CN107090444B - 提升耐热性的植酸酶 - Google Patents
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Abstract
本申请系关于一种提升耐热性的植酸酶，其氨基酸序列系为将序列编号2进行突变组合A至D其中之一之序列，其中突变组合A系将序列编号2第143个氨基酸和第262个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)，突变组合B系将序列编号2第259个氨基酸和第312个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)，突变组合C系将序列编号2第205个氨基酸和第257个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)，以及突变组合D系将序列编号2第264个氨基酸和第309个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)。
Description
本申请系关于一种植酸酶，尤指一种提升耐热性的植酸酶。
现有技术
植酸(phytic acid)又称为肌醇六磷酸(myo-inositol(1,2,3,4,5,6)hexakisphosphate)，为植物中储存磷的主要形式，在种子中含量尤其丰富，而种子如谷类及豆类是动物饲料的主要原料。虽然种子中的植酸可成为饲养动物所需磷的重要来源，但只有反刍动物才能代谢植酸以利用其中的磷；对于非反刍动物，不能被消化代谢的植酸反而被视为抗营养物质，是因为植酸带有丰富的负电，易与带有正电的离子，如钙离子、镁离子、锌离子、锰离子、铜离子、铁离子螯合，再与蛋白质及淀粉形成复合物，阻碍消化酵素代谢，影响营养物质及金属离子的消化吸收。此类无法代谢植酸的非反刍动物须在饮食中添加无机磷或添加植酸酶。但添加无机磷的方式不仅成本高，动物排泄物中未被代谢的植酸也会造成水质污染，破坏生态平衡。经由植酸酶在饲料中的添加，则可增加动物对饲料中磷的可利用性达到60％，降低磷酸的抗营养现象，除了提高营养吸收，也能降低磷的排出达50％。
植酸酶是能够从植酸中水解出磷酸根的酵素泛称，在动物、植物、微生物中皆可找到植酸酶基因的存在，植酸酶能够将植酸上的六个磷酸根依序水解出来，不同植酸酶的水解最终程度不一，水解机制也不同，若依此做为分类，植酸酶可分为组氨酸酸性磷酸酶(histidine acid phophatase)、紫色酸性磷酸酶(purple acid phosphatase)、β螺旋桨植酸酶(β-propeller phytase)，以及半胱氨酸磷酸酶(cysteine phytase)，其中组氨酸酸性磷酸酶因为其最适pH值及作用条件较适合用于饲料添加，因此被广泛的研究。组氨酸酸性磷酸酶催化机制是藉由酸碱反应，将连接肌醇环及磷酸根的磷酸单脂键进行水解作用，释放出磷酸根；水解步骤分为两个阶段，首先组氨酸酸性磷酸酶会利用活性区的组氨酸攻击植酸中的一个磷酸单脂键，形成磷酸-组氨酸中间体，再由活性区的天冬氨酸利用一个水分子提供质子给磷酸-组氨酸中间体中磷酸根的氧离子，释放出一个磷酸根。
尽管植酸酶于饲料添加在动物饲养已显示增加生产力，且使用500-1000单位活性的植酸酶可代替1克的的无机磷添加及减少30-50％磷的排出，但在工业上如何使占有饲料市场60％的植酸酶能具有经济效益，为酵素改造持续的目标及需求。植酸酶在饲料工业的制程及应用上，必须具有在pH 2-6.5高活性，抗酸性及抗胃蛋白酶及抗胰蛋白酶分解的特性，产品制粒时的耐热性，提高酵素作用时的活性才能降低生产成本。
酵素改造的策略可分为两种，一是利用定向进化，一是利用理论性的设计。定向进化包括两个步骤，一是制造具有丰富多样性的突变基因库，其次再从基因库中筛选具有特定优化特性的突变株。突变基因库的制造方法常用的有易错聚合酶链式反应(error-pronePCR)及DNA重组反应(DNA shuffling)，但庞大的突变基因库需要有大量筛选的方法，否则对于筛选上是相当耗费人力及时间的。近年来，随着可利用的蛋白质结构及序列增加，还有计算机计算软件技术的发展，蛋白质中与底物结合、活性区域、稳定结构的氨基酸可被识别出，因此以此理论基础建立的突变基因库能更有效地筛选出优化的酵素特性。
在比较耐热性蛋白质和适温性蛋白质结构的研究，可观察酵素结构与耐热性的关系，耐热性蛋白质有较多的氨基酸侧链和侧链间氢键及盐桥的键结。另外，藉由一连串于T4溶解酵素(T4lysozyme)做的突变蛋白质结构与特性分析，发现增加疏水核心的稳定性、加强局部氢键及盐桥的连结、使用双硫键稳定结构等可增加蛋白质耐热性。越来越多的研究运用计算机软件仿真计算以提高蛋白质的耐热性，突变蛋白质结构可藉由计算机软件分析建立起一套参数，再将参数运用在增加其他目标蛋白质的耐热性，缩小筛选稳定结构的改造点及键结的范围。
因此，本申请欲藉由改造基因以增加植酸酶之双硫键键接，藉此提升植酸酶对于温度的耐受性，以有效增加植酸酶在工业上应用的产业价值。
发明内容
本申请之目的在于改造现有植酸酶，利用结构分析及定点突变技术，增加植酸酶之双硫键键接，以有效提升植酸酶之耐热性，进而增加植酸酶之工业应用价值。
为达上述目的，本申请之一较广义实施态样为提供一种植酸酶，其氨基酸序列系为将序列编号2进行突变组合A至D其中之一之序列，其中突变组合A系将序列编号2第143个氨基酸和第262个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)，突变组合B系将序列编号2第259个氨基酸和第312个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)，突变组合C系将序列编号2第205个氨基酸和第257个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)，以及突变组合D系将序列编号2第264个氨基酸和第309个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)。编码该序列编号2之基因系从大肠杆菌(Escherichia coli)所分离出来并经优化的AppA基因，且该植酸酶系为组氨酸酸性磷酸酶。
在一实施例中，该植酸酶之氨基酸序列如序列编号24所示。
在一实施例中，该植酸酶之氨基酸序列如序列编号26所示。
在一实施例中，该植酸酶之氨基酸序列如序列编号28所示。
在一实施例中，该植酸酶之氨基酸序列如序列编号30所示。
本申请之另一较广义实施方案为提供一种植酸酶，其氨基酸序列系为将序列编号2进行突变组合A以及合并突变组合B及D其中之一之序列，其中突变组合A系将序列编号2第143个氨基酸和第262个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)，突变组合B系将序列编号2第259个氨基酸和第312个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)，以及突变组合D系将序列编号2第264个氨基酸和第309个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)。
在一实施例中，该植酸酶之氨基酸序列如序列编号32所示。
在一实施例中，该植酸酶之氨基酸序列如序列编号34所示。
附图说明
第1图显示植酸酶AppA的核苷酸序列以及氨基酸序列。
第2图显示植酸酶AppA的蛋白质立体结构及改造点的位置。
第3图显示定点突变所用的引子。
第4图显示改造后之AppA-A植酸酶的核苷酸序列以及氨基酸序列。
第5图显示改造后之AppA-B植酸酶的核苷酸序列以及氨基酸序列。
第6图显示改造后之AppA-C植酸酶的核苷酸序列以及氨基酸序列。
第7图显示改造后之AppA-D植酸酶的核苷酸序列以及氨基酸序列。
第8图显示改造后之AppA-A+B植酸酶的核苷酸序列以及氨基酸序列。
第9图显示改造后之AppA-A+D植酸酶的核苷酸序列以及氨基酸序列。
第10图显示AppA与AppA加上不同双硫键突变组合的耐热分析测试。
具体实施方式
体现本申请特征与优点的一些典型实施例将在后段的说明中详细叙述。应理解的是本申请能够在不同的实施方案上具有各种的变化，其皆不脱离本申请的范围，且其中的说明及图式在本质上系当作说明之用，而非用以限制本申请。
本申请中的植酸酶基因(EcAppA)是从大肠杆菌(Escherichia coli)所筛选出来的，其所表现的蛋白酶为组氨酸酸性磷酸酶。EcAppA有许多符合工业应用的特质如：高活性、高度底物专一性、最适作用pH范围、以及在工业生产菌株毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达量高等。为提高饲料制粒后的植酸酶活性，需提高EcAppA的耐热性，以提高EcAppA的产业应用价值。由于EcAppA已解出蛋白质结构，因此EcAppA是相当好做为进一步酵素改良的目标。
本申请利用双硫键来提升蛋白质结构稳定性，及降低高温造成的不可逆蛋白质结构延展，成功的提升EcAppA的耐热性。双硫键选定的位置为技术关键，本申请使用理智设计(rational design)筛选出双硫键的突变位点来提升EcAppA的耐热性。基于双硫键的形成不影响整体蛋白质结构的前提，选择双硫键的突变点为EcAppA的蛋白质结构相近处，以氨基酸侧链和侧链间β-碳原子距离内做筛选参数；且在较稳定的蛋白质二级结构表面添加双硫键，以增加双硫键带来的结构稳定效果；去除筛选出的二级结构本身转弯处的无效双硫键，得到的双硫键组合再以实验方式加以筛选其提升耐热性的功效。
以下将详述本申请改造植酸酶之方法及其所得到之改良植酸酶。
本申请系运用定点突变(site-directed mutagenesis)技术进行突变改造，并使用工业生产菌株毕赤酵母系统进行表达。首先，将EcAppA序列合成优化为毕赤酵母易表达的序列AppA，其核苷酸序列以及氨基酸序列如第1图所示，其中，AppA表达序列包含1236个碱基(含终止密码子，核苷酸序列以序列编号1标示)以及410个氨基酸(氨基酸序列以序列编号2标示)。利用EcoRI与NotI限制酶切位，构筑到pPICZαA载体中，接着进行定点突变。
第2图显示植酸酶AppA的蛋白质立体结构及改造点的位置，其中，植酸酶AppA蛋白质结构(PDB:1DKQ)及肌醇六磷酸(inositol hexaphosphate)以灰色显示，双硫键突变组合的位置A(143-262)、B(259-312)、C(205-257)、D(264-309)以黑色标示。如前所述，本申请系以氨基酸侧链和侧链间β-碳原子距离内做筛选参数在蛋白质二级结构表面挑选出的位点，去除在二级结构转弯处的双硫键突变点，此方法筛选出增加耐热的双硫键突变AppA-A、AppA-B、AppA-C、AppA-D，其中，双硫键突变AppA-A系将第143个氨基酸和第262个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)以形成双硫键，双硫键突变AppA-B系将第259个氨基酸和第312个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)以形成双硫键，双硫键突变AppA-C系将第205个氨基酸和第257个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)以形成双硫键，双硫键突变AppA-D系将第264个氨基酸和第309个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)以形成双硫键。前述四组双硫键突变位点其氨基酸侧链和侧链间β-碳原子距离分别为 (因第312个氨基酸为无氨基酸侧链的甘胺酸，此为甘胺酸的α-碳原子和第259个氨基酸侧链的β-碳原子间的距离)、
定点突变所用的引子如第3图所示，引子序列分别以序列编号3至22标示，其中F为顺向引子，R为逆向引子，且突变的位置以底线标示。如前所述，双硫键突变AppA-A、AppA-B、AppA-C、AppA-D的双硫键突变组合分别为A(143-262)、B(259-312)、C(205-257)、D(264-309)。A1和A2分别为双硫键突变组合A(143-262)中第143个氨基酸的位置和第262个氨基酸的位置突变用引子；B1和B2分别为双硫键突变组合B(259-312)中第259个氨基酸的位置和第312个氨基酸的位置突变用引子；C1和C2分别为双硫键突变组合C(205-257)中第205个氨基酸的位置和第257个氨基酸的位置突变用引子；D1和D2分别为双硫键突变组合D(264-309)中第264个氨基酸的位置和第309个氨基酸的位置突变用引子。另外，本申请亦进行AppA-A+B及AppA-A+D合并双硫键突变的改造，其合并双硫键突变组合分别为A+B(143-262、259-312)及A+D(143-262、264-309)，其中，合并双硫键突变组合A+B突变用引子包括A1、A2+B1、及B2等三组引子，而合并双硫键突变组合A+D突变用引子则包括A1、A2+D1、及D2等三组引子。
定点突变方法为利用突变引子进行聚合酶链锁反应(polymerase chainreaction,PCR)，接着在PCR反应产物中加入限制酶DpnI于37℃下作用，将原始模板去除。再把含有突变的质体送入大肠杆菌XL1B胜任细胞中，将菌液涂于含有50μg/ml Zeocin抗生素的LB培养基于37℃下进行培养一天。再挑选菌落，藉由定序步骤确认成功突变基因序列。
第4图显示改造后之AppA-A植酸酶的核苷酸序列以及氨基酸序列，其中，AppA-A植酸酶基因包含1236个碱基(含终止密码子，核苷酸序列以序列编号23标示)以及410个氨基酸(氨基酸序列以序列编号24标示)，且第143个氨基酸和第262个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)。
第5图显示改造后之AppA-B植酸酶的核苷酸序列以及氨基酸序列，其中，AppA-B植酸酶基因包含1236个碱基(含终止密码子，核苷酸序列以序列编号25标示)以及410个氨基酸(氨基酸序列以序列编号26标示)，且第259个氨基酸和第312个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)。
第6图显示改造后之AppA-C植酸酶的核苷酸序列以及氨基酸序列，其中，AppA-C植酸酶基因包含1236个碱基(含终止密码子，核苷酸序列以序列编号27标示)以及410个氨基酸(氨基酸序列以序列编号28标示)，且第205个氨基酸和第257个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)。
第7图显示改造后之AppA-D植酸酶的核苷酸序列以及氨基酸序列，其中，AppA-D植酸酶基因包含1236个碱基(含终止密码子，核苷酸序列以序列编号29标示)以及410个氨基酸(氨基酸序列以序列编号30标示)，且第264个氨基酸和第309个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)。
第8图显示改造后之AppA-A+B植酸酶的核苷酸序列以及氨基酸序列，其中，AppA-A+B植酸酶基因包含1236个碱基(含终止密码子，核苷酸序列以序列编号31标示)以及410个氨基酸(氨基酸序列以序列编号32标示)，且第143个氨基酸、第259个氨基酸、第262个氨基酸和第312个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)。
第9图显示改造后之AppA-A+D植酸酶的核苷酸序列以及氨基酸序列，其中，AppA-A+D植酸酶基因包含1236个碱基(含终止密码子，核苷酸序列以序列编号33标示)以及410个氨基酸(氨基酸序列以序列编号34标示)，且第143个氨基酸、第262个氨基酸、第264个氨基酸和第309个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)。
将突变成功的AppA基因使用限制酶PmeI把DNA质体进行线性化之后，藉由电转步骤将DNA送入毕赤酵母内。接着将菌液涂于含有100μg/ml Zeocin抗生素的YPD培养皿于30℃下进行培养两天。挑选菌落并接种到1ml YPD于30℃下培养一天后，取最终OD600浓度为0.2的体积接种到5ml BMGY培养基中于30℃下培养至隔天。接着，将培养基换成含有0.5％甲醇的2ml BMMY以诱导蛋白表现，培养于30℃下2～3天后，取菌液进行离心并收集上清液，进而检测植酸酶活性及耐热性。
植酸酶蛋白的活性测试方式是将4ml的7.5mM肌醇六磷酸钠与0.2ml酶蛋白(酶蛋白的缓冲液为0.05％Triton X-100、0.05％BSA、及0.25M乙酸钠，缓冲液为pH 5.5)及1.8ml的反应缓冲液0.25M乙酸钠，pH为5.5，在37℃之下作用30分钟。接着加入4ml的终止显色液(水:硝酸溶液:10％钼酸胺:0.2M偏钒酸胺＝4:2:1:1)，在OD415波长测定吸光值，再换算成酶活性单位(unit)。其中酶活性的标准曲线是由磷酸二氢钾标准溶液0-25μmol/ml之间制定。而1unit的定义为每分钟从浓度5mM植酸钠溶液中释放1μmole无机磷。
植酸酶蛋白的耐热测试方式，是将不同突变点的上清液依活性稀释为相同活性后，以聚合酶链锁反应机器进行耐热测试，耐热条件为85℃反应两分钟后立即降温到25℃。耐热性是以没有进行耐热测试的上清液活性当成100％来计算，以百分比表示。
第10图显示AppA与AppA加上不同双硫键突变组合的耐热分析测试。由第10图结果可知，AppA在85℃反应2分钟下，相较于AppA的21.7％的活性残留，AppA-A、AppA-B、AppA-C、AppA-D活性残留可提升为70.9％、68.5％、35.4％、37.4％。又，合并双硫键突变AppA-A+B及AppA-A+D亦可提高AppA在85℃反应2分钟下活性残留至80.5％及60.6％。换言之，本申请藉由添加双硫键来稳定植酸酶AppA的结构，使得AppA-A、AppA-B、AppA-C、AppA-D、AppA-A+B及AppA-A+D等突变蛋白在85℃下处理2分钟后的残留活性皆高于野生型AppA，故本申请改良后的植酸酶具有较高的耐热性，可有效运用在提升AppA制粒时的耐热性，及降低生产成本，因此具有较大潜力的工业应用价值。
综上所述，为了增加植酸酶的工业应用价值，本申请使用理智设计筛选出双硫键的突变位点，以藉由添加双硫键来稳定植酸酶的结构，进而提升植酸酶的耐热性。本申请筛选出四组突变位点，AppA-A系于第143个氨基酸和第262个氨基酸之间形成双硫键、AppA-B系于第259个氨基酸和第312个氨基酸之间形成双硫键，AppA-C系于第205个氨基酸和第257个氨基酸之间形成双硫键，AppA-D系于第264个氨基酸和第309个氨基酸之间形成双硫键。另外，本申请亦进行合并双硫键突变的改造，包括AppA-A+B及AppA-A+D。根据耐热分析测试结果可知，AppA-A、AppA-B、AppA-C、AppA-D、AppA-A+B及AppA-A+D等突变蛋白在85℃下处理2分钟后的残留活性皆高于野生型AppA，故本申请改良后的植酸酶具有较高的耐热性。换言之，本申请之双硫键选定的技术不仅有效筛选出耐热提升的蛋白质突变，且有效提高筛选效率，而本申请所筛选到的双硫键突变组合皆明显提升植酸酶的耐热性，可有效运用在提升植酸酶制粒时的耐热性，及降低生产成本，因此具有较大潜力的工业应用价值。
纵使本发明已由上述实施例详细叙述而可由本领域技术进行各种修饰，然皆不脱如附权利要求所述的范围。
Claims (8)
1.一种植酸酶，其氨基酸序列系为将序列编号2进行突变组合A至D其中之一之序列，其中突变组合A系将序列编号2第143个氨基酸和第262个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)，突变组合B系将序列编号2第259个氨基酸和第312个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)，突变组合C系将序列编号2第205个氨基酸和第257个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)，以及突变组合D系将序列编号2第264个氨基酸和第309个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)。
2.如权利要求1所述之植酸酶，其中该植酸酶之氨基酸序列如序列编号24所示。
3.如权利要求1所述之植酸酶，其中该植酸酶之氨基酸序列如序列编号26所示。
4.如权利要求1所述之植酸酶，其中该植酸酶之氨基酸序列如序列编号28所示。
5.如权利要求1所述之植酸酶，其中该植酸酶之氨基酸序列如序列编号30所示。
6.一种植酸酶，其氨基酸序列系为将序列编号2进行突变组合A以及合并突变组合B及D其中之一之序列，其中突变组合A系将序列编号2第143个氨基酸和第262个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)，突变组合B系将序列编号2第259个氨基酸和第312个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)，以及突变组合D系将序列编号2第264个氨基酸和第309个氨基酸突变成半胱氨酸(Cysteine)。
7.如权利要求6所述之植酸酶，其中该植酸酶之氨基酸序列如序列编号32所示。
8.如权利要求6所述之植酸酶，其中该植酸酶之氨基酸序列如序列编号34所示。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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