列為去除信號序列(signal peptide)的Escherichia coli K12 AppA序列(GenBank NC_000913.2)，即從第67個鹼基開始表達，但有幾個不影響活性的自然突變位點，包括原始基因的第266個鹼基由T變C(使胺基酸由纈胺酸變丙胺酸)，第302個鹼基由A變T(使胺基酸由麩醯胺酸變成白胺酸)，及第835個鹼基由C變T(不改變胺基酸)，序列加上啟動碼ATG後如第2圖所示，EcAppA基因之全長為1236個鹼基(DNA序列以序列編號1標示)以及411個胺基酸(胺基酸序列以序列編號2標示)。將EcAppA基因利用Eco RI與Xho I限制酶切位構築到構築到pET22b表達載體中。定點突變(site-directed mutagenesis)方法為利用突變引子進行聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction；PCR)，當中所用的突變引子如第3圖所示，其中Ec-V90T突變株之突變引子係設計為可將植酸酶EcAppA第90個胺基酸由纈胺酸突變成蘇胺酸(Threonine)。此突變株的序列列於第4圖中，其中突變株Ec-V90T的DNA序列以序列編號3標示，胺基酸序列則以序列編號4標示。

接著在PCR反應產物中加入Dpn I於37℃下作用，將原始模板去除。再把含有突變基因的質體送入大腸桿菌XL1B勝任細胞中，將菌液塗於含有100μg/ml Ampicillin抗生素的LB培養基於37℃下進行培養一天。再挑選菌落，藉由定序步驟確認成功突變基因序列。將突變成功的AppA基因轉殖到大腸桿菌BL21(DE3)內，進行蛋白表現與純化。

蛋白質表現方法是將轉殖成功的大腸桿菌BL21(DE3)利用含有100μg/ml Ampicillin的LB培養液進行培養，其中菌株先接種到5ml LB內培養6小時後，再放大體積至200ml LB培養，最終放大到2L的LB培養。在OD值到達0.6-0.8時，利用1mM的IPTG誘導轉入的蛋白質大量表現。之後，將菌液以6000g轉速離心20分鐘收集下來。利用超音波細胞粉碎機(sonicator)破菌，再以15000rpm離心30分鐘，並收集上清液，以快速蛋白質液相層析儀(fast protein liquid chromatography；FPLC)純化，利用DEAE陰離子交換管柱，分離出蛋白純度達95%以上的植酸酶蛋白。

植酸酶蛋白的活性測試方式是將4ml的7.5mM肌醇六磷酸鈉與0.2ml酶蛋白(酶蛋白的緩衝液為0.05% Triton X-100、0.05%BSA、及0.25M乙酸鈉，緩衝液為pH5.5)及1.8ml的反應緩衝液0.25M乙酸鈉，pH為5.5，在37℃下作用30分鐘。接著加入4ml的終止顯色液(水：硝酸溶液：10%鉬酸胺：0.2M偏釩酸胺=4：2:1：1)，在OD415波長測定吸光值，再換算成酶活性單位(unit)。其中酶活性的標準曲線是由磷酸二氫鉀標準溶液0-25μ mol/ml之間制定，而1 unit的定義為每分鐘從濃度5mM植酸鈉溶液中釋放1μmole無機磷。

而在畢赤酵母表達系統中，首先將AppA序列參考GenBank DQ513832.1的序列合成優化為畢赤酵母易表達的序列(r-AppA)，此序列經過密碼子使用(codon usage)序列優化，以適合於畢赤酵母中表達，該序列在畢赤酵母中經由外泌表達，於序列N端增加信號序列(signal peptide)，且位於原始胺基酸序列第1個位置的蛋胺酸(methionine)被移至信號序列上，由於信號序列在蛋白質表達過程會被切除，因此在畢赤酵母中分泌出的蛋白質胺基酸序列比原始的序列少了第一個蛋胺酸。如第5圖所示，r-AppA基因之全長為1233個鹼基(DNA序列以序列編號5標示)以及410個胺基酸(胺基酸序列以序列編號6標示)，並利用Eco RI與Not I限制酶切位構築到pPICZ α A載體中，其中在構築質體時發生了不影響活性的自然突變，使r-AppA的第116個胺基酸從丙胺酸變為纈胺酸。再利用定點突變方法以突變引子進行聚合酶鏈鎖反應，當中所用的突變引子如第3圖所示，其中r-N204A突變株之突變引子係設計為可將植酸酶r-AppA第204個胺基酸由天冬酰胺突變成丙胺酸(Alanine)，此突變株的序列列於第6圖中，其中突變株r-N204A的DNA序列以序列編號7標示，胺基酸序列則以序列編號8標示。而r-S206A突變株之突變引子則設計為可將植酸酶r-AppA第206個胺基酸由絲胺酸突變成丙胺酸，此突變株的序列列於第7圖中，其中突變株r-S206A的DNA序列以序列編號9標示，胺基酸序列則以序列編號10標示。

接著，使用Pme I把DNA質體進行線性化之後，藉由電轉步驟將DNA送入畢赤酵母內。接著將菌液塗於含有100μg/ml Zeocin抗生素的YPD培養皿於30℃下進行培養兩天。再挑選菌落並接種到5ml YPD於30℃下培養，再次接種到50ml BMGY中於30℃下培養至隔天。接著，將培養基換成含有0.5%甲醇的20ml BMMY以誘導蛋白表現，同樣培養於30℃下。每隔24小時取樣並補充0.5%甲醇。此外，將取樣的菌液進行離心並收集上清液，進而測定植酸酶活性，其方法如上述。

為了進一步地放大植酸酶生產量，我們先將菌株接種到5ml YPD培養至隔天，接著放大到2L於30℃下培養之後，再次放大到含有19L發酵培養基(FBSM)的50L發酵槽內。發酵過程中，會全程監控溫度在30℃並藉由氨水控制pH值在5.0左右，而溶氧的調控則藉由進氣量以及轉速維持在40%以上。在批次培養之後，饋加50%甘油讓酵母生長到一定的菌量。再把甲醇以梯度饋加的方式加進發酵槽中，進而誘導酶蛋白表現。定時取樣並收集上清液，進而檢測植酸酶的表現量與活性。

第8圖顯示野生型Ec-AppA與突變株Ec-V90T的植酸酶活性分析測試，圖中酶活性是以野生型EcAppA的酶活性做為100%的基準之下進行比較，統計分析是利用T-test的雙尾分析，在P<0.05時判定為顯著性差異(*)。由結果得知，將胺基酸序列上第90個位置的纈胺酸(Valine)突變成蘇胺酸(Threonine)能有效地提升植酸酶的活性約20%。

第9圖顯示野生型r-AppA與突變株r-N204A及r-S206A的植酸酶活性分析測試，圖中酶活性是以野生型r-AppA的酶活性做為100%的基準之下進行比較，統計分析是利用T-test的雙尾分析，在P<0.05時判定為顯著性差異(*)。由結果得知，利用定點突變製造移除活性區醣基化位點的突變株r-N204A及r-S206A，即第204個位置的天冬酰胺(Asparagine)突變成丙胺酸(Alanine)及第206個位置的絲胺酸(Serine)突變成丙胺酸(Alanine)，皆能使植酸酶活性上升約10%。

綜上所述，為了增加植酸酶的工業應用價值，本案係詳加分析及比較EcAppA植酸酶基因與其他活性高的植酸酶序列，加上活性區週遭的結構分析後，針對當中數個胺基酸利用定點突變的技術突變成目標胺基酸，用以提升作用活性。其中，將胺基酸序列上第90個位置的纈胺酸(Valine)突變成蘇胺酸(Threonine)所得到的Ec-V90T突變株能有效地提升植酸酶的活性約20%。而考慮到使用畢赤酵母做表達時所造成的醣基化對蛋白質的影響，本案亦利用定點突變製造移除活性區醣基化位點的突變株r-N204A及r-S206A，即第204個位置的天冬酰胺(Asparagine)突變成丙胺酸(Alanine)及第206個位置的絲胺酸(Serine)突變成丙胺酸(Alanine)，結果移除活性區醣基化位點的突變株皆能使植酸酶活性上升約10%。

在原本活性就相當高的酵素上再找尋增加活性的突變點本屬不易，活性能增加的幅度也不大，本案找到的突變點增加活性的幅度為10~20%，此幅度的增加若用大量篩選的方法也容易在表達量變動下被遺漏，而本案結合了酵素已知序列及結構，利用理性設計，在只篩選少許突變株的情況下，才能將其一一純化出來，確定其活性，篩選出有效突變株。由於植酸酶佔有55億飼料酵素市場的60%，藉由本案提出的突變株進一步提升植酸酶活性後，更能有效的節省生產成本及增加生產價值，故本案之具提升酶活性之植酸酶極具產業價值，爰依法提出申請。

本案得由熟習此技術之人士任施匠思而為諸般修飾，然皆不脫如附申請專利範圍所欲保護者。

<110> 基酵生物科技股份有限公司

<120> 具提升酶活性之植酸酶

<160> 10

<210> 1

<211> 1236

<212> DNA

<213> 大腸桿菌(Escherichia coli)

<400> 1

<210> 2

<211> 411

<212> PRT

<213> 大腸桿菌(Escherichia coli)

<400> 2

<210> 3

<211> 1236

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

<210> 4

<211> 411

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

<210> 5

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

<210> 6

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

<210> 7

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

<210> 8

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

<210> 9

<211> 1233

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

<210> 10

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Claims

一種植酸酶，其胺基酸序列係為將序列編號2第90個位置的纈胺酸突變成蘇胺酸之胺基酸序列。
如申請專利範圍第1項所述之植酸酶，其中編碼該序列編號2之基因係從大腸桿菌(Escherichia coli )所篩選出來的EcAppA基因。
如申請專利範圍第1項所述之植酸酶，其中該植酸酶係為組氨酸酸性磷酸酶。
如申請專利範圍第1項所述之植酸酶，其中該植酸酶之胺基酸序列係為序列編號4之胺基酸序列。
一種植酸酶，其胺基酸序列係為將序列編號6第204個位置的天冬酰胺突變成丙胺酸或將第206個位置的絲胺酸突變成丙胺酸之胺基酸序列，以藉此移除植酸酶活性區的醣基化位點。
如申請專利範圍第5項所述之植酸酶，其中編碼該序列編號6之基因係從大腸桿菌(Escherichia coli )所篩選出來的EcAppA基因進一步經過密碼子使用序列優化所得之基因。
如申請專利範圍第5項所述之植酸酶，其中該植酸酶係為組氨酸酸性磷酸酶。
如申請專利範圍第5項所述之植酸酶，其中該植酸酶之胺基酸序列係為序列編號8之胺基酸序列。
如申請專利範圍第5項所述之植酸酶，其中該植酸酶之胺基酸序列係為序列編號10之胺基酸序列。